CN103981278A - 利用Tem-PCR技术检测多种致病菌的PCR检测通用引物对 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种利用Tem-PCR技术检测多种致病菌的PCR检测通用引物对，如序列表SeqIDNo.1及SeqIDNo.2所示。首先设计并合成检测三种致病菌的特异性引物，分别如序列表SeqIDNo.3-SeqIDNo.8所示；再设计一对通用引物与之相联，如序列表SeqIDNo.1及SeqIDNo.2所示，形成嵌合引物，利用嵌合引物和通用引物进行PCR扩增检测致病菌。该方法简单快速、特异性好，为致病菌的检测提供了新的方法。

Description

利用Tem-PCR技术检测多种致病菌的PCR检测通用引物对
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种利用Tem-PCR技术检测多种致病菌的PCR检测通用引物对。
背景技术
目前对致病菌的检测方法主要有国标法、酶联荧光免疫检测法、聚合酶链式反应(PCR)、金标试纸法、DNA探针技术、LAMP恒温扩增法,这些方法都有存在不足之处，即检测通量不高。多重PCR方法是提高检测通量的基本方法。许多高通量技术，如基因芯片法、高效液相色谱法都基于多重PCR方法。但多重PCR技术引物设计困难，常常出现扩增效率不均衡问题，造成假阴性结果。同时还容易出现引物二聚体，给检测带来了难题。
发明内容
本发明针对多重PCR存在的问题，采用靶序列富集多重PCR(target，enrichedmultiplex PCR，Tem-PCR)技术，它的原理是针对待扩增的每一种靶序列，设计特异性引物，再编制一个通用引物(SuperPrimer)与之相联，形成嵌合引物，利用嵌合引物和通用引物(SuperPrimer)进行扩增。其独特之处在于嵌合引物的浓度极低，用在PCR的最初几个循环中富集目标序列。只有超级引物的浓度足以进行指数扩增，这样克服多重PCR的扩增偏爱性问题，解决了传统的多重PCR技术导致的假阴性结果问题。
本发明的目的在于提供一种利用Tem-PCR技术检测多种致病菌的PCR检测通用引物对，本发明的目的通过以下技术实现：
一种利用Tem-PCR技术检测多种致病菌的PCR检测通用引物对，如下：
上引物Super-F：如序列表Seq ID No.1所示，
下引物Super-R：如序列表Seq ID No.2所示。
本发明的另外一个目的是提供一种利用Tem-PCR技术检测多种致病菌的PCR检测嵌合引物组，由3对引物对组成，其中：
用于检测肠出血性大肠杆菌O157：H7引物对为：
上引物O157TEM-F：如序列表Seq ID No.3所示，
下引物O157TEM-R：如序列表Seq ID No.4所示；
用于检测单核细胞增生李斯特菌引物对为：
上引物单增TEM-F：如序列表Seq ID No.5所示，
下引物单增TEM-R：如序列表Seq ID No.6所示；
用于检测沙门氏菌引物对为：
上引物沙门TEM-F：如序列表Seq ID No.7所示，
下引物沙门TEM-R：如序列表Seq ID No.8所示。
本发明还有一个目的是提供一种利用Tem-PCR技术检测多种致病菌的方法，包括如下步骤：
(1)、PCR模板的制备；
(2)、合成一对非同源性通用引物，保证这对引物与细菌没有同源性，
上引物Super-F：如序列表Seq ID No.1所示，
下引物Super-R：如序列表Seq ID No.2所示；
(3)、利用NCBI网站，选择致病菌保守区域基因设计并合成3对嵌合引物对；
确定肠出血性大肠杆菌O157：H7的靶基因为rfbE，设计引物对：
上引物O157TEM-F：如序列表Seq ID No.3所示，
下引物O157TEM-R：如序列表Seq ID No.4所示；
单核细胞增生李斯特菌的靶基因为hly，设计引物对：
上引物单增TEM-F如序列表Seq ID No.5所示，
下引物单增TEM-R：如序列表Seq ID No.6所示；
沙门氏菌的靶基因为invA，设计引物对：
上引物沙门TEM-F：如序列表Seq ID No.7所示，
下引物沙门TEM-R：如序列表Seq ID No.8所示；
(4)、Tem-PCR检测多种致病菌的PCR条件的优化。
本发明还具有如下特征：
如上所述一种利用Tem-PCR技术检测多种致病菌的方法，其中步骤(3)所述Tem-PCR检测多种致病菌的PCR条件的优化结果如下：
10×PCR Buffer 2.5μL
dNTP 0.4mmol/L
Super-F 10μmol/L
Super-R 10μmol/L
O157TEM-F 8nmol/L
O157TEM-R 8nmol/L
单增TEM-F 8nmol/L
单增TEM-R 8nmol/L
沙门TEM-F 8nmol/L
沙门TEM-R 8nmol/L
Taq DNA Polymerase 2.0U
DNA模板 0.5μL
ddH2O 补充至25μL
；PCR反应条件为：预变性94℃10min；94℃30s，62℃1.5min，10个循环；94℃30s，46℃30s，72℃30s，共35个循环；72℃延伸5min。
本发明克服了多重PCR的扩增偏爱性问题，解决了传统多重PCR技术导致的假阴性结果的问题。Tem-PCR法比多重PCR法扩增效率均衡，扩增结果好。
附图说明
图1为TEM-PCR法与多重PCR法扩增目的片段的结果图，
其中：1为TEM-PCR法扩增的目的条带，2为多重PCR法扩增的目的条带。
具体实施方式
下面通过具体的实施例对本发明作进一步详细的描述。
实施例1
PCR模板的制备
参照天根TIANamp Bacteria DNA Kit说明书以下述表1所示的各种菌为样本进行细菌基因组DNA的提取和纯化。
实施例2
引物的设计与合成
1、非同源性通用引物的设计与合成
合成一对非同源性通用引物(或称超级引物)，保证这对引物与细菌没有同源性，是非同源性独特序列。引物序列如下所示：
Super-F：AACTGTGTTTACTACTAGG；
Super-R：GGATTTAATGGCTACTCTC。
2、特异性引物的设计与合成
利用NCBI网站，并参考相关文献，选择致病菌保守区域基因。
利用dnaman软件对下载的肠出血性大肠杆菌O157：H7、单核细胞增生李斯特菌、沙门氏菌3种致病菌保守区核苷酸序列进行比对，寻找出比较适合设计特异性的核苷酸序列区域。确定肠出血性大肠杆菌O157：H7的靶基因为rfbE，单核细胞增生李斯特菌的靶基因为hly，沙门氏菌的靶基因为invA。然后利用oligo6Demo设计特异性引物，并进行评价和筛选，确保扩增片段的大小差异在50bp以上，再利用Blast进行比对验证。最后在正向引物和反向引物的5’端各连接已设计好的通用引物，形成嵌合引物。引物序列如下所示：
(1)、肠出血性大肠杆菌O157：H7引物对为：
O157TEM-F：5’-AACTGTGTTTACTACTAGGAATTGAAGATTGCGCTGAAG-3’
O157TEM-R：5’-GGATTTAATGGCTACTCTCGTGTGGACAGGGTAAAAAAC-3’
(2)、单核细胞增生李斯特菌引物对为：
单增TEM-F：5’-AACTGTGTTTACTACTAGGGTAAGCGGAAAATCTGTCTC-3’
单增TEM-R：5’-GGATTTAATGGCTACTCTCATTTCGTTACCTTCAGGATC-3’
(3)、沙门氏菌引物对为：
沙门TEM-F：5’-AACTGTGTTTACTACTAGGGTGGGTTTTGTTGTCTTCTC-3’
沙门TEM-R：5’-GGATTTAATGGCTACTCTCAAGATAATAATGATGCCGGC-3’
实施例3
Tem-PCR检测多种致病菌的PCR条件的优化
首先设定若干个不同的通用引物、特异性引物浓度，通过正交实验优化引物使用浓度。然后再设定若干个前循环数、后循环数，也通过正交实验优化Tem-PCR扩增循环数。最后确定Tem-PCR方法检测多种致病菌的PCR反应条件如下：
PCR反应条件为：预变性94℃10min；94℃30s，62℃1.5min，10个循环；94℃30s，46℃30s，72℃30s，共35个循环；72℃延伸5min。
实施例4
Tem-PCR检测多种致病菌特异性实验结果
利用琼脂糖凝胶电泳方法检测扩增结果，确定方法的特异性。结果显示，对表1所列菌株进行特异性的检测，除目标菌外，未见阳性反应，证明本发明方法具有较强的特异性。
表1Tem-PCR特异性实验结果
实施例5Tem-PCR法与多重PCR法的比较
分别采用Tem-PCR法和多重PCR法同时检测肠出血性大肠杆菌O157：H7、单核细胞增生李斯特菌、沙门氏菌三种菌。多重PCR的反应条件如下所示：
反应条件为：预变性94℃10min；94℃30s，62℃30s，72℃30s，共35个循环；72℃延伸5min。
PCR反应结果如图1所示。实验结果显示：两种方法在未经优化引物使用浓度的情况下，Tem-PCR法能够扩增出三条目的条带，而多重PCR法只能扩增出两条目的条带，无单核细胞增生李斯特菌的扩增条带，由此证明Tem-PCR法比多重PCR法扩增效率均衡，扩增结果好。
<110>黑龙江出入境检验检疫局检验检疫技术中心
<120>利用Tem-PCR技术检测多种致病菌的PCR检测通用引物对
<160>8
<210>1
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
AACTGTGTTT  ACTACTAGG
<210>2
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
GGATTTAATG  GCTACTCTC  19
<210>3
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
AACTGTGTTT  ACTACTAGGA  ATTGAAGATT  GCGCTGAAG  39
<210>4
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
GGATTTAATG  GCTACTCTCG  TGTGGACAGG  GTAAAAAAC  39
<210>5
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<400>5
AACTGTGTTT  ACTACTAGGG  TAAGCGGAAA  ATCTGTCTC  39
<210>6
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<400>6
GGATTTAATG  GCTACTCTCA  TTTCGTTACC  TTCAGGATC  39
<210>7
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<400>7
AACTGTGTTT  ACTACTAGGG  TGGGTTTTGT  TGTCTTCTC  39
<210>8
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<400>8
GGATTTAATG  GCTACTCTCA  AGATAATAAT  GATGCCGGC  39
 

Claims (4)

1.一种利用Tem-PCR技术检测多种致病菌的PCR检测通用引物对，其特征在于，
上引物Super-F：如序列表Seq ID No.1所示，
下引物Super-R：如序列表Seq ID No.2所示。
2.一种利用Tem-PCR技术检测多种致病菌的PCR检测嵌合引物组，其特征在于，由3对引物对组成，其中：
用于检测肠出血性大肠杆菌 O157：H7引物对为：
上引物O157TEM-F：如序列表Seq ID No.3所示，
下引物O157TEM-R：如序列表Seq ID No.4所示；
用于检测单核细胞增生李斯特菌引物对为：
上引物单增TEM-F：如序列表Seq ID No.5所示，
下引物单增TEM-R：如序列表Seq ID No.6所示；
用于检测沙门氏菌引物对为：
上引物沙门TEM-F：如序列表Seq ID No.7所示，
下引物沙门TEM-R：如序列表Seq ID No.8所示。
3.一种利用Tem-PCR技术检测多种致病菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）、PCR模板的制备；
（2）、合成一对非同源性通用引物，保证这对引物与细菌没有同源性，
上引物Super-F：如序列表Seq ID No.1所示，
下引物Super-R：如序列表Seq ID No.2所示；
（3）、利用NCBI网站，选择致病菌保守区域基因设计并合成3对嵌合引物对；
确定肠出血性大肠杆菌 O157：H7的靶基因为rfbE，设计引物对：
上引物O157TEM-F：如序列表Seq ID No.3所示，
下引物O157TEM-R：如序列表Seq ID No.4所示；
确定单核细胞增生李斯特菌的靶基因为hly，设计引物对：
上引物单增TEM-F如序列表Seq ID No.5所示，
下引物单增TEM-R：如序列表Seq ID No.6所示；
确定沙门氏菌的靶基因为invA，设计引物对：
上引物沙门TEM-F：如序列表Seq ID No.7所示，
下引物沙门TEM-R：如序列表Seq ID No.8所示；
（4）、Tem-PCR检测多种致病菌的PCR条件的优化。
4.如权利要求3所述一种利用Tem-PCR技术检测多种致病菌的方法，其特征在于，步骤（3）所述Tem-PCR检测多种致病菌的PCR条件的优化结果如下：
10×PCR Buffer 2.5μL dNTP 0.4mmol/L Super-F 10μmol/L Super-R 10μmol/L O157TEM-F 8nmol/L O157TEM-R 8nmol/L 单增TEM-F 8nmol/L 单增TEM-R 8nmol/L 沙门TEM-F 8nmol/L 沙门TEM-R 8nmol/L Taq DNA Polymerase 2.0U DNA模板 0.5μL ddH2O 补充至25μL
；PCR反应条件为：预变性94℃ 10min；94℃ 30s，62℃ 1.5min，10个循环；94℃ 30s，46℃ 30s，72℃ 30s，共35个循环；72℃延伸5min。
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