KR101990163B1

KR101990163B1 - 독소 산생성 클로스트리듐·디피실의 검출 방법

Info

Publication number: KR101990163B1
Application number: KR1020147003107A
Authority: KR
Inventors: 히로유키 구보타; 히로시 마키노; 다카후미 사카이; 에이지 이시카와; 겐지 오이시
Original assignee: 가부시키가이샤 야쿠르트 혼샤
Priority date: 2011-09-01
Filing date: 2012-08-31
Publication date: 2019-06-17
Also published as: CN103764850A; US9388474B2; US20140212879A1; CN103764850B; KR20140054023A; EP2752496B1; WO2013031973A1; EP2752496A1; EP2752496A4; JPWO2013031973A1; JP5961171B2

Abstract

독소 산생성 C. difficile 을 특이적으로 또한 고감도로 검출하는 것을 가능하게 하는 올리고뉴클레오티드, 및 이것을 사용한 독소 산생성 C. difficile 의 검출 방법의 제공.
1) 배열 번호 1 에 나타내는 염기 배열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 및 배열 번호 2 에 나타내는 염기 배열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머 페어, 또는 당해 염기 배열에 대응하는 상보적 배열로 이루어지는 프라이머 페어. 2) 배열 번호 4 에 나타내는 염기 배열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 및 배열 번호 5 에 나타내는 염기 배열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머 페어, 또는 당해 염기 배열에 대응하는 상보적 배열로 이루어지는 프라이머 페어.

Description

독소 산생성 클로스트리듐·디피실의 검출 방법 {METHOD FOR DETECTING TOXIN-PRODUCING CLOSTRIDIUM DIFFICILE}

본 발명은 독소 산생성 클로스트리듐·디피실 (Clostridium difficile) 을 검출하기 위한 올리고뉴클레오티드 및 그것을 사용한 독소 산생성 클로스트리듐·디피실의 검출 방법에 관한 것이다.

클로스트리듐·디피실 (C. difficile) 은 인간에 대하여 병원성인 균체외 독소를 산생하는 아포 형성 그람 양성 간균이다. 본 균에 의해 일으켜지는 C. difficile 관련 설사증 (CDAD) 은 최근 큰 문제가 되고 있다 (비특허문헌 1). 즉, 항생 물질이나 항암제 등의 과잉 사용에 의해 정상적인 장내 세균총이 손상되고, 그 결과 증식한 C. difficile 이 독소 TcdA 및 TcdB 를 산생하여, 설사 등의 증상을 발증한다. C. difficile 은 감염된 사람의 변 중에 나와, 기물이나 손 등을 통하여, 사람의 입이나 점막에 도달하여 감염되는 것이 알려져 있다.

C. difficile 의 병원성은 주로 Large Clostridial Toxin (LCTs) 패밀리에 속하는 2 종류의 독소 TcdA 및 TcdB 에서 기인되는데, C. difficile 의 각 균주는 이들의 독소 산생성의 차이에 의해, TcdA 산생 TcdB 산생형 (A＋B＋), TcdA 비산생 TcdB 산생형 (A－B＋), 및 독소 비산생형 (A－B－) 으로 크게 구별된다. 또, C.difficile 의 독소 산생계는 tcdA 및 tcdB 와, 그들의 조절 인자를 코드하는 tcdC, tcdR, tcdE 로 구성되는 병원성 좌위 (座位) 에 의해 이루어져 있는 것으로 여겨지며, 독소의 산생을 부 (負) 로 제어하는 tcdC 가 결손되면, 독소 TcdA 및 TcdB 산생이 항진되는 것이 보고되어 있다.

따라서, 독소 산생성 C. difficile (A＋B＋ 및 A－B＋) 만을 선택적으로 검출하는 것은 CDAD 등의 C. difficile 감염증 (Clostridium difficile infection : CDI) 의 진단에 있어서 임상상 중요하다.

종래, 독소 산생성 C. difficile 의 검출에 대해서는, 독소 유전자 tcdA 및 tcdB 를 표적으로 한 프라이머가 몇 가지 보고되어 있으며, 이들을 사용하여 분변 (糞便) 추출 DNA 로부터 당해 유전자를 검출할 수 있는 것이 보고되어 있다 (비특허문헌 2 ∼ 4, 특허문헌 1).

그러나, C. difficile 은 정상 인간 장내에 있어서의 균수 레벨이 낮기 때문에, PCR 을 사용하여 분변 중의 독소 산생주를 검출하기 위해서는, 보다 높은 특이성 및 검출 감도의 양방을 가진 검출계의 구축이 필요하고, 이 점에서 아직 충분하다고는 할 수 없었다.

일본 공개특허공보 2003-164282호

Rupnik, M., M. H. Wilcox, and D. N. Gerding., Nat Rev Microbiol. 2009 7 : 526-36 Belanger, S. D., M. Boissinot, N. Clairoux, F. J. Picard, and M. G. Bergeron., J Clin Microbiol. 2003 41 : 730-4 Houser, B. A., A. L. Hattel, and B. M. Jayarao., Foodborne Pathog Dis. 2010 7 : 719-26. Sloan, L. M., B. J. Duresko, D. R. Gustafson, and J. E. Rosenblatt., J Clin Microbiol. 2008 46 : 1996-2001

본 발명은 독소 산생성 C. difficile 을 특이적으로 또한 고감도로 검출하는 것을 가능하게 하는 올리고뉴클레오티드, 및 이것을 사용한 독소 산생성 C. difficile 의 검출 방법을 제공하는 것에 관한 것이다.

본 발명자들은, 상기 과제를 감안하여, 20 균주의 tcdA 유전자 배열, 22 균주의 tcdB 유전자 배열, 나아가서는 Clostridium sordelii 의 독소 유전자인 tcsL, Clostridium novyi 의 독소 유전자인 tcnA, Clostridium perfringens 의 독소 유전자인 tcpL 의 염기 배열을 함께 얼라이먼트하고, 설계한 특정의 올리고뉴클레오티드를 사용하여 tcdA 유전자 및 tcdB 유전자를 증폭·측정함으로써, 독소 산생성의 C. difficile 을 특이적으로 또한 우수한 감도로 검출할 수 있음을 알아냈다.

본 발명은 이하의 1) ∼ 10) 에 관련된 것이다.

1) 배열 번호 1 에 나타내는 염기 배열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 및 배열 번호 2 에 나타내는 염기 배열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머 페어, 또는 당해 염기 배열에 대응하는 상보적 배열로 이루어지는 프라이머 페어.

2) 배열 번호 3 에 나타내는 염기 배열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 프로브, 또는 당해 염기 배열에 대응하는 상보적 배열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 프로브.

3) 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 형광 물질이 결합하고, 3' 말단에 퀀처 물질이 결합한 상기 2) 의 올리고뉴클레오티드 프로브.

4) 상기 1) 의 프라이머 페어와 상기 3) 의 올리고뉴클레오티드 프로브를 구비하는 리얼타임 PCR 용의 올리고뉴클레오티드 세트.

5) 배열 번호 4 에 나타내는 염기 배열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 및 배열 번호 5 에 나타내는 염기 배열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머 페어, 또는 당해 염기 배열에 대응하는 상보적 배열로 이루어지는 프라이머 페어.

6) 배열 번호 6 에 나타내는 염기 배열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 프로브, 또는 당해 염기 배열에 대응하는 상보적 배열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 프로브.

7) 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 형광 물질이 결합하고, 3' 말단에 퀀처 물질이 결합한 상기 6) 의 올리고뉴클레오티드 프로브.

8) 상기 5) 의 프라이머 페어와 상기 7) 의 올리고뉴클레오티드 프로브를 구비하는 리얼타임 PCR 용의 올리고뉴클레오티드 세트.

9) 인간 분변으로부터 추출한 DNA 를 주형으로 하고, 상기 4) 및/또는 8) 의 올리고뉴클레오티드 세트를 사용하여 각각 PCR 을 실시하는 공정과, 형광을 측정함으로써 증폭 산물을 측정하는 공정을 포함하는 독소 산생성 C. difficile 의 검출 방법.

10) 인간 분변으로부터 추출한 DNA 를 주형으로 하고, 상기 4) 및/또는 8) 의 올리고뉴클레오티드 세트, 그리고 이하에 나타내는 (a) 의 프라이머 페어 또는 (a) 의 프라이머 페어와 (b) 의 올리고뉴클레오티드 프로브를 구비하는 리얼타임 PCR 용의 올리고뉴클레오티드 세트를 사용하여 각각 PCR 을 실시하는 공정과, 형광을 측정함으로써 증폭 산물을 측정하는 공정을 포함하는 인간 분변 중의 C. difficile 에 있어서의 독소 산생성 C. difficile 및/또는 독소 비산생성 C. difficile 의 존재 비율의 산출 방법.

(a) 배열 번호 7 에 나타내는 염기 배열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 및 배열 번호 8 에 나타내는 염기 배열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머 페어, 또는 당해 염기 배열에 대응하는 상보적 배열로 이루어지는 프라이머 페어.

(b) 배열 번호 9 에 나타내는 염기 배열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 프로브, 또는 당해 염기 배열에 대응하는 상보적 배열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 프로브로서, 당해 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 형광 물질이 결합하고, 3' 말단에 퀀처 물질이 결합한 올리고뉴클레오티드 프로브.

본 발명의 올리고뉴클레오티드 및 독소 산생성 C. difficile 의 검출 방법에 의하면, 특이적으로 또한 고감도로 분변 중의 독소 산생성 C. difficile 을 검출할 수 있다. 따라서, 본 발명에 의하면, 독소 산생성 C. difficile 의 감염증의 진단을 간이하게 또한 정확하게 실시하는 것이 가능해지고, 또 정상 성인의 분변 중에 있어서의 독소 산생성 C. difficile 주의 검출 빈도를 용이하게 조사할 수 있다. 또, 아울러 C. difficile 의 총 균수를 측정함으로써, 분변 중의 C. difficile 에 대해, 독소 산생성 C. difficile 혹은 독소 비산생성 C. difficile 의 존재 비율을 산출할 수 있다.

도 1 은 TaqMan PCR 법에 있어서의 표적균에 대한 반응성 (A : tcdA-F/R/P, B : tcdB-F/R/P) 이다.
도 2 는 TaqMan PCR 법에 있어서의 분변 중의 표적균의 검출 감도 (A : tcdA-F/R/P, B : tcdB-F/R/P) 이다.

본 발명의 프라이머 페어에는, (1) tcdA 유전자를 증폭시키기 위한 프라이머 페어와, (2) tcdB 유전자를 증폭시키기 위한 프라이머 페어가 포함된다.

(1) tcdA 유전자를 증폭시키기 위한 프라이머 페어는 배열 번호 1 에 나타내는 염기 배열 (5'-CAGTCGGATTGCAAGTAATTGACAAT-3' (tcdA-F)) 로 이루어지는 올리고뉴클레오티드인 제 1 프라이머와, 배열 번호 2 에 나타내는 염기 배열 (5'-AGTAGTATCTACTACCATTAACAGTCTGC-3' (tcdA-R)) 로 이루어지는 올리고뉴클레오티드인 제 2 프라이머로 이루어진다. 제 1 프라이머는 PCR (폴리메라아제 연쇄 반응) 등의 핵산 증폭 반응에 있어서 포워드 프라이머로서 사용할 수 있고, 제 2 프라이머는 핵산 증폭 반응에 있어서 제 1 프라이머와 조합하는 리버스 프라이머로서 사용할 수 있다.

C. difficile 의 각 균주는 TcdA 산생 TcdB 산생형 (A＋B＋), TcdA 비산생 TcdB 산생형 (A－B＋), 및 독소 비산생형 (A－B－) 으로 크게 구별되는데, tcdA 독소 유전자의 유무와 TcdA 독소 산생의 유무는 반드시 일치하지 않는 것이 밝혀졌다. 종래 공지된 tcdA 유전자를 증폭시키기 위한 프라이머를 사용한 경우에는, A＋B＋ 형 주뿐만 아니라, A－B＋ 형 주도 검출되는 경우가 많아, 당해 방법에서는 TcdA 독소 산생균만을 검출할 수 없다 (실시예 2 (3) 참조). 이에 반하여, 본 발명의 제 1 및 제 2 프라이머로 이루어지는 프라이머 페어를 사용한 경우에는, 표 3 에 나타내는 바와 같이 A＋B＋ 형 주에 있어서의 tcdA 만이 증폭되고, A－B＋ 형 주에 있어서의 tcdA 는 증폭되지 않는다. 즉, 본 발명의 tcdA 유전자를 증폭시키기 위한 프라이머 페어를 사용한 경우에는, TcdA 독소 산생성 C. difficile, 즉 A＋B＋ 형 주만을 확실하게 검출할 수 있다 (실시예 2 (2) 및 (3) 참조).

(2) tcdB 유전자를 증폭시키기 위한 프라이머 페어는 배열 번호 4 에 나타내는 염기 배열 (5'-TACAAACAGGTGTATTTAGTACAGAAGATGGA-3' (tcdB-F)) 로 이루어지는 프라이머인 제 3 프라이머와, 배열 번호 5 에 나타내는 염기 배열 (5'-CACCTATTTGATTTAGMCCTTTAAAAGC-3' (tcdB-R)) 로 이루어지는 프라이머인 제 4 프라이머로 이루어진다. 제 3 프라이머는 핵산 증폭 반응에 있어서 포워드 프라이머로서 사용할 수 있고, 제 4 프라이머는 핵산 증폭 반응에 있어서 제 3 프라이머와 조합하는 리버스 프라이머로서 사용할 수 있다.

당해 프라이머 페어를 사용함으로써, tcdB 유전자를 확실하게 증폭시킬 수 있고, TcdB 독소 산생성 C. difficile, 즉 A＋B＋ 형 주 및 A－B＋ 형 주를 확실하게 검출할 수 있다 (표 3).

본 발명의 올리고뉴클레오티드 프로브에는, (1) tcdA 유전자에 특이적으로 하이브리다이즈되는 프로브와, (2) tcdB 유전자에 특이적으로 하이브리다이즈되는 프로브가 포함된다.

(1) tcdA 유전자에 특이적으로 하이브리다이즈되는 프로브는 배열 번호 3 에 나타내는 염기 배열 (5'-TTGAGATGATAGCAGTGTCAGGATTG-3' (tcdA-P)) 로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 (제 1 프로브) 로, 상기 제 1 및 제 2 프라이머로 이루어지는 프라이머 페어에 의한 증폭 범위에 특이적으로 결합하는 것이다. 또, (2) tcdB 유전자에 특이적으로 하이브리다이즈되는 프로브는 배열 번호 6 에 나타내는 염기 배열 (5'-TTTKCCAGTAAAATCAATTGCTTC-3' (tcdB-P)) 로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 (제 2 프로브) 로, 상기 제 3 및 제 4 프라이머로 이루어지는 프라이머 페어에 의한 증폭 범위에 특이적으로 결합하는 것이다.

이러한 올리고뉴클레오티드 프로브는 5' 말단측을 FAM (carboxyfluorescein), TET (tetrachlorocarboxyfluorescein) 등의 형광 물질, 3' 말단을 TAMRA (carboxytetramethylrhodamine), BHQ-1 (black hole quencher-1) 등의 퀀처 물질로 수식함으로써, 예를 들어 리얼타임 PCR 을 실시하기 위한 수식 올리고뉴클레오티드 (소위 Taqman 프로브) 로서 사용할 수 있다.

즉, 수식된 제 1 프로브는, 상기 제 1 및 제 2 프라이머로 이루어지는 프라이머 페어와 함께, tcdA 유전자를 리얼타임 PCR 에 의해 증폭·측정하기 위한 올리고뉴클레오티드 세트로서, 수식된 제 2 프로브는, 상기 제 3 및 제 4 프라이머로 이루어지는 프라이머 페어와 함께, tcdB 유전자를 리얼타임 PCR 에 의해 증폭·측정하기 위한 올리고뉴클레오티드 세트로서 사용할 수 있다.

본 발명의 올리고뉴클레오티드는, 상기 배열 번호 1 ∼ 6 에 나타내는 염기 배열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 외에, 당해 각 염기 배열에 대응하는 상보적 배열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드가 포함된다. 즉, 배열 번호 1 및 배열 번호 2 에 나타내는 염기 배열에 대응하는 상보적 배열로 이루어지는 프라이머 페어, 배열 번호 3 에 나타내는 염기 배열에 대응하는 상보적 배열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 프로브, 배열 번호 4 및 배열 번호 5 에 나타내는 염기 배열에 대응하는 상보적 배열로 이루어지는 프라이머 페어, 배열 번호 6 에 나타내는 염기 배열에 대응하는 상보적 배열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 프로브가 포함된다.

또, 배열 번호 1 ∼ 6 에 나타내는 염기 배열이나 당해 염기 배열에 대응하는 상보적 배열에 있어서 1 혹은 2 개의 염기가 결실, 치환, 부가 또는 삽입된 염기 배열로 이루어지고, 배열 번호 1 ∼ 6 에 나타내는 염기 배열 또는 그 상보적 배열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드와 각각 프라이머 또는 프로브로서 동등한 기능을 갖는 올리고뉴클레오티드는 본 발명의 올리고뉴클레오티드와 동등하게 취급된다.

본 발명의 올리고뉴클레오티드는 공지된 화학 합성법에 의해 용이하게 제조할 수 있다.

본 발명의 상기 각 프라이머 페어, 바람직하게는 상기 각 올리고뉴클레오티드 프로브를 함께 사용하고, 인간 분변으로부터 추출한 DNA 를 주형으로 하여 핵산 증폭 반응을 실시하고, 그 증폭 산물을 측정함으로써, TcdA 독소 산생성 C. difficile 및 TcdB 독소 산생성 C. difficile 을 각각 검출할 수 있다.

여기서, 당해 검출에는, C. difficile 의 유무 판정 및 C. difficile 의 정량이 포함된다. 또한, 정량에는 균수의 정량이 포함된다.

본 발명의 상기 각 프라이머 페어, 바람직하게는 상기 각 올리고뉴클레오티드 프로브를 함께 사용함으로써, 분변 중에 있어서의 TcdA 독소 산생성 C. difficile 및 TcdB 독소 산생성 C. difficile 의 균수를 측정할 수 있는데, 이들과 C. difficile 특이적인 프라이머나 프로브를 조합하고, C. difficile 의 총 균수를 함께 측정함으로써, 분변 중 (장내) 에 있어서의 C. difficile 의 내역, 즉 C. difficile 의 총 균수 (A＋B＋ 형, A－B＋ 형 및 A－B－ 형의 균수의 총합) 에 대한, 독소 산생성 C. difficile (A＋B＋ 형의 균수, A－B＋ 형의 균수 또는 A＋B＋ 형 및 A－B＋ 형의 균수의 총합), 또는 독소 비산생성 C. difficile (A－B－ 형의 균수) 의 존재 비율을 산출할 수 있다.

이러한 C. difficile 에 특이적인 프라이머, 프로브로는, 이하에 나타내는 (a) 의 프라이머 페어 또는 (a) 의 프라이머 페어와 (b) 의 올리고뉴클레오티드 프로브를 구비하는 리얼타임 PCR 용의 올리고뉴클레오티드 세트를 들 수 있다.

여기서, (a) 의 프라이머 페어는 배열 번호 7 에 나타내는 염기 배열 (5'-GCAAGTTGAGCGATTTACTTCGGT-3' (CD16SrRNA-F)) 로 이루어지는 올리고뉴클레오티드인 제 5 프라이머와, 배열 번호 8 에 나타내는 염기 배열 (5'-GTACTGGCTCACCTTTGATATTYAAGAG-3' (CD16SrRNA-R)) 로 이루어지는 올리고뉴클레오티드인 제 6 프라이머로 이루어진다. 제 5 프라이머는 핵산 증폭 반응에 있어서 포워드 프라이머로서 사용할 수 있고, 제 6 프라이머는 핵산 증폭 반응에 있어서 제 5 프라이머와 조합하는 리버스 프라이머로서 사용할 수 있다.

(b) 의 올리고뉴클레오티드 프로브는 배열 번호 9 에 나타내는 염기 배열 (5'-TGCCTCTCAAATATATTATCCCGTATTAG-3' (CD16SrRNA-P)) 로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 (제 3 프로브) 로, 상기 제 5 및 제 6 프라이머로 이루어지는 프라이머 페어에 의한 증폭 범위에 특이적으로 결합하는 것이다. 이러한 올리고뉴클레오티드 프로브는, 5' 말단측을 FAM, TET 등의 형광 물질, 3' 말단을 TAMRA, BHQ-1 등의 퀀처 물질로 수식함으로써, 예를 들어 리얼타임 PCR 을 실시하기 위한 수식 올리고뉴클레오티드 (소위 Taqman 프로브) 로서 사용할 수 있다.

또한, 배열 번호 7 ∼ 9 에 나타내는 염기 배열이나 당해 염기 배열에 대응하는 상보적 배열에 있어서 1 혹은 2 개의 염기가 결실, 치환, 부가 또는 삽입된 염기 배열로 이루어지고, 배열 번호 7 ∼ 9 에 나타내는 염기 배열 또는 그 상보적 배열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드와 각각 프라이머 또는 프로브로서 동등한 기능을 갖는 올리고뉴클레오티드는 상기 (a) 및 (b) 의 올리고뉴클레오티드와 동등하게 취급된다.

미생물의 존재 또는 존재량 등을 조사하는 피검체로는, 예를 들어, 결막 면봉, 치석, 치구 (齒垢), 객담 (喀痰), 인후 면봉, 타액, 콧물, 폐포 세정액, 흉수, 위액, 위 세정액, 뇨, 자궁경관 점액, 질 분비물, 피부 병소 (病巢), 분변, 혈액, 복수, 조직, 수액 (髓液), 관절액, 환부 면봉 등의 생태 유래 시료, 식품, 의약품, 화장품, 식품·의약품·화장품의 중간 처리물, 미생물 배양액, 식물, 토양, 활성 오니, 배수와 같은 미생물을 함유할 가능성이 있는 대상을 들 수 있다. 피검체 유래의 시료로는, 피검체의 미생물의 존재 또는 존재량을 반영할 수 있는 시료이면 특별히 한정되지 않으며, 예를 들어, 피검체에 함유되는 뉴클레오티드를 함유하는 혼합물이나 DNA 를 함유하는 혼합물을 들 수 있는데, PCR 법에 사용한다는 관점에서는, 피검체에 함유되는 DNA 를 함유하는 혼합물이 바람직하다.

인간 분변으로부터의 DNA 의 추출은 종래의 게놈 DNA의 조제의 경우와 동일한 수법에 의해 실시할 수 있는데, 예를 들어, 피검체의 전부 또는 일부로부터, 필요에 따라, 추출·분리·정제 방법에 의해 전처리를 실시한 후, 적절히 공지된 방법에 의해 취득할 수 있다. 필요에 따라, 여과, 원심 분리, 크로마토그래피 등의 공지된 방법에 의한 전처리를 실시한 후, 예를 들어,「유리 비즈 등의 존재하에서 교반하는 물리적 파쇄법」,「CTAB 법」,「페놀클로로포름법 (PC 법)」,「자기 비즈법」,「실리카 칼럼법」등의 범용법, 혹은 이들을 조합한 수법을 사용한 추출에 의해 얻을 수 있고, 또 시판되는 키트를 사용하여 실시할 수도 있다.

PCR 에 의한 높은 검출 감도를 얻기 위해서는, 고농도의 DNA 를 취득하는 것이 바람직하고, 한편으로, 분변으로부터의 핵산 추출액 중에는 PCR 을 저해하는 물질이 혼재하기 때문에, 이들 저해 물질을 가능한 한 제거한 고순도의 DNA 를 취득하는 것이 바람직하다. 이 목적을 위해, 특히 고농도 또한 고순도의 DNA 를 추출할 수 있는 FastDNA SPIN Kit for Feces (MP Biomedicals) 를 사용하는 것이 바람직하다.

핵산 증폭법으로는, 특별히 한정되지 않지만, PCR 법의 원리를 이용한 공지된 방법을 들 수 있다. 예를 들어, PCR 법, LAMP (Loop-mediated isothermal AMPlification) 법, ICAN (Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids) 법, RCA (Rolling Circle Amplification) 법, LCR (Ligase Chain Reaction) 법, SDA (Strand Displacement Amplification) 법 등을 들 수 있다.

또, 핵산 증폭 반응 후의 증폭 산물의 검출에는, 증폭 산물을 특이적으로 인식할 수 있는 공지된 수단을 사용할 수 있다. 예를 들어, 증폭 반응의 과정에서 도입되는 dNTP 에, 방사성 동위체, 형광 물질, 발광 물질 등의 표지체를 작용시켜, 이 표지체를 검출할 수 있다. 표지한 dNTP 를 도입한 증폭 산물을 관찰하는 방법으로는, 상기 서술한 표지체를 검출하기 위한 당 기술 분야에서 공지된 방법이면 어느 방법이어도 된다. 예를 들어, 표지체로서 방사성 동위체를 사용한 경우에는, 방사 활성을, 예를 들어 액체 신틸레이션 카운터, γ-카운터 등에 의해 계측할 수 있다. 또 표지체로서 형광을 사용한 경우에는, 그 형광을 형광 현미경, 형광 플레이트 리더 등을 사용하여 검출할 수 있다.

본 발명에 있어서는, 핵산 증폭법으로서, PCR 의 증폭량을 리얼타임으로 모니터하여 해석하는 리얼타임 PCR 을 사용하는 것이 신속성과 정량성의 면에서 바람직하다. 또, 리얼타임 PCR 로는, 당 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 방법, 예를 들어 TaqMan 프로브법, 인터칼레이터법 및 사이클링 프로브법 등을 들 수 있는데, 본 발명에 있어서는, TaqMan 프로브법을 사용하는 것이 특히 바람직하다.

TaqMan 프로브법은 5' 말단을 형광 물질 (FAM 등) 로, 3' 말단을 퀀처 물질 (TAMRA 등) 로 수식한 올리고뉴클레오티드 (TaqMan 프로브) 를 PCR 반응계에 첨가하는 방법이다.

본 발명에 있어서는, 상기와 같이, 수식된 제 1 프로브와 제 2 프로브를 TaqMan 프로브로서 사용할 수 있으며, 이것은 PCR 반응의 어닐링 단계에서 주형 DNA 에 특이적으로 하이브리다이즈되는데, 프로브 상에 퀀처 물질이 존재하기 때문에, 여기광을 조사해도 형광의 발생은 억제된다. 신장 반응 단계일 때, Taq DNA 폴리메라아제가 갖는 5' → 3' 엑소뉴클리아제 활성에 의해, 주형에 하이브리다이즈된 TaqMan 프로브가 분해되면, 형광 물질이 프로브로부터 유리되고, 퀀처 물질에 의한 억제가 해제되어 형광을 발한다.

PCR 의 조건은 특별히 한정되지 않으며, PCR 장치마다 최적 조건을 정하면 되는데, 예를 들어, 이하의 조건을 들 수 있다.

1) 2 개 사슬 DNA 의 1 개 사슬 DNA 로의 열 변성 : 통상적으로 93 ∼ 95 ℃ 정도에서, 통상적으로 10 초간 ∼ 1 분간 정도 가열한다.

2) 어닐링 : 통상적으로 50 ∼ 60 ℃ 정도에서, 통상적으로 10 초간 ∼ 1 분간 정도 가열한다.

3) DNA 신장 반응 : 통상적으로 70 ∼ 74 ℃ 정도에서, 통상적으로 30 초간 ∼ 5 분간 정도 가열한다.

여기서, 어닐링과 DNA 신장 반응은 나누지 않고 동시에 실시할 수도 있다.

상기 1) ∼ 3) 의 반응을, 통상적으로 30 ∼ 50 사이클 정도 실시함으로써, 목적으로 하는 tcdA 유전자 및 tcdB 유전자를 검출 가능할 정도로 증폭시킬 수 있다.

또, 상기 Taqman 프로브의 반응액 중의 농도는 감도의 면에서 100 ∼ 1000 nM 정도가 바람직하다.

또, 2 개 사슬 DNA 에 결합함으로써 형광을 발하는 시약 (형광 인터칼레이터) 을 PCR 반응계에 첨가하는 인터칼레이터법을 사용하는 경우에는, 형광 인터칼레이터로서, 예를 들어, SYBR GreenⅠ, SYBR GreenⅡ, SYBR Gold, 옥사졸 옐로우, 티아졸 오렌지, 에티듐브로마이드, 피코그린 등의 공지된 시약의 존재하에서 PCR 을 실시하고, 표적 배열의 증폭에 수반하여 증가하는 형광 강도를 측정하면 된다.

리얼타임 PCR 은 서멀 사이클러와 분광 형광 광도계를 일체화한 리얼타임 PCR 전용의 장치, 예를 들어, ABI PRISM 7900HT sequence detection system (Applied Biosystems) 을 사용하여 실시할 수 있다.

DNA 량의 측정은, 먼저, 농도 기지의 표준 DNA 용액을 단계 희석시킨 것을 PCR 에 공시 (供試) 하고, 이 초발 (初發) 의 DNA 량을 횡축에, 그것을 주형으로 한 PCR 의 증폭 산물량이 일정량에 도달할 때의 사이클수 (threshold cycle ; Ct 값) 를 종축에 플롯하여, 검량선을 작성한다. 미지 농도의 시료에 대해서도, 동일한 조건하에서 반응을 실시하여 Ct 값을 구하고, 이 값과 검량선으로부터, 시료 중의 목적으로 하는 DNA 량을 구함으로써 실시할 수 있다.

또, 균수의 정량은, 검량선 작성용으로 공시한 DNA 량에 상당하는 균수값을 산출함으로써, DNA 량의 측정과 동일한 순서로 실시할 수 있다. 먼저, 표준 DNA 용액의 조제에 사용하는 균주의 순배양 균액 중의 균수를 측정하고, 이들 기지 균수로부터 DNA 의 추출을 실시함으로써, 추출 후의 DNA 용액 (표준 DNA 용액) 에 함유되는 DNA 량에 상당하는 균수값을 얻을 수 있다. 따라서, PCR 에 공시한 초발의 DNA 량에 상당하는 균수값을 산출할 수 있기 때문에, 횡축을 균수값으로 환산한 검량선을 작성함으로써, 미지 농도의 시료 중에 함유되는 목적 미생물의 균수값을 동일하게 산출할 수 있다.

이렇게 하여,「목적 미생물의 DNA 량」또는「목적 미생물의 (DNA 량에 상당하는) 균수」가 기지의 표준 DNA 용액과 미지 농도의 DNA 시료를 사용하여, PCR 을 실시하고, 일정한 PCR 증폭 산물량에 도달하였을 때의「PCR 사이클수」(Ct 값) 의 대비를 실시하면, 농도 미지 시료 중의「목적 미생물의 DNA 량」또는「목적 미생물의 균수」를 구할 수 있다. 또한, 이러한 대비에 있어서는, PCR 의 주형으로 하는「목적 미생물의 균수」와「Ct 값」의 상관 관계를 나타내는 검량선을 사용하는 것이 간편성의 면에서 바람직하다. 이러한 검량선은 목적 미생물의 균수를 횡축에, Ct 값을 종축에 플롯하여 작성되는 것이 통상적이다. 검량선 작성시에 사용하는 미생물은 기준주 등의 공지 균주를 사용해도 된다.

또, 피검체 중에 있어서의 목적 미생물 DNA 량은, 예를 들어, 목적 미생물 DNA 에 특이적으로 하이브리다이즈될 수 있는 핵산 단편과 피검체 시료의 하이브리다이즈 효율의 지득에 의해서도 구할 수 있다.

이렇게 하여, 본 발명의 방법에 의하면, TcdA 독소 산생성 C. difficile 및 TcdB 독소 산생성 C. difficile 을 특이적으로 검출할 수 있고 (실시예 2), 또 분변 1 g 당 10³ 개 이상의 C. difficile 이 존재하고 있으면 그 DNA 를 검출할 수 있고 (실시예 3), 고감도의 검출이 가능하다.

또한, C. difficile 에 특이적인 프라이머 세트, 올리고뉴클레오티드 프로브를 조합하여 사용하고, C. difficile 의 총 균수를 측정함으로써, 분변 중 (장내) 에 있어서의 C. difficile 의 내역 (총 균수에 대한 독소 산생성 및 독소 비산생성 C. difficile 의 존재 비율) 을 정확하게 파악할 수 있어, C. difficile 감염증의 진단, 임상 연구 등에 공헌할 수 있다.

실시예

실시예 1 독소 산생성 C. difficile 의 검출

[Ⅰ] 재료 및 방법

(A) 사용 균주 및 배양 조건

C. difficile DSM 1296T 는 Deutsche Sammlung von Mikroorganizmen und Zellkulturen GmbH (DSMZ, Germany) 로부터, ATCC 43255, 43596, 43598, 700057 은 American Type Culture Collection (USA) 으로부터, NTCT 13307, 13366 은 Health Protection Agency (UK) 로부터, CCUG20309, 37780, 37785 는 Culture Collection University of Goteborg (Sweden) 로부터 각각 구입하였다. C. difficile 이외의 Clostridium 속 균종은 전부 DSMZ 로부터 구입하였다.

모든 균주는, 1 ％ 글루코오스 첨가 변법 GAM 배지 (닛스이 제약) 를 사용하여, 혐기 조건하, 37 ℃ 에서 24 시간 배양하였다. 균액 중의 균수 측정은 DAPI 염색법에 의해 실시하였다.

(B) TaqMan PCR 반응

ABI7900HT 시스템을 사용하여, TaqMan PCR 을 실시하였다. PCR 에는 Takara ExTaq Hot Start Version (Takara) 및 Ampdirect plus (shimadzu) 를 사용하였다. 반응액 조성은 2 × Ampdirect plus, 프라이머 F/R 0.2 μM, TaqMan 프로브 0.2 μM, Rox Reference Dye, ExTaq DNA polymerase 0.4 Units 및 주형 DNA 용액 5 ㎕ 이고, total 20 ㎕ 로 하였다. 95 ℃, 30 초간 Taq 효소를 활성화한 후, 95 ℃, 5 초, 56 ℃, 50 초를 50 사이클 실시하였다.

(C) DNA 추출용 분변 샘플의 조제

RNAlater 를 사용하여 조제한 10 ％ 분변 현탁액 (w/v) 2 ㎖ (200 ㎎ 분변을 함유한다) 를 원심 분리하고, 상청 1 ㎖ 를 제거하였다. 인산 완충 생리 식염수 (PBS (－)) 1 ㎖ 를 첨가하고 vortex 로 교반한 후, 원심 분리된 전체 상청을 디캔테이션으로 제거하였다. PBS (－) 1 ㎖ 를 첨가하고 vortex 로 교반한 후, 원심 분리된 전체 상청을 제거하였다. 얻어진 분변 펠릿은 DNA 추출에 사용할 때까지 －80 ℃ 에서 보존하였다.

(D) DNA 의 추출

배양균액으로부터의 DNA 추출은 마츠키 등의 방법 (Matsuki, T., K. Watanabe, J. Fujimoto, Y. Kado, T. Takada, K. Matsumoto, and R. Tanaka. 2004. Quantitative PCR with 16S rRNA-gene-targeted species-specific primers for analysis of human intestinal bifidobacteria. Appl. Environ. Microbiol. 70 : 167-173) 에 따라 실시하였다.

분변 펠릿으로부터의 DNA 추출은 FastDNA SPIN Kit for Feces (MP Biomedicals) 를 사용하였다. 추출법의 상세를 이하에 나타낸다.

200 ㎎ 분변 펠릿이 들어 있는 2.0 ㎖ tube 에 Lysing Matrix E, Sodium phosphate buffer 825 ㎕ 및 Pre-lysis solution 275 ㎕ 를 첨가하고, vortex 로 10 - 15 s 교반하였다. 14,000 × g 으로 5 min 원심 분리한 상청을 제거하고, Sodium phosphate buffer 978 ㎕ 및 MT buffer 122 ㎕ 를 첨가하여 교반하였다. FastPrep level 6.0 으로 45 s 격렬하게 진탕하고, 14,000 × g 으로 15 min 원심 분리하였다. 상청을 새로운 2.0 ㎖ tube 에 회수하고, Protein precipitate solution 250 ㎕ 를 첨가하고, 격렬하게 진탕하여 혼화하였다. 4 ℃ 에서 10 min 가만히 정지시킨 후, 14,000 × g 으로 2 min 원심 분리한 상청을 15 ㎖ tube 에 회수하였다. Binding matrix solution 1 ㎖ 를 첨가하여 조용하게 혼화한 후, 실온에서 5 min 인큐베이트하였다. 14,000 × g 으로 2 min 원심 분리한 상청을 제거한 후, Wash buffer-1 을 1 ㎖ 첨가하고, 피펫팅에 의해 펠릿을 조용하게 재현탁시켰다. 현탁액 약 600 ㎕ 를 SPIN filter tube 에 옮기고, 14,000 × g 으로 1 min 원심 분리한 플로우 스루를 제거하였다. 나머지 현탁액을 다시 SPIN filter tube 에 옮기고, 14,000 × g 으로 1 min 원심 분리한 플로우 스루를 제거하였다. Wash buffer-2 를 0.5 ㎖ 첨가하고, 필터 상의 매트릭스를 피펫팅에 의해 조용하게 재현탁시킨 후, 14,000 × g 으로 2 min 원심 분리한 플로우 스루를 제거하였다. 다시 14,000 × g 으로 2 min 원심 분리하고, 필터를 새로운 1.9 ㎖ catch tube 에 옮겼다. TES 100 ㎕ 를 첨가하고, 가볍게 태핑하여 매트릭스를 현탁시키고, 14,000 × g 으로 2 min 원심 분리한 플로우 스루를 회수하였다.

[Ⅱ] 프라이머 및 프로브의 설계

C. difficile 의 독소 유전자 tcdA 및 tcdB 를 표적으로 하여, 각각에 특이적인 프라이머 및 프로브를 이하의 순서로 설계하였다. 데이터베이스로부터 취득한 20 균주의 tcdA 유전자 배열 (*1) 및 22 균주의 tcdB 유전자 배열 (*2) 을 사용하여, Clustal X 에 의한 상동성 검색 (얼라이먼트) 을 실시하였다. TcdA 및 TcdB 는 Large Clostridial Toxin (LCTs) 으로 분류되며, 일부의 Clostridium 속 세균이 산생되는 LCTs 와 높은 상동성을 갖는다. 그 때문에, 대조로서 Clostridium sordelii 의 tcsL [X82638], Clostridium novyi 의 tcnA [Z48636], Clostridium perfringens 의 tcpL [AB262081] 의 유전자 배열을 함께 얼라이먼트에 사용하였다. 얼라이먼트의 결과, 표적 독소 유전자와 그 밖의 유전자의 상동성이 높고, 또 tcdA 및 tcdB 는 양자의 염기 배열 사이에서 약 60 ％ 의 상동성이 있었던 점에서, 프라이머 작성용 소프트웨어에서는 tcdA 및 tcdB 각각의 표적 독소 유전자에 대한 특이적인 염기 배열을 알아낼 수 없었다. 그래서, 얼라이먼트 결과를 육안으로 확인하고, 시행 착오하여, 표적 유전자에 특이적이고 또한 균주 사이에서 보존성이 높은 것으로 생각되는 영역을 선택하여, 프라이머 및 프로브를 설계하였다 (표 1).

*1 tcdA 유전자의 GenBank accession no. : M30307, NC_009089, NC_013316, NC_013315, AJ011301, NZ_ADVM01000023, NZ_ABHF02000018, NZ_ABHE02000016, NZ_ABFD02000006, NZ_ABHD02000008, NZ_ABHG02000011, NZ_ABKK02000013, NZ_AAML04000007, NZ_ABKL02000008, FN668941, FN668375, FN665652, FN665653, FN665654, Y12616, AJ132669

*2 tcdB 유전자의 GenBank accession no. : M30307, Z23277, AJ011301, NC_009089, NC_013316, NC_013315, AF217292, NZ_ABHF02000018, NZ_ADVM01000023, NZ_ADNX01000011, NZ_ABHE02000016, NZ_ABHD02000008, NZ_ABFD02000006, NZ_ABKL02000008, NZ_ABKK02000013, NZ_ABHG02000011, NZ_AAML04000007, FN668941, FN668375, FN665652, FN665653, FN665654

[Ⅲ] 프라이머 및 프로브의 특이성

(1) C. difficile 균주의 독소 산생성의 확인

이뮤노크로마토법을 이용한 독소 검출 키트 Keul-o-test Clostridium difficile Complete (BioGenTechnologies) 를 사용하여, C. difficile 10 균주의 독소 산생성을 조사하였다.

BHI 액체 배지를 사용하여, 각 균주를 혐기 조건하, 37 ℃ 에서 4 일간 배양하였다. 배양 상청을 키트의 프로토콜에 따라 공시하고, TcdA 및 TcdB 의 독소 산생을 특이적인 밴드의 유무에 의해 판정하였다. 그 결과, 하기 표 2 에 나타내는 바와 같이, 모두 독소 산생성을 나타냄이 확인되었다.

(2) TaqMan PCR 법에 있어서의 특이성 (1)

C. difficile 10 균주 (A＋B＋ 형 5 균주, A－B＋ 형 2 균주, A－B－ 형 3 균주), Clostridium 속 10 균종, 및 장내균 12 균종을 사용하여, 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트 (tcdA-F/R/P 및 tcdB-F/R/P) 의 특이성을 조사하였다. 순배양 균체로부터 추출한 DNA 용액을 사용하여 반응당 10⁵ 개 상당량을 공시하고, 상기 (B) 의 조건으로 TaqMan PCR 을 실시하여, 증폭 시그널의 유무를 확인하였다. 결과를 표 3 에 나타낸다.

표 3 으로부터, DSM 1296^T 주에서는 tcdA 와 tcdB 의 양방의 증폭 시그널이 검출되었고, 독소 산생성과 일치하였다. 동일하게, 그 밖의 균주에 있어서도, 독소 산생성에 일치한 증폭 시그널이 확인되었다. 한편, 비표적 균주에 있어서는 시그널이 전혀 검출되지 않았고, 프라이머 다이머의 시그널도 전혀 확인되지 않았다.

(3) 프라이머 및 프로브의 특이성 (2)

상기 특허문헌 1 에 기재된 프라이머 세트 (J) 중, tcdA 를 증폭시키기 위한 프라이머 (배열 39/40) 와 본원 발명의 상기 프라이머 tcdA-F/R/P 의 특이성을 비교하였다.

즉, C. difficile 10 균주 (A＋B＋ 형 5 균주, A－B＋ 형 2 균주, A－B－ 형 3 균주) 에 대한, 특허문헌 1 의 프라이머 세트 (배열 39/40) 의 반응성을 조사하였다. 순배양 균체로부터 추출한 DNA 용액을 사용하여 반응당 10⁵ 개 상당량을 PCR 에 공시하였다. PCR 에는 HotStartTaq DNA polymerase (주식회사 퀴아젠) 를 사용하고, 반응액 조성은 10 × PCR buffer, 프라이머 F/R 0.4 μM, dNTP 0.25 mM each, Rox Reference Dye, SYBR Green Ⅰ, Taq DNA polymerase 0.25 Units 및 주형 DNA 용액 5 ㎕ 이고, total 20 ㎕ 로 하였다. 94 ℃ 에서 20 초, 50 ℃ 에서 30 초, 74 ℃ 에서 40 초를 45 사이클의 반응 조건으로 PCR 을 실시하고, 얻어진 Ct 값이 표준 균주 (DSM 1296T) 의 Ct 값 ± 3.3 의 범위 내이면 "＋", 45 이상이면 "－" 로 판정하였다.

상기 (2) 에서 얻어진 tcdA-F/R/P 의 반응성에 대해서도, 동일한 판정 기준으로 평가하였다. 이들 결과를 표 4 에 나타낸다.

특허문헌 1 의 프라이머 세트 (J) (배열 39/40) 에 대해서는, A＋B＋ 주에 추가하여, A－B＋ 주에서도 증폭이 확인된 반면, 본 발명의 tcdA-F/R/P 에서는 A－B＋ 주에서는 증폭되지 않고, A＋B＋ 주만을 확실하게 증폭시킬 수 있음이 나타났다.

다음으로, 표적 균주 사이에서 반응성에 차이가 없음을 확인하기 위해, 각 표적 균주의 검량선을 각각 작성하여 비교하였다. 그 결과, 모두 공시한 표적 균주를 Ct 값 2 이내 (균수로 환산하여 4 배 이내) 의 차이로 검출 가능하였다 (도 1). 이들 결과로부터, 본 발명의 방법은 표적의 독소를 산생하는 균주만을 특이적으로 또한 정확하게 검출할 수 있음이 나타났다.

실시예 2 독소 산생성 C. difficile 의 검출 (첨가 회수 시험)

분변 중의 독소 산생성 C. difficile 의 검출 하한값을 검증하기 위해, 내재성의 C. difficile 이 검출되지 않은 3 명의 분변 샘플을 사용하여, 첨가 회수 시험을 실시하였다.

미리 내재성의 C. difficile 이 존재하지 않음을 확인한 정상 성인 3 명의 분변 샘플을 선택하고, TcdA 및 TcdB 의 양방을 산생하는 C. difficile DSM 1296^T 주의 순배양 균체를 분변 중에 1 g 당 10⁸, 10⁷, 10⁶, 10⁵, 10⁴, 10³ 개가 되도록 첨가하였다. 또한, 첨가 균수는 DAPI 카운트의 측정 균수에 기초하여 조정하였다.

상기 (C) 및 (D) 의 방법에 따라 DNA 추출을 실시하고, 추출 DNA 원액 및 2 배 희석액 5 ㎕ 를 각각 사용하여, 상기 (B) 의 조건으로 TaqMan PCR 을 실시하였다. 검량선 작성용의 스탠다드로서, PBS (－) 10 ㎖ 당 10⁸ 개 (분변 1 g 당 10⁸ 개에 대응) 가 되도록 첨가하고, 분변 샘플과 동일하게 추출하였다. 추출된 스탠다드 DNA 를 10⁵ 배까지 10 배 계열 희석시킨 합계 6 포인트의 DNA 용액 5 ㎕ 를 PCR 에 공시하여 검량선을 작성하고, 분변 첨가 샘플의 균수 산출에 사용하였다.

그 결과, tcdA-F/R/P 및 tcdB-F/R/P 어느 것과 관련해서도, 분변 1 g 당 10³ 개를 검출 가능하였다 (도 2). 이와 같이 본 발명의 방법에 의하면, 세균 DNA 를 표적으로 하여 고감도의 검출이 가능하고, 독소 산생성 C. difficile 을 특이적으로 또한 고감도 (검출 하한값 : 분변 1 g 당 10³ 개) 로 정량할 수 있다.

실시예 3 장내에 내재균으로서 서식하는 균주의 검출

[Ⅰ] 재료 및 방법

(1) CD16SrRNA-F/R/P 의 제조

C.difficile 총 균수를 측정하기 위한 프라이머 세트 CD16SrRNA-F 및 CD16SrRNA-R 을 제조하고, 또한 그 증폭 범위에 새로 프로브를 설계한 TaqMan 프로브 CD16SrRNA-P 를 설계하였다 (표 5).

(2) 분변 DNA 샘플

일본의 고령자 시설 입주자 및 직원 102 명으로부터 채취한 분변 중, 선택 배양법에 의해 C. difficile 의 분리가 확인된 16 검체의 분변 DNA 를 본 해석에 사용하였다.

(3) 선택 배양법

동결 변을 융해 후, 9 배 용량의 혐기 수송 배지에 현탁하였다. 이것을 등량의 98 ％ 에탄올과 혼화하고, 실온에서 30 분간 인큐베이트하였다. 에탄올 처리액 0.1 ㎖ 를 Cycloserine cefoxin mannitol agar (CCMA) 에 도말하고, 본 배지를 37 ℃ 에서 24 시간 혐기 배양하였다. 배지 상에 검출된 콜로니에 대해, 성상 및 그람 염색성으로부터 C. difficile 로 추정되는 것의 수를 계측하였다.

(4) DNA 추출법

2 ㎖ 스크루 캡 튜브 중의 검량선용 균액 200 ㎕ 또는 대변 10 배 희석액에 0.3 g 의 유리 비즈 (φ0.1 ㎜), 300 ㎕ 의 Tris-SDS 용액 (250 ㎖ 의 200 mM Tris-HCl, 80 mM EDTA, pH 9.0 과 50 ㎖ 의 10 ％ SDS 를 혼합하여 조정한다), 500 ㎕ 의 Tris-EDTA buffer Saturated Phenol 을 첨가한다.

샘플이 들어 있는 튜브를 진탕 파쇄기 (FastPrep FP120) 에 세트한다. 파워 레벨 5.0 으로 30 초간 격렬하게 진탕하여, 균체를 파쇄한다. 튜브를 꺼내어 15,000 rpm 으로 5 분간 원심 분리한다.

상청 400 ㎕ 를 새로운 2 ㎖ 스크루 캡에 옮긴다. 400 ㎕ 의 Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (25 : 24 : 1) 을 첨가하고, FastPrep FP120 에 세트한다. 파워 레벨 4.0 으로 45 초 격렬하게 진탕하고, 15,000 rpm 으로 5 분간 원심 분리한다.

새로운 1.5 ㎖ 튜브에 250 ㎕ 의 상청을 옮긴다. 25 ㎕ 의 3M 아세트산 Na (pH 5.4) 를 첨가하여 혼합한다.

300 ㎕ 의 Isopropanol 을 첨가한다. 15,000 rpm 으로 5 분간 원심 분리한다. 상청을 디캔테이션으로 제거한다. 500 ㎕ 의 70 ％ Ethanol 을 첨가하고 (교반하지 않고 그대로) 다시 15,000 rpm 으로 5 분간 원심 분리한다. 상청을 디캔테이션으로 제거한다.

덮개를 떼어내고 60 ℃ 의 히트 블록 인큐베이터로 약 30 분간 가온하면서 건조시킨다. Tris-EDTA buffer 를 첨가하고, 교반하여 균일하게 용해시킨다. －30 ℃ 에서 동결 보존한다.

(5) TaqMan PCR 반응

실시예 1 [Ⅰ] (B) 와 동일한 방법으로 실시하였다.

[Ⅱ] 결과

16 검체 중, 8 검체로부터 독소 산생주가 검출되었다 (표 6). 이들 8 검체 중, 7 검체에서는, TapMan PCR 법에 의한 C. difficile 의 총 균수 (CD16SrRNA-F/R/P), TcdA 산생성 C. difficile 의 균수 (tcdA-F/R/P), 및 TcdB 산생성 C. difficile 의 균수 (tcdB-F/R/P) 가 동등하였던 점에서, 장내에 A＋B＋ 형의 독소 산생주가 우세하게 존재하고 있음을 알 수 있다.

독소 산생주가 검출된 8 검체 중 1 검체 (S-09) 에서는, C. difficile 의 총 균수가 독소 산생성 C. difficile 의 균수보다 대수값으로 1.5 이상으로 대폭 높았던 점에서, 독소 비산생성 C. difficile 이 최우세 (장내에서 가장 우세하게 존재한다) 인 것으로 판별할 수 있는 것 외에, 최우세하지 않은 독소 산생성 C. difficile 도 검출할 수 있음을 알 수 있었다.

즉, CD16SrRNA-F/R/P, tcdA-F/R/P 및 tcdB-F/R/P 를 조합하여 사용함으로써, TaqMan PCR 법에 의해, C. difficile 의 총 균수 (A＋B＋ 형, A－B＋ 형 및 A－B－ 형의 균수의 총합), TcdA 산생성 C. difficile (A＋B＋ 형) 의 균수, 및 TcdB 산생성 C. difficile 의 균수 (A＋B＋ 형 및 A－B＋ 형의 균수의 총합) 를 측정할 수 있기 때문에, 분변 중 (장내) 에 있어서의 C. difficile 의 내역 (총 균수, 총 균수에 대한 독소 산생성 및 독소 비산생성 C. difficile 의 비율) 을 정확하게 파악 할 수 있어, C. difficile 감염증의 진단, 임상 연구 등에 공헌할 수 있다.

SEQUENCE LISTING <110> KABUSHIKI KAISHA YAKULT HONSHA <120> METHOD FOR DETECTION OF TOXIGENIC CLOSTRIDIUM DIFFICILE <130> YK0071 <150> JP 2011-190706 <151> 2011-09-01 <160> 9 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence specific to tcdA gene(tcdA-F) <400> 1 cagtcggatt gcaagtaatt gacaat 26 <210> 2 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence specific to tcdA gene(tcdA-R) <400> 2 agtagtatct actaccatta acagtctgc 29 <210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe sequence specific to tcdA gene(tcdA-P) <400> 3 ttgagatgat agcagtgtca ggattg 26 <210> 4 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence specific to tcdB gene(tcdB-F) <400> 4 tacaaacagg tgtatttagt acagaagatg ga 32 <210> 5 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence specific to tcdB gene(tcdB-R) <400> 5 cacctatttg atttagmcct ttaaaagc 28 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe sequence specific to tcdB gene(tcdB-P) <400> 6 tttkccagta aaatcaattg cttc 24 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe sequence specific to c.difficile(CD16SrRNA-F) <400> 7 gcaagttgag cgatttactt cggt 24 <210> 8 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe sequence specific to c.difficile(CD16SrRNA-R) <400> 8 gtactggctc acctttgata ttyaagag 28 <210> 9 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe sequence specific to c.difficile(CD16SrRNA-P) <400> 9 tgcctctcaa atatattatc ccgtattag 29

Claims

배열 번호 1 에 나타내는 염기 배열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 및 배열 번호 2 에 나타내는 염기 배열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머 페어, 또는 당해 염기 배열에 대응하는 상보적 배열로 이루어지는 프라이머 페어.
배열 번호 3 에 나타내는 염기 배열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 프로브, 또는 당해 염기 배열에 대응하는 상보적 배열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 프로브.
제 2 항에 있어서,
올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 형광 물질이 결합하고, 3' 말단에 퀀처 물질이 결합한 올리고뉴클레오티드 프로브.
제 1 항에 기재된 프라이머 페어와 제 3 항에 기재된 올리고뉴클레오티드 프로브를 구비하는 리얼타임 PCR 용의 올리고뉴클레오티드 세트.
인간 분변으로부터 추출한 DNA 를 주형으로 하고, 제 4 항에 기재된 올리고뉴클레오티드 세트를 사용하여 PCR 을 실시하는 공정과, 형광을 측정함으로써 증폭 산물을 측정하는 공정을 포함하는 독소 산생성 C. difficile 의 검출 방법.
인간 분변으로부터 추출한 DNA 를 주형으로 하고, 제 4 항에 기재된 올리고뉴클레오티드 세트, 그리고 이하에 나타내는 (a) 의 프라이머 페어 또는 (a) 의 프라이머 페어와 (b) 의 올리고뉴클레오티드 프로브를 구비하는 리얼타임 PCR 용의 올리고뉴클레오티드 세트를 사용하여 PCR 을 실시하는 공정과, 형광을 측정함으로써 증폭 산물을 측정하는 공정을 포함하는 인간 분변 중의 C. difficile 에 있어서의 독소 산생성 C. difficile 및/또는 독소 비산생성 C. difficile 의 존재 비율의 산출 방법.
(a) 배열 번호 7 에 나타내는 염기 배열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 및 배열 번호 8 에 나타내는 염기 배열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머 페어, 또는 당해 염기 배열에 대응하는 상보적 배열로 이루어지는 프라이머 페어.
(b) 배열 번호 9 에 나타내는 염기 배열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 프로브, 또는 당해 염기 배열에 대응하는 상보적 배열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 프로브로서, 당해 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 형광 물질이 결합하고, 3' 말단에 퀀처 물질이 결합한 올리고뉴클레오티드 프로브.
제 5 항에 있어서, 이하의 (i) 의 프라이머 페어와 (ii) 의 올리고뉴클레오티드 프로브를 구비하는 리얼타임 PCR 용의 올리고뉴클레오티드 세트를 사용하여 PCR 을 실시하는 공정을 추가로 포함하는 방법.
(i) 배열 번호 4 에 나타내는 염기 배열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 및 배열 번호 5 에 나타내는 염기 배열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머 페어, 또는 당해 염기 배열에 대응하는 상보적 배열로 이루어지는 프라이머 페어.
(ii) 배열 번호 6 에 나타내는 염기 배열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 프로브, 또는 당해 염기 배열에 대응하는 상보적 배열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 프로브로서, 당해 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 형광 물질이 결합하고, 3' 말단에 퀀처 물질이 결합한 올리고뉴클레오티드 프로브.
제 6 항에 있어서, 이하의 (i) 의 프라이머 페어와 (ii) 의 올리고뉴클레오티드 프로브를 구비하는 리얼타임 PCR 용의 올리고뉴클레오티드 세트를 사용하여 PCR 을 실시하는 공정을 추가로 포함하는 방법.
(i) 배열 번호 4 에 나타내는 염기 배열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 및 배열 번호 5 에 나타내는 염기 배열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머 페어, 또는 당해 염기 배열에 대응하는 상보적 배열로 이루어지는 프라이머 페어.
(ii) 배열 번호 6 에 나타내는 염기 배열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 프로브, 또는 당해 염기 배열에 대응하는 상보적 배열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 프로브로서, 당해 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 형광 물질이 결합하고, 3' 말단에 퀀처 물질이 결합한 올리고뉴클레오티드 프로브.
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