CN111534610A - 用于检测产毒酿脓链球菌的荧光定量pcr方法及相应的试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于检测产毒酿脓链球菌的荧光定量PCR方法及相应的试剂盒。本发明巧妙的应用了特异性的基因检测区分酿脓链球菌属与其它链球菌属，以及产毒和非产毒的链球菌属，通过综合判断，得出准确的菌属信息。本发明与现有的主流检测试剂盒相比，本发明用于检测产毒酿脓链球菌的试剂盒具有灵敏度高、快捷方便、特异型好、判断严谨准确等优势，具有良好的应用前景和市场价值。
Description
技术领域
本发明属于分子检测技术领域，具体涉及一种通过特异性基因对产毒酿脓链球菌进行荧光定量PCR检测的方法和相应的检测试剂盒。
背景技术
酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)，又被称为A群链球菌(Group Astreptococcus，GAS)，为β溶血、对杆菌肽敏感、PYR阳性，具有兰氏A群抗原，在血平板上形成大菌落。酿脓链球菌镜下呈球形或卵圆形，直径约0.5～1.0μm，呈链状排列，链长短不一，在液体培养基中易形成长链。本菌无芽孢，无鞭毛。多数菌株在培养早期(2～4小时)形成透明质酸荚膜。酿脓链球菌易被普通的碱性染料着色，自病灶新分离株为革兰染色阳性，老龄菌或被吞噬后的细菌可转成革兰阴性，通过染色镜检不易区分鉴定本菌。
酿脓链球菌是人体重要致病菌之一，从轻度浅表皮肤感染到危及生命的全身性疾病。感染通常始于咽喉或皮肤。最引人注目的标志是草莓般的皮疹。轻度化脓性链球菌感染的实例包括咽炎(链球菌性咽喉炎)和局部皮肤感染(脓疱病)。丹毒和蜂窝织炎的特征在于化脓性链球菌在皮肤深层的增殖和侧向扩散。化脓性链球菌在筋膜中的侵袭和增殖可导致坏死性筋膜炎。据统计，全球每年发生7亿人次A群链球菌感染。
目前，针对酿脓链球菌的鉴别诊断，已建立了很多检测方法，其中涂片染色镜检、血平板培养、生理生化检测、兰氏血清学试验已广泛应用，但仍然存在耗时、灵敏度低等问题。近年来，随着高通量基因组测序技术广泛应用，越来越多的酿脓链球菌菌株得到了全基因组测序，基因组长度范围为1.8～1.9Mbp。丰富的基因组数据为分子诊断技术锁定酿脓链球菌特异性序列提供了参考数据库。当前，分子生物学技术正以其高灵敏度、高特异性、实验周期短、易操作等优势逐步应用于酿脓链球菌的诊断检测。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种用于检测产毒酿脓链球菌的荧光定量PCR方法。
具体地，上述方法包括如下步骤：
S1、收集样品；
S2、提取基因组DNA；
S3、检测酿脓链球菌属特异性基因rpoB以及产毒特异性基因gene1、gene2、gene3和gene4；
S4、读取扩增Ct值；当所述酿脓链球菌属特异性基因和所述产毒特异性基因中至少1个基因的Ct值均小于35时，产毒酿脓链球菌的检测结果为阳性；当所述酿脓链球菌属特异性基因rpoB的Ct值大于35和/或所述产毒特异性基因gene1、gene2、gene3和gene4的Ct值大于35时，产毒酿脓链球菌的检测结果为阴性。
作为一种优选技术方案，所述酿脓链球菌属特异性基因rpoB(NCBI AccessionNumber：AE009949.1)的检测引物如SEQ ID NO:1～2所示；
SEQ ID NO:1(5'-ATTACACGCACTATGGCCGT-3')；
SEQ ID NO:2(5'-AGTTTCGAATTGGCCTGTGC-3')。
所述产毒特异性基因gene1的检测引物如SEQ ID NO:3～4所示；
SEQ ID NO:3(5'-ACTTGCCTTTATTTGCCATGCT-3')(NCBI Accession Number：QAB33988.1)；
SEQ ID NO:4(5'-ACTCAGAGTAGGCCAGTCGT-3')(NCBI Accession Number：QAB35525.1)。
所述产毒特异性基因gene2的检测引物如SEQ ID NO:5～6所示；
SEQ ID NO:5(5'-TGGAGCAGGCAAAACGACTT-3')(NCBI Accession Number：QCK64271.1)；
SEQ ID NO:6(5'-AATTCAAGAGCCCGCCACAG-3')(NCBI Accession Number：QCK64272.1)。
所述产毒特异性基因gene3的检测引物如SEQ ID NO:7～8所示；
SEQ ID NO:7(5'-ACCTTAACTGGCTCTGCGTT-3')(NCBI Accession Number：QCK50270.1)；
SEQ ID NO:8(5'-TAAGGTTGCTGCCAGGCTAG-3')(NCBI Accession Number：QCK51666.1)。
所述产毒特异性基因gene4(NCBI Accession Number：QCK50707.1)的检测引物如SEQ ID NO:9～10所示。
SEQ ID NO:9(5'-TGCCTGCATTCTTGGTTTGAC-3')；
SEQ ID NO:10(5'-CAGGTGTTTCTTGCTTGGTCC-3')。
本发明另一目的是提供一种用于检测产毒酿脓链球菌的荧光定量PCR试剂盒，其包含上述的酿脓链球菌属特异性基因rpoB的检测引物和产毒特异性基因gene1、gene2、gene3和gene4的检测引物。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明通过前期对酿脓链球菌属和其他链球菌属，产毒和非产毒链球菌属的微生物的大量研究数据中，挖掘出能够区分酿脓链球菌属和其他链球菌属，产毒和非产毒链球菌属的特异性的孤儿基因，通过对特异性基因的检测，准确的判断出菌类样品和环境样品中是否含有产毒的酿脓链球菌，具有前期大数据的挖掘和不同种属之间比对基础，选择的特异性基因具有物种和菌属的特异性。
(2)本发明中，通过对设计条件和实验条件的优化，选取针对于每个基因检测扩增条件处于最优化的引物作为检测引物，提高引物扩增的效率，能够达到稳定、高效、高灵敏度和重现性的检测引物，实现微量样品的正确检出。
(3)本发明检测方法与市面上其他的检测方法相比，本发明的两部分检测策略，能够分步判断酿脓链球菌属和其他链球菌属、产毒和非产毒链球菌属，判断必须两项同时阳性检出才最终判断为产毒酿脓链球菌，结果更加严谨和准确。
(4)本发明能够实现从10个阳性菌到10000个阳性菌的检测范围，灵敏度高，应用范围广，更高浓度的样品可以通过稀释折算同样被检测出来，检测结果稳定，具有很好的重现性。
(5)本发明检测方法能够应用于对于临床医学中的组织、器官灌洗液、体外分泌物、排泄物等多方面来源临床样品筛查和检测，精准地判断出该临床样品中是否含有产毒酿脓链球菌，操作方便、快速、灵敏。本发明检测试剂盒能够应用于多种临床样品的快速检验，无需额外进行微生物培养，使基因检验在日常民生中得到应用，具有灵敏度高、操作性强、快速、高效等优点。附图说明
图1是rpoB基因检测引物标准曲线。
图2的gene1基因检测引物标准曲线。
图3是gene2基因检测引物标准曲线。
图4是gene3基因检测引物标准曲线。
图5是gene4基因检测引物标准曲线。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例结合附图详细说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
本发明所用的以下试剂可通过常规途径购买得到。
表1
在一些实施方案中，使用扩增产物构建阳性标准品质粒，并进行引物的扩增标准曲线检测和绘制，得到每对检测引物的扩增效率，本发明所提供的引物序列其扩增效率和置信程度均在最优化的水平。
在一些实施方案中，通过对不同的阳性菌株检测特异性的基因，能够正确的区分出酿脓链球菌属和其他链球菌属，产毒和非产毒链球菌属，从而准确检测并判断出产毒酿脓链球菌。
在一些实施方案中，通过对10个、100个、1000个和10000个阳性菌进行提取和检测，能够精确区分出酿脓链球菌属和其他链球菌属，产毒和非产毒链球菌属，从而准确检测并判断出产毒酿脓链球菌。并且能够保证低至10个阳性菌仍然能够准确检出，而更高滴度的微生物样品可以通过稀释至检测区间，同样可以准确检出。
在一些实施方案中，采集肺泡灌洗液、皮肤分泌物、尿液、阴道分泌物、过滤水的样品，通过对特异性基因的检测，能够快速和准确的检验出样品中是否含有产毒酿脓链球菌，方便快捷。
本领域技术人员应能理解，本方法中检测的基因和设计的特异性引物，同样可以通过相同检测对象的其他区段的设计达到相应的检测目的。
本发明所描述的用于检测产毒酿脓链球菌荧光定量PCR的方法及试剂盒可以广泛应用于临床检测中组织灌洗液检测、体外分泌物以及排泄物的检测等多个临床医学检验范畴，能够为临床医学检测提供方便、快捷、准确、高效的基于基因检测的监控产品。
实施例1检测引物扩增标准曲线
1.微生物培养
使用碱性蛋白胨水作为酿脓链球菌的培养基，pH8.8～9.0的碱性蛋白胨水或平板中生长良好。在碱性平板上菌落直径为2mm，圆形，光滑，透明。选取处于生长旺盛的微生物样品进行后续的实验。
2.基因组DNA提取
按照Qiagen的QIAamp DNA Mini Kit说明书指示进行基因组DNA的提取。
3.扩增产物标准品质粒制作
使用源自酿脓链球菌提取的DNA，分别以rpoB基因、gene1、gene2、gene3和gene4的引物进行扩增，扩增产物经过加A处理后，使用T4连接酶连入T载体，并且通过转导感受态细胞后，质粒得到大规模扩增。5个基因的引物序列如SEQ ID NO:1～10所示，具体如表2。
表2
4.质粒的提取和标准曲线梯度的配置
分别涂板扩增rpoB基因、gene1、gene2、gene3和gene4对应的引物扩增产物的标准品克隆菌，收集单克隆的菌斑，并通过LB培养摇菌过夜扩增，最后得到5ml指数生长期的质粒阳性菌株，按照QIAGEN Plasmid Midi Kit说明书指示进行质粒DNA的提取。提取后检测质粒DNA的浓度，并通过10倍稀释的方法，配置6个浓度梯度的标准品，浓度梯度分别为1μg/μL，100ng/μL，10ng/μL，1ng/μL，100pg/μL，10pg/μL。
5.检测引物标准曲线绘制
按照BioRad iQ SYBR Green SuperMix说明书指示进行浓度梯度标准曲线的qPCR扩增，并且绘制对应的扩增曲线，得到每对引物的扩增效率。每一个qPCR的反应设置3个生物学重复及3个技术重复，qPCR反应体系和扩增反应条件如表3所示。
表3
6.结果分析
检测引物扩增标准曲线结果显示，rpoB基因、gene1、gene2、gene3和gene4对应的引物均为经过优化的引物设计和反应体系。其中线性的标准曲线可信度R2>0.980，高扩增效率在90-105％，证明引物设计和反应体系是最优状态。分析5个基因的扩增曲线的相关性系数和可信度，以及6个浓度梯度下的扩增效率，均达到最优状态的要求，5对引物在该反应条件下能够满足检测要求。
表4
| 基因名 | 斜率 | 截距 | 扩增效率 | 可信度R<sup>2</sup> |
| rpoB | -3.3628 | 35.803 | 98.32％ | 0.9975 |
| gene1 | -3.1321 | 36.366 | 108.58％ | 0.9992 |
| gene2 | -3.5123 | 35.655 | 92.63％ | 0.9992 |
| gene3 | -3.531 | 35.395 | 91.96％ | 0.9974 |
| gene4 | -3.4955 | 35.437 | 93.23％ | 0.9989 |
实施例2阳性及阴性样品检测情况
1.微生物培养
同实施例1。
2.基因组DNA提取
同实施例1。
3.5个目标基因的qPCR检测
按照BioRad iQ SYBR Green SuperMix说明书指示进行样品的qPCR扩增，并且得到每对引物对应的Ct值读数。每一个qPCR的反应设置3个生物学重复及3个技术重复，qPCR反应体系和扩增反应条件如表5所示。
表5
4.结果分析
如表6和表7所示，5对引物的qPCR扩增结果显示，酿脓链球菌属呈现rpoB基因的阳性结果，而其他链球菌属均显示阴性结果。因此，对于酿脓链球菌属和其他链球菌属，进行rpoB基因的检测，能够较好的区分酿脓链球菌属和其他链球菌属。同时，gene1、gene2、gene3和gene4的检测结果，产毒的酿脓链球菌属呈现检测结果阳性，而其他非产毒酿脓链球菌属和其他链球菌属呈现阴性。因此，进行gene1、gene2、gene3和gene4的检测，能够较好的区分产毒和非产毒的链球菌属。综上所述，rpoB基因的对应引物，能够满足链球菌属中酿脓链球菌的检测判断，gene1、gene2、gene3和gene4的对应引物，能够满足产毒和非产毒链球菌属的检测判断。
表6
表7
实施例3检测体系的灵敏度
1.微生物培养
使用碱性蛋白胨水作为酿脓链球菌的培养基，pH8.8～9.0的碱性蛋白胨水或平板中生长良好。在碱性平板上菌落直径为2mm，圆形，光滑，透明。选取处于生长旺盛的微生物样品进行后续的实验，收集菌体后进行浓度计算，并且10稀释得到10个菌/ml，100个菌/ml，1000个菌/ml，和10000个菌/ml，对不同浓度梯度的菌液进行后续的DNA提取实验。
2.基因组DNA提取
同实施例1。
3.5个目标基因的qPCR检测
同实施例2。
4.结果分析
5对引物的qPCR扩增结果显示，从10个菌至10000个菌的范围内，酿脓链球菌属呈现rpoB基因的阳性结果。因此，通过进行rpoB基因的检测，能够较好的达到从10个菌至10000个菌的范围内酿脓链球菌属的检出。同时，从10个菌至10000个菌的范围内，gene1和gene4基因的检测结果，产毒的酿脓链球菌属呈现检测结果阳性，而其他非产毒酿脓链球菌属呈现阴性。因此，进行gene1和gene4基因的检测，能够较好的达到从10个菌至10000个菌的范围内产毒和非产毒的链球菌属的检测和区分。综上所述，可以通过rpoB基因、gene1、gene2、gene3和gene4的搭配检测，较好的完成产毒酿脓链球菌的检测，检测范围可以从10个菌株至10000个菌株，更高的菌株浓度也可以通过稀释的方法稀释至最佳检测范围内，能够达到预期的检测要求。
表8
表9
实施例4临床样品的检测
1.临床样品收集和基因组DNA的提取
分别收集不同的肺泡灌洗液、皮肤分泌物、尿液、阴道分泌物和过滤水，按照Qiagen的QIAamp DNA Mini Kit说明书指示进行基因组DNA的提取。
2.5个目标基因的qPCR检测
同实施例2。
3.结果分析
5对引物的qPCR扩增结果显示，除了一个阴道分泌物样本和过滤水，其他样品均检出rpoB基因，证明相应的样品来源中含有酿脓链球菌。而除了两个肺泡灌洗液样本、尿液样本、一个皮肤分泌物样本、一个阴道分泌物样本和过滤水外，其他样品均检出gene1、gene2、gene3和gene4基因的一个或者两个，证明对应的样品来源中含有产毒的链球菌。最终判断为产毒酿脓链球菌阳性的准则为，rpoB基因检测得到Ct值小于35个循环，同时gene1、gene2、gene3和gene4基因中的一个及以上检测得到Ct值小于35个循环。如果rpoB基因检测得到Ct值大于35个循环，或者，gene1、gene2、gene3和gene4基因均检测得到Ct值大于35个循环，则判断为产毒酿脓链球菌阴性未检出。
表10
表11
以上实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 广州微芯生物科技有限公司
<120> 用于检测产毒酿脓链球菌的荧光定量PCR方法及相应的试剂盒
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
attacacgca ctatggccgt 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agtttcgaat tggcctgtgc 20
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
acttgccttt atttgccatg ct 22
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
actcagagta ggccagtcgt 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tggagcaggc aaaacgactt 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aattcaagag cccgccacag 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
accttaactg gctctgcgtt 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
taaggttgct gccaggctag 20
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tgcctgcatt cttggtttga c 21
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
caggtgtttc ttgcttggtc c 21
Claims (7)
1.用于检测产毒酿脓链球菌的荧光定量PCR方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、收集样品；
S2、提取基因组DNA；
S3、检测酿脓链球菌属特异性基因rpoB，以及产毒特异性基因gene1、gene2、gene3和gene4；
S4、读取扩增Ct值；当所述酿脓链球菌属特异性基因和所述产毒特异性基因中至少1个基因的Ct值小于35时，产毒酿脓链球菌的检测结果为阳性；当所述酿脓链球菌属特异性基因rpoB的Ct值大于35和/或所述产毒特异性基因gene1、gene2、gene3和gene4的Ct值大于35时，产毒酿脓链球菌的检测结果为阴性。
2.根据权利要求1所述的用于检测产毒酿脓链球菌的荧光定量PCR方法，其特征在于，所述酿脓链球菌属特异性基因rpoB的检测引物如SEQ ID NO:1～2所示。
3.根据权利要求1所述的用于检测产毒酿脓链球菌的荧光定量PCR方法，其特征在于，所述产毒特异性基因gene1的检测引物如SEQ ID NO:3～4所示。
4.根据权利要求1所述的用于检测产毒酿脓链球菌的荧光定量PCR方法，其特征在于，所述产毒特异性基因gene2的检测引物如SEQ ID NO:5～6所示。
5.根据权利要求1所述的用于检测产毒酿脓链球菌的荧光定量PCR方法，其特征在于，所述产毒特异性基因gene3的检测引物如SEQ ID NO:7～8所示。
6.根据权利要求1所述的用于检测产毒酿脓链球菌的荧光定量PCR方法，其特征在于，所述产毒特异性基因gene4的检测引物如SEQ ID NO:9～10所示。
7.一种用于检测产毒酿脓链球菌的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，包含权利要求2～7任一项所述的酿脓链球菌属特异性基因rpoB的检测引物和产毒特异性基因gene1、gene2、gene3和gene4的检测引物。
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- 2019-11-12 CN CN201911098236.2A patent/CN111534610A/zh active Pending
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