CN104073566A - 弗尼斯弧菌检测用引物对、试剂盒及检测方法 - Google Patents

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Abstract

弗尼斯弧菌检测用引物对、试剂盒及检测方法。所述引物对碱基序列为SEQ ID NO.1/2。本发明进一步公开了包含上述引物对的试剂盒及应用上述引物对进行PCR检测的弗尼斯弧菌检测方法。本发明的引物特异性强，检测试剂盒及方法简便易用，结果准确，具有很高的特异性和灵敏度。

Description

弗尼斯弧菌检测用引物对、试剂盒及检测方法
技术领域
本发明涉及食源性病原菌的快速检测方法，尤其涉及利用PCR技术检测样品中弗尼斯弧菌的方法。还涉及检测所使用的特异性引物序列和检测试剂盒。
背景技术
弧菌作为近海河口环境中微生物区系的成员，广泛分布于自然水域及渔业生物中，是引发人类细菌性疾病的主要病原菌之一。人们通过饮用不清洁水、食用未加工或未加工熟的带有致病性弧菌的食物，特别是海产品容易感染发病。弧菌属中霍乱弧菌(Vibri.cholerae)、副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、创伤弧菌(Vibrio vulcificus)、河弧菌(Vibrio fluvialis)、拟态弧菌(Vibrio minicus)、麦氏弧菌(Vibrio metschnikovii)、霍利斯弧菌(Vibrio hollisae)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、弗尼斯弧菌(Vibrio furnissii)、海鱼弧菌(Vibrio damsela)、辛辛那提弧菌(Vibrio cincinatiensis)和鲨鱼弧菌(Vibriocarchariae)12个种为人潜在肠道致病菌。由弗尼斯弧菌引起的急性胃肠炎首先发现于日本及东方一些国家，其后扩散至西方国家，通常呈爆发流行或散发性急性胃肠炎。弗尼斯弧菌能产生肠毒素，为旅游者腹泻的病原菌之一，临床上以腹泻及腹痛为主，并伴随有恶心及呕吐等症状，也有严重致死病例报。
快速、准确的检测食品中致病菌是有效预防和控制病原菌感染的重要保障，但是目前国内外现有的检测方法中，对弗尼斯弧菌的检测只有常规的病原菌分离培养法，该方法不仅费时费力，无法满足快速高通量检测病原菌的要求；再加上弧菌属细菌生化反应相对不稳定，给鉴定工作带来了很多困难和不确定性，容易出现假阴性和假阳性结果，影响检测结果质量，并且会带来较大的经济损失。随着分子生物学技术的发展，人们采用PCR技术应用于细菌的快速诊断，该方法不仅敏感、准确，而且快速、高通量，通过DNA提取、PCR扩增、电泳观察等分子生物学手段检测病原菌的方法，但现有技术中还未见有针对弗尼斯弧菌检测的PCR技术。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可快速、准确、灵敏地检测食品和水产品样品中弗尼斯弧菌的PCR检测方法。
为实现上述目的，本发明首先提供一种弗尼斯弧菌检测用引物对，其碱基序列为SEQ IDNO.1/2。
正向引物(SEQ ID NO.1)：5′-CAATCCAAGATGGTCACGCTAA-3′，
反向引物(SEQ ID NO.2)：5′-TTTATCCACCGCGTACAGCTT-3′。
另一方面，本发明提供一种弗尼斯弧菌检测用试剂盒，所述试剂盒是PCR检测试剂盒，其中包括碱基序列为SEQ ID NO.1/2的引物对。
作为优选，该试剂盒中还包括用于PCR检测的阳性对照模板，所述阳性对照模板为浓度为10nmol/L～100nmol/L的弗尼斯弧菌标准菌株的DNA提取物。所述试剂盒在检测应用中，可以使用其它任意非弗尼斯弧菌DNA提取物为阴性对照模板，并使用双蒸水为空白对照。
本发明的再一目的在于提供一种弗尼斯弧菌的检测方法，所述方法为PCR检测方法，其包括以SEQ ID NO.1/2为引物对进行PCR扩增的步骤。
上述本发明的弗尼斯弧菌的检测方法的检测对象是食品和水产品样品，目的在于检查待测样品中是否存在弗尼斯弧菌。该方法中，PCR扩增以弗尼斯弧菌ToxS基因(GenBank登陆号CP002377.1)的112～261位的核酸序列为靶基因，以SEQ ID NO.1/2所示的引物对，通过PCR选择性扩增所述靶基因，并检测确认是否存在有扩增产物。
更为具体地，上述本发明的的的弗尼斯弧菌检测方法，包括如下步骤：
⑴提取待测样品DNA，得到模板液；
⑵PCR扩增：
反应体系：模板液2μl、10×PCR缓冲液2μL、dNTP0.4μL、Taq酶1U、浓度为10μM的引物对SEQ ID NO.1/2各0.5μL、补充灭菌双蒸水至总体积为20μL；以上各组分加入至0.2mLPCR反应管中，混匀，5000r/min离心10s；
反应条件：94℃预变性4min，然后94℃1min、59℃1min、72℃1min，35个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存；
⑶PCR扩增产物电泳检测：
用电泳缓冲液制备1％琼脂糖凝胶，取步骤⑵所制备的PCR扩增产物6μL，与1μL上样缓冲液混合后点样，用DNA分子量标记物做参照；3V/cm～5V/cm恒压电泳，电泳20min～40min，电泳检测结果用凝胶成像分析系统记录并保存；
⑷结果判定：以弗尼斯弧菌标准菌株作为阳性对照，以其它非弗尼斯菌株作为阴性对照，以灭菌双蒸水为模版作为空白对照进行步骤⑴～⑷的操作；
如待测样品扩增片断大小与阳性对照一致即可判定为阳性，若样品无扩增产物或者产物片段大小不一致即可判定为阴性，阳性扩增片段需进行测序并与参考序列进行比对；
本发明检测条件下：阳性对照的PCR扩增产物为150bp，阴性对照和空白对照无扩增产物。
具体实施方式中，步骤⑴模板液的制备方法可以从现有技术中简单获取，对本领域技术人员来说，确定模板液中DNA浓度及保证检测样品符合标准是无需花费创造性劳动的，本发明中使用DNA浓度为10nmol/L～100nmol/L的模板液进行PCR扩增。
具体地，以保藏菌株为原材料制备模板液可以使用下述方法：待测样品用3％氯化钠碱性蛋白胨水增菌培养后，取1.0mL培养液于13000rpm离心2min，弃上清液，用DNA提取试剂盒处理得模板液；或者向1.0mL培养液中加入20μL～30μL灭菌双蒸水振荡混匀后煮沸5min，再取2μL上清液做模板液。上述增菌培养时间一般需要8h～18h至菌浓度约0.5麦氏浊度时，所得的模板液满足反应测量的要求。
使用本发明的方法，尤其是特异性引物进行PCR扩增检测，与经典方法的细菌培养、分离、鉴定方法相比，本发明的方法更快速、准确。且较传统方法特异性强，灵敏度高，对弗尼斯弧菌检测特异性为100％，检测灵敏度为2400CFU/mL。
附图说明
本发明附图3幅：
图1是弗尼斯弧菌特异性检验结果，其中：1、20:Marker DL2000；2、3、4、5、6、7：弗尼斯弧菌DNA PCR产物；8：水对照；9、10：霍乱弧菌DNA PCR产物；11、12：副溶血性弧菌DNA PCR产物；13、14：溶藻弧菌DNA PCR产物；15、16：创伤弧菌DNA PCR产物；17、18：拟态弧菌DNA PCR产物；19：水对照。
图2是弗尼斯弧菌特异性检验结果，其中：1、24：Marker DL2000；2、3：河弧菌DNAPCR产物；4、5：霍利斯弧菌DNA PCR产物；6、7：鲨鱼弧菌DNA PCR产物；8、9：海鱼弧菌DNA PCR产物；10、11：麦氏弧菌DNA PCR产物；12、13：嗜水气单胞菌DNA PCR产物；14、15：大肠杆菌DNA PCR产物；16、17：志贺氏菌DNA PCR产物；18、19：金黄色葡萄球菌DNA PCR产物；20、21：弗尼斯弧菌DNA PCR产物；22、23：水对照。
图3是弗尼斯弧菌灵敏度检验结果，其中：1、25:Marker DL2000；2、3：弗尼斯弧菌(2.4×108cfu/mL)DNA PCR产物；4、5弗尼斯弧菌(2.4×107cfu/mL)DNA PCR产物；6、7：弗尼斯弧菌(2.4×106cfu/mL)DNA PCR产物；8、9：弗尼斯弧菌(2.4×105cfu/mL)DNA PCR产物；10、11：弗尼斯弧菌(2.4×104cfu/mL)DNA PCR产物；12、13：弗尼斯弧菌(2.4×103cfu/mL)DNA PCR产物；14、15：弗尼斯弧菌(2.4×102cfu/mL)DNA PCR产物；16、17：弗尼斯弧菌(2.4×101cfu/mL)DNA PCR产物；18、19：弗尼斯弧菌(2.4cfu/mL)DNA PCR产物；20、21：弗尼斯弧菌(0.24cfu/mL)DNA PCR产物；22、23：阴性对照；24：水对照。
具体实施方式
下面为本发明的具体实施例，它对本发明技术方案的建立及其应用作进一步的说明，但并不以任何形式限制本发明的内容。
若无特殊说明，本部分试验所用生物样品来自丹东出入境检验检疫局微生物实验室、大连出入境检验检疫局微生物实验室的水产品和动植物样品。
DNA提取试剂盒：TaKaRa MiniBEST Bacteria Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0(货号9763)购于宝生物工程(大连)有限公司；
PCR扩增酶试剂：TaKaRa Ex Taq(货号RR001A)购于宝生物工程(大连)有限公司；
ABI Veriti PCR仪(ABI公司，美国)。
实施例1、检测方法的建立
一、引物的设计
根据同源性基因筛查比较结果，选择具有很高特异性的弗尼斯弧菌的ToxS基因(SEQID NO.3)为检测扩增的目标基因。据NCBI上已公布的上述基因的核酸序列，并通过对检测引物退火温度的一致性以及GC含量的相似性等因素的综合考虑，设计了如下特异性引物：
正向引物：5′-CAATCCAAGATGGTCACGCTAA-3′，
反向引物：5′-TTTATCCACCGCGTACAGCTT-3′；
二、弗尼斯弧菌PCR检测方法的建立：
1、制备模板DNA样品溶液；
本实施例基因组DNA的抽提采用宝生物工程(大连)有限公司生产的DNA提取试剂盒(货号9763)并按其操作说明进行抽提样品DNA，得到模板液。
模板液DNA浓度和纯度的测定：取5μL制得的DNA溶液加ddH2O梯度稀释至1mL，使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计测260nm和280nm处的光密度值。DNA的浓度按照如下公式计算获得：C＝A×N×50/1000，式中：
C为DNA浓度(μg/μL)；
A为260nm处的吸光值；
N为核酸稀释倍数；
1OD260nm＝50μg/mL双链DNA；
当OD260/OD280比值在1.7～1.9之间时，适宜于PCR扩增。
2、PCR检测
①反应体系：总体积20ul，包括步骤1制得的模板DNA溶液2μl，10×PCR缓冲液2μL、dNTP0.4μL、引物(10μM)各0.5μL、Taq酶1U，补充灭菌双蒸水至总体积为20μL。
②以上各组分加入至0.2mL PCR反应管中，混匀，5000r/min，离心10s。
③步骤②的反应体系按下述条件进行实时荧光PCR检测：
94℃预变性4min，然后94℃1min、59℃1min、72℃1min，35个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存。
④步骤③PCR扩增产物电泳检测：
用电泳缓冲液制备1％琼脂糖凝胶，取6μL PCR扩增产物，分别和1μL上样缓冲液混合，进行点样，用DNA分子量标记物做参照。3V/cm～5V/cm恒压电泳，电泳20min～40min，电泳检测结果用凝胶成像分析系统记录并保存。阳性对照的弗尼斯弧菌转录调节因子ToxS基因的PCR扩增产物均为150bp，阴性对照和空白对照无扩增产物。样品扩增片断大小与阳性对照一致即为阳性，若样品无扩增产物或者产物片段大小不一致即为阴性。阳性扩增片段需进行测序并与参考序列进行比对。
实施例2、特异性试验
应用实施例1的特异性引物及检测方法检测含有弗尼斯弧菌的DNA样品。同时检测含有麦氏弧菌、溶藻弧菌、嗜水气单胞菌、拟态弧菌、创伤弧菌、霍乱弧菌、副溶血性弧菌、霍利斯弧菌、鲨鱼弧菌、河弧菌、海鱼弧菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌等其它致病菌DNA样品，以对方法的特异性进行评估，检测结果如图1和2所示：
电泳检测结果显示阴性对照和空白对照无扩增产物，说明反应结果正常，反应体系无污染；阳性对照扩增产物为150bp大小的基因片断，反应结果正常。
由图1和图2可知，对弗尼斯弧菌中toxS基因进行检测，结果扩增产物为150bp大小的基因片断，检测结果为阳性；其他致病菌的toxS基因检测结果显示无扩增产物，检测结果均为阴性。
由上述实验结果可见，本发明具有很好的特异性。
实施例3、灵敏度试验
一、标准菌株纯培养物检测灵敏度
应用实施例1的特异性引物及检测方法，对弗尼斯弧菌标准菌株纯培养物进行检测灵敏度的研究。
取上述标准菌株于3％氯化钠碱性蛋白胨水中培养18h左右后，测其麦氏浊度，估计其菌数，然后按十倍递增进行梯度稀释到10-7，取最后四个稀释液的菌液进行平板计数，每个稀释度重复3个，按照相应的方法培养后进行菌落计数取平均值确定其真实的菌密度。同时每个稀释液各取1mL菌液于2mL离心管中并作3管重复，用于提取DNA并应用本发明方法进行PCR检测，以确定本发明方法的检测灵敏度。
检测结果见图3，从图中可以看出，阴性对照和空白对照无扩增产物，说明反应结果正常，反应体系无污染；阳性对照扩增产物为150bp大小的基因片断，反应结果正常；标准菌株纯培养物灵敏度检测结果显示，弗尼斯弧菌标准菌株浓度分别为24000cfu/mL、2400cfu/mL时均能很好检出。结果表明该标准方法对标准菌株纯培养物检测灵敏度2400cfu/mL。
二、样品中添加弗尼斯弧菌标准菌株的灵敏度实验
应用实施例1的特异性引物及检测方法，对样品中添加弗尼斯弧菌标准菌株进行检测灵敏度的研究。
选用已经确定弗尼斯弧菌阴性的样品，分别取10g样品加入100mL增菌液中同时添加已知不同浓度梯度的弗尼斯弧菌，均质后取1mL均质液提取DNA，用于灵敏度试验，确定样品中添加弗尼斯弧菌后的检测灵敏度。同时提取阴性样品均质液1mL提DNA用于PCR检测。
检测结果：阴性对照和空白对照无扩增产物，说明反应结果正常，反应体系无污染；阳性对照扩增产物为150bp大小的基因片断，反应结果正常；标准菌株纯培养物灵敏度检测结果显示，弗尼斯弧菌标准菌株浓度分别为24000cfu/mL、2400cfu/mL时均能很好检出。结果表明该标准方法对标准菌株纯培养物检测灵敏度2400cfu/mL。
实施例4、应用于实际样品检测
应用实施例1的特异性引物和检测方法，以传统的检测方法为对照(ISO/TS21872-2Microbiology of food and animal feeding stuffs-Horizontal method for the detection of potentiallyenteropathogenic Vibrio spp.–Part2:Detection of species other than Vibrio parahaemolyticus andVibrio cholerae.)。实际检测样品包括江瑶贝、蚬子肉、冻鸡肉及冻花菜等共358份，检测结果如表1所示：
表1
结果显示，所检测实际样品共384份，其中：
检测水产品258份，采用PCR方法检测弗尼斯弧菌阳性6份，采用传统生化培养方法检测弗尼斯弧菌阳性6份；
检测动物产品69份，采用PCR方法检测弗尼斯弧菌均未检出，采用传统生化培养方法检测弗尼斯弧菌均未检出；
检测植物产品57份，采用PCR方法检测弗尼斯弧菌均未检出，采用传统生化培养方法检测弗尼斯弧菌均未检出。
由大量的实际应用结果可见，应用本发明方法检测弗尼斯弧菌，具有较好的应用结果。

Claims (8)

1.弗尼斯弧菌检测用引物对，其特征在于，碱基序列为SEQ ID NO.1/2。
2.弗尼斯弧菌检测用试剂盒，包括碱基序列为SEQ ID NO.1/2的引物对。
3.根据权利要求2所述的弗尼斯弧菌检测用试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括浓度为10～100nmol/L的弗尼斯弧菌标准菌株的DNA提取物。
4.一种弗尼斯弧菌的检测方法，其特征在于，所述方法包括以SEQ ID NO.1/2为引物对进行PCR扩增的步骤。
5.权利要求4所述的弗尼斯弧菌的检测方法，其特征在于，所述PCR扩增以弗尼斯弧菌ToxS基因112～261位的核酸序列为靶基因。
6.权利要求5所述的弗尼斯弧菌的检测方法，其特征在于，所述的ToxS基因的GenBank登陆号CP002377.1。
7.权利要求4所述的弗尼斯弧菌检测方法，包括如下步骤：
⑴提取待测样品DNA，得到模板液；
⑵PCR扩增：
反应体系：模板液2μl、10×PCR缓冲液2μL、dNTP0.4μL、Taq酶1U、浓度为10μM的引物对SEQ ID NO.1/2各0.5μL、补充灭菌双蒸水至总体积为20μL；以上各组分加入至0.2mLPCR反应管中，混匀，5000r/min离心10s；
反应条件：94℃预变性4min，然后94℃1min、59℃1min、72℃1min，35个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存；
⑶PCR扩增产物电泳检测：
用电泳缓冲液制备1％琼脂糖凝胶；取步骤⑵所制备的PCR扩增产物6μL，与1μL上样缓冲液混合后点样，用DNA分子量标记物做参照；3V/cm～5V/cm恒压电泳，电泳20min～40min，电泳检测结果用凝胶成像分析系统记录并保存；
⑷结果判定：以弗尼斯弧菌标准菌株作为阳性对照，以其它非弗尼斯菌株作为阴性对照，以灭菌双蒸水为模版作为空白对照进行步骤⑴～⑷的操作；
如待测样品扩增片断大小与阳性对照一致即可判定为阳性，若样品无扩增产物或者产物片段大小不一致即可判定为阴性，阳性扩增片段需进行测序并与参考序列进行比对。
8.权利要求7所述的弗尼斯弧菌检测方法，其特征在于，所述的步骤⑴模板液的制备方法是：待测样品以3％氯化钠碱性蛋白胨水增菌培养至菌浓度约0.5麦氏浊度时，取1.0mL培养液于13000rpm离心2min，弃上清液，用DNA提取试剂盒处理得模板液，或者向1.0mL培养液中加入20～30μL灭菌双蒸水振荡混匀后煮沸5min，再取2μL上清液做模板液。
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