CN104946782A - 沙门菌和大肠杆菌O78双重Tem-PCR快速检测方法 - Google Patents

沙门菌和大肠杆菌O78双重Tem-PCR快速检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了沙门菌和大肠杆菌O78双重Tem-PCR快速检测方法。该方法使用沙门菌的invA基因引物组和大肠杆菌O78的O-抗原基因引物组对复杂样品增菌后提取的混合DNA直接进行双重Tem-PCR扩增，通过凝胶电泳判读结果。本发明采用Tem-PCR技术和多重PCR技术相结合，克服多重PCR的扩增偏爱性问题，比普通多重PCR检测灵敏度提高了2-3个数量级，可以达到样品污染菌为个位数的检测水平，解决了传统的多重PCR技术容易导致假阴性结果的问题。本发明能快速、方便、特异、灵敏地检测沙门氏菌和大肠杆菌O78，易于大范围推广，可用于细菌鉴定、疾病诊断和流行病学调查，具有广阔的市场前景和较大的经济效益。

Description

沙门菌和大肠杆菌O78双重Tem-PCR快速检测方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及沙门菌和大肠杆菌O78双重Tem-PCR快速检测方法与应用。
背景技术
快速检测与鉴定致病性病原菌是及时有效的预防和控制病原菌传播的前提，对于畜禽业的健康正常发展以及食品的检验检疫安全和人类健康具有重要意义。
目前食品卫生微生物学检验(GB/T 4789.1—2003)病原菌仍主要依靠传统的细菌培养、血清学、生化鉴定等方法，检测周期长(需4～7d)，操作繁琐复杂，特异性、敏感度均较低，不能适应快速检测的需要。随着以核酸为基础的分子微生物检测技术的发展，特别是聚合酶链反应(Polymerase ChainReaction，PCR)技术的应用，使病原菌诊断技术发展到一个新的水平。PCR技术能够快速、灵敏地进行检测，并且已经在微生物检测方面获得了极为广泛的应用。后来，酶联荧光免疫检测法、金标试纸法、DNA探针技术、LAMP恒温扩增法等都逐渐出现在病原微生物检测领域。
目前的畜禽养殖都是规模化养殖，密度大，病原菌感染后传播快，而传统的病原菌检测方法操作繁琐，耗时耗力，不能起到有效地监测和预防作用，也很难指导发病后的合理用药。而目前对致病菌的检测方法如国标法、酶联荧光免疫检测法、聚合酶链式反应(PCR)、金标试纸法、DNA探针技术、LAMP恒温扩增法,这些方法都有存在不足之处，即检测通量不高。
多重PCR方法是提高检测通量的基本方法，可以在同一PCR体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段。不仅可以缩短检测时间，尤其适用于多种病原微生物同时存在的样品及复杂生态环境下的病原微生物检测方面。但多重PCR技术由于存在扩增偏好性,常常出现扩增效率不均衡问题，降低检测灵敏度甚至造成假阴性结果。
发明内容
本发明针对多重PCR存在的问题，采用靶序列富集多重PCR(target enriched multiplex PCR，Tem-PCR)技术，它的原理是针对待扩增的每一种靶序列，设计特异性引物，再编制一个通用引物(SuperPrimer)与之相联，形成嵌合引物，利用嵌合引物和通用引物(SuperPrimer)进行扩增。其独特之处在于嵌合引物的浓度极低，用在PCR的最初几个循环中富集目标序列。只有超级引物的浓度足以进行指数扩增，这样克服多重PCR的扩增偏爱性问题，可将传统多重PCR检测灵敏度提高2-3个数量级,解决了传统的多重PCR技术导致的假阴性结果问题。
本发明要解决的技术问题是提供用于沙门菌和大肠杆菌O78双重Tem-PCR快速检测的引物。
本发明要解决的另外一个技术问题是提供一种沙门菌和大肠杆菌O78双重Tem-PCR快速检测方法。
对于用于沙门菌和大肠杆菌O78双重Tem-PCR快速检测的引物，本发明采用的技术方案是，包括：
(1)具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列；或
(2)与(1)的核苷酸序列具有基本序列同源性，并具有相同功能的核苷酸序列。
对于沙门菌和大肠杆菌O78双重Tem-PCR快速检测方法，本发明采用的技术方案是包括以下步骤：
(1)设计和合成引物；所述引物包括超级引物Fs和Rs、扩增沙门菌的外引物invA-F0和invA-R0、内引物invA-Fi和invA-Ri以及扩增大肠杆菌O78的特异性的内引物O78-Fi和O78-Ri和外引物O78-F0和O78-R0；
扩增沙门菌的外引物invA-F0和invA-R0、内引物invA-Fi和invA-Ri以及扩增大肠杆菌O78的特异性的内引物O78-Fi和O78-Ri和外引物O78-F0和O78-R0如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列；
(2)样品DNA模板制备；包括：
a)取沙门菌或大肠杆菌O78的菌液1mL于12000r/min离心5min；沉淀加入100μL无菌水，混匀后，于100℃沸水浴10～15min，立即冰浴5min，12000r/min离心5min，上清液即为DNA模板；或
b)取1g新鲜鸡粪加入5mL LB液体培养基，37℃，200rpm，增菌5h；低速离心5min；取1mL上清，12000rpm离心5min，弃上清，加入100μL ddH2O悬浮沉淀，置100℃水浴煮沸10～15min；12000rpm离心3min，上清即为DNA模板；或
c)取奶粉5g加入100mL LB液体培养基中，高压灭菌后取1mL添加10倍梯度倍比稀释的沙门菌和大肠杆菌O78菌液各100uL，37℃250rpm增菌5h；12000rpm离心5min，弃上清，加入100μL ddH2O悬浮沉淀，置100℃水浴煮沸10～15min。12000rpm离心3min，上清即为DNA模板；或
d)取107cfu/mL的沙门菌和大肠杆菌O78用灭菌化妆水10倍比梯度稀释，分别取不同浓度的化妆水稀释菌液100uL加入900uL LB液体培养基中，37℃250rpm增菌5h；SDS法裂解制备DNA模板；
(3)双重Tem-PCR扩增反应；所述双重Tem-PCR扩增反应是以步骤(2)提取的DNA作为模板，采用双重Tem-PCR法进行扩增，扩增体系和反应条件如下：
2×PCR buffer 2μL，0.4mM dNTP，外引物invA-F0和invA-R0以及O78-F0和O78-R0各0.04μM，内引物invA-Fi和invA-Ri以及O78-Fi和O78-Ri各0.16μM，Fs和Rs各0.4μM，DNA聚合酶1U，MgCl22mM，DNA模板1.0μL，ddH2O补足20μL；PCR扩增条件为：94℃，10min；94℃30s，56℃1min，72℃1min，10个循环；94℃15s，72℃90s，3个循环；94℃15s，56℃15s，72℃30s，25个循环；最后72℃后延伸5min；
(4)将PCR扩增反应产物进行琼脂糖电泳检测；将5μL所述扩增反应产物用1％琼脂糖电泳分离，根据条带有无和大小判定结果。
作为优选，MgCl2的浓度为2～3mM。
作为优选，dNTP的浓度为0.2～0.5mM。
作为优选，外引物的浓度从0μM到0.1μM；内引物的浓度从0.1μM到0.2μM。
作为优选，DNA聚合酶为Taq酶，浓度为1.0～3.0U。
作为优选，所用病原菌分别购自中国工业微生物所、中国兽医菌种保藏中心和广州微生物所菌种保藏中心：鸡肠炎沙门菌(Salmonella enterica)：CICC21510，鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)：CMCC50115，猪霍乱沙门氏菌(S.choleraesuis)：ATCC13312；大肠杆菌O78(Escherichia coli O78)：CVCC1490、ATCC35401。
本发明主要基于靶标基因的多重PCR技术和Tem-PCR扩增技术对大肠杆菌O78和沙门菌进行快速检测，达到一次性快速检测沙门菌和大肠杆菌O78的目的。
本发明所选用的各病原菌的基因均具有较强的特异性和灵敏性。超级引物为一对非同源性通用引物，保证这对引物与细菌没有同源性，是非同源性独特序列。沙门菌的invA基因和O78O-抗原特异基因为沙门菌和大肠杆菌O78特有的毒力因子基因，且序列高度保守。
本发明的有益效果是：
本发明提供的双重Tem-PCR检测方法可以弥补多重PCR技术存在的不足，提供一种沙门菌和大肠杆菌O78快速高效的分子检测方法。双重Tem-PCR扩增结果表明：沙门菌和大肠杆菌O78的特异引物具有较高的检测灵敏度和特异性,可将检测灵敏度提高到个位数水平,比普通多重PCR检测灵敏度提高2-3个数量级。本发明提供的增菌培养后制备DNA的方法，可以有效缩短检测的时间，提高检测效率。同时，增菌培养后可使扩增体系中死菌的模板DNA所占比例大大降低，从而确保了对病原菌的传播和防治情况进行实时检测的可靠性。总之，本发明提供的一种沙门菌和大肠杆菌O78双重Tem-PCR检测方法操作简单、高效、灵敏，为病原菌的实时监测和快速诊断提供了有效手段，可以推广应用于畜禽养殖、食品卫生、环境安全等领域病原菌的快速检测。
本发明克服了多重PCR由于扩增偏爱性而常常出现扩增效率不均衡，容易造成假阴性结果的问题。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
图1是本发明实施例的双重Tem-PCR特异性扩增产物电泳分析。
图2是本发明实施例的双重Tem-PCR检测灵敏度实验结果。
图3是本发明实施例的模拟鸡粪样品双重Tem-PCR检测灵敏度实验结果。
图4是本发明实施例的模拟奶粉样品双重Tem-PCR检测灵敏度实验结果。
图5是本发明实施例的模拟化妆水样品双重Tem-PCR检测灵敏度实验结果。
具体实施方式
实施例1
一种沙门菌和大肠杆菌O78双重Tem-PCR快速检测方法，采用双重Tem-PCR技术一次性扩增沙门菌和大肠杆菌O78的特异基因，然后通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。
本实施例所用病原菌分别购自中国工业微生物所、中国兽医菌种保藏中心和广州微生物所菌种保藏中心：鸡肠炎沙门菌(Salmonella enterica)：CICC21510，鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)：CMCC50115，猪霍乱沙门氏菌(S.choleraesuis)：ATCC13312；大肠杆菌O78(Escherichia coli O78)：CVCC1490、ATCC35401。
本实施例所用主要试剂：
Taq DNA聚合酶，dNTPs，1000bp DNA Marker[宝生物工程(大连)有限公司]，引物(北京华大基因科技有限公司)，LB(青岛海博生物科技有限公司)。
本实施例所用主要仪器：
Life Touch TC-XP基因扩增仪(杭州博日科技有限公司)；
DYCP-31DN水平电泳仪(北京六一仪器厂)；
Tanon-2500R全自动数码凝胶图像分析系统(上海天能科技有限公司)。
上述沙门菌和大肠杆菌O78双重Tem-PCR快速检测方法具体包括以下步骤：
(1)合成引物
根据沙门菌invA基因和大肠杆菌O78O-抗原特异基因设计特异引物，。上述引物的核苷酸序列为：
invA-F0：5’-CGCTCTTTCGTCTGGCATTA-3’
invA-R0：5’-CAGTCCTAACGACGACCCTTC-3’
invA-Fi：5’-Fs-CTTGATTGAAGCCGATGC-3’
invA-Ri：5’-Rs-AGTAGACAGGGCGGAGGA-3’
O78-F0：5’-GGAAAGGGCGATTATGGTG-3’
O78-R0：5’-CTTCGGTTATGTCCTGTGC-3’
O78-Fi：5’-Fs-AGAATATGCGGCTGTAAGG-3’
O78-Ri：5’-Rs-TTCAAATCCATTGCCACAT-3’
引物的特异性检测：首先将设计合成的引物在BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)网上比对，发现O78特异引物和大肠杆菌O78有100％的相似度(CP004009，FJ940775)，另外和一株未注明血清型的大肠杆菌(FN649414)有100％的同源性，与其它菌株的相似度较低；沙门氏菌特异引物引物对只和沙门氏菌相似度100％，和其它菌株相似度都不足50％。然后用3株沙门氏菌，2株大肠杆菌O78和13株含其他大肠杆菌血清型菌株和常见肠道致病菌组成的非目标菌基因组DNA分别进行单引物对PCR反应，验证引物的特异性。
(2)双重Tem-PCR扩增反应体系的建立及特异性验证
将步骤(1)中的引物组合在一起进行双重Tem-PCR扩增以检测沙门菌和大肠杆菌O78。选取对双重Tem-PCR有较大影响的因素：退火温度、循环数、模板量以及退火和延伸时间等反应条件进行单因素优化实验，以摸索确定最佳的双重Tem-PCR反应体系。反应组分和反应条件优化如下：各阶段退火温度从55℃到65℃，退火和延伸时间分别为30s，60s和90s，引物浓度从0.02mM到0.4mM，dNTP浓度从0.02mM到0.5mM。优化后按下列体系配置PCR反应体系：
2×PCR buffer 2μL，0.4mM dNTPs，invA-F0和invA-R0以及O78-F0和O78-R0各0.04μM，invA-Fi和invA-Ri以及O78-Fi和O78-Ri各0.16μM，Fs和Rs各0.4μM，exTaq 1U，上述样品DNA模板1.0μL，ddH2O补足20μL。
PCR条件为：94℃，10min；94℃30s，56℃1min，72℃1min，10个循环；94℃15s，72℃90s，3个循环；94℃15s，56℃15s，72℃30s，25个循环；最后72℃后延伸5min；预变性94℃3min；94℃变性30s，60℃退火30s和72℃延伸30s，共30循环；终延伸72℃5min。
将5μL PCR产物用1％琼脂糖电泳分离，电泳结果如附图1所示，其中1为沙门菌和大肠杆菌混合DNA模板；2-4为沙门菌属，分别为鸡肠炎沙门菌(S.enterica，CICC21510)、鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium，CMCC50115)、猪霍乱沙门氏菌(S.choleraesuis，ATCC13312)；5-6为2株大肠杆菌O78(E.coli O78，CVCC1490和ATCC35401)；7为大肠杆菌O2(E.coli O2，CVCC1562)；8-9为大肠杆菌(E.coli，CMCC44102和CICC10413)；10为金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，CMCC26003)；11为铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa，ATCC27853)；12-13为2株志贺氏菌：痢疾志贺氏菌(Shigelladysenteriae，CMCC51252)和福氏志贺氏菌(S.flexneri，CMCC51572)；14为阪崎肠杆菌(Enterobacter Sakazakii，CMCC45401)；15为大肠杆菌O157(E.coli O157，CVCC248)；16为粪肠球菌(Enterococcus faecalis，ATCC29212)；17-18为2株芽孢杆菌：蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus，CMCC63301)和枯草芽孢杆菌(B.subtilis，CMCC63501)；19为单增李斯特菌(Listeriamonocytogenes，GIM1.347)；20为白色念珠菌(Candida albican，ATCC10231)；21为清水对照。结果表明引物组合扩增2株大肠杆菌O78产生约300bp左右的条带，扩增沙门菌不同菌种均可得到约500bp大小的条带，扩增其他菌均无条带产生。此结果说明所设计沙门菌和大肠杆菌O78引物具有高度特异性，不能扩增非靶标菌。对沙门菌和大肠杆菌O78的特异扩增条带进行回收测序，大肠杆菌O78扩增特异条带实际大小为304bp，沙门菌特异扩增条带大小为421bp，与引物设计预期一致，说明所设计引物特异性好。在混合DNA样品中，各目标条带清晰，分子量与预期吻合，扩增结果与预期一致。此结果说明该双重Tem-PCR检测体系在优化的反应条件和反应体系下有很好的扩增特异性。
(3)双重Tem-PCR灵敏度检测实验
将步骤(2)中的双重Tem-PCR反应体系在优化的反应条件下进行灵敏度检测实验。取过夜增菌液，10倍倍比稀释后LB平板计数，同时高温裂解法制备核酸，并以此为模板进行双重Tem-PCR扩增，每个处理3个重复。电泳结果见附图2。附图中，M6-M0分别为浓度为106-100cfu/mL大肠杆菌O78菌液和沙门氏菌混合菌液制备的DNA样品；Nc为ddH2O阴性对照。结果表明：双重Tem-PCR体系扩增106-100cfu/mL大肠杆菌O78不同浓度菌液DNA均可产生约300bp大小的条带，说明大肠杆菌O78检测灵敏度约100cfu/mL；双重Tem-PCR体系扩增106-101cfu/mL的沙门菌DNA，均可产生约500bp大小的扩增条带，菌液浓度为100cfu/mL时扩增条带不可见，说明沙门菌的检测灵敏度约为101cfu/mL，而普通双重PCR检测沙门菌和大肠杆菌O78的灵敏度分别为104cfu/mL和102cfu/mL。此结果说明所建立的多重扩增体系比普通双重PCR提高了2-3个数量级，呈现较好的检测灵敏度。
实施例2
一种鸡粪样品中沙门菌和大肠杆菌O78双重Tem-PCR快速检测方法，在无菌鸡粪中添加沙门菌或大肠杆菌O78后增菌培养，提取鸡粪样品中总DNA，利用实施例1中所述体系进行双重Tem-PCR扩增，然后通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。
本实施例所用主要试剂和仪器同实施例1.
上述鸡粪样品中沙门菌和大肠杆菌O78双重Tem-PCR快速检测方法具体包括以下步骤：
取高温高压灭菌的新鲜鸡粪1g加入10倍梯度倍比稀释的沙门菌和大肠杆菌O78菌液1mL，LB液体培养基补足5mL，37℃，200rpm，增菌5h；低速离心5min；取1mL上清，12000rpm离心5min，弃上清，加入100μL ddH2O悬浮沉淀，置100℃水浴煮沸10～15min。12000rpm离心3min，上清即为DNA模板。
利用实施例1中所建立的双重Tem-PCR扩增体系对上述DNA模板进行扩增，反应体系和反应条件同前“双重Tem-PCR扩增反应体系的建立”。电泳结果见附图3。附图3中，M为DL1000DNA Marker；Pc为沙门菌和O78等量DNA混合样品阳性质控；M5-M0分别为1g灭菌鸡粪中加入浓度为105-100cfu/mL大肠杆菌O78和沙门菌混合菌液制备的DNA样品；K为灭菌鸡粪未添加菌液阴性对照Nc为ddH2O阴性对照。扩增结果表明：加入同等浓度105-100cfu/mL沙门菌和大肠杆菌O78的混合鸡粪样品，采用化学裂解和高温裂解制备的DNA样品双重Tem-PCR扩增均可产生约500bp和300bp两条扩增条带；K和Nc无扩增条带。此结果说明增菌培养5h后，鸡粪中大肠杆菌O78和沙门菌的检测灵敏度均可达100cfu/mL，比普通多重PCR检测沙门菌(检测灵敏度为103cfu/mL)和大肠杆菌O78(灵敏度为102cfu/mL)灵敏度提高了2-3个数量级，呈现较好的检测灵敏度。
实验结果表明鸡粪样品DNA提取方法简单高效。本实施例实验也同时采用酚氯仿法抽提DNA，扩增结果和高温煮沸法制备的DNA扩增结果没有明显差别，但是浪费试剂和时间，有悖于分子诊断快速简便的基本要求，所以建议采用上述高温裂解法进行带菌鸡粪样品中总DNA的制备。
实施例3
一种奶粉样品中沙门菌和大肠杆菌O78双重Tem-PCR快速检测方法，在无菌奶粉中添加沙门菌或大肠杆菌O78后增菌培养，提取奶粉样品中总DNA，利用实施例1中所述体系进行双重Tem-PCR扩增，然后通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。
本实施例所用主要试剂和仪器同实施例1.
上述奶粉样品中沙门菌和大肠杆菌O78双重Tem-PCR快速检测方法具体包括以下步骤：
取奶粉5g加入100mL LB液体培养基中，高压灭菌后取1mL添加10倍梯度倍比稀释的沙门菌和大肠杆菌O78菌液各100uL，37℃250rpm增菌5h；12000rpm离心5min，弃上清，加入100μL ddH2O悬浮沉淀，置100℃水浴煮沸10～15min。12000rpm离心3min，上清即为DNA模板。
利用实施例1中所建立的双重Tem-PCR扩增体系对上述DNA模板进行扩增，反应体系和反应条件同前“双重Tem-PCR扩增反应体系的建立”。电泳结果见附图4。附图4中，M为DL1000DNA Marker；Pc为沙门菌和O78等量DNA混合样品阳性质控；M5-M0分别为灭菌奶粉中加入浓度为105-100cfu/mL大肠杆菌O78和沙门菌混合菌液制备的DNA样品；K为灭菌奶粉未添加菌液阴性对照；Nc为ddH2O阴性对照。扩增结果表明：加入同等浓度105-100cfu/mL沙门菌和大肠杆菌O78的混合奶粉样品制备的DNA双重Tem-PCR扩增均可产生约500bp和300bp两条扩增条带；K和Nc无扩增条带。此结果说明增菌培养5h后，奶粉中大肠杆菌O78和沙门菌的检测灵敏度均可达100cfu/mL，比普通多重PCR检测奶粉中大肠杆菌O78(检测灵敏度约101cfu/mL)和沙门菌(检测灵敏度约为103cfu/mL)灵敏度分别高了1个和3个数量级，呈现较好的检测灵敏度。同时基本满足卫生检验检疫规则所规定食品中对沙门菌不得检出的要求。
食源性致病微生物的检验通常采用24h静置增菌培养，这种方法可以尽可能降低非菌体DNA对于PCR扩增的抑制作用从而提高检测灵敏度，但是延长了检测时间，同时降低检测效率。本实施例采用恒温震荡增菌培养结合差速离心法制备混合样品的DNA，仅用5h可使待检菌浓度达到可检测水平，加上PCR反应时间，可在8h内获得检测结果，大大提高了检测效率。
实施例4
一种化妆水样品中沙门菌和大肠杆菌O78双重Tem-PCR快速检测方法，在无菌化妆水中添加沙门菌或大肠杆菌O78后增菌培养，提取化妆水样品中总DNA，利用实施例1中所述体系进行双重Tem-PCR扩增，然后通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。
本实施例所用主要试剂和仪器同实施例1.
上述化妆水样品中沙门菌和大肠杆菌O78双重Tem-PCR快速检测方法具体包括以下步骤：
取107cfu/mL的沙门菌和大肠杆菌O78用灭菌化妆水10倍比梯度稀释，分别取不同浓度的化妆水稀释菌液100uL加入900uL LB液体培养基中，37℃250rpm增菌5h；SDS法裂解制备DNA模板。
利用实施例1中所建立的双重Tem-PCR扩增体系对上述DNA模板进行扩增，反应体系和反应条件同前“双重Tem-PCR扩增反应体系的建立”。电泳结果见附图5。附图5中，M为DL1000DNA Marker；Pc为沙门菌和O78等量DNA混合样品阳性质控；M5-M0分别为化妆水中加入浓度为105-100cfu/mL大肠杆菌O78和沙门菌混合菌液制备的DNA样品；K为灭菌化妆水未添加菌液阴性对照Nc为ddH2O阴性对照。扩增结果表明：加入同等浓度105-100cfu/mL沙门菌和大肠杆菌O78的混合化妆水样品制备的DNA双重Tem-PCR扩增均可产生约500bp和300bp两条扩增条带；K和Nc无扩增条带。此结果说明增菌培养5h后，化妆水中大肠杆菌O78和沙门菌的检测灵敏度均可达100cfu/mL，呈现较好的检测灵敏度。比普通多重PCR检测奶粉中大肠杆菌O78(检测灵敏度约101cfu/mL)和沙门菌(检测灵敏度约为103cfu/mL)灵敏度分别高了1个和3个数量级，呈现较好的检测灵敏度。
以上所述的本发明实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何使用本发明引物序列或部分序列(连续碱基相似度不高于50％)用于分子检测，包括各种等温或变温PCR以及基因芯片等分子杂交技术的应用均在本发明的权力要求保护范围之内。任何在本发明的精神和原则之内所作的修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的权利要求保护范围之内。

Claims (6)

1.用于沙门菌和大肠杆菌O78双重Tem-PCR快速检测的引物，其特征在于，包括：
(1)具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列；或
(2)与(1)的核苷酸序列具有基本序列同源性，并具有相同功能的核苷酸序列。
2.采用权利要求1所述引物对沙门菌和大肠杆菌O78的双重Tem-PCR快速检测方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)设计和合成引物；所述引物包括超级引物Fs和Rs、扩增沙门菌的外引物invA-F0和invA-R0、内引物invA-Fi和invA-Ri以及扩增大肠杆菌O78的特异性的内引物O78-Fi和O78-Ri和外引物O78-F0和O78-R0；
扩增沙门菌的外引物invA-F0和invA-R0、内引物invA-Fi和invA-Ri以及扩增大肠杆菌O78的特异性的内引物O78-Fi和O78-Ri和外引物O78-F0和O78-R0如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列；
(2)样品DNA模板制备；包括：
a)取沙门菌或大肠杆菌O78的菌液1mL于12000r/min离心5min；沉淀加入100μL无菌水，混匀后，于100℃沸水浴10～15min，立即冰浴5min，12000r/min离心5min，上清液即为DNA模板；或
b)取1g新鲜鸡粪加入5mL LB液体培养基，37℃，200rpm，增菌5h；低速离心5min；取1mL上清，12000rpm离心5min，弃上清，加入100μL ddH2O悬浮沉淀，置100℃水浴煮沸10～15min；12000rpm离心3min，上清即为DNA模板；或
c)取奶粉5g加入100mL LB液体培养基中，高压灭菌后取1mL添加10倍梯度倍比稀释的沙门菌和大肠杆菌O78菌液各100uL，37℃250rpm增菌5h；12000rpm离心5min，弃上清，加入100μL ddH2O悬浮沉淀，置100℃水浴煮沸10～15min。12000rpm离心3min，上清即为DNA模板；或
d)取107cfu/mL的沙门菌和大肠杆菌O78用灭菌化妆水10倍比梯度稀释，分别取不同浓度的化妆水稀释菌液100uL加入900uL LB液体培养基中，37℃250rpm增菌5h；SDS法裂解制备DNA模板；
(3)双重Tem-PCR扩增反应；所述双重Tem-PCR扩增反应是以步骤(2)提取的DNA作为模板，采用双重Tem-PCR法进行扩增，扩增体系和反应条件如下：
2×PCR buffer 2μL，0.4mM dNTP，外引物invA-F0和invA-R0以及O78-F0和O78-R0各0.04μM，内引物invA-Fi和invA-Ri以及O78-Fi和O78-Ri各0.16μM，Fs和Rs各0.4μM，DNA聚合酶1U，MgCl22mM，DNA模板1.0μL，ddH2O补足20μL；PCR扩增条件为：94℃，10min；94℃30s，56℃1min，72℃1min，10个循环；94℃15s，72℃90s，3个循环；94℃15s，56℃15s，72℃30s，25个循环；最后72℃后延伸5min；
(4)将PCR扩增反应产物进行琼脂糖电泳检测；将5μL所述扩增反应产物用1％琼脂糖电泳分离，根据条带有无和大小判定结果。
3.根据权利要求2所述的双重Tem-PCR快速检测方法，其特征在于，所述MgCl2的浓度为2～3mM。
4.根据权利要求2所述的双重Tem-PCR快速检测方法，其特征在于，所述dNTP的浓度为0.2～0.5mM。
5.根据权利要求2所述的双重Tem-PCR快速检测方法，其特征在于，所述外引物的浓度从0μM到0.1μM；内引物的浓度从0.1μM到0.2μM。
6.根据权利要求2所述的双重Tem-PCR快速检测方法，其特征在于，所述DNA聚合酶为Taq酶，浓度为1.0～3.0U。
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