CN103305613A - 大鲵致病性嗜水气单胞菌pcr诊断试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种大鲵致病性嗜水气单胞菌PCR诊断试剂盒，它包括250μL的PCRpremix缓冲液，150μL超纯水，50μL的MarkerDL2000，40μL浓度为10μmol/L的上引物及40μL浓度为10μmol/L的下引物，20μL阴性对照以及20μL阳性对照。本发明采用根据GenBank中的致病性嗜水气单胞菌气溶素基因（hlyA）序列，设计了1对引物，通过对PCR反应条件进行优化，研制出大鲵致病性嗜水气单胞菌的PCR诊断试剂盒，以期对临床样品进行简便、快捷、灵敏、准确的检测，为该病的防制提供科学依据。根据以上研究设计的引物，将其应用在PCR快速检测试剂盒中，可快速检测出大鲵致病性嗜水气单胞菌，并且具有良好的特异性及敏感性。
Description
技术领域
本发明涉及一种试剂盒，尤其是一种大鲵致病性嗜水气单胞菌PCR诊断试剂盒。
背景技术
嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）属于气单胞菌科（Aermonadaceae）气单胞菌属（Aeromonas），是革兰氏阴性短杆菌，是一类广泛存在于水环境的常见菌，对水产动物、畜禽和人类均有致病性。该菌可引起大鲵的头部、腹部、尾部皮肤局部出血、坏死，随着病情的加重，可出现多个内脏器官发生了肿胀、严重充血等病理变化。目前，该菌的检测方法主要有鉴别培养基、Dot-ELISA、间接ELISA等检测技术，但这些方法都存在着操作复杂、耗时较长的缺点。近年来随着全国各地大鲵产业的发展，大鲵引种频繁，该病成暴发趋势，给大鲵养殖业带来了巨大的经济损失。
发明内容
本发明的目的是：提供一种大鲵致病性嗜水气单胞菌PCR诊断试剂盒，它可以快速检测大鲵致病性嗜水气单胞菌，并且简便、灵敏、准确、特异性强。
本发明是这样实现的：大鲵致病性嗜水气单胞菌PCR诊断试剂盒，它包括250μL 的PCR premix缓冲液，150μL超纯水，50μL的Marker DL2000，40μL浓度为10μmol/L的上引物及40μL浓度为10μmol/L的下引物， 20μL阴性对照以及20μL阳性对照；上游引物的序列为：5`-AGTCCGCGAAGAAGTTTTTGTAC-3`；下游引物的序列为：5`- TTCATGAGGTCCCAGGCCAGGT-3`。
阴性对照为超纯水。
阳性对照为标准致病性嗜水气单胞菌的PCR产物。
试剂盒的保存期检测
将试剂盒保存在4℃、-20℃分别于1月、3月、6月、1年，对阳性样品进行检测，4℃保存1年条带较淡，－20℃保存1月、3月、6月、1年条带亮度无影响。
本发明本研究根据GenBank中的致病性嗜水气单胞菌气溶素基因（hlyA）序列，设计了1对引物，通过对PCR反应条件进行优化，建立了检测大鲵致病性嗜水气单胞菌的PCR诊断法方法，以期对临床样品进行简便、快捷、灵敏、准确的检测，为该病的防制提供科学依据。
本研究根据GenBank中嗜水气单胞菌气溶素基因的序列，设计1对特异性引物，通过对PCR反应条件进行优化，建立了检测大鲵致病性嗜水气单胞菌的PCR诊断法方法，与传统的细菌分离鉴定相比较，建立的PCR检测方法操作更为简便，耗时较短，且容易区分致病株与非致病株。该PCR试剂盒能够对大鲵致病性嗜水气单胞菌样品进行快捷、灵敏、准确的检测，有利于该病的快速诊断及流行病学调查。
为了验证本发明的技术效果，进行了以下实验：
大鲵致病性嗜水气单胞菌PCR诊断方法的建立
1 材料与方法
1.1 菌株致病性嗜水气单胞菌标准株、非致病性嗜水气单胞菌购自中国兽医微生物保藏管理中心，大肠杆菌、黄杆菌、弗氏柠檬酸杆菌由贵州省畜禽疫病研究实验室保存。
主要试剂 Goldview、Tris、EDTA、DL2000、Taq DNA Polymerase（5U/μL）及相应10×Taq Buffer、dNTP等购自宝生物（大连）工程有限公司；苯酚、氯仿、无水乙醇、普通培养基为国产试剂。
引物设计
根据嗜水气单胞菌气溶素基因（hlyA）序列设计1对特异性引物，上游引物：5’-AGAAGGTGACCACCAAGAACAAG-3’，下游引物：5’-AATGCTGCTCGCCTTGTCCT-3’，引物由宝生物（大连）工程有限公司合成。
细菌核酸的抽提
（1）菌液样品DNA的提取
将待检菌液按12000 r/min 离心5 min，弃上清液，用100μLTE或灭菌双蒸水重悬，涡漩后，于沸水中水浴10 min，再放置-20℃冻融。冻融后12000 r/min 离心5 min，收集上清液，上清液-20℃保存备用。
（2）组织样品
取待检样品肝脏组织样品共约0.5 g，加入500 μL PBS缓冲液，待检样品研磨后－20℃反复冻融3次12000 r/min离心取上清用于核酸的提取。取上述处理好的样品500μL于1.5 mL离心管中，每管加50μL消化缓冲液，加蛋白酶K至终浓度100μg/mL混匀，55℃水浴1h。从水浴中取出消化后的样品，在每管中加入饱和苯酚600μL，充分震荡摇匀之后常温12000r/min离心10min；取上清液约400μL，加入200 μL的苯酚和200 μL的氯仿溶液，震荡摇匀，常温12000r/min离心10 min；取上清液再加入两倍体积的预冷无水乙醇，摇匀后置-20℃沉淀30min；常温12000 r/min离心10 min，然后弃去上清液，加入1 mL 75%的酒精常温10000 r/min离心5 min洗涤一次后，将所得核酸沉淀物放在42℃烘箱内烘干，或室温放置自然晾干，在每管中加入50μL左右的TE溶解DNA，-20℃保存备用。
反应条件的优化
对PCR反应条件，包括退火温度（52℃、57℃、62℃），引物浓度（5 μmol/L、10 μmol/L 20 μmol/L），Taq DNA polymerase浓度（0.5 U、1 U、2 U）进行优化，以确定最佳反应条件，同时以超纯水作为空白对照。PCR反应在25 μL反应体系中进行，10×Taq Buffer 5μL，dNTP mixture 4μL，Taq DNA polymerase 1μL，用超纯水补足至25μL。反应条件为：94℃ 5 min；94℃ 1 min，退火温度（52℃、57℃、62℃）1 min，72℃ 1 min，30个循环；最后72℃延伸10 min。取10 μL PCR扩增产物于10 g/L琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定。
敏感性试验
将提取的致病性嗜水气单胞菌标准株核酸用蛋白质核酸仪测定浓度后，进行10倍比稀释后分别进行PCR反应，以确定建立的PCR诊断试剂盒的敏感性。
特异性试验
以致病性嗜水气单胞菌、非致病性嗜水气单胞菌、大肠杆菌、黄杆菌、弗氏柠檬酸杆菌进行PCR反应，以确定建立的PCR诊断方法的特异性。
重复性试验
应用建立PCR方法，重复检测致病性嗜水气单胞菌 DNA样品3次以检验结果的可靠性。
方法对临床样品的检测
对2011～2012年贵州省贵阳市、黔南州、铜仁地区几个大鲵养殖场和养殖专业户采集的63份病料应用建立的大鲵致病性嗜水气单胞菌PCR检测方法进行检测，同时进行细菌学和生化检验。
结果
2.1 PCR反应条件的优化与鉴定
致病性嗜水气单胞菌的PCR扩增片段经胶回收，送大连宝生物工程有限公司测序，结果表明，扩增片段分别为致病性嗜水气单胞菌气溶素基因特异性条带。PCR反应在25 μL反应体系中最佳反应条件为，退火温度57℃，Taq DNA polymerase 0.5 U，引物浓度10 μmol/L用引物均有效扩增出了其目的片段，片段大小为600 bp，无非特异性片段产生，如图1所示。
敏感性试验
将提取的致病性嗜水气单胞菌标准株核酸用蛋白质核酸仪测定浓度为20 μg，进行10倍比稀释后分别进行PCR反应，PCR反应中，致病性嗜水气单胞菌 DNA的最低检测量为0.4 ng/L，如图2所示。
特异性试验
以致病性嗜水气单胞菌、非致病性嗜水气单胞菌、大肠杆菌、黄杆菌、弗氏柠檬酸杆菌进行PCR反应，以确定建立的PCR诊断试剂盒的特异性，结果嗜水气单胞菌为阳性，而非致病性嗜水气单胞菌、大肠杆菌、黄杆菌、弗氏柠檬酸杆菌为阴性，如图3所示。
重复性试验
应用建立的PCR方法，重复检测致病性嗜水气单胞菌DNA样品3次，结果均一致。
试剂盒对临床样品的检测
对2011年～2012年贵州省贵阳市、黔南州、铜仁地区几个大鲵养殖场和养殖专业户采集的123份病料应用建立的大鲵致病性嗜水气单胞菌PCR检测方法进行检测，共检测出82份阳性样品，而细菌学和生化检验结果为80份，建立的PCR方法检测结果与细菌学和生化检验符合率为97.6％。
讨论
近年来随着大鲵的人工养殖不断发展，大鲵的疾病不断暴发，主要以嗜水气单胞菌引起的腹水病、腐皮病、细菌性败血症为主。人工养殖中通常在引种运输，或是养殖水环境恶化，以及大鲵自身抵抗力下常常暴发该病。
嗜水气单胞菌广泛存在于水环境中,是一种条件致病菌。嗜水气单胞菌有致病菌株与非致病菌株之分，嗜水气单胞菌的致病性与其胞外产物即毒力因子密切相关，目前已发现的毒力因子有外毒素、蛋白酶、S层、菌毛、转铁蛋白和外膜蛋白等，而已确定的外毒素有气溶素（Aerolysin）、溶血素（Hemolysin）、溶血毒素(（Hemolytic toxin）和细胞毒性肠毒素（Cytolytic enterotoxin）等。目前研究者应用致病性嗜水气单胞菌气溶素基因的特异性，开展了大量的研究。饶静静等根据GenBank中登录的嗜水气单胞菌的气溶素基因（hlyA）、溶血素基因（aerA），建立了检测致病性嗜水气单胞菌的多重PCR检测方法，对8株嗜水气单胞菌、16株相关菌株进行多重PCR检测，结果显示，非致病性分离株均未扩增出毒力基因hlyA和aerA，而致病性分离株均含有hlyA基因。卢强等根据致病性嗜水气单胞菌气溶素基因，设计引物，建立了检测嗜水气单胞菌的PCR方法，通过对20株嗜水气单胞菌，12株相关菌株及157份送检病料的检测，并与SPA-CoA检测结果对照表明，PCR方法具有较高的敏感性和特异性，可检测最低100 cfu的细菌。
由于采用了上述的技术方案，本发明根据GenBank中嗜水气单胞菌气溶素基因的序列，设计1对特异性引物，通过对PCR反应条件进行优化，建立了检测大鲵致病性嗜水气单胞菌的PCR诊断法方法，与传统的细菌分离鉴定相比较，建立的PCR检测方法操作更为简便，耗时较短，且容易区分致病株与非致病株。建立的PCR方法检测结果与细菌学和生化检验符合率为97.6％，表明该PCR方法能够对大鲵致病性嗜水气单胞菌样品进行快捷、灵敏、准确的检测，有利于该病的快速诊断及流行病学调查。
具体实施方式
本发明的实施例：大鲵致病性嗜水气单胞菌PCR诊断试剂盒，它包括250μL 的PCR premix缓冲液，150μL超纯水，50μL的Marker DL2000，40μL浓度为10μmol/L的上引物及40μL浓度为10μmol/L的下引物， 20μL阴性对照以及20μL阳性对照；上游引物的序列为：5’-AGAAGGTGACCACCAAGAACAAG-3’，下游引物：5’-AATGCTGCTCGCCTTGTCCT-3’；阴性对照为超纯水；阳性对照为标准致病性嗜水气单胞菌的PCR产物。
SEQUENCE LISTING
序列表
<110> 贵州省畜牧兽医研究所
<120> 大鲵致病性嗜水气单胞菌PCR诊断试剂盒
<130> nm:
<160> 2
<170> PatentIn version
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>根据嗜水气单胞菌气溶素基因（hlyA）序列设计1对特异性引物，用DNAStar软件设计,以用于PCR扩增。
，下游引物：
<400> 1
AGAAG GTGAC CACCA AGAAC AAG 23
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>根据嗜水气单胞菌气溶素基因（hlyA）序列设计1对特异性引物，用DNAStar软件设计,以用于PCR扩增。
<400> 2
AATGC TGCTC GCCTT GTCCT 20
Claims (4)
1.一种大鲵致病性嗜水气单胞菌PCR诊断试剂盒，其特征在于：它包括250μL 的PCR premix缓冲液，150μL超纯水，50μL的Marker DL2000，40μL浓度为10μmol/L的上引物及40μL浓度为10μmol/L的下引物， 20μL阴性对照以及20μL阳性对照；上游引物的序列为：5’-AGAAGGTGACCACCAAGAACAAG-3’，下游引物：5’-AATGCTGCTCGCCTTGTCCT-3’。
2.根据权利要求1所述的大鲵致病性嗜水气单胞菌PCR诊断试剂盒，其特征在于：阴性对照为超纯水。
3.根据权利要求1所述的大鲵致病性嗜水气单胞菌PCR诊断试剂盒，其特征在于：阳性对照为标准致病性嗜水气单胞菌的PCR产物。
4.根据权利要求1所述的大鲵致病性嗜水气单胞菌PCR检测试剂盒，其特征在于：PCR premix缓冲液由3 mmol/ul的MgCl2，500pmol/ul的 dNTP 2.0μL，25mmol/μL的Tris-HCl及0.2μL Taq酶组成，其PH值为pH8.3。
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