CN107502672B - 同时检测多种食源性致病菌的试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种同时检测多种食源性致病菌的试剂盒及其应用，属于食源性致病菌检测技术领域。本发明由固定有19种致病菌特异性探针的食源性致病菌并行检测基因芯片、特异性引物和通用引物组成。本发明可以一次反应同时对结肠弯曲菌、空肠弯曲菌、阪崎肠杆菌等19种食品典型致病菌进行快速、灵敏的检测。提供传统方法无法提供的多重扩增、多重检测相结合的检测数据，该检测方法从样品处理到检测结果仅需1‑2小时左右，准确率为100%，操作步骤简单，检测时间短，特异性强，灵敏度高，重复性好；可对引起食源性疾病的19种病原体进行准确的分型检测，用作食源性致病菌的快速筛查。
Description
技术领域
本发明涉及食源性病菌检测技术领域，特别涉及一种同时检测多种食源性致病菌的试剂盒及其应用。
背景技术
由食源性致病菌引起的食源性疾病已成为当今世界上最关注的公共卫生问题之一。WHO将大肠杆菌O157、沙门氏菌、志贺氏菌及单核细胞增生李斯特菌依次列为四种重要的食源性致病菌，并且列为中国进出口产品的必检项目。在我国，沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌为食物中最常见病原菌。据我国2013年卫生部的全国食物中毒事件情况通报显示，微生物性食物中毒人数最多，占食物中毒事件总中毒人数的60.4％，主要是由沙门氏菌、副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、志贺氏菌等引起的细菌性食物中毒。这些致病菌的存在严重威胁着人类健康，快速检测食品中的致病菌是保障食品质量安全，预防食源性疾病暴发的有效手段。
目前对于食源性病原菌的检测大多仍沿用细菌培养及生化鉴定方法，检验步骤繁琐复杂，检测周期较长，而且无法对难以培养的病原菌进行检测；而一些简单的分子生物学和免疫学方法存在着假阳性率较高以及一次只能检测一种或几种致病菌等缺点和不足，不能满足食品安全快速检测需求，也不利于食物中毒等突发事件处理。因此需要建立一种简便、快速、准确的食源性致病菌筛查和检验技术，以满足日常检测的需求。
发明内容
为了弥补现有技术的不足，解决现有技术中食源性病原菌检测步骤繁琐。检测周期长、无法检测难以培养的病菌、一次性检测种类少的问题，本发明提供了一种同时检测多种食源性致病菌的试剂盒及其制作方法和应用。
本发明的技术方案为：
一种同时检测多种食源性致病菌的试剂盒，由固定有19种致病菌特异性探针的食源性致病菌并行检测基因芯片、特异性引物和通用引物组成；其中所述19种致病菌为结肠弯曲菌、空肠弯曲菌、阪崎肠杆菌、大肠杆菌O157、肠集聚性大肠杆菌、肠出血性大肠杆菌、肠致病性大肠杆菌、肠产毒性大肠杆菌、产志贺毒素大肠杆菌、出血性大肠杆菌、单核增生性李斯特菌、沙门氏菌、志贺菌、金黄色葡萄球菌、霍乱弧菌CTX型、霍乱弧菌OMPW型、副溶血弧菌、小肠结肠炎耶尔森菌-yst型、小肠结肠炎耶尔森菌-ail型；所述特异性引物为能对所述19种致病菌靶基因进行特异性扩增的引物；所述通用引物为与所述19种致病菌靶基因无关的核酸序列；其中所述通用引物中的反向通用引物5’端带有荧光标记。
作为优选方案，所述食源性致病菌并行检测基因芯片中19种致病菌特异性探针为：
结肠弯曲菌：5’—ACC TTT GAC GGC ATT ATC TC—3’；
空肠弯曲菌：5’—ATC CAT CTT CTA TCA TTG CC—3’；
阪崎肠杆菌：5’—AAC TGG GAC CAA CCC AGT TT—3’；
大肠杆菌O157：5’—ACG GGT CAA CGT TAG AAC AT—3’；
肠集聚性大肠杆菌：5’—ATT CCG TAT ATT ATC ATC AG—3’；
肠出血性大肠杆菌：5’—AAC TGC TCT GGA TGC ATC TC—3’；
肠致病性大肠杆菌：5’—CAC CAT TGC AGA TTC AAT CA—3’；
肠产毒性大肠杆菌：5’—CAA TAC ATA TAA TAT AGA GG—3’；
产志贺毒素大肠杆菌：5’—ATG CAT CTC TGG TCA TTG TA—3’；
出血性大肠杆菌：5’—CAC CTT CAC CTG TAG TAA TA—3’；
单核增生性李斯特菌：5’—TTC AAG CTA TTA TTT ACA GC—3’；
沙门氏菌：5’—CGA TCA AAT ATC TGC GGC GT—3’；
志贺菌：5’—ACG GAA TCC GGA GGT ATT GC—3’；
金黄色葡萄球菌：5’—TAA CCG TAT CAC CAT CAA CT—3’；
霍乱弧菌CTX型：5’—ACC TGG TAC TTC TAC TTG AA—3’；
霍乱弧菌OMPW型：5’—TGC ATT ATT AGT ACC CGT AC—3’；
副溶血弧菌：5’—TTG TAA CCT TGC GCT TTG TA—3’；
小肠结肠炎耶尔森菌-yst型：5’—TTG AAG CCG TCT CTT GGC CT—3’；
小肠结肠炎耶尔森菌-ail：5’—CCT GAT GAG TAT AAG CAA AC—3’。
作为优选方案，所述特异性引物的序列如下：
结肠弯曲菌：5’—CCA CCT GTA ATC ACT CCT AAT ACC
5’—GCC CAC ATT GTT AAA GAT GCT C
空肠弯曲菌：5’—TGC TGA AGA GGG TTT GGG TG
5’—AGA AGC CAT CAT CGC ACC T
阪崎肠杆菌：5’—CCG CAC CGA AAG ATA ACA C
5’—CCA GCC AGT CGT AGC CCA TT
大肠杆菌O157：5’—AGC CGA CCT TGA AAT ACC ACC C
5’—CCT TCG TGC TCC TCC GTT ACT C
肠集聚性大肠杆菌：5’—TCC ATT TAT CGC AAT CAG AT
5’—AGA ATC GTC AGC ATC AGC
肠出血性大肠杆菌：5’—ATC TGG CGT TAA TGG AGT
5’—TCA TCG TAT AAA CAG GAG C
肠致病性大肠杆菌：5’—AAT CAT GAA TAA GAA ATA CG
5’—ACC ATT AAT TGC AGA CGT TGC
肠产毒性大肠杆菌：5’—TGC CTG TGC TGG ATG TTA TT
5’—CCA GAC GGT TCA GAT GAG GC
产志贺毒素大肠杆菌：5’—ATA TCT GGC GTT AAT GGA G
5’—CTC CCG GCG TCA TCG TAT
出血性大肠杆菌：5’—ATA TGT GGG AAC ATT TGG AG
5’—TGC CTA TGT ACA GCT AAT CC
单核增生性李斯特菌：5’—CGA AAT GGC TTA CAG TGA ATC AC
5’—AAT CTG GAA GGT CTT GTA GGT TC
沙门氏菌：5’—GAA ATG CCA AAG ACT GCG
5’—TCA ATG AAT AGC CGA GGT
志贺菌：5’—TTC CTT GAC CGC CTT TCC G
5’—GCA TCA GCA GCA ACA GCG
金黄色葡萄球菌：5’—CAT AAA GAA CCT GCG ACA T
5’—GCA CTT GCT TCA GGA CCA TA
霍乱弧菌CTX型：5’—AGA TGG CTA TCA TTA CTT
5’—GAG GCG TTT TAT TAT TCC
霍乱弧菌OMPW型：5’—ATG TTG GTG CGG GTT TGA
5’—ACC ACA CAG AAG CGT TGA GG
副溶血弧菌：5’—TGC GAA AGT GCT TGA GAT G
5’—GAT GAG CGG TTG ATG TCC
小肠结肠炎耶尔森菌-yst型：5’—GTG ATG GAG GTT CTA TGA A
5’—TCT GAG TAT CGC ACG CTT
小肠结肠炎耶尔森菌-ail：5’—AAC CTG AAG TAC CGT TAT G
5’—GTT GAT GCG GAA AGA TGG
以上所有特异性引物5’端都带有一个通用引物标签，通用引物序列如下：
5’—CCG TGT TAC TGG CAT AGT CG
5’—TCC TGT GCT CTC TTA CTG TG。
作为优选方案，所述食源性致病菌并行检测基因芯片的制备方法，包括步骤：
1)根据所述19种致病菌基因组的保守片段设计探针，长度为20bp；
2)在所述19种致病菌的特异性探针的5’端加上一段8-20bp的poly T，同时进行氨基修饰，用去离子水将探针稀释，并与spotting solution等体积混合，使得终浓度为60-90pmol/ul，通过cartesian microarray制作系统点阵在醛基修饰的载玻片表面，置于70％-80％相对湿度，室温条件下48-72小时进行固定；洗涤并干燥后去除自由醛基；用0.2％SDS震荡洗涤，重复两次，最后用纯水浸泡，晾干；固定有19条特异性探针的食源性致病菌并行检测基因芯片即制作完毕。
进一步地，所述洗涤并干燥具体为将玻片放于0.1-0.3％SDS中震荡洗涤1-3min，取出后室温充分干燥，然后将玻片放于硼氢化钠溶液中震荡3-8min，去除自由醛基。
所述同时检测多种食源性致病菌的试剂盒在食源性致病菌检验检疫中的应用。
所述同时检测多种食源性致病菌的试剂盒在食源性致病菌检验检疫中的应用方法，包括步骤：
1)将所述固定有19种致病菌特异性探针的食源性致病菌并行检测基因芯片固定在卡盒底部的杂交检测槽内；
2)使用商业化的试剂盒提取DNA进行核酸分离；
3)使用所述特异性引物及通用引物进行PCR扩增反应；
4)PCR扩增完成以后卡盒内部的移液枪把所有产物都放到杂交检测槽进行杂交，杂交时芯片底部的加热器将温度控制在65℃；十五分钟杂交结束后移液枪做快速清洗；
5)清洗完的卡盒放到卡盒阅读仪里接受最后的信号检测，卡盒阅读仪里面有激光共聚焦扫描系统和光电倍增管等检测装置，读到的数据通过系统分析软件处理直接以数字的形式显现。
本发明可检测病原体的指标如下：
本发明的有益效果为：
本发明可以一次反应同时对结肠弯曲菌、空肠弯曲菌、阪崎肠杆菌等19种食品典型致病菌进行快速、灵敏的检测。提供传统方法无法提供的多重扩增、多重检测相结合的检测数据，该检测方法从样品处理到检测结果仅需1-2小时左右，准确率为100％，操作步骤简单，检测时间短，特异性强，灵敏度高，重复性好；可对引起食源性疾病的19种病原体进行准确的分型检测，用作食源性致病菌的快速筛查。
具体实施方式
实施本发明使用全自动多基因核酸检测系统，该系统集核酸提取、扩增和检测三个步骤于一体，而且提供了多重、自动、封闭(防污染)这三个实验室检测和临床诊断迫切需要的关键功能，避免污染而导致的假阳性。本发明使用该系统，多个靶点的分子诊断可以在一个小时到两个小时内完成。
把食源性致病菌的检测放到全自动多基因核酸检测系统上来，可以做到一个标本，一个反应，多个指标，达到一次性快速检测多种食源性致病菌的目的。
实施例1：样品核酸的提取
按照国标或者行业标准方法进行对食品样品中的微生物进行增菌培养，使用商品化的细菌基因组DNA提取试剂盒从增菌液中提取细菌DNA。共提取54份标本核酸，其中38份为亚型已知的阳性标本，10份为阴性对照，6份为不相关细菌样本。标本信息如下表：
实施例2：食源性致病菌并行检测基因芯片制备
先在如上19条探针的5’端加上一段8-20bp的poly T,同时进行氨基修饰，用去离子水将探针稀释，并与spotting solution等体积混合，使得终浓度为75pmol/ul,通过cartesian microarray制作系统点阵在醛基修饰的载玻片表面，置于75％相对湿度，室温条件下48-72小时进行固定；取出后将玻片放于0.2％SDS中震荡洗涤2min,取出后室温充分干燥，然后将玻片放于硼氢化钠溶液中震荡5min,以去除自由醛基；用0.2％SDS震荡洗涤1min，重复两次，最后用纯水浸泡2min，晾干；如此，19条探针的食源性致病菌并行检测基因芯片即制作完毕，然后将芯片固定在卡盒底部的杂交检测槽内。
实施例3：PCR扩增和杂交
将上述标本核酸(一个卡盒检测一个标本，根据需要另外还设有一个空白对照。为检测试剂的重复性，每个样本做三个重复)从样品加入孔加入到卡盒中，卡盒中预先装有PCR扩增、杂交检测、清洗所需所有试剂，实施例2制备好的源性致病菌并行检测基因芯片也预先放置在卡盒底部的杂交检测槽中。将卡盒放到卡盒处理仪中，从系统控制软件中编写好反应程序，运行，仪器自动进行PCR扩增、杂交。
(1)采用Qiagen多重PCR Kit，Cat No.206143进行PCR扩增，PCR扩增进行两轮，第一轮PCR扩增反应体系配置如下表：
| 试剂 | 体积(μL) |
| Nuclease free H<sub>2</sub>O | 9.5 |
| Multiplex MM | 12.5 |
| Primers | 1 |
| 模板 | 2 |
| 总体积 | 25.00 |
反应程序如下：
第二轮PCR扩增反应体系配置如下表：
| 试剂 | 体积(μL) |
| Nuclease free H<sub>2</sub>O | 10.5 |
| Multiplex MM | 12.5 |
| 通用引物 | 1 |
| PCR 1产物 | 1 |
| 总体积 | 25.00 |
反应程序如下：
(2)杂交反应：
PCR扩增完成以后卡盒内部的移液枪把所有产物都放到杂交检测槽进行杂交。杂交时芯片底部的加热器将温度控制在65℃。十五分钟杂交结束后移液枪做快速清洗。清洗完的卡盒放到卡盒阅读仪里接受最后的信号检测。
以上所有试剂，包括：核酸提取、PCR扩增、杂交反应、清洗等都预先放置在卡盒底部的相应试剂槽内(为降低成本，也可使用商业化提取试剂盒手工提取核酸，将核酸加入到卡盒中即可)，应用时由卡盒内的移液器来实现精确的液体转移。卡盒为全封闭设计，避免了交叉污染和高浓度产物污染。
扩增、杂交反应程序预先在系统控制软件中编写好，卡盒处理仪应用“转换恒温加热头”扩增技术，通过3个快速转换的固定温度加热头自动实现快速扩增、杂交。
实施例4：信号检测
反应完毕，将卡盒从处理仪中取出，放到卡盒阅读仪中，卡盒阅读仪里面有激光共聚焦扫描系统和光电倍增管等检测装置，读到的数据通过系统分析软件处理直接以数字的形式显现出来，卡盒从阅读仪中拿出来就直接扔掉，封闭体系避免了污染的发生。检测结果如下:
结果分析：
(1)该试剂可以对38份阳性菌核酸样本进行准确分型，特异性高达100％。
(2)重复性好，检测数据批内变异系数(CV)＜10％。
(3)检测10份已知的阴性样本，结果显示均不存在假阳性。
(4)检测6份其它细菌样本，结果显示均为阴性，不存在错检的情况。
检测结果说明：本试剂可以对引起食源性疾病的19种病原体进行准确的分型检测，特异性和重复性均好。进一步临床验证后，可以用作食源性致病菌的快速筛查。
Claims (5)
1.一种同时检测多种食源性致病菌的试剂盒，其特征在于：由固定有19种致病菌特异性探针的食源性致病菌并行检测基因芯片、特异性引物和通用引物组成；其中所述19种致病菌为结肠弯曲菌、空肠弯曲菌、阪崎肠杆菌、大肠杆菌O157、肠集聚性大肠杆菌、肠出血性大肠杆菌、肠致病性大肠杆菌、肠产毒性大肠杆菌、产志贺毒素大肠杆菌、出血性大肠杆菌、单核增生性李斯特菌、沙门氏菌、志贺菌、金黄色葡萄球菌、霍乱弧菌CTX型、霍乱弧菌OMPW型、副溶血弧菌、小肠结肠炎耶尔森菌-yst型、小肠结肠炎耶尔森菌-ail型；所述特异性引物为能对所述19种致病菌靶基因进行特异性扩增的引物；所述通用引物为与所述19种致病菌靶基因无关的核酸序列；其中所述通用引物中的反向通用引物5’端带有荧光标记；
所述食源性致病菌并行检测基因芯片中19种致病菌特异性探针为：
结肠弯曲菌：5’— ACC TTT GAC GGC ATT ATC TC—3’；
空肠弯曲菌：5’— ATC CAT CTT CTA TCA TTG CC —3’；
阪崎肠杆菌：5’— AAC TGG GAC CAA CCC AGT TT —3’；
大肠杆菌O157：5’— ACG GGT CAA CGT TAG AAC AT—3’；
肠集聚性大肠杆菌：5’— ATT CCG TAT ATT ATC ATC AG—3’；
肠出血性大肠杆菌：5’— AAC TGC TCT GGA TGC ATC TC—3’；
肠致病性大肠杆菌：5’— CAC CAT TGC AGA TTC AAT CA—3’；
肠产毒性大肠杆菌：5’— CAA TAC ATA TAA TAT AGA GG—3’；
产志贺毒素大肠杆菌：5’— ATG CAT CTC TGG TCA TTG TA—3’；
出血性大肠杆菌：5’— CAC CTT CAC CTG TAG TAA TA—3’；
单核增生性李斯特菌：5’—TTC AAG CTA TTA TTT ACA GC—3’；
沙门氏菌：5’— CGA TCA AAT ATC TGC GGC GT —3’；
志贺菌：5’— ACG GAA TCC GGA GGT ATT GC —3’；
金黄色葡萄球菌：5’—TAA CCG TAT CAC CAT CAA CT—3’；
霍乱弧菌CTX型：5’— ACC TGG TAC TTC TAC TTG AA—3’；
霍乱弧菌OMPW型：5’— TGC ATT ATT AGT ACC CGT AC—3’；
副溶血弧菌：5’— TTG TAA CCT TGC GCT TTG TA —3’；
小肠结肠炎耶尔森菌-yst型：5’— TTG AAG CCG TCT CTT GGC CT—3’；
小肠结肠炎耶尔森菌-ail：5’—CCT GAT GAG TAT AAG CAA AC—3’；
所述特异性引物的序列如下：
结肠弯曲菌：5’— CCA CCT GTA ATC ACT CCT AAT ACC
5’—GCC CAC ATT GTT AAA GAT GCT C
空肠弯曲菌：5’— TGC TGA AGA GGG TTT GGG TG
5’—AGA AGC CAT CAT CGC ACC T
阪崎肠杆菌：5’— CCG CAC CGA AAG ATA ACA C
5’—CCA GCC AGT CGT AGC CCA TT
大肠杆菌O157：5’— AGC CGA CCT TGA AAT ACC ACC C
5’— CCT TCG TGC TCC TCC GTT ACT C
肠集聚性大肠杆菌：5’— TCC ATT TAT CGC AAT CAG AT
5’— AGA ATC GTC AGC ATC AGC
肠出血性大肠杆菌：5’— ATC TGG CGT TAA TGG AGT
5’— TCA TCG TAT AAA CAG GAG C
肠致病性大肠杆菌：5’— AAT CAT GAA TAA GAA ATA CG
5’— ACC ATT AAT TGC AGA CGT TGC
肠产毒性大肠杆菌：5’— TGC CTG TGC TGG ATG TTA TT
5’— CCA GAC GGT TCA GAT GAG GC
产志贺毒素大肠杆菌：5’— ATA TCT GGC GTT AAT GGA G
5’— CTC CCG GCG TCA TCG TAT
出血性大肠杆菌：5’— ATA TGT GGG AAC ATT TGG AG
5’— TGC CTA TGT ACA GCT AAT CC
单核增生性李斯特菌：5’— CGA AAT GGC TTA CAG TGA ATC AC
5’—AAT CTG GAA GGT CTT GTA GGT TC
沙门氏菌：5’— GAA ATG CCA AAG ACT GCG
5’—TCA ATG AAT AGC CGA GGT
志贺菌：5’— TTC CTT GAC CGC CTT TCC G
5’—GCA TCA GCA GCA ACA GCG
金黄色葡萄球菌：5’— CAT AAA GAA CCT GCG ACA T
5’—GCA CTT GCT TCA GGA CCA TA
霍乱弧菌CTX型：5’—AGA TGG CTA TCA TTA CTT
5’—GAG GCG TTT TAT TAT TCC
霍乱弧菌OMPW型：5’— ATG TTG GTG CGG GTT TGA
5’—ACC ACA CAG AAG CGT TGA GG
副溶血弧菌：5’— TGC GAA AGT GCT TGA GAT G
5’—GAT GAG CGG TTG ATG TCC
小肠结肠炎耶尔森菌-yst型：5’— GTG ATG GAG GTT CTA TGA A
5’—TCT GAG TAT CGC ACG CTT
小肠结肠炎耶尔森菌-ail：5’— AAC CTG AAG TAC CGT TAT G
5’—GTT GAT GCG GAA AGA TGG
以上所有特异性引物5’端都带有一个通用引物标签，通用引物序列如下：
5’ —CCG TGT TAC TGG CAT AGT CG
5’ —TCC TGT GCT CTC TTA CTG TG。
2.如权利要求1所述同时检测多种食源性致病菌的试剂盒，其特征在于，所述食源性致病菌并行检测基因芯片的制备方法，包括步骤：
1）根据所述19种致病菌基因组的保守片段设计探针，长度为20bp；
2）在所述19种致病菌的特异性探针的5’端加上一段8-20 bp的poly T，同时进行氨基修饰，用去离子水将探针稀释，并与spotting solution等体积混合，使得终浓度为60-90pmol/ul，通过 cartesian microarray制作系统点阵在醛基修饰的载玻片表面，置于70%-80%相对湿度，室温条件下48-72小时进行固定；洗涤并干燥后去除自由醛基；用0.2%SDS震荡洗涤，重复两次，最后用纯水浸泡，晾干；固定有19条特异性探针的食源性致病菌并行检测基因芯片即制作完毕。
3.如权利要求2所述同时检测多种食源性致病菌的试剂盒，其特征在于：所述洗涤并干燥具体为将玻片放于0.1-0.3%SDS中震荡洗涤1-3 min，取出后室温充分干燥，然后将玻片放于硼氢化钠溶液中震荡3-8min，去除自由醛基。
4.如权利要求1所述同时检测多种食源性致病菌的试剂盒在食品食源性致病菌检验检疫中的应用。
5.如权利要求1所述同时检测多种食源性致病菌的试剂盒在食品食源性致病菌检验检疫中的应用方法，其特征在于，包括步骤：
1）将所述固定有19种致病菌特异性探针的食源性致病菌并行检测基因芯片固定在卡盒底部的杂交检测槽内；
2）使用商业化的试剂盒提取DNA进行核酸分离；
3）使用所述特异性引物及通用引物进行PCR扩增反应；
4）PCR扩增完成以后卡盒内部的移液枪把所有产物都放到杂交检测槽进行杂交，杂交时芯片底部的加热器将温度控制在65℃；十五分钟杂交结束后移液枪做快速清洗；
5）清洗完的卡盒放到卡盒阅读仪里接受最后的信号检测，卡盒阅读仪里面有激光共聚焦扫描系统和光电倍增管等检测装置，读到的数据通过系统分析软件处理直接以数字的形式显现。
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| "水产品中4种食源性致病菌多重PCR检测方法的建立";童桂香等;《南方农业学报》;20151231;第46卷(第12期);第2217-2222页 * |
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