发明内容
本发明的目的是提供一种辅助鉴定猪链球菌2型与猪链球菌7型的专用引物及其应用。
本发明提供的辅助鉴定猪链球菌2型和/或猪链球菌7型的专用引物,由序列表的序列1所示DNA、序列表的序列2所示DNA、序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA组成。
所述专用引物可用于制备辅助鉴定猪链球菌2型和/或猪链球菌7型的试剂盒。
本发明还保护一种辅助鉴定猪链球菌2型和/或猪链球菌7型的试剂盒,所述专用引物。所述试剂盒还可包括PCR扩增的常规试剂,琼脂糖凝胶电泳的常规试剂等。
所述专用引物或所述试剂盒可用于辅助鉴定猪链球菌2型和/或猪链球菌7型。
本发明还保护辅助鉴定猪链球菌2型和/或猪链球菌7型的方法I,包括如下步骤:
(1)提取待测细菌的基因组DNA;
(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板,用所述专用引物进行PCR扩增;如果得到了211bp的PCR扩增产物,待测细菌为候选的猪链球菌2型;如果得到了347bp的PCR扩增产物,待测细菌为候选的猪链球菌7型;如果没有得到211bp或347bp的PCR扩增产物,待测细菌为候选的非猪链球菌2型且为候选的非猪链球菌7型。
本发明还保护辅助鉴定猪链球菌2型和/或猪链球菌7型的方法II,包括如下步骤:
(1)提取待测细菌的基因组DNA;
(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板,分别用引物对甲和引物对乙进行PCR扩增;如果应用所述引物对甲得到了211bp的PCR扩增产物,待测细菌为候选的猪链球菌2型;如果应用所述引物对甲没有得到211bp的PCR扩增产物,待测细菌为候选的非猪链球菌2型;如果应用所述引物对乙得到了347bp的PCR扩增产物,待测细菌为候选的猪链球菌7型;如果应用所述引物对乙没有得到347bp的PCR扩增产物,待测细菌为候选的非猪链球菌7型;所述引物对甲是序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA组成的引物对;所述引物对乙是序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA组成的引物对。
本发明还保护鉴别猪链球菌2型和猪链球菌7型的方法III,包括如下步骤:
(1)提取待测细菌的基因组DNA;所述待测细菌为猪链球菌2型或猪链球菌7型;
(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板,用所述专用引物进行PCR扩增;如果得到了211bp的PCR扩增产物,待测细菌为猪链球菌2型;如果得到了347bp的PCR扩增产物,待测细菌为猪链球菌7型。
本发明还保护鉴别猪链球菌2型和猪链球菌7型的方法IV,包括如下步骤:
(1)提取待测细菌的基因组DNA;所述待测细菌为猪链球菌2型或猪链球菌7型;
(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板,分别用引物对甲和引物对乙进行PCR扩增;如果应用所述引物对甲得到了211bp的PCR扩增产物,待测细菌为猪链球菌2型;如果应用所述引物对乙得到了347bp的PCR扩增产物,待测细菌为猪链球菌7型。
本发明还保护一种检测来自死亡动物的样品中是否携带猪链球菌2型和/或猪链球菌7型的方法V,包括如下步骤:
(1)提取待测样品的基因组DNA;
(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板,用所述专用引物进行PCR扩增;如果得到了211bp的PCR扩增产物,待测样品疑似含有猪链球菌2型;如果得到了347bp的PCR扩增产物,待测样本疑似含有猪链球菌7型;如果没有得到211bp或347bp的PCR扩增产物,待测样本疑似不含有猪链球菌2型和猪链球菌7型。
本发明还保护一种检测来自死亡动物的样品中是否携带猪链球菌2型和/或猪链球菌7型的方法VI,包括如下步骤:
(1)提取待测样品的基因组DNA;
(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板,分别用引物对甲和引物对乙进行PCR扩增;如果应用所述引物对甲得到了211bp的PCR扩增产物,待测样品疑似含有猪链球菌2型;如果应用所述引物对甲没有得到211bp的PCR扩增产物,待测样本疑似不含有猪链球菌2型;如果应用所述引物对乙得到了347bp的PCR扩增产物,待测样本疑似含有猪链球菌7型;如果应用所述引物对乙没有得到347bp的PCR扩增产物,待测待测样本疑似不含有猪链球菌7型;所述引物对甲是序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA组成的引物对;所述引物对乙是序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA组成的引物对。
所述方法I和/或所述方法II和/或所述方法III和/或所述方法IV和/或所述方法V和/或所述方法VI中,所述PCR扩增的反应条件为:94℃2min预变性;94℃10s,55℃15s,72℃15s,30个循环;72℃延伸10min。所述方法I和/或所述方法II中,所述待测细菌可为猪链球菌2型、猪链球菌7型、猪大肠埃希氏菌、猪布氏杆菌或金黄色葡萄球菌。所述方法V和/或所述方法VI中,所述动物可为猪。所述方法I和/或所述方法II和/或所述方法III和/或所述方法IV均可用于待测细菌的分类鉴定。
本发明提供的专用引物可以辅助鉴定和鉴别猪链球菌2型和猪链球菌7型,应用本发明提供的专用引物进行检测,具有特异、灵敏、快速等优点,可以防患于未然,对人和动物感染猪链球菌的防控具有重要意义。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明,但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料,如无特殊说明,均为自常规生化试剂商店购买得到的。杜×大×长三元杂交猪(杜×大×长三元杂交猪即杜洛克猪、大白猪和长白猪的三元杂交猪):购自北京大兴种猪种禽厂。猪链球菌2型(Streptococcus suis type 2,SS2;又称猪链球菌血清2型或猪链球菌荚膜2型):购自中国兽医药品监察所,产品目录号为CVCC1940。猪大肠埃希氏菌:购自中国兽医药品监察所,产品目录号为CVCC216。猪布氏杆菌:购自中国兽医药品监察所,产品目录号为CVCC1079。金黄色葡萄球菌:购自中国兽医药品监察所,产品目录号为CVCC3052。以下实施例中的定量试验,均设置三次重复实验,结果取平均值。
猪链球菌7型(Streptococcus suis sequence type 7,SS7)公众可以从中国科学院微生物研究所获得;参考文献:Ye C,Bai X,Zhang J,et al.Spread ofStreptococcus suis sequence type 7,China.Emerg Infect Dis.,2008,14(5):787-791。
猪链球菌2型和猪链球菌7型的形态特征和生理特征如下:在绵羊血琼脂培养基上培养:猪链球菌2型和猪链球菌7型菌落均呈灰绿色,但猪链球菌7型溶血特性更易于观察到,猪链球菌2型显示α溶血环,猪链球菌7型显示β溶血环;在显微镜下观察,二者猪链球菌2型和猪链球菌7型均显球形或卵圆形、多呈链状,但猪链球菌2型菌体比猪链球菌7型菌体略小。
实施例1、猪链球菌的特异型引物的设计
在菌属保守序列、CPS2J基因引物序列区域设计SS2特异性引物对如下:
SS-CPS2J-F:5’-CGGTTACCAAATGGTGGTG-3’(序列表的序列1);
SS-CPS2J-R:5’-ACTTTTGCAGCTCAGATTCTTG-3’(序列表的序列2)。
目的扩增片段长度为211bp(靶序列见序列表的序列5)。
在菌属保守序列、CPS7H基因引物序列区域设计SS7特异性引物对如下:
SS-CPS7H-F:5’-GGCAGCTCTAACACGAAATAAG-3’(序列表的序列3);
SS-CPS7H-R:5’-TCTTACACAATTGAAGTAATATCGC-3’(序列表的序列4)。
目的扩增片段长度为347bp(靶序列见序列表的序列6)。
实施例2、样本的制备
一、双阳性样本的制备
每只杜×大×长三元杂交猪口腔上颚扁桃体部位喷雾接种1ml浓度为104cfu/ml的猪链球菌2型菌液和1ml浓度为1010cfu/ml的猪链球菌7型菌液。
接种感染后第5天,采集扁桃体试纸,分离细菌进行形态特征和生理特征鉴定,可以鉴定出猪链球菌2型和猪链球菌7型的猪为双阳性样本。
二、猪链球菌2型阳性样本的制备
每只杜×大×长三元杂交猪口腔上颚扁桃体部位喷雾接种1ml浓度为104cfu/ml的猪链球菌2型菌液。
接种感染后第5天,采集扁桃体试纸,分离细菌进行形态特征和生理特征鉴定,可以鉴定出猪链球菌2型且没有鉴定出猪链球菌7型的猪为猪链球菌2型阳性样本。
三、猪链球菌7型阳性样本的制备
每只杜×大×长三元杂交猪口腔上颚扁桃体部位喷雾接种1ml浓度为1010cfu/ml的猪链球菌7型菌液。
接种感染后第5天,采集扁桃体试纸,分离细菌进行形态特征和生理特征鉴定,可以鉴定出猪链球菌7型且没有鉴定出猪链球菌2型的猪为猪链球菌7型阳性样本。
实施例3、猪链球菌的特异型引物的应用
分别取实施例2制备的双阳性样本、猪链球菌2型阳性样本和猪链球菌7型阳性样本的扁桃体试纸进行检测。
一、基因组DNA的提取
(1)在血液中加入3倍体积的红细胞裂解液,颠倒混匀,室温放置5分钟,期间再颠倒混匀几次,10000rpm离心1min(或5000rpm离心5min也可),弃上清,用100μLTE缓冲液充分悬浮沉淀;
(2)取100μL步骤(1)得到的溶液,加入50μL溶菌酶(100μg/mL),37℃处理1h。
(3)每管加入200μL裂解缓冲液,震荡15s。
(4)每管加入100μL 5mol/L NaCl水溶液,充分混匀后,12000rpm离心10min,除去蛋白质复合物及细胞壁等残渣,取上清。
(5)将上清转移到新离心管中,加入等体积的Tris饱和酚,充分混匀后,12000rpm离心3min,进一步沉淀蛋白质。
(6)吸取离心后水层,加等体积的氯仿,颠倒混匀,12000rpm离心3min,去除苯酚。
(7)吸出上清,加入两倍体积预冷的无水乙醇,15000rpm高速离心15min,弃上清液,收集沉淀。
(8)用900μL 70%酒精洗涤两次。
(9)真空干燥后,用10μL-30μL TE(用超纯水也可)溶解DNA,进行检测或-20℃冰箱放置备用。
二、猪链球菌的PCR的检测
以步骤一提取的基因组DNA为模板,分别用实施例1设计的SS2特异性引物对(SS-CPS2J-F和SS-CPS2J-R)和SS7特异性引物对(SS-CPS7H-F和SS-CPS7H-R)进行PCR扩增,得到PCR扩增产物。
PCR反应体系甲见表1。灭菌双蒸水作为阴性对照。
表1PCR反应体系甲
dNTP |
2μL |
SS-CPS2J-F(10pmol/μL) |
1μL |
SS-CPS2J-R(10pmol/μL) |
1μL |
Taq DNA Polymerase |
0.5μL |
10×Buffer |
2.5μL |
ddH2O |
15μL |
模板 |
3μL |
合计 |
25μL |
PCR反应体系乙见表2。灭菌双蒸水作为阴性对照。
表2PCR反应体系乙
dNTP |
2μL |
SS-CPS7H-F(10pmol/μL) |
1μL |
SS-CPS7H-R(10pmol/μL) |
1μL |
Taq DNA Polymerase |
0.5μL |
10×Buffer |
2.5μL |
ddH2O |
15μL |
模板 |
3μL |
合计 |
25μL |
反应体系甲和反应体系乙的反应程序相同,均如下:94℃2min预变性;94℃10s,55℃15s,72℃15s,30个循环;72℃延伸10min。
PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳。
猪链球菌2型阳性样本的结果见图1。应用SS2特异性引物对得到了200bp左右的目的条带,应用SS7特异性引物对没有得到200bp左右的目的条带。回收目的条带进行测序,结果表明应用SS2特异性引物对得到了211bp的DNA片段。
猪链球菌7型阳性样本的结果见图2。应用SS7特异性引物对得到了350bp左右的目的条带,应用SS2特异性引物对没有得到350bp左右的目的条带。回收目的条带进行测序,结果表明应用SS7特异性引物对得到了347bp的DNA片段。
双阳性样本的结果见图3。应用SS2特异性引物对得到了200bp左右的目的条带,应用SS7特异性引物对得到了350bp左右的目的条带。回收目的条带进行测序,结果表明应用SS2特异性引物对得到了211bp的DNA片段,应用SS7特异性引物对得到了347bp的DNA片段。
实施例4、敏感性试验
一、猪链球菌2型引物对的敏感性
猪链球菌2型的菌液梯度稀释,得到各种稀释液。
分别将1mL各个稀释液5000rpm离心5min,弃上清;沉淀用100μL TE缓冲液充分悬浮,100℃煮沸10分钟,迅速于-20℃放置10min,12000rpm离心10min;取上清作为PCR扩增的模板。
分别将各稀释液制备的模板采用实施例3的PCR反应体系甲(表1)进行PCR扩增。灭菌双蒸水作为阴性对照。PCR反应体系甲中,猪链球菌2型的浓度分别为107CFU/mL、106CFU/mL、105CFU/mL、104CFU/mL、103CFU/mL或102CFU/mL。
PCR反应条件:94℃2min预变性;94℃10s,55℃15s,72℃15s,30个循环;72℃延伸10min。
PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳,结果见图4。猪链球菌2型在PCR反应体系中的浓度为103CFU/mL以上,均可检测到211bp的DNA片段。
二、猪链球菌7型引物对的敏感性
猪链球菌7型的菌液梯度稀释,得到各种稀释液。
分别将1mL各个稀释液5000rpm离心5min,弃上清;沉淀用100μL TE缓冲液充分悬浮,100℃煮沸10分钟,迅速于-20℃放置10min,12000rpm离心10min;取上清作为PCR扩增的模板。
分别将各稀释液制备的模板采用实施例3的PCR反应体系乙(表2)进行PCR扩增。灭菌双蒸水作为阴性对照。PCR反应体系乙中,猪链球菌7型的浓度分别为107CFU/mL、106CFU/mL、105CFU/mL、104CFU/mL、103CFU/mL或102CFU/mL。
PCR反应条件:94℃2min预变性;94℃10s,55℃15s,72℃15s,30个循环;72℃延伸10min。
PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳,结果见图5。猪链球菌7型在反应体系中的浓度为103CFU/mL以上,均可检测到347bp的DNA片段。
实施例5、特异性试验
分别将猪链球菌2型、猪链球菌7型、猪大肠埃希氏菌、猪布氏杆菌和金黄色葡萄球菌作为待测菌,用SS2特异性引物对和SS7特异性引物对分别进行如下检测:
将1mL菌液5000rpm离心5min,弃上清;沉淀用100μL TE缓冲液充分悬浮,100℃煮沸10分钟,迅速于-20℃放置10min,12000rpm离心10min;取上清作为PCR扩增的模板。
将各菌液制备的模板分别采用实施例1设计的SS2特异性引物对(SS-CPS2J-F和SS-CPS2J-R)和SS7特异性引物对(SS-CPS7H-F和SS-CPS7H-R)进行PCR扩增,得到PCR扩增产物。PCR反应体系见表3。灭菌双蒸水作为阴性对照。PCR扩增体系中,待测菌的浓度为105CFU/mL。PCR反应条件:94℃2min预变性;94℃10s,55℃15s,72℃15s,30个循环;72℃延伸10min。
表3PCR反应体系
dNTP |
2μL |
SS-CPS2J-F(10pmol/μL) |
1μL |
SS-CPS2J-R(10pmol/μL) |
1μL |
SS-CPS7H-F(10pmol/μL) |
1μL |
SS-CPS7H-R(10pmol/μL) |
1μL |
Taq DNA Polymerase |
0.5μL |
10×Buffer |
2.5μL |
ddH2O |
13μL |
模板 |
3μL |
合计 |
25μL |
PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳,结果见图6。猪链球菌2型显示一条211bp的DNA片段,猪链球菌7型显示一条347bp的DNA片段,猪大肠埃希氏菌、猪布氏杆菌和金黄色葡萄球菌均不显示任何DNA片段。
实施例6、猪链球菌临床样品的检测
利用SS2特异性引物对和SS7特异性引物对共检测2009-2010年采集自河北省、山东省、广东省的猪全血385份,其中2型和7型双阳性22份,仅2型阳性29份,仅7型阳性为24份,阴性310份,阳性率为19.48%。
本实施例中检测血液样本和细菌培养物样品,实际应用中,也可以检测待测动物的组织样品、咽喉、扁桃体试纸等。组织样品的处理方法:无菌剪刀、镊子剪取1mg待检样品,加3倍体积PBS,于研磨器中充分研磨,5000rpm离心5min,将组织悬液移入无菌Eppendorf管中,用来提取DNA。咽喉、扁桃体试纸的处理方法:将试纸置于无菌Eppendorf管中,加PBS至管1/3体积,震荡混匀,5000rpm离心5min,弃上清,沉淀用100μL TE缓冲液充分悬浮。