KR102342483B1 - 캠필로박터균 및 클로스트리디움균 검출용 프라이머 세트 및 검출 방법 - Google Patents

캠필로박터균 및 클로스트리디움균 검출용 프라이머 세트 및 검출 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 캠필로박터균 및 클로스트리디움균 검출용 LAMP 프라이머 세트 및 검출 방법에 관한 것이다. 본 발명의 캠필로박터균 및 클로스트리디움균을 등온증폭 방식으로 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머 세트, 이를 포함하는 조성물, 키트 및 이를 이용한 방법은 높은 민감도와 특이성은 물론 신속하게 검체 또는 식품 내 병원체의 오염 여부를 검출할 수 있으며, 또한 필요한 경우 반응 종결 후 전기영동과 같은 별도의 처리 없이 바로 검출 확인이 가능하여 편리성이 증대된다.

Description

캠필로박터균 및 클로스트리디움균 검출용 프라이머 세트 및 검출 방법{A primer sets and detection method for detecting campylobacter strain and clostridium strain}
본 발명은 캠필로박터균 및 클로스트리디움균 검출용 LAMP 프라이머 세트 및 검출 방법에 관한 것이다.
국내 반려동물 사육 인구가 증가하고 있고 반려동물 수명이 연장됨에 따라 반려동물 유래 세균에 대한 연구가 진행되고 있다. 한편, 반려동물 설사병의 주요 병원성세균에는 잘 알려진 대장균 이외에도 혐기성세균으로는 캠필로박터균과 클로스트리디움균이 있다. 따라서, 외국의 주요 반려동물 진단회사인 Zoologix 및 Luminex 뿐만 아니라 코넬대 수의분야 진단법에서는 캠필로박터균 및 클로스트리디움 디피싸일을 검사대상으로 하고 있다. 캠필로박터균은 사람에서 주요 식중독 원인균으로도 알려져 있는데 특히 캠필로박터 제주니는 설사, 복통 등의 증상을 일으키는 식품 매개 장염의 주요 원인균으로 국내에서의 식중독 발생의 주요 원인이기도 한 병원체이다. 반려동물의 또 다른 주요 혐기성균인 클로스트리디움 디피싸일은 사람에게도 감염될 수 있는 장내세균으로 항생제에 대한 자연 내성으로 항생제 치료가 어려운 세균이다. 반려동물에서는 클로스트리디움 퍼프린젠스도 보고되고 있으며 클로스트리디움 퍼프린젠스는 반려동물뿐만 아니라 가축에서도 소화기 계통의 질병을 일으키는 세균으로 알려져 있다. 반려동물에서 다양한 혐기성 세균들이 확인되고 있지만 혐기성세균의 경우 공기중에 오래 노출되면 생존율이 낮아지기 때문에 신속하게 동정 후 혐기상태를 유지해야 항생제 감수성 검사 수행 및 결과에 따라 치료를 할 수 있다. 하지만 현재 고가의 장비인 미생물질량분석기(MALDI-TOF)가 없으면 신속한 동정이 어려우며 realtime PCR 장비는 고가이고 일반 PCR의 경우 gel등에 전기영동을 해야 하는 등 결과를 최종 확인하는데 번거로움이 있으며, 고가의 관련 장비를 구매하거나 장비를 배치할 공간 확충이 어려울 수 있다. 하지만 등온증폭반응(LAMP: Loop-mediated isothermal amplification)은 기존의 PCR이나 realtime PCR과 유사한 원리로 정확도와 민감도가 높지만 관련된 장비가 다수 필요한 것은 아니며, 결과를 색깔에 의해 직관적으로 바로 확인이 가능하여 다양한 분야에서 활용이 되고 있는 방법이며, 특히 6개의 primer는 타깃의 다른 부위를 인식함으로써 민감도 및 특이도가 뛰어나다. 그러므로 상기 반려동물 주요 혐기성 병원균인 캠필로박터균 및 클로스트리디움균을 검출하기 위한 LAMP 반응용 프라이머를 개발한다면 정확도와 민감도가 높은 균 검출이 가능할 것으로 기대되나, 이에 대한 연구는 미흡한 실정이다.
이에 본 발명자들은 캠필로박터균 및 클로스트리디움균의 검출 방법을 연구하고 검출 기술을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 캠필로박터 콜라이(C. coli), 캠필로박터 제주니(C. jejuni), 클로스트리디움 디피싸일(C. difficile) 및/또는 클로스트리디움 퍼프린젠스(C. perfringens) 검출용 프라이머 세트, 조성물, 키트 및 검출 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 F3프라이머, B3프라이머, FIP 프라이머, BIP 프라이머, LF 프라이머 및 LB 프라이머를 포함하는 캠필로박터 콜라이 검출을 위한 프라이머 세트로,
상기 F3 프라이머는 서열번호 1로 표시되고;
상기 B3 프라이머는 서열번호 2로 표시되고;
상기 FIP 프라이머는 서열번호 3으로 표시되고;
상기 BIP 프라이머는 서열번호 4로 표시되고;
상기 LF 프라이머는 서열번호 5로 표시되고; 그리고
상기 LB 프라이머는 서열번호 6으로 표시되는 캠필로박터 콜라이 검출을 위한 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는 조성물, 키트 및 상기 프라이머 세트를 이용하여 시료에서 캠필로박터 콜라이를 검출하는 단계;를 포함하는 캠필로박터 콜라이검출 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 F3프라이머, B3프라이머, FIP 프라이머, BIP 프라이머, LF 프라이머 및 LB 프라이머를 포함하는 캠필로박터 제주니 검출을 위한 프라이머 세트로,
상기 F3 프라이머는 서열번호 7로 표시되고;
상기 B3 프라이머는 서열번호 8로 표시되고;
상기 FIP 프라이머는 서열번호 9로 표시되고;
상기 BIP 프라이머는 서열번호 10으로 표시되고;
상기 LF 프라이머는 서열번호 11로 표시되고; 그리고
상기 LB 프라이머는 서열번호 12로 표시되는 캠필로박터 제주니 검출을 위한 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는 조성물, 키트 및 상기 프라이머 세트를 이용하여 시료에서 캠필로박터 제주니를 검출하는 단계;를 포함하는 캠필로박터 제주니 검출 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 F3프라이머, B3프라이머, FIP 프라이머, BIP 프라이머, LF 프라이머 및 LB 프라이머를 포함하는 클로스트리디움 디피싸일 검출을 위한 프라이머 세트로,
상기 F3 프라이머는 서열번호 13으로 표시되고;
상기 B3 프라이머는 서열번호 14로 표시되고;
상기 FIP 프라이머는 서열번호 15로 표시되고;
상기 BIP 프라이머는 서열번호 16으로 표시되고;
상기 LF 프라이머는 서열번호 17로 표시되고; 그리고
상기 LB 프라이머는 서열번호 18로 표시되는 클로스트리디움 디피싸일 검출을 위한 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는 조성물, 키트 및 상기 프라이머 세트를 이용하여 시료에서 클로스트리디움 디피싸일을 검출하는 단계;를 포함하는 클로스트리디움 디피싸일 검출 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 F3프라이머, B3프라이머, FIP 프라이머, BIP 프라이머, LF 프라이머 및 LB 프라이머를 포함하는 클로스트리디움 퍼프린젠스 검출을 위한 프라이머 세트로,
상기 F3 프라이머는 서열번호 19로 표시되고;
상기 B3 프라이머는 서열번호 20으로 표시되고;
상기 FIP 프라이머는 서열번호 21로 표시되고;
상기 BIP 프라이머는 서열번호 22로 표시되고;
상기 LF 프라이머는 서열번호 23으로 표시되고; 그리고
상기 LB 프라이머는 서열번호 24로 표시되는 클로스트리디움 퍼프린젠스 검출을 위한 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는 조성물, 키트 및 상기 프라이머 세트를 이용하여 시료에서 클로스트리디움 퍼프린젠스를 검출하는 단계;를 포함하는 클로스트리디움 퍼프린젠스 검출 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 캠필로박터 콜라이 검출을 위한 프라이머 세트 및 캠필로박터 제주니 검출을 위한 프라이머 세트를 포함하는 캠필로박터 콜라이 및 캠필로박터 제주니 검출을 위한 프라이머 세트, 상기 캠필로박터 콜라이 및 캠필로박터 제주니 검출을 위한 프라이머 세트를 포함하는 조성물, 키트 및 상기 캠필로박터 콜라이 및 캠필로박터 제주니 검출을 위한 프라이머 세트를 이용하여 시료에서 캠필로박터 콜라이 및 캠필로박터 제주니를 검출하는 단계;를 포함하는 캠필로박터 콜라이 및 캠필로박터 제주니 검출 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 클로스트리디움 디피싸일 검출을 위한 프라이머 세트 및 클로스트리디움 퍼프린젠스 검출을 위한 프라이머 세트를 포함하는 클로스트리디움 디피싸일 및 클로스트리디움 퍼프린젠스 검출을 위한 프라이머 세트, 상기 클로스트리디움 디피싸일 및 클로스트리디움 퍼프린젠스 검출을 위한 프라이머 세트를 포함하는 조성물, 키트 및 상기 클로스트리디움 디피싸일 및 클로스트리디움 퍼프린젠스 검출을 위한 프라이머 세트를 이용하여 시료에서 클로스트리디움 디피싸일 및 클로스트리디움 퍼프린젠스를 검출하는 단계;를 포함하는 클로스트리디움 디피싸일 및 클로스트리디움 퍼프린젠스 검출 방법을 제공한다.
본 발명의 캠필로박터균 및 클로스트리디움균을 등온증폭 방식으로 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머 세트, 이를 포함하는 조성물, 키트 및 이를 이용한 방법은 높은 민감도와 특이성은 물론 신속하게 검체 또는 식품 내 병원체의 오염 여부를 검출할 수 있으며, 또한 필요한 경우 반응 종결 후 전기영동과 같은 별도의 처리 없이 바로 검출 확인이 가능하여 편리성이 증대된다.
도 1은 캠필로박터 콜라이 특이적 프라이머 세트의 특이도를 확인하는 LAMP 결과와 LAMP PCR 전기영동 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 캠필로박터 제주니 특이적 프라이머 세트의 특이도를 확인하는 LAMP 결과와 LAMP PCR 전기영동 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 클로스트리디움 디피싸일 특이적 프라이머 세트의 특이도를 확인하는 LAMP 결과와 LAMP PCR 전기영동 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 클로스트리디움 퍼프린젠스 특이적 프라이머 세트의 특이도를 확인하는 LAMP 결과와 LAMP PCR 전기영동 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 캠필로박터 콜라이 및 캠필로박터 제주니 특이적 프라이머 세트의 특이도를 확인하는 LAMP 결과와 LAMP PCR 전기영동 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 클로스트리디움 디피싸일 및 클로스트리디움 퍼프린젠스 특이적 프라이머 세트의 특이도를 확인하는 LAMP 결과와 LAMP PCR 전기영동 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 캠필로박터 콜라이 특이적 프라이머 세트의 민감도를 확인하고 그 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 캠필로박터 제주니 특이적 프라이머 세트의 민감도를 확인하고 그 결과를 나타낸 도이다.
도 9는 클로스트리디움 디피싸일 특이적 프라이머 세트의 민감도를 확인하고 그 결과를 나타낸 도이다.
도 10은 클로스트리디움 퍼프린젠스 특이적 프라이머 세트의 민감도를 확인하고 그 결과를 나타낸 도이다.
도 11은 캠필로박터 콜라이 및 캠필로박터 제주니 특이적 프라이머 세트의 민감도를 확인하고 그 결과를 나타낸 도이다.
도 12는 클로스트리디움 디피싸일 및 클로스트리디움 퍼프린젠스 특이적 프라이머 세트의 민감도를 확인하고 그 결과를 나타낸 도이다.
본 발명은 LAMP 방식을 이용하여 캠필로박터균 및 클로스트리디움균을 핵산 수준에서 높은 정확도와 민감도로 용이하게 검출할 수 있다는 것에 근거한 것으로 본 발명은 캠필로박터 콜라이(Campylobacter coli), 캠필로박터 제주니(Campylobacter jejuni), 클로스트리디움 디피싸일(Clostridium difficile) 및/또는 클로스트리디움 퍼프린젠스(Clostridium perfringens)를 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머 세트, 이를 포함하는 조성물, 키트 및 상기 프라이머 세트를 이용한 캠필로박터 콜라이, 캠필로박터 제주니, 클로스트리디움 디피싸일 및/또는 클로스트리디움 퍼프린젠스 검출 방법에 관한 것이다.
본 발명은 F3프라이머, B3프라이머, FIP 프라이머, BIP 프라이머, LF 프라이머 및 LB 프라이머를 포함하는 캠필로박터 콜라이 검출을 위한 프라이머 세트로,
상기 F3 프라이머는 서열번호 1로 표시되고;
상기 B3 프라이머는 서열번호 2로 표시되고;
상기 FIP 프라이머는 서열번호 3으로 표시되고;
상기 BIP 프라이머는 서열번호 4로 표시되고;
상기 LF 프라이머는 서열번호 5로 표시되고; 그리고
상기 LB 프라이머는 서열번호 6으로 표시되는 캠필로박터 콜라이 검출을 위한 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명에서 용어 "프라이머"는 단일가닥의 올리고뉴클레오타이드로 폴리머레이즈(중합효소)를 이용한 핵산 증폭 또는 합성 반응에서 그 3' 말단에 뉴클레오타이드가 공유결합에 의해 추가되어 연장되는 핵산 분자를 일컫는 것이다. 본 발명에 따른 프라이머 세트는 핵산의 증폭 즉 LAMP법에 사용되는 것일 수 있다.
본 발명에서 용어 "핵산"은 단일가닥 또는 이중 가닥의 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드로, 하나 이상의 뉴클레오타이드를 포함하는 RNA 또는 DNA 분자 또는 그 유사체 및 그 유도체를 일컫는 것일 수 있다.
본 발명에서 용어 "검출"은 캠필로박터균 또는 클로스트리디움균의 오염 또는 감염 여부를 핵산의 존재여부 또는 존재할 경우 그 양을 분석하는 것으로, 특히 후술하는 LAMP 분석에 기반을 둔 것이다.
본 발명은 특이도가 매우 우수하고, 다양한 야외 분리주의 정확한 검출이 가능한 것을 특징으로 하며, 본 발명의 실시예에서 나타내고 있는 바와 같이 낮은 농도의 균주를 검출해낼 수 있는 높은 민감도를 가진다.
본 발명에 따른 프라이머는 표적 핵산에 상보성을 통해 특이적으로 결합을 하고 LAMP 방식으로 표적 핵산을 증폭한다. LAMP는 등온조건에서 높은 민감도와 특이성으로 표적 핵산을 증폭할 수 있는 핵산 증폭 방법 (Notomi, T.et al. 2000.Loop-Mediated Isothermal Amplification of DNA. Nucleic Acids Res 28, E63)으로 가닥교체(strand displacement) 활성을 갖는 DNA 폴리머레이즈 및 표적 핵산의 여러 부위에서 특이적으로 고안된 최소 4개의 프라이머 세트 (한국 특허 제612551호 등 참고)를 표준 방법으로 하여, 6개의 프라이머 세트를 이용한 방법 (Nagamine, K. et al. 2002. Accelerated reaction by Loop mediated isothermal amplification using loop primers. Mol Cell Probes 16, 223-9 등 참고)을 모두 포함하는 것이다.
상기 LAMP 방식에는 최소 4 종류의 다음과 같은 프라이머가 사용된다: FIP (forward inner primer), BIP (backward inner primer), F3 (forward outer primer) 및 B3 (backward outer primer). 그리고 신속한 반응 (Accelerated LAMP)을 위해서는 LF (Loop F) 및 LB (Loop B)를 추가로 포함하여 총 6개의 프라이머가 사용될 수 있다. 각 F3 프라이머, B3 프라이머, FIP 프라이머, BIP 프라이머, Loop F 프라이머 (LF) 및 Loop B (LB)프라이머의 특징 및 기능에 대하여 앞서 언급한 문헌(Notomi et al., 2000; 및 Nagamine et al.,2002)을 참고할 수 있다.
또한, 본 발명의 프라이머 서열은 검출 가능한 시그널을 직접적 또는 간접적으로 제공할 수 있는 표지를 이용하여 변형시킬 수 있다. 상기 프라이머는 분광학, 광화학, 생화학, 면역화학 또는 화학적 수단을 이용하여 검출될 수 있는 표지를 포함할 수 있다. 유용한 표지는 32P, 형광 염료, 전자 밀집 시약, 효소(일반적으로 ELISA에 이용되는 것), 바이오틴 또는 합텐 및 항혈청 또는 단일클론성 항체가 이용가능한 단백질을 포함한다. 따라서 본 발명의 프라이머는 검출 가능한 표지 물질로 표지된 것일 수 있다.
본 발명의 프라이머들은 적절한 서열의 클로닝 및 제한효소 분해 및 나랭(Narang)등의 포스포트리에스테르 방법(1979, Meth, Enzymol. 68:90-99), 보카지(Beaucage)등의 디에틸포스포라미다이트 방법(1981, Tetrahedron Lett. 22: 1859-1862), 및 미국 특허 제 4458066호의 고형물 지지 방법과 같은 직접적인 화학적 합성법을 포함하는 임의의 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다.
또한 본 발명의 F3, B3, FIP, BIP, LF 및 LB 프라이머는 1:1:8:8:4:4의 몰 농도비로 포함되는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 캠필로박터 콜라이 검출용 조성물 및 키트를 제공한다.
본 발명의 조성물은 상기 프라이머 세트에 추가적으로 완충액(buffer), dNTPs, 마그네슘 및 DNA 중합효소를 더 포함하여 이루어지는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 완충액은 예를 들면 소디움포스페이트 완충액, 포타슘포스페이트 완충액, Tris-HCl 완충액 또는 Tricine 완충액 같은 것이 사용될 수 있다.
또한 반응물에는 dNTP 대신에 뉴클레오타이드 유사체(analog)도 사용될 수 있다. 뉴클레오타이드 유사체는 변형되거나 또는 자연에서 발견되지 않는 것으로 주형 유도된 DNA 합성 과정에서 천연의 뉴클레오타이드와 함께 또는 단독으로 중합될 수 있는 것이다. 이러한 와슨 크릭 베이스 페어링을 통해 중합될 수 있는 유사체로 뉴클레오타이드 베이스의 유사를 포함하는 것은 예를 들면 치환된 퓨린 또는 피리미딘, 데아자퓨린, 메틸퓨린, 메틸피리미딘, 아미노퓨린, 아미노피리미딘, 티오퓨린, 티오피리미딘, 인돌, 피롤, 7-데아자구아닌, 7-메틸구아닌, 하이포잔틴, 쉐도사이토신, 쉐도아이소사이토신, 아이소사이토신, 아이소구아닌, 2-티오피리미딘, 4-티오티민, 6-티오구아닌, 니트로피롤, 니트로인돌 및 4-메틸인돌을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 마그네슘은 마그네슘 아세테이트, 마그네슘 클로라이드 또는 마그네슘 설페이트와 같은 염의 형태로 사용될 수 있다.
본 발명의 키트는 상기 조성물을 동결 건조된 형태로 플라스틱 튜브에 담아 제조될 수 있다. 상기 키트는 조성물 외에, 분석에 사용되는 적절한 시약 및 도구를 더 포함할 수 있으며, 이러한 시약 및 도구로는 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지, 용해제 또는 세정제 등이 포함된다.
상기 적합한 담체로는, 이에 제한되지는 않으나, 가용성 담체, 예를 들어 당 분야에 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액, 예를 들어 PBS, 불용성 담체, 예를 들어 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소 수지, 가교 덱스트란, 폴리사카라이드, 라텍스에 금속을 도금한 자성 미립자와 같은 고분자, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로스 및 이들의 조합일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 이용하여 시료에서 캠필로박터 콜라이를 검출하는 단계;를 포함하는 캠필로박터 콜라이 검출 방법을 제공한다.
본 발명의 검출 방법에 있어서, 상기 시료는 미지의 시료로서 캠필로박터 콜라이를 포함하거나 포함하지 않는 시료일 수 있다.
본 발명의 상기 캠필로박터 콜라이를 검출하는 단계는 LAMP를 통해 이루어질 수 있으며, 상기 LAMP 결과를 통해 색 변화를 관찰하여 시료 내 캠필로박터 콜라이 유무를 파악하는 단계;를 더 포함할 수 있다. 또한 추가적으로 LAMP PCR을 수행하고 전기영동하는 단계;를 더 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 LAMP를 통한 검출 방법은 50 내지 80℃에서 등온 증폭 과정을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 60내지 70℃에서 등온 증폭 과정을 수행할 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 등온 증폭 과정은 15분 내지 1시간 동안 수행될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 20분 내지 40분 동안 수행될 수 있다.
본 발명의 LAMP를 통한 검출 방법은 상기 등온 증폭 과정 이후에 70 내지 100℃에서 반응이 더 수행될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 75 내지 85℃에서 수행될 수 있다. 또한, 상기 반응은 1분 내지 15분 동안 진행될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 3분 내지 10분 동안 진행될 수 있다.
본 발명의 LAMP를 통한 검출 방법에서의 조성 용액은 총 부피 10 내지 100ul 용액에 0.1 내지 0.8uM의 각 F3 및 B3 프라이머, 0.8 내지 4.0uM의 각 FIP 및 BIP 프라이머 및 0.4 내지 2.0uM의 각 LF 및 LB 프라이머가 포함될 수 있으며, 추가적으로 0.1 내지 0.5M betaine, 5 내지 20mM MgSO4, 0.7 내지 7mM dNTPs 및 50 내지 150μM HNB (Sigma)가 포함될 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 추가적으로 상기 조성 용액에는 5 내지 50ul의 2X reaction buffer, 0.5 내지 5ul의 Bst polymerase, 2 내지 20ul의 증류수 및 1 내지 10ul의 template DNA(0.1 내지 0.5ug의 대상 세균 DNA 포함)가 포함될 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
또한 본 발명의 F3, B3, FIP, BIP, LF 및 LB 프라이머는 1:1:8:8:4:4의 몰 농도비로 포함되는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 프라이머 및 이를 포함하는 조성물 또는 키트 및 방법은 감염 또는 오염 여부 검출을 위해 위해 세균의 감염 또는 오염여부가 의심되는 다양한 시료에서 오염, 또는 감염 여부의 스크리닝, 존재 유무 검출 및 정량을 위한 다양한 분석에 유용하게 사용될 수 있다.
본원에 따른 프라이머 세트, 조성물, 키트 또는 방법이 사용될 수 있는 시료는 예를 들면 식품용수, 음용수, 보존식, 섭취식품, 식재료를 포함하는 각종 식품, 사료, 혈액, 소변, 분변, 또는 체액을 포함하는 가검물 또는 상수도, 지하수, 공중시설의 물, 도마, 칼, 행주를 포함하는 조리도구 또는 병원에서 사용하는 각종 장비 또는 장치를 포함하는 환경검체 대하여 실시될 수 있다. 시료를 채취하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들면 균이 오염되었다고 의심되는 시료를 채취한 후, 이를 멸균수 또는 0.85% 생리식염수에 현탁한 후 프로테나제K(Proteinase K)를 처리한 후 펠렛을 회수한 후 열수추출하여 LAMP 반응을 수행할 수 있다. 또한 이러한 생물학적 시료는 검사 직전에 통상의 시료 수득방법에 의해 직접 수득한 것이거나 또는 미리 분리되어 보관된 것일 수 있다. 또 다른 구현예에서 본원에 따른 시료는 상술한 시료로부터 분리된 핵산이 시료로서 사용될 수 있다. 분리란 핵산이 포함되어 있던 시료로부터의 분리된 것으로, 다양한 순도로 분리된 것을 포함하는 것이다.
이하, 캠필로박터 제주니, 클로스트리디움 디피싸일 및 클로스트리디움 퍼프린젠스 검출용 프라이머 세트, 조성물, 키트 및 검출 방법에 대해 설명하며 별도의 기재가 없는 한 캠필로박터 콜라이에서의 설명과 동일하게 적용되고, 명세서 기재 복잡성을 피하기 위해 반복 설명을 생략한다.
또한, 본 발명은 F3프라이머, B3프라이머, FIP 프라이머, BIP 프라이머, LF 프라이머 및 LB 프라이머를 포함하는 캠필로박터 제주니 검출을 위한 프라이머 세트로,
상기 F3 프라이머는 서열번호 7로 표시되고;
상기 B3 프라이머는 서열번호 8로 표시되고;
상기 FIP 프라이머는 서열번호 9로 표시되고;
상기 BIP 프라이머는 서열번호 10으로 표시되고;
상기 LF 프라이머는 서열번호 11로 표시되고; 그리고
상기 LB 프라이머는 서열번호 12로 표시되는 캠필로박터 제주니 검출을 위한 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명은 특이도가 매우 우수하고, 다양한 야외 분리주의 정확한 검출이 가능한 것을 특징으로 하며, 본 발명의 실시예에서 나타내고 있는 바와 같이 낮은 농도의 균주를 검출해낼 수 있는 높은 민감도를 가진다.
또한 본 발명의 F3, B3, FIP, BIP, LF 및 LB 프라이머는 1:1:8:8:4:4의 몰 농도비로 포함되는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 캠필로박터 제주니 검출용 조성물, 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 이용하여 시료에서 캠필로박터 제주니를 검출하는 단계;를 포함하는 캠필로박터 제주니 검출 방법을 제공한다.
본 발명의 검출 방법에 있어서, 상기 시료는 미지의 시료로서 캠필로박터 제주니를 포함하거나 포함하지 않는 시료일 수 있다.
본 발명의 상기 캠필로박터 제주니를 검출하는 단계는 LAMP를 통해 이루어질 수 있으며, 상기 LAMP 결과를 통해 색 변화를 관찰하여 시료 내 캠필로박터 제주니 유무를 파악하는 단계;를 더 포함할 수 있다. 또한 추가적으로 LAMP PCR을 수행하고 전기영동하는 단계;를 더 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 F3프라이머, B3프라이머, FIP 프라이머, BIP 프라이머, LF 프라이머 및 LB 프라이머를 포함하는 클로스트리디움 디피싸일 검출을 위한 프라이머 세트로,
상기 F3 프라이머는 서열번호 13으로 표시되고;
상기 B3 프라이머는 서열번호 14로 표시되고;
상기 FIP 프라이머는 서열번호 15로 표시되고;
상기 BIP 프라이머는 서열번호 16으로 표시되고;
상기 LF 프라이머는 서열번호 17로 표시되고; 그리고
상기 LB 프라이머는 서열번호 18로 표시되는 클로스트리디움 디피싸일 검출을 위한 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명은 특이도가 매우 우수하고, 다양한 야외 분리주의 정확한 검출이 가능한 것을 특징으로 하며, 본 발명의 실시예에서 나타내고 있는 바와 같이 낮은 농도의 균주를 검출해낼 수 있는 높은 민감도를 가진다.
또한 본 발명의 F3, B3, FIP, BIP, LF 및 LB 프라이머는 1:1:8:8:4:4의 몰 농도비로 포함되는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 클로스트리디움 디피싸일 검출용 조성물 및 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 이용하여 클로스트리디움 디피싸일을 검출하는 단계;를 포함하는 클로스트리디움 디피싸일 검출 방법을 제공한다.
본 발명의 검출 방법에 있어서, 상기 시료는 미지의 시료로서 클로스트리디움 디피싸일을 포함하거나 포함하지 않는 시료일 수 있다.
본 발명의 상기 클로스트리디움 디피싸일을 검출하는 단계는 LAMP를 통해 이루어질 수 있으며, 상기 LAMP 결과를 통해 색 변화를 관찰하여 시료 내 클로스트리디움 디피싸일 유무를 파악하는 단계;를 더 포함할 수 있다. 또한 추가적으로 LAMP PCR을 수행하고 전기영동하는 단계;를 더 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 F3프라이머, B3프라이머, FIP 프라이머, BIP 프라이머, LF 프라이머 및 LB 프라이머를 포함하는 클로스트리디움 퍼프린젠스 검출을 위한 프라이머 세트로,
상기 F3 프라이머는 서열번호 19로 표시되고;
상기 B3 프라이머는 서열번호 20으로 표시되고;
상기 FIP 프라이머는 서열번호 21로 표시되고;
상기 BIP 프라이머는 서열번호 22로 표시되고;
상기 LF 프라이머는 서열번호 23으로 표시되고; 그리고
상기 LB 프라이머는 서열번호 24로 표시되는 클로스트리디움 퍼프린젠스 검출을 위한 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명은 특이도가 매우 우수하고, 다양한 야외 분리주의 정확한 검출이 가능한 것을 특징으로 하며, 본 발명의 실시예에서 나타내고 있는 바와 같이 낮은 농도의 균주를 검출해낼 수 있는 높은 민감도를 가진다.
또한 본 발명의 F3, B3, FIP, BIP, LF 및 LB 프라이머는 1:1:8:8:4:4의 몰 농도비로 포함되는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 클로스트리디움 퍼프린젠스 검출용 조성물 및 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 이용하여 시료에서 클로스트리디움 퍼프린젠스를 검출하는 단계;를 포함하는 클로스트리디움 퍼프린젠스 검출 방법을 제공한다.
본 발명의 검출 방법에 있어서, 상기 시료는 미지의 시료로서 클로스트리디움 퍼프린젠스를 포함하거나 포함하지 않는 시료일 수 있다.
본 발명의 상기 클로스트리디움 퍼프린젠스를 검출하는 단계는 LAMP를 통해 이루어질 수 있으며, 상기 LAMP 결과를 통해 색 변화를 관찰하여 시료 내 클로스트리디움 퍼프린젠스 유무를 파악하는 단계;를 더 포함할 수 있다. 또한 추가적으로 LAMP PCR을 수행하고 전기영동하는 단계;를 더 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 캠필로박터 콜라이 검출용 프라이머 세트와 상기 캠필로박터 제주니 검출용 프라이머 세트를 포함하는 캠필로박터 콜라이 및 캠필로박터 제주니 검출용 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명의 상기 캠필로박터 콜라이 및 캠필로박터 제주니 검출용 프라이머 세트는 미지의 시료에 존재하는 캠필로박터 콜라이 및 캠필로박터 제주니를 특이적으로 검출해낼 수 있는 프라이머 세트일 수 있다.
본 발명은 특이도가 매우 우수하고, 다양한 야외 분리주의 정확한 검출이 가능한 것을 특징으로 하며, 본 발명의 실시예에서 나타내고 있는 바와 같이 낮은 농도의 균주를 검출해낼 수 있는 높은 민감도를 가진다.
또한, 본 발명은 상기 캠필로박터 콜라이 및 캠필로박터 제주니 검출용 프라이머 세트를 포함하는 캠필로박터 콜라이 및 캠필로박터 제주니 검출용 조성물 및 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 캠필로박터 콜라이 및 캠필로박터 제주니 검출용 프라이머 세트를 이용하여 시료에서 캠필로박터 콜라이 및 캠필로박터 제주니를 검출하는 단계;를 포함하는 캠필로박터 콜라이 및 캠필로박터 제주니 검출 방법을 제공한다.
본 발명의 검출 방법에 있어서, 상기 시료는 미지의 시료로서 캠필로박터 콜라이 및 캠필로박터 제주니를 포함하거나 포함하지 않는 시료일 수 있다.
본 발명의 상기 캠필로박터 콜라이 및 캠필로박터 제주니를 검출하는 단계는 LAMP를 통해 이루어질 수 있으며, 상기 LAMP 결과를 통해 색 변화를 관찰하여 시료 내 캠필로박터 콜라이 및 캠필로박터 제주니 유무를 파악하는 단계;를 더 포함할 수 있다. 또한 추가적으로 LAMP PCR을 수행하고 전기영동하는 단계;를 더 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 클로스트리디움 디피싸일 검출용 프라이머 세트와 상기 클로스트리디움 퍼프린젠스 검출용 프라이머 세트를 포함하는 클로스트리디움 디피싸일 및 클로스트리디움 퍼프린젠스 검출용 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명의 상기 클로스트리디움 디피싸일 및 클로스트리디움 퍼프린젠스 검출용 프라이머 세트는 미지의 시료에 존재하는 클로스트리디움 디피싸일 및 클로스트리디움 퍼프린젠스를 특이적으로 검출해낼 수 있는 프라이머 세트일 수 있다.
본 발명은 특이도가 매우 우수하고, 다양한 야외 분리주의 정확한 검출이 가능한 것을 특징으로 하며, 본 발명의 실시예에서 나타내고 있는 바와 같이 낮은 농도의 균주를 검출해낼 수 있는 높은 민감도를 가진다.
또한, 본 발명은 상기 클로스트리디움 디피싸일 및 클로스트리디움 퍼프린젠스 검출용 프라이머 세트를 포함하는 클로스트리디움 디피싸일 및 클로스트리디움 퍼프린젠스 검출용 조성물 및 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 클로스트리디움 디피싸일 및 클로스트리디움 퍼프린젠스 검출용 프라이머 세트를 이용하여 시료에서 클로스트리디움 디피싸일 및 클로스트리디움 퍼프린젠스를 검출하는 단계;를 포함하는 클로스트리디움 디피싸일 및 클로스트리디움 퍼프린젠스 검출 방법을 제공한다.
본 발명의 검출 방법에 있어서, 상기 시료는 미지의 시료로서 클로스트리디움 디피싸일 및 클로스트리디움 퍼프린젠스를 포함하거나 포함하지 않는 시료일 수 있다.
본 발명의 상기 클로스트리디움 디피싸일 및 클로스트리디움 퍼프린젠스를 검출하는 단계는 LAMP를 통해 이루어질 수 있으며, 상기 LAMP 결과를 통해 색 변화를 관찰하여 시료 내 클로스트리디움 디피싸일 및 클로스트리디움 퍼프린젠스 유무를 파악하는 단계;를 더 포함할 수 있다. 또한 추가적으로 LAMP PCR을 수행하고 전기영동하는 단계;를 더 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
중복되는 내용은 본 명세서의 복잡성을 고려하여 생략하며, 본 명세서에서 달리 정의되지 않은 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는 것이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 캠필로박터균 및 클로스트리디움균 및 대조균 핵산 추출
반려 동물 주요 혐기성 병원균인 캠필로박터 콜라이(Campylobacter coli), 캠필로박터 제주니(Campylobacter jejuni), 클로스트리디움 디피싸일(Clostridium difficile), 클로스트리디움 퍼프린젠스(Clostridium perfringens)를 검역본부 분리 야외 분리주 및 ATCC로부터 확보하여 핵산을 추출하였다. 또한, 비교실험에 사용한 대장균(E. coli), 엔테로코커스 히라에(E. hirae), 엔테로코커스 페시움(E. faecium), 엔테로코커스 페칼리스(E. faecalis), 폐렴간균(K. pneumoniae), 살모넬라 엔테리티디스(S. Enteritidis), 살모넬라 티피무리움(S. Typhimurium), 스타필로코커스 에피데르미디스(S. epidermidis), 스타필로코커스 아우레우스(S. aureus), 스타필로코커스 스첼리페리(S. schleiferi), 스타필로코커스 주딘테르미디우스(S. pseudintermedius), 스타필로코커스 펠리스(S. felis), 스타필로코커스 와르네리(S. warneri), 아시네토박터 바우마니(A. baumannii)는 여러 균주은행(ATCC, KCTC, KCCM)으로부터 확보하여 핵산을 추출하였다.
실시예 2. 캠필로박터균 및 클로스트리디움 균 특이적 프라이머 설계
캠필로박터균 및 클로스트리디움균의 특정 유전자 염기서열 정보를 NCBI 및 GenBank에서 수득하여 균주에 특이적인 최종 프라이머를 선정하였다.
실시예 2.1 캠필로박터 콜라이 특이적 프라이머 설계
캠필로박터 콜라이의 표적으로 glya(GenBank accession number, AF136494.1) 유전자를 기반으로 내부 프라이머(forward inner prime(FIP) 및 backward inner primer(BIP)), 외부 프라이머(F3 및 B3) 및 루프 프라이머(forward loop primer(LF) 및 backward loop primer (LB))를 설계하였다. 상기 설계한 프라이머 세트는 프라이머 제조업체에 의뢰하여 합성하였으며, 설계한 프라이머 세트의 부위 및 구체적인 서열을 표 1에 나타내었다.
실시예 2.2 캠필로박터 제주니 특이적 프라이머 설계
캠필로박터 제주니의 표적으로 cdta(GenBank accession number, CP023866.1) 유전자를 기반으로 내부 프라이머(forward inner prime(FIP) 및 backward inner primer(BIP)), 외부 프라이머(F3 및 B3) 및 루프 프라이머(forward loop primer(LF) 및 backward loop primer (LB))를 설계하였다. 상기 설계한 프라이머 세트는 프라이머 제조업체에 의뢰하여 합성하였으며, 설계한 프라이머 세트의 부위 및 구체적인 서열을 표 1에 나타내었다.
실시예 2.3 클로스트리디움 디피싸일 특이적 프라이머 설계
콜로스트리디움 디피싸일의 표적으로 metap(GenBank accession number, CP029566.1) 유전자를 기반으로 내부 프라이머(forward inner prime(FIP) 및 backward inner primer(BIP)), 외부 프라이머(F3 및 B3) 및 루프 프라이머(forward loop primer(LF) 및 backward loop primer (LB))를 설계하였다.
상기 설계한 프라이머 세트는 프라이머 제조업체에 의뢰하여 합성하였으며, 설계한 프라이머 세트의 부위 및 구체적인 서열을 표 1에 나타내었다.
실시예 2.4. 클로스트리디움 퍼프린젠스 특이적 프라이머 설계
클로스트리디움 퍼프린젠스의 표적으로 cpa(GenBank accession number, L43547.1) 유전자를 기반으로 내부 프라이머(forward inner prime(FIP) 및 backward inner primer(BIP)), 외부 프라이머(F3 및 B3) 및 루프 프라이머(forward loop primer(LF) 및 backward loop primer (LB))를 설계하였다. 상기 설계한 프라이머 세트는 프라이머 제조업체에 의뢰하여 합성하였으며, 설계한 프라이머 세트의 부위 및 구체적인 서열을 표 1에 나타내었다.
실시예 2.5 캠필로박터균 특이적 프라이머 세트 설계
실시예 2.1에서 설계한 캠필로박터 콜라이 특이적 프라이머 세트와 실시예 2.2에서 설계한 캠필로박터 제주니 특이적 프라이머 세트를 결합하여 캠필로박터균 특이적 프라이머 세트를 설계하였다. 설계한 프라이머 세트의 부위 및 구체적인 서열을 표 1에 나타내었다.
실시예 2.6 클로스트리디움균 특이적 프라이머 세트 설계
실시예 2.3에서 설계한 클로스트리디움 디피싸일 특이적 프라이머 세트와 실시예 2.4에서 설계한클로스트리디움 퍼프린젠스 특이적 프라이머 세트를 결합하여 클로스트리디움균 특이적 프라이머 세트를 설계하였다. 설계한 프라이머 세트의 부위 및 구체적인 서열을 표 1에 나타내었다.
대상세균 Target gene Oligo name Sequence 5'-3' 서열번호
C. coli glya F3 CGAGTGCTTATGCTCGTAT 1
B3 GTCATGATGATACCGCCTC 2
FIP(F1c+F2) CTCACCTGCTACAACAAGTGAGAGATTGCGGATGAAGT 3
BIP(B1c+B2) CATCCAAGTCCATTTCCTCATGGACCACGTAAGGTTTTG 4
LoopF(LF) CCAGCAATGTGTGCAATG 5
LoopB(LB) CATGTAGTAAGCTCTACAACCC 6
C. jejuni cdta F3 TAGCGGTGCTGATTTAGTAC 7
B3 CCCCAAATCCAATTTCCTTG 8
FIP(F1c+F2) GCGAGGATTGATCCCATTACTCCTATTACCCCACCTT 9
BIP(B1c+B2) CCCTGCGGTTTCTGATTTCAAACCGTTAAAGCTGCTC 10
LoopF GTTGGCACTATTGCTTGTTC 11
LoopB TAACCATTTTAGGCCCTAGC 12
C. difficile metap F3 CCATACATTCCCATTGAGCA 13
B3 AGGTCTTGAGGTTGCCAA 14
FIP(F1c+F2) GCTTTCACGAAGACCCTTCGTGAGTTCCTTCATTTACC 15
BIP(B1c+B2) AATCCAACTCCATGACCACGGAGATATAGGTGATGCTGTC 16
LoopF GTTCCTGGGATGATATTCAC 17
LoopB CTCTAACGACAGAGTATCCA 18
C. perfringens cpa F3 TGGTCAAAAGAATATGCAAGAG 19
B3 CATGTAGTCATCTGTTCCA 20
FIP(F1c+F2) GAGAGTTAGCTARAGTTACCTTCTAGCATGAGTCATAGTTGG 21
BIP(F1c+F2) CACGATGTATCAGAGGGTAACCACTAGTTGATATGTAAGCTAC 22
LoopF TGCTGCATAATCCCAATCA 23
LoopB GATCCATCAGTTGGAAAGAATG 24
C. coli &
C. jejuni 		glya F3 CGAGTGCTTATGCTCGTAT 1
B3 GTCATGATGATACCGCCTC 2
FIP(F1c+F2) CTCACCTGCTACAACAAGTGAGAGATTGCGGATGAAGT 3
BIP(B1c+B2) CATCCAAGTCCATTTCCTCATGGACCACGTAAGGTTTTG 4
LoopF CCAGCAATGTGTGCAATG 5
LoopB CATGTAGTAAGCTCTACAACCC 6
cdta F3 TAGCGGTGCTGATTTAGTAC 7
B3 CCCCAAATCCAATTTCCTTG 8
FIP(F1c+F2) GCGAGGATTGATCCCATTACTCCTATTACCCCACCTT 9
BIP(B1c+B2) CCCTGCGGTTTCTGATTTCAAACCGTTAAAGCTGCTC 10
LoopF GTTGGCACTATTGCTTGTTC 11
LoopB TAACCATTTTAGGCCCTAGC 12
C. difficile &
C. perfringens 		metap F3 CCATACATTCCCATTGAGCA 13
B3 AGGTCTTGAGGTTGCCAA 14
FIP(F1c+F2) GCTTTCACGAAGACCCTTCGTGAGTTCCTTCATTTACC 15
BIP(B1c+B2) AATCCAACTCCATGACCACGGAGATATAGGTGATGCTGTC 16
LoopF GTTCCTGGGATGATATTCAC 17
LoopB CTCTAACGACAGAGTATCCA 18
cpa F3 TGGTCAAAAGAATATGCAAGAG 19
B3 CATGTAGTCATCTGTTCCA 20
FIP(F1c+F2) GAGAGTTAGCTARAGTTACCTTCTAGCATGAGTCATAGTTGG 21
BIP(B1c+B2) CACGATGTATCAGAGGGTAACCACTAGTTGATATGTAAGCTAC 22
LoopF TGCTGCATAATCCCAATCA 23
LoopB GATCCATCAGTTGGAAAGAATG 24
실시예 3. LAMP 반응의 특이도 확인
실시예 2에서 설계한 프라이머 세트 조합의 캠필로박터 및 클로스트리디움 균에 대한 특이도를 확인하기 위하여 LAMP를 수행하였고, 반응물의 색 변화와 전기 영동의 결과로 특이도를 확인하였다.
구체적으로 실시예 1에서 확보한 캠필로박터균, 클로스트리디움균 및 기타 14종의 균주들을 표준 방법대로 배양하여 유전체를 추출한 후 각각의 DNA를 20ng/ul로 준비하였다. 이어 LAMP 분석을 위해 총 부피 25ul에서 0.2uM의 각 F3 및 B3 프라이머, 1.6uM의 각 FIP 및 BIP 프라이머, 0.8uM의 각 LF 및 LB 프라이머, 0.4M betaine, 10 mM MgSO4, 1.4 mM dNTPs, 120 μM HNB (Sigma)의 조성을 사용하였으며, 12.5 ul의 2X reaction buffer, 1.0ul의 Bst polymerase, 6.5ul의 증류수, 3ul의 template DNA(0.25ug의 대상 세균 DNA 포함)를 포함하는 조성의 용액을 사용하였다. 상기 조성으로 63℃에서 30분동안 등온 증폭을 실시한 뒤, 80℃에서 5분간 반응시켜 반응을 종료하였다.
특이도를 확인하기 위해 색 분석은 HNB(hydroxy maphthol blue) 염료를 반응액에 넣어 수행하였다. HNB는 Mg2+ 이온 농도의 지시자(indicator)로서 작용한다. Mg2+ 이온이 없을 경우, 하늘색으로 보이며, Mg2+이 있을 경우, 보라색을 띤다. 따라서 반응 전에는 보라색으로 존재하다가, DNA 합성 반응이 일어나면서 Mg2+ 이온 농도가 줄어들고 이에 따라 보라색에서 푸른색으로의 색의 변화가 일어난다. 색의 변화는 핵산이 증폭되었음을 나타내는 양성 반응으로, 나안 또는 약 650nm 파장에서 흡광도를 측정하여 정성 및 정량 분석이 가능하다. 본원에 따른 방법은 신속하고 편리하게 결과를 눈으로 보고 정성 분석을 할 수 있으며, 또한 분광광도계를 이용하여 650nm 파장에서 흡광도를 측정할 경우 정성 및 정량 분석이 가능한 장점이 있다.
실시예 3.1 캠필로박터 콜라이 특이적 프라이머 세트의 특이도 확인
실시예 2.1에서 설계한 캠필로박터 콜라이 특이적 프라이머 세트의 특이도를 확인하고 LAMP 결과와 LAMP PCR 전기영동 결과 및 사용된 균주명을 도 1 및 표 2에 나타내었다.
No. 검역본부 분리 야외분리주 고유번호 및 표준균주명 균종명
1 V14-18-A02-027-003 C. coli
2 V14-18-A02-027-004 C. coli
3 V14-18-A02-027-012 C. coli
4 V16-18-A02-027-001 C. coli
5 V16-18-A02-027-002 C. coli
6 V14-18-S03-027-001 C. coli
7 V14-18-S03-027-003 C. coli
8 V14-18-S03-027-004 C. coli
9 V14-18-S03-027-005 C. coli
10 V14-18-S03-027-008 C. coli
11 ATCC 19438 C. coli
12 ATCC33560 C. jejuni
13 ATCC 25922 E. coli
14 ATCC 9790 E. hirae
15 ATCC 51558 E. faecium
16 ATCC 29212 E. faecalis
17 ATCC9639 C. difficile
18 ATCC 700603 K. pneumoniae
19 ATCC 13076 S. Enteritidis
20 ATCC 14028 S. Typhimurium
21 ATCC 1228 S. epidermidis
22 ATCC 29213 S. aureus
23 ATCC 43808 S. schleiferi
24 ATCC 49051 S. pseudintermedius
25 ATCC 49168 S. felis
26 KCTC 3340 S. warneri
27 KCCM35453 A. baumannii
도 1에 나타낸 바와 같이, 캠필로박터 콜라이 특이적 프라이머 세트는 다른 균주에는 교차 반응을 하지 않으며, 캠필로박터 콜라이만을 특이적으로 검출하는 것을 색 변화 및 전기 영동 결과를 통해 확인하였다. 또한, 10종의 서로 다른 캠필로박터 콜라이 야외 분리주 포함 11종의 캠필로박터 콜라이를 모두 검출하는 것을 확인함으로써, 캠필로박터 콜라이 특이적 프라이머 세트의 특이도를 확인할 수 있다.
실시예 3.2 캠필로박터 제주니 특이적 프라이머 세트의 특이도 확인
실시예 2.2에서 설계한 캠필로박터 제주니 특이적 프라이머 세트의 특이도를 확인하고 LAMP 결과와 LAMP PCR 전기영동 결과 및 사용된 균주명을 도 2 및 표 3에 나타내었다.
No. 검역본부 분리 야외분리주 고유번호 및 표준균주명 균종명
1 V14-18-A01-008-010 C. jejuni
2 V14-18-A01-008-014 C. jejuni
3 V14-18-A01-008-021 C. jejuni
4 V14-18-A01-008-023 C. jejuni
5 V14-18-A01-008-024 C. jejuni
6 V06-18-A03-008-001 C. jejuni
7 V14-18-A03-008-001 C. jejuni
8 V14-18-A03-008-002 C. jejuni
9 V14-18-A03-008-005 C. jejuni
10 V14-18-A03-027-016 C. jejuni
11 ATCC 33560 C. jejuni
12 ATCC19438 C. coli
13 ATCC 25922 E. coli
14 ATCC 9790 E. hirae
15 ATCC 51558 E. faecium
16 ATCC 29212 E. faecalis
17 ATCC9639 C. difficile
18 ATCC 700603 K. pneumoniae
19 ATCC 13076 S. Enteritidis
20 ATCC 14028 S. Typhimurium
21 ATCC 1228 S. epidermidis
22 ATCC 29213 S. aureus
23 ATCC 43808 S. schleiferi
24 ATCC 49051 S. pseudintermedius
25 ATCC 49168 S. felis
26 KCTC 3340 S. warneri
27 KCCM35453 A. baumannii
도 2에 나타낸 바와 같이, 캠필로박터 제주니 특이적 프라이머 세트는 다른 균주에는 교차 반응을 하지 않으며, 캠필로박터 제주니만을 특이적으로 검출하는 것을 색 변화 및 전기 영동 결과를 통해 확인하였다. 또한, 10종의 서로 다른 캠필로박터 제주니 야외 분리주 포함 11종의 캠필로박터 제주니를 모두 검출하는 것을 확인함으로써, 캠필로박터 제주니 특이적 프라이머 세트의 특이도를 확인할 수 있다.
실시예 3.3 클로스트리디움 디피싸일 특이적 프라이머 세트의 특이도 확인
실시예 2.3에서 설계한 클로스트리디움 디피싸일 특이적 프라이머 세트의 특이도를 확인하고 LAMP 결과와 LAMP PCR 전기영동 결과 및 사용된 균주명을 도 3 및 표 4에 나타내었다.
No. 검역본부 분리 야외분리주 고유번호 및 표준균주명 균종명
1 V11-18-E11-016-031 C. difficile
2 V11-18-E11-016-037 C. difficile
3 V11-18-E11-016-038 C. difficile
4 V11-18-E11-016-039 C. difficile
5 V11-18-E11-016-040 C. difficile
6 V11-18-E11-016-042 C. difficile
7 V11-18-E12-016-005 C. difficile
8 V11-18-E12-016-006 C. difficile
9 V11-18-E12-016-007 C. difficile
10 ATCC 9689 C. difficile
11 ATCC 25922 E. coli
12 ATCC 9790 E. hirae
13 ATCC 51558 E. faecium
14 ATCC 29212 E. faecalis
15 ATCC 19438 C. coli
16 ATCC 33560 C. jejuni
17 ATCC 700603 K. pneumoniae
18 ATCC 13076 S. Enteritidis
19 ATCC 14028 S. Typhimurium
20 ATCC 1228 S. epidermidis
21 ATCC 29213 S. aureus
22 ATCC 43808 S. schleiferi
23 ATCC 49051 S. pseudintermedius
24 ATCC 49168 S. felis
25 KCTC 3340 S. warneri
26 야외분리주 C. perfringens
27 KCCM35453 A. baumannii
도 3에 나타낸 바와 같이, 클로스트리디움 디피싸일 특이적 프라이머 세트는 다른 균주에는 교차 반응을 하지 않으며, 클로스트리디움 디피싸일만을 특이적으로 검출하는 것을 색 변화 및 전기 영동 결과를 통해 확인하였다. 또한, 9종의 서로 다른 클로스트리디움 디피싸일 야외 분리주 포함 10종의 클로스트리디움 디피싸일을 모두 검출하는 것을 확인함으로써, 클로스트리디움 디피싸일 특이적 프라이머 세트의 특이도를 확인할 수 있다.
실시예 3.4 클로스트리디움 퍼프린젠스 특이적 프라이머 세트의 특이도 확인
실시예 2.4에서 설계한 클로스트리디움 퍼프린젠스 특이적 프라이머 세트의 특이도를 확인하고 LAMP 결과와 LAMP PCR 전기영동 결과 및 사용된 균주명을 도 4 및 표 5에 나타내었다.
No. 검역본부 분리 야외분리주 고유번호 및 표준균주명 균종명
1 V11-18-E11-016-001 C. perfringens
2 V11-18-E11-016-002 C. perfringens
3 V11-18-E11-016-005 C. perfringens
4 V11-18-E11-016-006 C. perfringens
5 V11-18-E11-016-007 C. perfringens
6 V11-18-E11-016-008 C. perfringens
7 V11-18-E11-016-010 C. perfringens
8 V11-18-E11-016-012 C. perfringens
9 V11-18-E11-016-013 C. perfringens
10 V11-18-E11-016-015 C. perfringens
11 V11-18-E11-016-016 C. perfringens
12 V11-18-E11-016-017 C. perfringens
13 V11-18-E11-016-018 C. perfringens
14 V11-18-E11-016-019 C. perfringens
15 V11-18-E11-016-020 C. perfringens
16 V11-18-E11-016-021 C. perfringens
17 V11-18-E11-016-022 C. perfringens
18 V11-18-E11-016-024 C. perfringens
19 V11-18-E11-016-025 C. perfringens
20 V11-18-E11-016-027 C. perfringens
21 V11-18-E11-016-028 C. perfringens
22 V11-18-E11-016-030 C. perfringens
23 V11-18-E11-016-033 C. perfringens
24 V12-18-E11-016-001 C. perfringens
25 V13-18-E11-016-001 C. perfringens
26 V17-18-E11-016-001 C. perfringens
27 V17-18-E11-016-002 C. perfringens
28 V17-18-E11-016-003 C. perfringens
29 V17-18-E11-016-004 C. perfringens
30 V17-18-E11-016-005 C. perfringens
31 V17-18-E11-016-008 C. perfringens
32 V17-18-E11-016-009 C. perfringens
33 V17-18-E11-016-010 C. perfringens
34 V17-18-E11-016-011 C. perfringens
35 V11-18-E12-016-002 C. perfringens
36 V11-18-E12-016-003 C. perfringens
37 V11-18-E12-016-004 C. perfringens
38 V15-18-E12-016-001 C. perfringens
39 ATCC 9689 C. difficile
40 ATCC 25922 E. coli
41 ATCC 9790 E. hirae
42 ATCC 51558 E. faecium
43 ATCC 29212 E. faecalis
44 ATCC 19438 C. coli
45 ATCC 33560 C. jejuni
46 ATCC 700603 K. pneumoniae
47 ATCC 13076 S. Enteritidis
48 ATCC 14028 S. Typhimurium
49 ATCC 1228 S. epidermidis
50 ATCC 29213 S. aureus
51 ATCC 43808 S. schleiferi
52 ATCC 49051 S. pseudintermedius
53 ATCC 49168 S. felis
54 KCTC 3340 S. warneri
55 KCCM35453 A. baumannii
도 4에 나타낸 바와 같이, 클로스트리디움 퍼프린젠스 특이적 프라이머 세트는 다른 균주에는 교차 반응을 하지 않으며, 클로스트리디움 퍼프린젠스만을 특이적으로 검출하는 것을 색 변화 및 전기 영동 결과를 통해 확인하였다. 또한, 38종의 서로 다른 클로스트리디움 퍼프린젠스 야외 분리주 모두를 검출하는 것을 확인함으로써, 클로스트리디움 퍼프린젠스 특이적 프라이머 세트의 특이도를 확인할 수 있다.
실시예 3.5 캠필로박터균 특이적 프라이머 세트의 특이도 확인
실시예 2.5에서 설계한 캠필로박터 콜라이 특이적 프라이머 세트와 캠필로박터 제주니 특이적 프라이머 세트를 결합하여 설계한 캠필로박터균 특이적 프라이머 세트의 캠필로박터 균에 대한 특이도를 확인하고 LAMP 결과와 LAMP PCR 전기영동 결과 및 사용된 균주명을 도 5 및 표 6에 나타내었다.
No. 검역본부 분리 야외분리주 고유번호 및 표준균주명 균종명
1 V14-18-A02-027-003 C. coli
2 V14-18-A02-027-004 C. coli
3 V14-18-A02-027-012 C. coli
4 V16-18-A02-027-001 C. coli
5 V16-18-A02-027-002 C. coli
6 V14-18-S03-027-001 C. coli
7 V14-18-S03-027-003 C. coli
8 V14-18-S03-027-004 C. coli
9 V14-18-S03-027-005 C. coli
10 V14-18-S03-027-008 C. coli
11 V14-18-A01-008-010 C. jejuni
12 V14-18-A01-008-014 C. jejuni
13 V14-18-A01-008-021 C. jejuni
14 V14-18-A01-008-023 C. jejuni
15 V14-18-A01-008-024 C. jejuni
16 V06-18-A03-008-001 C. jejuni
17 V14-18-A03-008-001 C. jejuni
18 V14-18-A03-008-002 C. jejuni
19 V14-18-A03-008-005 C. jejuni
20 V14-18-A03-027-016 C. jejuni
21 ATCC 19438 C. coli
22 ATCC33560 C .jejuni
23 ATCC 25922 E. coli
24 ATCC 9790 E. hirae
25 ATCC 51558 E. faecium
26 ATCC 29212 E. faecalis
27 ATCC 9639 C. difficile
28 ATCC 700603 K. pneumoniae
29 ATCC 13076 S. Enteritidis
30 ATCC 14028 S. Typhimurium
31 ATCC 1228 S. epidermidis
32 ATCC 29213 S. aureus
33 ATCC 43808 S. schleiferi
34 ATCC 49051 S. pseudintermedius
35 ATCC 49168 S. felis
36 KCTC 3340 S. warneri
37 KCCM35453 A. baumannii
도 5에 나타낸 바와 같이, 캠필로박터 콜라이 특이적 프라이머 세트와 캠필로박터 제주니 특이적 프라이머 세트를 결합하여 설계한 캠필로박터균 특이적 프라이머 세트는 다른 균주에는 교차 반응을 하지 않으며, 캠필로박터 콜라이 및 캠필로박터 제주니만을 특이적으로 검출하는 것을 색 변화 및 전기 영동 결과를 통해 확인하였다. 또한, 10종의 서로 다른 캠필로박터 콜라이 야외 분리주 포함 11종의 캠필로박터 콜라이 및 10종의 서로 다른 캠필로박터 제주니 야외 분리주 포함 11종의 캠필로박터 제주니를 모두 검출하는 것을 확인함으로써, 캠필로박터 콜라이 및 캠필로박터 제주니 특이적 프라이머 세트의 특이도를 확인할 수 있다.
실시예 3.6 클로스트리디움균 특이적 프라이머 세트의 특이도 확인
실시예 2.6에서 설계한 클로스트리디움 디피싸일 특이적 프라이머 세트와 클로스트리디움 퍼프린젠스 특이적 프라이머 세트를 결합하여 설계한 클로스트리디움균 특이적 프라이머 세트의 클로스트리디움균에 대한 특이도를 확인하고 LAMP 결과와 LAMP PCR 전기영동 결과 및 사용된 균주명을 도 6 및 표 7에 나타내었다.
No. 검역본부 분리 야외분리주 고유번호 및 표준균주명 균종명
1 V11-18-E11-016-031 C. difficile
2 V11-18-E11-016-037 C. difficile
3 V11-18-E11-016-038 C. difficile
4 V11-18-E11-016-039 C. difficile
5 V11-18-E11-016-040 C. difficile
6 V11-18-E11-016-042 C. difficile
7 V11-18-E12-016-005 C. difficile
8 V11-18-E12-016-006 C. difficile
9 V11-18-E12-016-007 C. difficile
10 V11-18-E11-016-001 C. perfringens
11 V11-18-E11-016-002 C. perfringens
12 V11-18-E11-016-005 C. perfringens
13 V11-18-E11-016-006 C. perfringens
14 V11-18-E11-016-007 C. perfringens
15 V11-18-E11-016-008 C. perfringens
16 V11-18-E11-016-010 C. perfringens
17 V11-18-E11-016-012 C. perfringens
18 V11-18-E11-016-013 C. perfringens
19 V11-18-E11-016-015 C. perfringens
20 V11-18-E11-016-016 C. perfringens
21 ATCC 9689 C. difficile
22 ATCC 25922 E. coli
23 ATCC 9790 E. hirae
24 ATCC 51558 E. faecium
25 ATCC 29212 E. faecalis
26 ATCC 19438 C. coli
27 ATCC 33560 C. jejuni
28 ATCC 700603 K. pneumoniae
29 ATCC 13076 S. Enteritidis
30 ATCC 14028 S. Typhimurium
31 ATCC 1228 S. epidermidis
32 ATCC 29213 S. aureus
33 ATCC 43808 S. schleiferi
34 ATCC 49051 S. pseudintermedius
35 ATCC 49168 S. felis
36 KCTC 3340 S. warneri
37 KCCM35453 A. baumannii
도 6에 나타낸 바와 같이, 클로스트리디움 디피싸일 특이적 프라이머 세트와 클로스트리디움 퍼프린젠스 특이적 프라이머 세트를 결합하여 설계한 클로스트리디움균 특이적 프라이머 세트는 다른 균주에는 교차 반응을 하지 않으며, 클로스트리디움 디피싸일 및 클로스트리디움 퍼프린젠스만을 특이적으로 검출하는 것을 색 변화 및 전기 영동 결과를 통해 확인하였다. 또한, 9종의 서로 다른 클로스트리디움 디피싸일 야외 분리주 포함 10종의 클로스트리디움 디피싸일 및 11종의 서로 다른 클로스트리디움 퍼프린젠스 야외 분리주 모두를 검출하는 것을 확인함으로써, 클로스트리디움 디피싸일 및 클로스트리디움 퍼프린젠스 특이적 프라이머 세트의 특이도를 확인할 수 있다.
실시예 4. LAMP 반응의 민감도 확인
실시예 2에서 설계한 프라이머 세트 조합의 캠필로박터 및 클로스트리디움 균에 대한 민감도를 확인하였다. 이를 위해 실시예 1에서 준비한 캠필로박터균 및 클로스트리디움 유전체를 실시예 3에서 준비한 반응액에 0.125ug, 0.25ug, 0.5ug, 1ug, 2ug의 양(ug/25uL)으로 첨가하여 반응물의 색 변화와 전기 영동의 결과로 특이도를 확인하였다. 상기 조성으로 63℃에서 30분동안 등온 증폭을 실시한 뒤, 80℃에서 5분간 반응시켜 반응을 종료하였다. 민감도를 확인하기 위하여, 실시예 3에서와 동일한 방법으로 색 분석과 전기 영동을 실시하였다.
실시예 4.1 캠필로박터 콜라이 특이적 프라이머 세트의 민감도 확인
실시예 2.1에서 설계한 캠필로박터 콜라이 특이적 프라이머 세트의 민감도를 확인하기 위하여 상기 방법으로 실험을 수행하였고 그 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타낸 바와 같이, 0.125ug를 포함한 실험군에서는 색 변화가 관찰되지 않았으나, 0.25ug을 포함한 실험군에서는 색 변화가 관찰되었다. 상기 결과를 통해, 캠필로박터 콜라이 특이적 프라이머 세트의 최소 민감도는 0.25ug임을 확인하였다.
실시예 4.2 캠필로박터 제주니 특이적 프라이머 세트의 민감도 확인
실시예 2.2에서 설계한 캠필로박터 제주니 특이적 프라이머 세트의 민감도를 확인하기 위하여 상기 방법으로 실험을 수행하였고 그 결과를 도 8에 나타내었다.
도 8에 나타낸 바와 같이, 0.125ug를 포함한 실험군에서는 색 변화가 관찰되지 않았으나, 0.25ug을 포함한 실험군에서는 색 변화가 관찰되었다. 상기 결과를 통해, 캠필로박터 제주니 특이적 프라이머 세트의 최소 민감도는 0.25ug임을 확인하였다.
실시예 4.3 클로스트리디움 디피싸일 특이적 프라이머 세트의 민감도 확인
실시예 2.3에서 설계한 클로스트리디움 디피싸일 특이적 프라이머 세트의 민감도를 확인하기 위하여 상기 방법으로 실험을 수행하였고 그 결과를 도 9에 나타내었다.
도 9에 나타낸 바와 같이, 0.125ug를 포함한 실험군에서는 색 변화가 관찰되지 않았으나, 0.25ug을 포함한 실험군에서는 색 변화가 관찰되었다. 상기 결과를 통해, 클로스트리디움 디피싸일 특이적 프라이머 세트의 최소 민감도는 0.25ug임을 확인하였다.
실시예 4.4 클로스트리디움 퍼프린젠스 특이적 프라이머 세트의 민감도 확인
실시예 2.4에서 설계한 클로스트리디움 퍼프린젠스 특이적 프라이머 세트의 민감도를 확인하기 위하여 상기 방법으로 실험을 수행하였고 그 결과를 도 10에 나타내었다.
도 10에 나타낸 바와 같이, 0.125ug를 포함한 실험군에서는 색 변화가 관찰되지 않았으나, 0.25ug을 포함한 실험군에서는 색 변화가 관찰되었다. 상기 결과를 통해, 클로스트리디움 퍼프린젠스 특이적 프라이머 세트의 최소 민감도는 0.25ug임을 확인하였다.
실시예 4.5 캠필로박터균 특이적 프라이머 세트의 민감도 확인
실시예 2.5에서 설계한 캠필로박터 콜라이 특이적 프라이머 세트와 캠필로박터 제주니 특이적 프라이머 세트를 결합하여 설계한 캠필로박터균 특이적 프라이머 세트의 캠필로박터 균에 대한 민감도를 확인하기 위하여 상기 방법으로 실험을 수행하였고 그 결과를 도 11에 나타내었다.
도 11에 나타낸 바와 같이, 0.125ug를 포함한 실험군에서는 색 변화가 관찰되지 않았으나, 0.25ug을 포함한 실험군에서는 색 변화가 관찰되었다. 상기 결과를 통해, 캠필로박터균 특이적 프라이머 세트의 최소 민감도는 0.25ug임을 확인하였다.
실시예 4.6 클로스트리디움균 특이적 프라이머 세트의 민감도 확인
실시예 2.6에서 설계한 클로스트리디움 디피싸일 특이적 프라이머 세트와 클로스트리디움 퍼프린젠스 특이적 프라이머 세트를 결합하여 설계한 클로스트리디움균 특이적 프라이머 세트의 클로스트리디움균에 대한 민감도를 확인하기 위하여 상기 방법으로 실험을 수행하였고 그 결과를 도 12에 나타내었다.
도 12에 나타낸 바와 같이, 0.125ug를 포함한 실험군에서는 색 변화가 관찰되지 않았으나, 0.25ug을 포함한 실험군에서는 색 변화가 관찰되었다. 상기 결과를 통해, 클로스트리디움균 특이적 프라이머 세트의 최소 민감도는 0.25ug임을 확인하였다.
<110> REPUBLIC OF KOREA(Animal and Plant Quarantine Agency) <120> A primer sets and detection method for detecting campylobacter strain and clostridium strain <130> 1-104 <160> 24 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F3 primer for C. coli <400> 1 cgagtgctta tgctcgtat 19 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B3 primer for C. coli <400> 2 gtcatgatga taccgcctc 19 <210> 3 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FIP(F1c+F2) primer for C. coli <400> 3 ctcacctgct acaacaagtg agagattgcg gatgaagt 38 <210> 4 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BIP(B1c+B2) primer for C. coli <400> 4 catccaagtc catttcctca tggaccacgt aaggttttg 39 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LoopF(LF) primer for C. coli <400> 5 ccagcaatgt gtgcaatg 18 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LoopB(LB) primer for C. coli <400> 6 catgtagtaa gctctacaac cc 22 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F3 primer for C. jejuni <400> 7 tagcggtgct gatttagtac 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B3 primer for C. jejuni <400> 8 ccccaaatcc aatttccttg 20 <210> 9 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FIP(F1c+F2) primer for C. jejuni <400> 9 gcgaggattg atcccattac tcctattacc ccacctt 37 <210> 10 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BIP(B1c+B2) primer for C. jejuni <400> 10 ccctgcggtt tctgatttca aaccgttaaa gctgctc 37 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LoopF primer for C. jejuni <400> 11 gttggcacta ttgcttgttc 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LoopB primer for C. jejuni <400> 12 taaccatttt aggccctagc 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F3 primer for C. difficile <400> 13 ccatacattc ccattgagca 20 <210> 14 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B3 primer for C. difficile <400> 14 aggtcttgag gttgccaa 18 <210> 15 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FIP(F1c+F2) primer for C. difficile <400> 15 gctttcacga agacccttcg tgagttcctt catttacc 38 <210> 16 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BIP(B1c+B2) primer for C. difficile <400> 16 aatccaactc catgaccacg gagatatagg tgatgctgtc 40 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LoopF primer for C. difficile <400> 17 gttcctggga tgatattcac 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LoopB primer for C. difficile <400> 18 ctctaacgac agagtatcca 20 <210> 19 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F3 primer for C. perfringens <400> 19 tggtcaaaag aatatgcaag ag 22 <210> 20 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B3 primer for C. perfringens <400> 20 catgtagtca tctgttcca 19 <210> 21 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FIP(F1c+F2) primer for C. perfringens <400> 21 gagagttagc taragttacc ttctagcatg agtcatagtt gg 42 <210> 22 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BIP(F1c+F2) primer for C. perfringens <400> 22 cacgatgtat cagagggtaa ccactagttg atatgtaagc tac 43 <210> 23 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LoopF primer for C. perfringens <400> 23 tgctgcataa tcccaatca 19 <210> 24 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LoopB primer for C. perfringens <400> 24 gatccatcag ttggaaagaa tg 22

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  23. 클로스트리디움 디피싸일(C. difficile) 검출을 위한 서열번호 13 내지 18의 염기서열로 구성된 프라이머 세트; 및 클로스트리디움 퍼프린젠스(C. perfringens) 검출을 위한 서열번호 19 내지 24의 염기서열로 구성된 프라이머 세트;를 포함하는,
    클로스트리디움 디피싸일(C. difficile) 및 클로스트리디움 퍼프린젠스(C. perfringens) 2 종의 동시 검출용 프라이머 세트.
  24. 제23항의 프라이머 세트를 포함하는 클로스트리디움 디피싸일(C. difficile) 및 클로스트리디움 퍼프린젠스(C. perfringens) 2 종의 동시 검출용 조성물.
  25. 제23항의 프라이머 세트를 포함하는 클로스트리디움 디피싸일(C. difficile) 및 클로스트리디움 퍼프린젠스(C. perfringens) 2 종의 동시 검출용 키트.
  26. 제23항의 프라이머 세트를 이용하여 시료에서 클로스트리디움 디피싸일(C. difficile) 및 클로스트리디움 퍼프린젠스(C. perfringens)를 검출하는 단계;를 포함하는 클로스트리디움 디피싸일(C. difficile) 및 클로스트리디움 퍼프린젠스(C. perfringens) 2 종의 동시 검출 방법.
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