CN104846066A - 鸡白痢沙门氏菌的pcr检测引物及检测方法 - Google Patents

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师冬云
郑江霞
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Abstract

本发明涉及鸡白痢沙门氏菌的PCR检测引物及检测方法，所述引物序列如Seq ID No.1和2所示，并基于所述引物建立了鸡白痢沙门氏菌的PCR检测方法。本发明提供的鸡白痢沙门氏菌的PCR检测方法，操作简便，易于掌握，便于推广，一般的分子实验室都可进行，仅需2天即可完成。同时本方法具有抗干扰能力强，灵敏度高，特异性强等优点，可以满足在家禽及其产品中快速、特异性检测鸡白痢沙门氏菌的需求。无论是家禽养殖场，还是禽产品加工厂，都可以选择最近的分子实验室进行检测，及时检测鸡白痢沙门氏菌感染情况，将对公共健康的危害降到最低。

Description

鸡白痢沙门氏菌的PCR检测引物及检测方法
技术领域
本发明涉及鸡白痢沙门氏菌的分子生物学检测，具体地说，涉及鸡白痢沙门氏菌的PCR检测引物及检测方法。
背景技术
PCR技术是近二十年发展成熟的一种体外扩增特异性DNA片段的技术，具有简便、快速、敏感性高和特异性强等优点。因而从上世纪90年代以来开始尝试利用该技术来检测食品中以及临床样品和环境中的沙门氏菌。但到目前为止，相关的PCR技术只能鉴定到沙门氏菌属，无法直接区分血清型，通常还需要结合生化鉴定和血清学实验进行分型。近几年，随着一些沙门氏菌血清型测序的完成，国外开始有研究根据鸡白痢沙门氏菌特有的基因序列进行PCR检测，以达到特异性检测鸡白痢沙门氏菌的目的，国内相关研究较少。而目前对鸡白痢沙门氏菌的特异性PCR检测大多是根据rfbs基因进行的，例如根据第598和237位点上的碱基多态性进行检测，但这两个位点上的多态性还有待扩大群体验证。2010年李求春等报道了ipaJ基因与鸡白痢的Ⅲ型分泌系统有关，其特异性已得到多位学者的认可。
Soumet等(1999年)利用多重PCR结合改良MSRV培养基的方法实施肠炎沙门氏菌的特异性检测，主要是依据沙门氏菌属特异性片段设计引物ST11-ST15，根据sefA基因设计引物sef167-sef478，用此方法检测了1078份鸡舍环境棉拭子，证明其敏感度(95％)高于传统方法的敏感度(92.5％)。
薛俊龙等(2011年)用鸡白痢沙门氏菌fliC基因序列建立特异性PCR诊断方法，此PCR体系能检出50pg以上的细菌DNA，阳性检出率和敏感性均高于常规检测方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种可快速、准确地检测鸡白痢沙门氏菌的特异性引物及含有该引物的试剂盒。
本发明的另一目的是提供基于上述引物及试剂盒，建立鸡白痢沙门氏菌的特异性PCR检测方法。
为了实现本发明目的，本发明根据鸡白痢沙门氏菌(SalmonellaPullorum)特有的ipaJ基因(GenBank：GU949535.1)设计了一对特异性PCR引物，扩增产物大小为161bp，引物序列如下：
正向引物ipaJ-F：5’-ATTAACAGGAGGAGGCTGG-3’(Seq IDNo.1)
反向引物ipaJ-R：5’-CCATTCCCAAAAGCCTGCAT-3’(Seq ID No.2)
本发明还提供含有上述引物的用于检测鸡白痢沙门氏菌的试剂盒。
优选地，所述试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+、PCR反应缓冲液等中的至少一种。
更优选地，所述试剂盒还包括标准阳性模板。
本发明还提供鸡白痢沙门氏菌的PCR检测方法，利用上述引物或试剂盒对鸡白痢沙门氏菌进行PCR检测。包括以下步骤：
1)提取样品中的DNA；
2)以步骤1)中提取的DNA为模板，ipaJ-F和ipaJ-R为引物进行PCR扩增反应；
3)分析PCR产物。
PCR反应体系以15μl计为：
PCR反应条件为：95℃5分钟；95℃1分钟，55℃1分钟，72℃1分钟，共34个循环；72℃10分钟。
本发明提供的鸡白痢沙门氏菌的PCR检测方法，操作简便，易于掌握，便于推广，一般的分子实验室都可进行，仅需2天即可完成。同时本方法具有抗干扰能力强，灵敏度高，特异性强的优点，完全可以满足在家禽及其产品中快速、特异性检测鸡白痢沙门氏菌的需求。无论是家禽养殖场，还是禽产品加工厂，都可以选择最近的分子实验室进行检测，及时确诊鸡白痢沙门氏菌污染情况，将经济损失及对公共健康的危害降到最低。
附图说明
图1为本发明实施例1中鸡白痢沙门氏菌ipaJ基因特异性检测结果；其中，M：DNA分子量标准，N：空白对照，1：大肠杆菌，2：伤寒沙门氏菌，3：猪霍乱沙门氏菌，4：肠炎沙门氏菌，5：鸡伤寒沙门氏菌，6：鸡白痢沙门氏菌。
图2为本发明实施例2中鸡脾脏组织中检测鸡白痢沙门氏菌结果部分胶图；其中，M：DNA分子量标准，P：阳性对照，1-23：脾脏组织样本。
图3为本发明实施例3中鸡蛋3个不同部位中鸡白痢沙门氏菌检测结果部分胶图；其中，M：DNA分子量标准，P：阳性对照，1-23：蛋黄样本。
图4为本发明实施例4中鸡白痢沙门氏菌的PCR检测灵敏度结果；其中，M：DNA分子量标准，N：空白对照，1-7：分别对应于不同的DNA模板浓度。
具体实施方式：
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular cloning:a laboratory manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
实施例1 鸡白痢沙门氏菌的特异性PCR检测方法
根据鸡白痢沙门氏菌(Salmonella Pullorum)特有的ipaJ基因(GenBank：GU949535.1)设计了一对特异性PCR引物，扩增产物大小为161bp，引物序列如下：
正向引物ipaJ-F：5’-ATTAACAGGAGGAGGCTGG-3’
反向引物ipaJ-R：5’-CCATTCCCAAAAGCCTGCAT-3’
选取鸡体内最常见的大肠杆菌，亲缘关系最近、引起病症相似、基因同源性最高的鸡伤寒沙门氏菌(Salmonella Gallinarum)、肠炎沙门氏菌(Salmonella Enteritidis)、能引起人伤寒症的伤寒沙门氏菌(Salmonella Typhi)和猪霍乱沙门氏菌(Salmonella Choleraesuis)作为对照菌株，根据该引物序列建立的PCR法进行检测，证明了ipaJ基因的特异性，并且根据该引物进行PCR检测不会产生干扰条带，结果如图1所示。
PCR反应体系以15μl计为：
PCR反应条件为：95℃5分钟；95℃1分钟，55℃1分钟，72℃1分钟，共34个循环；72℃10分钟。
扩增产物于1.5％的琼脂糖凝胶中电泳，观察结果。
实施例2 鸡白痢沙门氏菌PCR检测技术的应用
从某鸡场鸡群中经全血平板凝集法检测得到54周龄试验蛋鸡，其中50只为鸡白痢阴性鸡，50只为鸡白痢阳性鸡，分别作为阴性组和阳性组，解剖后立即无菌条件下取其脾脏。用实施例1中的PCR法与培养分离法同时检测脾脏中鸡白痢沙门氏菌。
结果表明，采用PCR法的检出率明显高于传统的培养分离法，而且用时短、检测方便迅速。传统法检测呈阴性而PCR法检测显阳性的样品，经多次划线分离可得到鸡白痢沙门氏菌，结果如表1和图2所示。
表1 PCR法与传统培养分离法检出率和用时的比较
实施例3 鸡白痢沙门氏菌PCR检测技术的应用
取40只54周龄全血平板凝集呈阳性的试验蛋鸡，鸡蛋产出后马上进行甲醛熏蒸消毒。分别取其蛋壳、壳膜和蛋黄进行增菌培养，用该特异性PCR法检测蛋壳、壳膜和蛋黄3个不同部位中鸡白痢沙门氏菌的定植情况，所得结果与国内外相关研究基本相符。部分结果如图3所示。
增菌方法为：取样后按1:9的重量比加入缓冲蛋白胨水(BPW)，振荡培养18小时，吸取1ml培养液加入到9ml亚硒酸盐胱氨酸选择性增菌液(SC)中，振荡培养18小时。
提取DNA：取选择性增菌液2mL置于Ep管中，12000rpm离心5min，超纯水洗涤2次，用0.2mL超纯水悬浮，隔水煮沸15min，插入冰中冷却2min，12000rpm离心15min，取上清用作DNA模板。
PCR反应中以鸡白痢沙门氏菌标准菌株DNA为阳性对照。
实施例4 鸡白痢沙门氏菌PCR检测技术的灵敏度检测
提取鸡白痢沙门氏菌标准菌株DNA，用分光光度计测定DNA浓度为91.7ng/μl，按比例对其进行稀释并测定稀释后的准确浓度。分别取91.7ng/μl、44.0ng/μl、21.5ng/μl、6.7ng/μl、4.0ng/μl、1.3ng/μl、0.8ng/μl(分别对应于图4中第7至第1泳道)共7种浓度的DNA各1μl作为模板进行PCR扩增。扩增体系及扩增条件同实施例1的描述。
结果如图4所示，该PCR法能检测到模板DNA量的下限值为0.8ng/μl(第1泳道)，因此只要样品中模板DNA含量不低于0.8ng/μl，均可采用该法进行有效的扩增检测。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (8)

1.鸡白痢沙门氏菌(Salmonella Pullorum)的PCR检测引物，其特征在于，所述引物包括：
正向引物ipaJ-F：5’-ATTAACAGGAGGAGGCTGG-3’和
反向引物ipaJ-R：5’-CCATTCCCAAAAGCCTGCAT-3’。
2.含有权利要求1所述引物用于检测鸡白痢沙门氏菌的试剂盒。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+、PCR反应缓冲液中的至少一种。
4.根据权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括标准阳性模板。
5.鸡白痢沙门氏菌的PCR检测方法，其特征在于，利用权利要求1所述引物或权利要求2-4任一项所述试剂盒对鸡白痢沙门氏菌进行PCR检测。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)提取样品中的DNA；
2)以步骤1)中提取的DNA为模板，ipaJ-F和ipaJ-R为引物进行PCR扩增反应；
3)分析PCR产物。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，PCR反应体系以15μl计为：
8.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，PCR反应条件为：95℃5分钟；95℃1分钟，55℃1分钟，72℃1分钟，共34个循环；72℃10分钟。
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