CN108220460A - 一种食源性化脓链球菌lamp引物组及试剂盒与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及食品安全的分子生物学检测技术领域，公开了一种食源性化脓链球菌LAMP引物组及试剂盒与应用。所述LAMP引物组包括外引物F3和B3，内引物FIP和BIP，以化脓性链球菌转录调控基因spy1258作为靶基因，用于定性检测食品及食品接触材料中的化脓链球菌。所述试剂盒包括所述食源性化脓链球菌的LAMP引物组、DNA聚合酶、2×反应缓冲液、密封液、荧光染料、阳性对照、阴性对照。本发明试剂盒可对1fg/μL的化脓链球菌有效检出，具有非常高的灵敏度。引物组对靶序列6个位点进行特异性扩增，保证了其特异性且与其它菌株无交叉反应。整个扩增过程只需1h即能完成，目的基因产量最高可达10¹⁰拷贝。

Description

一种食源性化脓链球菌LAMP引物组及试剂盒与应用

技术领域

本发明涉及食品安全的分子生物学检测技术领域，更具体的，涉及一种食源性化脓链球菌LAMP引物组及试剂盒与应用。

背景技术

链球菌属通常分为化脓和非化脓两类，化脓性链球菌出现β-溶血，非化脓性链球菌出现α-溶血或不溶血。常见的化脓性链球菌有化脓链球菌、无乳链球菌等。非化脓性链球菌有缓症链球菌群包括口腔链球菌、肺炎链球菌等。

化脓性链球菌（Streptococcus pyogenes，S. pyogenes）,又称酿脓链球菌是一种革兰氏阳性菌，属于厚壁菌门、链球菌属。S. pyogenes 形态有圆形的，也有卵圆形的，一般呈链状排列，无芽孢，有荚膜。研究发现S. pyogenes有多种分型，它们导致S. pyogenes的菌落形态各异，一般分为三大类：（1）粘液样菌落。这类菌落外形较大，表面凸起，含水分较多；（2）无光泽菌落。这类菌落表面扁平，比较粗糙，透明度较高；（3）有光泽菌落。这类菌落外形较小，表面比较平滑有光泽（Johnson DR and Kaplan EL 1996）。

食源性致病菌是导致食品安全问题的重要来源。食品致病菌是可以引起食物中毒或以食品为传播媒介的致病性细菌。致病性细菌直接或间接污染食品及水源，人经口感染可导致肠道传染病的发生及食物中毒以及畜禽传染病的流行。近年来，由化脓链球菌引发的细菌性感染呈增长趋势，严重危害人们安全和健康。

不同来源的化脓性链球菌具有不同属性。不同于痰液、脑脊液及其他分泌物等样品中化脓性链球菌，本发明的化脓性链球菌是一种常见的食源性致病菌，为革兰氏阳性链球菌，其形态为圆形或卵圆形，一般呈链状排列，能够β型溶血现象。食品中常见于奶、肉、蛋及其制品中，化脓链球菌能够引起皮肤软组织感染、脓疱疮、急性咽炎等疾病。

目前我国对化脓链球菌的检测方法包括传统的微生物培养鉴定、免疫检测和PCR检测技术等。传统培养法存在操作繁琐、耗时长及灵敏度低等缺点；免疫检测法虽然灵敏度较高且耗时较短，但特异性较低；近年发展起来的PCR法在时耗、特异性及灵敏度均能很好符合要求，但其对设备要求高而难以在基层及现场检测普及。

环介导等温扩增（(loop-mediated isothermal amplification, LAMP）是一种近年来发展起来的新型基因扩增技术，其利用4条特异性引物（内、外引物各两条）和Bst DNA聚合酶，特异性识别靶序列上的6个独立位点，在恒温条件（65℃左右）下可以特异性、高效、快速的扩增DNA靶序列，其能在1h内扩增靶基因至10⁹~10¹⁰拷贝。LAMP技术具有操作简单、反应速度快、灵敏度高、特异性好及价格廉价等优点，目前已经在致病菌检测、转基因成份检测、疾病诊断等领域广泛应用。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于克服上述缺陷，提供一种食源性化脓链球菌LAMP引物组。

本发明的另一目的在于提供一种具有食源性化脓链球菌LAMP引物组的试剂盒。

本发明的另一目的在于提供一种食源性化脓链球菌LAMP引物组及其试剂盒的应用。

本发明通过以下技术方案实现：

一种食源性化脓链球菌的LAMP引物组，包括外引物F3和B3，内引物FIP和BIP，以化脓性链球菌转录调控基因spy1258作为靶基因，用于定性检测食品及食品接触材料中的化脓链球菌，其引物核苷酸序列如下所示：

spy1258-F3：CCTTACTAAAAAGGCTGGTATC

spy1258-B3：GAGTTGCGGAAATTTGAGG

spy1258-FIP：TCCAGAGTGTCATTTTTGAAGTGAT-AATAGAGGAACCTTCTACCTCC

spy1258-BIP：TCAGGCTGAAATCTACACAGACAC-GCGGTTATAAATTCTCTATGTTCT。

优选地，内引物与外引物的摩尔比为1:8。

一种用于定性检测食品及食品接触材料中的化脓链球菌的试剂盒，包括所述食源性化脓链球菌的LAMP引物组。

优选地，还包括DNA聚合酶、2×反应缓冲液、密封液、荧光染料、阳性对照、阴性对照。

优选地，DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶，浓度为8U/μL。

优选地，2×反应缓冲液包含buffer缓冲液、甜菜碱和dNTIPs，三者体积比为10:8:7。

优选地，荧光染料为浓度10×SYBR Green I；优选地，所述密封液为矿物油。

优选地，阳性对照为化脓链球菌标准菌株基因组DNA；阴性对照为灭菌去离子水。

一种所述食源性化脓链球菌LAMP引物组或所述试剂盒在定性检测食品及食品接触材料中化脓链球菌的应用。

一种应用所述试剂盒检测食品及食品接触材料中化脓链球菌的方法，包括以下步骤：

（1）提取待测物DNA：食品样品前处理遵从GB 4789.11-2014，即取25g（mL）待检样品置于无菌均质袋中，加入225mL改良胰蛋白胨大豆肉汤培养基（mTSB）中，均质1~2min；或加入盛有225mL mTSB的均质杯中，以8000 r/min~10000 r/min均质1min~2min。食品接触材料前处理采用无菌生理盐水湿润棉拭子，分别在2个50 cm²（5cm×5cm）面积范围来回均匀涂抹整个方格3次后，用灭菌剪刀剪去棉拭子与手接触的部分，置10mL mTSB内，均质；36℃±1培养18~24h，取200mL培养过的菌液于干净的1.5mL离心管中，100℃煮沸10min，12000 rpm离心10min，取上清，-20℃保存备用。

（2）采用25μL反应体系：内引物spy1258-FIP和spy1258-BIP各1.6μM，spy1258-F3和spy1258-B3各0.2μM，2×反应缓冲液12.5μL，DNA聚合酶8U，荧光染料为0.5μL，待检样品2μL，加超纯水至25μL；混匀后，加入一滴密封液，混匀离心，置于62.5℃反应45min；

（3）检测结果判断：将上述反应管放入荧光PCR仪中，根据是否出现扩增曲线来判断检测结果：若出现“S” 型扩增曲线则检测结果为阳性，即样品中含有化脓链球菌；若无“S”型扩增曲线出现则检测结果为阴性，即样品中不含化脓链球菌。

优选地，一滴密封液约为20μL。

优选地，荧光PCR仪为美国ABI 7500 型实时荧光定量PCR系统（Life Tech(applied biosystems）、德国罗氏LightCycler@1.5型荧光定量PCR仪等。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

（1）灵敏度高。本发明的试剂盒可对1fg/μL的化脓链球菌有效检出，具有非常高的灵敏度。

（2）特异性强。本发明根据化脓链球菌特异性靶序列设计4条引物，对靶序列6个位点进行特异性扩增，保证了其特异性，且与其它菌株无交叉反应。

（3）耗时少，效率高。整个扩增过程只需1h即能完成，目的基因在此过程中产量最高可达10¹⁰拷贝。

（4）操作便捷，设备要求低。检测过程不需要昂贵复杂仪器，只需将样品放入恒定温度仪中即能反应检测，判读结果只需观测是否出现反应曲线就能判断是否含有化脓链球菌，本发明适合用于基层单位检测及现场抽查检测。

附图说明

图1为化脓链球菌LAMP检测方法特异性实验结果示意图，依次为化脓链球菌（Streptococcus pyogenes，S. pyogenes）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus,S.aureus）、宋内氏志贺氏菌（Shigella sonnei, S.sonnei）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa, P.aeruginosa）、大肠埃希氏菌（Escherichia coli, E.coli）、蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus, B.cereus）、单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes，L.monocytogenes）、伊氏李斯特菌（Listeria ivanovii，L.ivanovii）、英诺克李斯特氏菌（Listeria innocua，L.innocua）、斯氏李斯特氏菌（Listeria seeligeri，L.seeligeri）、马红球菌（Rhodococcus equi，R.equi）、阪崎肠杆菌（Enterobacter sakazakii，E. sakazakii）、小肠结肠炎耶尔森氏菌（Yersinia enterocolitica，Y.enterocolitica）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis，B.subtilis）、空肠弯曲菌（Campylobacter jejuni，C.jejuni）和副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus，V.parahaemolyticus）的LAMP反应结果。

图2为化脓链球菌LAMP检测方法灵敏度实验结果示意图：其中，从右到左浓度依次为浓度100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL、10fg/μL、1fg/μL的化脓链球菌基因组DNA模板LAMP反应结果。

图3 为化脓链球菌LAMP试剂盒检测试剂样品示意图，依次为空白对照（blank），阳性对照（positive），阴性对照（negative），样品1（sample 1）和样品2（sample 2）的LAMP反应结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步说明本发明。除非特别说明，本发明实施例中采用的原料和方法为本领域常规市购的原料和常规使用的方法。

实施例1

化脓链球菌的LAMP引物的设计合成、试剂盒和检测方法

（1）LAMP引物的设计及合成

根据化脓性链球菌转录调控基因spy1258作为靶基因，发明人创造性的设计出2对LAMP（内引物FIP和BIP、外引物F3和B3）。引物由上海生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列如下：

SEQ NO.1：spy1258-F3：CCTTACTAAAAAGGCTGGTATC

SEQ NO.2：spy1258-B3：GAGTTGCGGAAATTTGAGG

SEQ NO.3：spy1258-FIP：TCCAGAGTGTCATTTTTGAAGTGAT-AATAGAGGAACCTTCTACCTCC

SEQ NO.4：spy1258-BIP：ATCAGGCTGAAATCTACACAGACAC-GCGGTTATAAATTCTCTATGTTCT

（2）化脓链球菌LAMP检测试剂盒

一种用于定性检测食品及食品接触材料中的化脓链球菌的试剂盒包括DNA聚合酶、2×反应缓冲液、密封液、荧光染料、阳性对照、阴性对照及上述LAMP引物组。

其中，DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶，浓度为8U/μL；2×反应缓冲液中buffer缓冲液：甜菜碱：dNTPs为10:8:7；荧光染料为浓度10×SYBR Green I；密封液为矿物油；阳性对照为化脓链球菌标准菌株基因组DNA；阴性对照为灭菌去离子水。

（3）检测方法

一种应用所述试剂盒检测食品及食品接触材料中化脓链球菌的方法，包括以下步骤：

（1）提取待测物DNA：食品样品前处理遵从GB 4789.11-2014，即取25g（mL）待检样品置于无菌均质袋中，加入225mL改良胰蛋白胨大豆肉汤培养基（mTSB）中，均质1~2min；或加入盛有225mL mTSB的均质杯中，以8000 r/min~10000 r/min均质1min~2min。

食品接触材料前处理：采用无菌生理盐水湿润棉拭子，分别在2个50 cm²（5cm×5cm）面积范围来回均匀涂抹整个方格3次后，用灭菌剪刀剪去棉拭子与手接触的部分，置10mL mTSB内，均质；36℃±1培养18~24h，取200mL培养过的菌液于干净的1.5mL离心管中，100℃煮沸10min，12000 rpm离心10min，取上清，-20℃保存备用。

（2）LAMP反应体系为25μL反应体系：包括内引物spy1258-FIP和spy1258-BIP各1.6μM，spy1258-F3和spy1258-B3各0.2μM，2×反应缓冲液12.5μL，Bst DNA聚合酶8U，10×SYBRGreen I为0.5μL，待检样品2μL，加超纯水至25μL；混匀后，加入密封液一滴（约20μL）。

混匀离心，置于62.5℃反应45min。

（3）检测结果判断：将上述反应管放入荧光PCR仪（如ABI 7500，LightCycler@1.5）中，根据是否出现扩增曲线来判断检测结果。若出现“S” 型扩增曲线则检测结果为阳性，即样品中含有化脓链球菌；若无“S”型扩增曲线出现则检测结果为阴性，即样品中不含化脓链球菌。

实施例2

LAMP特异性实验

用实施例1的LAMP反应试剂盒对化脓链球菌、金黄色葡萄球菌、宋内氏志贺氏菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希氏菌、蜡样芽孢杆菌、单核细胞增生李斯特氏菌、伊氏李斯特菌、英诺克李斯特氏菌、斯氏李斯特氏菌、马红球菌、阪崎肠杆菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、枯草芽孢杆菌、空肠弯曲菌及副溶血性弧菌按照上述反应体系及检测方法进行特异性实验，实验结果如图1所示。并设置灭菌双蒸水为阴性对照。从图1中可知，只有化脓链球菌出现“S”形扩增曲线，为阳性结果，而其他菌株在45min反应时间内均未出现“S”形曲线，说明实施例1中的反应体系具有只对化脓链球菌的特异性。

实施例3

LAMP灵敏度实验

将化脓链球菌标准菌株划线于血平板上，36℃±1培养18h，采用OMEGA公司的原核生物基因组提取试剂盒提取细菌中的DNA。将提取的化脓链球菌DNA进行10倍梯度稀释，获得浓度分别为100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、100 fg/μL、10 fg/μL、1 fg/μL共6个梯度的DNA模板，并设置阴性对照（灭菌双蒸水），按实施例1中的反应体系和检测方法进行试验，以确定LAMP试剂盒的灵敏度。

图2结果表明，实施例1的LAMP试剂盒可对1fg/μL的化脓链球菌有效检出。

实施例4

本实施例以市场上采购的两个不同厂商生产的纸杯为检测对象，定性检测纸杯中的化脓链球菌。

（1）按照实施例1分别对样品1和样品2进行前处理、培养，并提取DNA；

（2）LAMP反应体系为25μL反应体系：包括内引物spy1258-FIP和spy1258-BIP各1.6μM，spy1258-F3和spy1258-B3各0.2μM，2×反应缓冲液12.5μL，Bst DNA聚合酶8U，10×SYBRGreen I为0.5μL，待检样品2μL，加超纯水至25μL；混匀后，加入密封液一滴（约20μL）。混匀离心，置于62.5℃反应45min。并设置空白对照、阴性对照（灭菌双蒸水）和阳性对照（化脓链球菌标准菌株）。

（3）检测结果判断：将上述反应管放入荧光PCR仪（如ABI 7500，LightCycler@1.5）中，根据是否出现扩增曲线来判断检测结果。检测结果见图3，样品1出现“S”形扩增曲线，为阳性结果，样品2未出现“S”形扩增曲线，为阴性结果，表明样品1中含有化脓链球菌，样品2中不含有化脓链球菌。该方法可以有效检出实际样品中的化脓链球菌。

序列表

<110> 广东产品质量监督检验研究院

<120> 一种食源性化脓链球菌LAMP引物组及试剂盒与应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 引物spy1258-F3(primer spy1258-F3)

<400> 1

ccttactaaa aaggctggta tc 22

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 引物spy1258-B3(primer spy1258-B3)

<400> 2

gagttgcgga aatttgagg 19

<210> 3

<211> 47

<212> DNA

<213> 引物spy1258-FIP(primer spy1258-FIP)

<400> 3

tccagagtgt catttttgaa gtgataatag aggaaccttc tacctcc 47

<210> 4

<211> 48

<212> DNA

<213> 引物spy1258-BIP(primer spy1258-BIP)

<400> 4

tcaggctgaa atctacacag acacgcggtt ataaattctc tatgttct 48

Claims (10)

1.一种食源性化脓链球菌的LAMP引物组，其特征在于，包括外引物F3和B3，内引物FIP和BIP；以化脓性链球菌转录调控基因spy1258作为靶基因，用于定性检测食品及食品接触材料中的化脓链球菌，其引物核苷酸序列如下所示：

spy1258-F3：CCTTACTAAAAAGGCTGGTATC

spy1258-B3：GAGTTGCGGAAATTTGAGG

spy1258-FIP：TCCAGAGTGTCATTTTTGAAGTGAT-AATAGAGGAACCTTCTACCTCC

spy1258-BIP：TCAGGCTGAAATCTACACAGACAC-GCGGTTATAAATTCTCTATGTTCT。

2.一种用于定性检测食品及食品接触材料中的化脓链球菌的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述食源性化脓链球菌的LAMP引物组。

3.根据权利要求2所述试剂盒，其特征在于，内引物与外引物的摩尔比为1:8。

4.根据权利要求3所述试剂盒，其特征在于，还包括DNA聚合酶、2×反应缓冲液、密封液、荧光染料、阳性对照、阴性对照。

5.根据权利要求4所述试剂盒，其特征在于，DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶，浓度为8U/μL。

6.根据权利要求4所述试剂盒，其特征在于，2×反应缓冲液包含buffer缓冲液、甜菜碱和dNTIPs，三者体积比为10:8:7。

7.根据权利要求4所述试剂盒，其特征在于，荧光染料为浓度10×SYBR Green I；优选地，所述密封液为矿物油。

8.根据权利要求4所述试剂盒，其特征在于，阳性对照为化脓链球菌标准菌株基因组DNA；阴性对照为灭菌去离子水。

9.一种权利要求1所述食源性化脓链球菌LAMP引物组或权利要求2~8任意一项所述试剂盒在定性检测食品及食品接触材料中化脓链球菌的应用。

10.一种应用权利要求3~8所述试剂盒检测食品及食品接触材料中化脓链球菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）提取待测物DNA：食品样品前处理遵从GB 4789.11-2014，即取25g（mL）待检样品置于无菌均质袋中，加入225mL改良胰蛋白胨大豆肉汤培养基（mTSB）中，均质1~2min；或加入盛有225mL mTSB的均质杯中，以8000 r/min~10000 r/min均质1min~2min;

食品接触材料前处理采用无菌生理盐水湿润棉拭子，分别在2个50 cm²（5cm×5cm）面积范围来回均匀涂抹整个方格3次后，用灭菌剪刀剪去棉拭子与手接触的部分，置10mL mTSB内，均质；36℃±1培养18~24h，取200mL培养过的菌液于干净的1.5mL离心管中，100℃煮沸10min，12000 rpm离心10min，取上清，-20℃保存备用;

（2）采用25μL反应体系：内引物spy1258-FIP和spy1258-BIP各1.6μM，spy1258-F3和spy1258-B3各0.2μM，2×反应缓冲液12.5μL，DNA聚合酶8U，荧光染料为0.5μL，待检样品2μL，加超纯水至25μL；混匀后，加入一滴密封液，混匀离心，置于62.5℃反应45min；

（3）检测结果判断：将上述反应管放入荧光PCR仪中，根据是否出现扩增曲线来判断检测结果：若出现“S” 型扩增曲线则检测结果为阳性，即样品中含有化脓链球菌；若无“S”型扩增曲线出现则检测结果为阴性，即样品中不含化脓链球菌。