CN103911443A

CN103911443A - 一种检测11种常见感染性腹泻病原体的基因芯片及其应用

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Publication number: CN103911443A
Application number: CN201410101768.8A
Authority: CN
Inventors: 孙成铭; 栾材富; 刘杰; 伊茂礼; 李少君; 吴金英; 张守信; 段丽君; 孙隽; 龚磊; 张成林
Original assignee: Yantai Yuhuangding Hospital
Current assignee: Yantai Yuhuangding Hospital
Priority date: 2014-03-18
Filing date: 2014-03-18
Publication date: 2014-07-09
Anticipated expiration: 2034-03-18
Also published as: CN103911443B

Abstract

本发明涉及一种基因芯片及其应用，属于生物检测领域。本发明针对11种临床常见感染性腹泻病原微生物设计了一组检测探针，以及含有该组探针的基因芯片。本发明的检测探针包括副溶血弧菌探针、创伤弧菌探针、霍乱弧菌探针、溶藻弧菌探针、弗尼斯弧菌探针、志贺氏菌探针、大肠杆菌探针、气单胞菌探针、沙门氏菌探针、弯曲菌探针，以及变形杆菌探针；前述探针序列如SEQ ID NO：1-117所示。本发明的基因芯片及探针能够检测11种临床常见致腹泻病原菌，检测通量高，特异性强，灵敏度高，检测快速有效。

Description

一种检测11种常见感染性腹泻病原体的基因芯片及其应用

技术领域

本发明涉及一种基因芯片，尤其涉及一种用于区分和检测11种临床常见感染性腹泻致病菌的基因芯片，属于生物检测领域。

背景技术

腹泻是一种发病率高并流行于世界各地的胃肠道传染病，其发病率仅次于上呼吸道感染，在我国感染性腹泻发病率居所有传染病首位。感染性腹泻是我国的常见病和多发病，病因比较复杂，可由病毒、细菌和原虫引起，近年来时有暴发流行，已经成为当前世界上不断增多的公共卫生问题之一，因此亟需建立多种常见腹泻致病菌快速高效的诊断方法。

目前，腹泻致病菌的传统检测方法主要包括以下几种：（1）粪便常规检查；（2）病原学检查；（3）血清学检查；（4）分子生物学——PCR检测方法；（5）分子生物学——基因芯片法。其中，基因芯片是通过微加工技术，将数以万计、乃至百万计的特定序列的DNA片段（基因探针），有规律地排列固定于硅片、玻片等支持物上，构成的一个二维DNA探针阵列，利用这类芯片与标记的生物样品进行杂交，可对样品的基因表达谱生物信息进行快速定性和定量分析。基因芯片技术的优点在于：1）高通量并行检测：当一个样品同时需要检测多种病原菌时，一次实验即可得出全部结果；2）操作简便快速：整个检测只需4-8小时基本可以出结果；但同时基因芯片技术也存在重复性差，灵敏度较低等问题。

16s rRNA在细菌及其他微生物（真菌中为18s rRNA）的进化过程中高度保守，被称之为细菌的“分子化石”，同时其序列保守性又是相对的，在保守区之间又存在着9个高变区，不同细菌的科、属、种之间存在着不同程度的差异，故16s rRNA可以作为细菌分类的标志，又可以作为细菌检测和鉴定的靶分子。而且，随着微生物研究的不断发展，16s rRNA的数量也在不断的增加，更加完整，采用16s rRNA分类鉴定微生物也更加可靠。

16s rRNA序列对微生物进行分类鉴定存在一定的局限性，16s rRNA对于亲缘关系较近的细菌可能分辨率不够，常不能反映关系较近的种间关系。因此，需要采用其他基因进行微生物分类鉴定分析，与16s rRNA起到相互补充的作用。最近研究发现，蛋白编码基因gyrB是用于细菌鉴定和分类的又一理想的靶基因。gyrB基因是编码DNA解旋酶B亚基的基因，该基因进化速率较快，碱基替换频率较高，能比16s rRNA基因更好地区分相似种。

由于出血性大肠杆菌O157:H7和志贺氏菌两种微生物的16s rRNA与gyrB基因与普通大肠杆菌的基因序列相似度极高，无法根据这两种基因序列设计探针。根据文献调研得知，出血性大肠埃希氏菌O157:H7的wzy基因与志贺氏菌的ipaH基因为两种微生物所特有的功能基因，可以用来特异性检测两种微生物。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种复合基因芯片，用于同时检测11种临床上常见的感染性腹泻病原体。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一组针对十一种感染性腹泻病原体的基因芯片检测探针，包括副溶血弧菌探针、创伤弧菌探针、霍乱弧菌探针、溶藻弧菌探针、弗尼斯弧菌探针、志贺氏菌属探针、大肠杆菌探针、气单胞菌探针、沙门氏菌探针、弯曲菌探针，以及变形杆菌探针；其中，所述副溶血弧菌探针的序列选自SEQ ID NO：1-10中的任意一种或多种，所述创伤弧菌探针的序列选自SEQ ID NO：11-18中的任意一种或多种，所述霍乱弧菌探针的序列选自SEQ ID NO：19-30中的任意一种或多种，所述溶藻弧菌探针的序列选自SEQ ID NO：31-40中的任意一种或多种，所述弗尼斯弧菌探针的序列选自SEQ ID NO：41-51中的任意一种或多种，所述志贺氏菌探针的序列选自SEQ ID NO：52-64中的任意一种或多种，所述大肠杆菌探针的序列选自SEQ ID NO：65-76中的任意一种或多种，所述气单胞菌探针的序列选自SEQ ID NO：77-86中的任意一种或多种，所述沙门氏菌探针的序列选自SEQ ID NO：87-96中的任意一种或多种，所述弯曲菌探针的序列选自SEQ ID NO：97-107中的任意一种或多种，所述变形杆菌探针的序列选自SEQ ID NO：108-117中的任意一种或多种。

本发明第二方面公开了一种检测十一种感染性腹泻病原体的基因芯片，所述基因芯片上整合了前述基因芯片检测探针。

进一步，所述基因芯片还包括芯片基片。

所述芯片基片可选自氨基基片（玻片表面为氨基基团修饰）、醛基基片（玻片表面为醛基基团修饰）、巯基基片（玻片表面为巯基基团修饰）、琼脂糖基片（玻片表面以琼脂糖覆盖）、葡聚糖基片（玻片表面以葡聚糖覆盖）等。

更进一步，所述基因芯片为氨基基片。

本发明第三方面公开了一种检测十一种感染性腹泻病原体的方法，包括以下步骤：

1）提取待测样本的模板DNA；

2）模板DNA的扩增与标记；

3）扩增标记产物与前述基因芯片杂交；

4）杂交后的芯片扫描和结果判读。

进一步，步骤2）所述模板DNA的扩增采用通用PCR引物，所述通用PCR引物的序列如SEQ ID NO：118-119所示。

进一步，步骤2）所述模板DNA的扩增，其扩增的聚合酶链反应的反应体系如下：

进一步，步骤2）所述模板DNA的扩增，其扩增的聚合酶链反应程序为：94℃5min；然后按94℃30s，55℃30s，72℃90s做35个循环；最后72℃10min。

进一步，步骤2）所述标记为基于随机引物的Klenow酶标记，其方法及反应体系如下：

A.取5μL PCR扩增产物作为模板，加入随机引物（Random Primer）3μL，并补水至19μl，震荡混匀，瞬时离心后进行下一步反应；

B.将离心后的样品管放入PCR仪，程序设置为：95℃3min，0℃3min；瞬时离心；

C.制备荧光标记反应体系Mix，荧光标记反应体系Mix的组成如下；

D.向步骤B的样品管中各加入6μL步骤C制备的荧光标记反应体系Mix，震荡混匀，离心；

E.将前一步骤的产物进行PCR反应，反应程序为：37℃1.5h，70℃10min；

F.反应结束后，将样品置于冰上5min，瞬时离心后避光4℃保存，用于后续芯片杂交。

进一步，步骤3）所述芯片杂交的杂交体系如下，杂交反应条件为：95℃变性3min,60℃，杂交2h。

本发明最后一方面公开了前述针对十一种感染性腹泻病原体的基因芯片检测探针，以及前述检测十一种感染性腹泻病原体的基因芯片在制备腹泻病原体检测制剂中的应用。

本发明的有益效果是：本发明针对十一种临床常见感染性腹泻病原性微生物的特异性鉴别靶基因（gyrb、wzy、ipaH）设计相应的引物和探针，构建复合基因芯片；通过引物和探针双重特异性检测，复合物在复合基因表面沉积，使特定的分子杂交转变成可视信号，从而检测不同感染性腹泻病原体。本发明的基因芯片能检测11种常见感染性腹泻致病菌，检测通量高、特异性强、灵敏度好、快速有效。

附图说明

图1为肠出血性大肠埃希氏菌E.coli的基因芯片杂交检测图；

图2为痢疾志贺氏菌S.dysenteriae的基因芯片杂交检测图；

图3为沙门氏菌Salmonella的基因芯片杂交检测图；

图4为创伤弧菌V.vulnificus的基因芯片杂交检测图；

图5为副溶血弧菌V.parahaemolyticus的基因芯片杂交检测图；

图6为霍乱弧菌V.cholerae的基因芯片杂交检测图；

图7为普通变形杆菌P.vulgaris的基因芯片杂交检测图；

图8为解藻朊酸弧菌V.alginolyticus的基因芯片杂交检测图；

图9为弗尼斯弧菌V.furnissii；

图10为嗜水气单胞菌A.hydrophila的基因芯片杂交检测图；

图11为空肠弯曲杆菌Campylobacter的基因芯片杂交检测图；

图12为阴性对照的基因芯片杂交检测图；

图13为扩增产物部分测序峰截图（1.创伤弧菌2.痢疾志贺杆菌3.大肠杆菌4.沙门氏菌）

图14为样本经通用引物PCR扩增后电泳图（M泳道Maker DL2000）

图15为基因芯片制造的工艺线路图；

图16为基因芯片点样液与50%DMSO点样液在同一张芯片上点样效果的比较（A：用基因芯片点样液的DNA点阵，B：用50%DMSO点样液的DNA点阵）；

图17为芯片总体设计示意图；

图18为芯片灵敏度检测结果图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

实施例1基因芯片检测探针

1.PCR扩增和电泳检测

对样品细菌（创伤弧菌、痢疾志贺氏菌、出血性大肠埃希氏菌O157:H7、沙门氏菌，见表1.1）的16S rRNA基因进行PCR扩增及电泳检测，引物序列如SEQ ID NO：118-119所示，扩增的电泳结果如图14所示，扩增产物的测序结果见表1.2，部分测序峰截图如图13所示。

表1.116S rRNA基因PCR后电泳图注释

表1.2测序检测结果

2.探针设计

针对腹泻项目中提供的微生物，设计长度为40mer的探针，对目标微生物进行区分，项目中提供的微生物见下表2.1：

表2.1感染性腹泻项目常见微生物

通过搜索RDP数据库和NCBI核酸数据库，筛选质量好的序列信息，构建本地序列数据库。收集上表中微生物各种、属的所有16S rRNA和gyrb基因序列，具体信息见表2.2。

表2.2各微生物所对应的gyrb基因序列的数量

搜索NBCI核酸数据库，找到所有相关物种的16S rRNA序列。针对对每个种属，将其所有的16S rRNA序列用clustalW进行多重序列连配。根据clustalW的多重序列连配结果，找出保守区，并针对这些保守区设计属特异的探针。根据clustalW的多重序列连配结果，找出非保守区，并针对这些非保守区设计种特异的探针。

所有的探针必须满足以下条件：a)60%>GC含量>40%;b)所有探针的最高和最低Tm值差异控制在±3℃之内;c)探针不会形成发卡结构：反向互补序列不能长于5mer;d)探针之间不会形成二聚体：探针间最大连续匹配不超过18，最大不连续匹配不超过18;e探针序列不能有超过4的连续单碱基重复);f)和样本中可能遇到的其它病菌的匹配模式不会同目标病菌的一致。

所有探针blast所有物种序列库（包括目标物种和应回避物种）。根据blast结果整理出探针对序列的匹配情况。根据探针对序列匹配表，通过一个基于熵和互信息技术的算法，选择出最少的、可以达到鉴定目标的探针。以初步筛选的探针为输入，利用RDP和NT等公共数据库进行进一步的探针筛选和特异性检测，得到最后的探针集。

3.探针设计结果

一共设计出117条探针(见表3.1)，用于区分11种目标微生物(副溶血弧菌、创伤弧菌、霍乱弧菌、溶藻弧菌、弗尼斯弧菌、志贺氏菌属、肠出血性大肠埃希氏菌O157：H7、气单胞菌属、沙门氏菌属、弯曲菌属、变形杆菌属)等多种临床上可能遇到的微生物。

表3.1检测探针

实施例2基因芯片

腹泻病原菌基因芯片的芯片制造工艺包括：点样探针配制、醛基基片制备，芯片印制、固定和扫描，芯片包装等步骤，工艺路线见图15。

1.点样探针的配制

采用基因芯片点样液和水，将寡核苷酸探针配制成特定浓度点样液，然后按照点阵排布模式转移至384孔板的相应位置，并用封口膜密封，准备点样。

1.1点样液的选择

腹泻病原菌基因芯片制备中所用的基因芯片点样液为博奥生物有限公司自主研发并已商品化的产品（产品目录号：440010），采用基因芯片点样液进行点样与采用传统的点样液——50%DMSO进行点样后结果比较见图16。

1.2探针浓度

芯片上有两种探针（probe），一种是用于病原菌检测的“检测探针”（见表3.1），另一种是质控探针（点样阳性质控探针、点样阴性质控探针、杂交阳性质控探针均购自北京博奥晶典生物技术有限公司，杂交阴性质控探针为水）。

在满足检测要求的前提下，从节约成本考虑，点样阳性质控（QC）探针点样浓度选用1μM，杂交阳性质控（PC）探针点样浓度选用5μM，点样阴性质控（IC）探针选用10μM。综合考虑特异性和灵敏度因素，选择了15μM作为检测探针和阴性对照（NC）探针的点样浓度。

2.芯片基片的选择和制备

本发明腹泻病原菌基因芯片的研制过程中，选择氨基基片作为芯片印制的固体介质。玻片表面氨基修饰是指玻片在硅烷化试剂作用下，进行表面氨基修饰。具体参照邹宗亮等（邹宗亮，2001）的方法，采用1%APTES乙醇溶液进行玻片的硅烷化处理，并对APTES的作用时间进行了优化。

具体方法为：取铬酸洗液处理后的玻片，采用1%APTES乙醇溶液进行硅烷化处理，处理时间分别为16分钟、1小时、24小时，对硅烷化试剂处理后的基片进行清洗后烘干，即成氨基基片。对制备的氨基基片采用末端标记荧光的寡聚核苷酸进行点样后固定，制备成芯片，对芯片进行扫描，提取探针信号值，比较三种作用时间下探针的信号值。

实验结果：三种硅烷化作用时间下，探针信号值及芯片间CV值见表4.1。从检测结果可以看出，硅烷化1小时的氨基基片扫描后探针信号值最强，基片批内的CV值最低；说明此种条件下氨基基片的固定能力最强，同批内基片的均一性最好。因此本项目选择了1小时作为玻片硅烷化反应的时间。

表4.1不同硅烷化时间对氨基基片固定能力的影响

3.点样

芯片点样选用博奥生物有限公司的SmartArrayer^TM136微阵列芯片生产系统。依据SmartArrayer^TM136点样仪提供的说明书资料，样品点样时环境湿度应不高于50％，本研究采用点样时环境湿度为40%±5%，温度为18-28℃。预点个数为45个。

本实施例采用的点样钢针为SMP3（TeleChem International Inc.），洗针方法为：水洗6s→超声3s→（水洗3s→超声3s）×4次→水洗2s→抽干2s→水洗2s→抽干5s。

阵列设计：芯片设计为24×23阵列，如表4.2所示。

表4.2基因芯片点样阵列

4.固定

固定参数参考相关文献（邢婉丽，2004）。

实施例3使用基因芯片进行样品检测

1.样本的采集与处理

检测的病原微生物为肠出血性大肠埃希氏菌（E.coli），痢疾志贺氏菌（S.dysenteriae），沙门氏菌（Salmonella），创伤弧菌（V.vulnificus），副溶血弧菌（V.parahaemolyticus），霍乱弧菌（V.cholerae），普通变形杆菌（P.vulgaris），解藻朊酸弧菌（V.alginolyticus），弗尼斯弧菌（V.furnissii），嗜水气单胞菌（A.hydrophila），空肠弯曲杆菌（Campylobacter）；通过细菌基因组核酸提取试剂盒（购自QIAGEN公司）从上述微生物样本中提取样本的DNA。

2.样品核酸的扩增和标记

2.1聚合酶链式反应

2.1.1通用扩增引物

设计并筛选出能够广谱地、特异性较好地、尽可能扩增靶基因全长的通用引物对，引物序列见表5.1。

表5.1通用基因引物列表

验证结果表明，细菌扩增引物16S-F27和16S-R1492构成的引物对扩增效率较好，扩增长度也较长，可以满足芯片检测要求（表1.1，附图14）。

2.1.2PCR扩增条件

1)所需PCR扩增试剂及其储存方式如下：

2)配制PCR Mix：取一只空的无菌EP管，按照表5.2在冰上制备PCR Mix。

表5.2PCR Mix（一个反应）

使用移液器轻柔吸打3-5次混均，瞬时离心（5sec）收集溶液于管底。置于冰上。

3)PCR扩增程序：

94℃5min；然后按94℃30s，55℃30s，72℃90s做35个循环；最后72℃10min。

程序结束后，将EP管取出，瞬时离心（5sec）收集溶液于管底。PCR扩增的产物可直接用于荧光标记，如不立即进行荧光标记实验，可将PCR产物放于4℃冰箱进行保存。2.2扩增产物的标记——基于随机引物的Klenow标记

a)取5μL PCR扩增产物作为模板，向每个样品管加入随机引物（pd(N)9，购自Takara公司）3μL，并补水至19μl，震荡混匀，瞬时离心后进行下一步反应。

b)将离心后的样品管放入PCR仪，95℃变性3min,立即放置冰上3min，瞬时离心;

c)按照表5.3在冰上制备荧光标记反应体系Mix;

表5.3荧光标记反应体系Mix(1个反应)

d）向步骤b）样品管中各加入6μL荧光标记反应体系Mix，震荡混匀，瞬时离心;

e)将离心管放入PCR仪，运行按照表5.4设置的程序，进行荧光标记扩增;

表5.4荧光标记反应程序

f)反应结束后，将样品置于冰上5min，瞬时离心后避光4℃保存，用于后续芯片杂交。

3.扩增标记产物的芯片杂交

3.1配制杂交体系

将杂交buffer在42℃融化，按表5.5配制各样品杂交体系，95℃变性3min,放置冰上，备用。

表5.5杂交体系

3.2杂交

a）打开芯片杂交盒，将杂交盒平放桌面上，在杂交和底部凹槽内加入约80μL灭菌水，以防止杂交过程中杂交液大量挥发。

b）将芯片正面朝上（标签朝向操作者）放入杂交盒内两个定位销之间。

c）放上芯片盖片（有凸台的一面朝向芯片），上端先接触芯片，再缓缓盖下。

d）用移液器通过盖玻片加样孔缓慢注入20μL变性后的杂交液，杂交液会凭借液体表面张力在盖玻片下面的凸台和芯片表面之间形成一道液膜，不要震动盖片或芯片避免破坏液膜。

e）将杂交盒的盖板扣上，确保槽板两端的定位销分别插入盖板两端的定位销孔中。扣上盖板后，分别将两个金属夹卡进两侧，注意：动作要平缓，不要让杂交盒有大的震动，以防止杂交液溅出点阵区域；另外，金属夹需要完全卡进，以确保杂交盒的密封性。

f）将杂交盒放入博奥BioMixerTMⅡ杂交仪，60℃，2h或过夜

①开启杂交仪背板电源，启动杂交仪。系统自检（小于1分钟）无误后，触摸屏出现运行界面。

②在欢迎界面等待几秒后，自动跳转到状态界面。此界面可看到方案号、方案名称。按Setting按钮可查看此方案下的具体参数。

③选定方案以后，按Hyb.进行预热，系统开始运行，加热体、风扇开始工作，杂交盒托盘开始旋转。

④约10分钟后，短暂关闭Hyb.按钮，装载杂交盒与杂交盒托盘并随后按Hyb.按钮进行杂交。

芯片总体设计示意图可以如图17所示，芯片点阵设计为：1张芯片包括4个点阵，一张芯片可用于4份不同样本的检测。

4.杂交后的芯片扫描和结果判读

使用博奥LuxScan10K扫描仪进行扫描。对肠出血性大肠埃希氏菌（E.coli），痢疾志贺氏菌（S.dysenteriae），沙门氏菌（Salmonella），创伤弧菌（V.vulnificus），副溶血弧菌（V.parahaemolyticus），霍乱弧菌（V.cholerae），普通变形杆菌（P.vulgaris），解藻朊酸弧菌（V.alginolyticus），弗尼斯弧菌（V.furnissii），嗜水气单胞菌（A.hydrophila），空肠弯曲杆菌（Campylobacter）11种微生物进行基因芯片检测，实验结果见图1至12。

从结果可知，杂交出现预期的特异性探针信号，杂交信号明显；非目的探针与背景完全一致，未见非特异性杂交信号，靶基因之间不存在交叉杂交现象；试验结果表明，本研究设计的基因芯片具有良好的特异性。

实施例4芯片灵敏度检测

1.检测样品：嗜水气单胞菌（基因组）

2.检测基因：gyrb

3.检测方法：

对不同浓度的模板DNA进行基因芯片检测（2.5×10⁰～2.5×10⁴代表1ul模板中所含基因组拷贝数）。

4.实验结果：

本发明的基因芯片可检测到低至1.25x10²拷贝的致病菌基因组核酸，实验结果见图18。

Claims

1.一组针对十一种感染性腹泻病原体的基因芯片检测探针，包括副溶血弧菌探针、创伤弧菌探针、霍乱弧菌探针、溶藻弧菌探针、弗尼斯弧菌探针、志贺氏菌属探针、大肠杆菌探针、气单胞菌探针、沙门氏菌探针、弯曲菌探针，以及变形杆菌探针；其中，所述副溶血弧菌探针的序列选自SEQ ID NO：1-10中的任意一种或多种，所述创伤弧菌探针的序列选自SEQ ID NO：11-18中的任意一种或多种，所述霍乱弧菌探针的序列选自SEQ ID NO：19-30中的任意一种或多种，所述溶藻弧菌探针的序列选自SEQ IDNO：31-40中的任意一种或多种，所述弗尼斯弧菌探针的序列选自SEQ ID NO：41-51中的任意一种或多种，所述志贺氏菌探针的序列选自SEQ ID NO：52-64中的任意一种或多种，所述大肠杆菌探针的序列选自SEQ ID NO：65-76中的任意一种或多种，所述气单胞菌探针的序列选自SEQ ID NO：77-86中的任意一种或多种，所述沙门氏菌探针的序列选自SEQ ID NO：87-96中的任意一种或多种，所述弯曲菌探针的序列选自SEQ ID NO：97-107中的任意一种或多种，所述变形杆菌探针的序列选自SEQ IDNO：108-117中的任意一种或多种。

2.一种检测十一种感染性腹泻病原体的基因芯片，其特征在于，所述基因芯片上整合了权利要求1所述的基因芯片检测探针。

3.如权利要求2所述的基因芯片，其特征在于，所述基因芯片还包括芯片基片。

4.如权利要求3所述的基因芯片，其特征在于，所述芯片基片为氨基基片。

5.一种检测十一种感染性腹泻病原体的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）提取待测样本的模板DNA；

2）模板DNA的扩增与标记；

3）扩增标记产物与权利要求2-4任一权利要求所述基因芯片杂交；

4）杂交后的芯片扫描和结果判读。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤2）所述模板DNA的扩增采用通用PCR引物，所述通用PCR引物的序列如SEQ ID NO：118-119所示。

7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤2）所述模板DNA的扩增，其扩增的聚合酶链反应的反应体系如下：

8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤2）所述模板DNA的扩增，其扩增的聚合酶链反应程序为：94℃5min；然后按94℃30s，55℃30s，72℃90s做35个循环；最后72℃10min。

9.权利要求1所述针对十一种感染性腹泻病原体的基因芯片检测探针，以及权利要求2-4任一权利要求所述检测十一种感染性腹泻病原体的基因芯片在制备腹泻病原体检测制剂中的应用。