CN113430288A - 一种用于区分三种猪链球菌血清型的复合pcr分型试剂盒及其应用 - Google Patents

一种用于区分三种猪链球菌血清型的复合pcr分型试剂盒及其应用 Download PDF

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田永祥
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Abstract

本发明属于生物技术技术领域，具体涉及一种用于区分三种猪链球菌血清型的复合PCR分型试剂盒及其应用。所述的试剂盒包含引物组；所述的引物组为：P1:TGATAGTGATTTGTCGGGAGGG、P2:GAGTATCTAAAGAATGCCTATTG；P3:AGCTCTAACACGAAATAAGGC、P4:GTCAAACACCCTGGATAGCCG；和P5:TTGGTGAGATTAAATCTAGAAAAG、P6:AGCCCTTATTGTCCTCAAAT；所述复合PCR分型试剂盒用于区分2型、7型和马链球菌兽疫亚种三种猪链球菌血清型具有很高的准确性，特异性好，灵敏度达pg级。

Description

一种用于区分三种猪链球菌血清型的复合PCR分型试剂盒及 其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于区分三种猪链球菌血清型的复合PCR分型试剂盒及其应用。
背景技术
猪链球菌病是由多种猪源的致病性链球菌引起的一种细菌性传染病，其最主要致病菌为猪链球菌。猪链球菌可感染猪和人，导致急性出血性败血症、脑膜炎、肺炎、关节炎等，发病率和死亡率高，不仅给养猪业造成巨大的经济损失，也对人类的生命安全构成威胁。根据荚膜多糖的差异可将猪链球菌分为35种血清型，其中猪链球菌2型被认为是分布最广、致病性最强的一种血清型。
近年来，随着集约化猪场的快速发展，猪链球菌病的发病率和死亡率有逐年上升趋势，并且已经在我国大部分地区流行开来。因此，建立快速、简单的猪链球菌分型方法，尽早检测猪链球菌对于该菌的预防和控制尤为重要。根据文献报道，在中国，目前已发现并分离到的血清型有35种，主要流行血清型有2型、7型和马链球菌兽疫亚种。
常见的猪链球菌分型方法主要有血清学和基因分型两种方法。血清学分型方法主要有补体结合、间接血凝、乳胶凝集及ELISA等。但因为操作繁琐、周期长、或敏感性低、特异性差等不能满足临床检测的需求。目前，猪场的猪链球菌主要流行血清型有2型、7型和马链球菌兽疫亚种，因此迫切需要一种高度特异、敏感和简便的方法对感染猪链球菌的样品进行分型。本复合PCR分型试剂盒所选引物特异性好，无同源序列，不会产生假阳性，而退火温度为56℃以保证引物同目的序列有效退火，不会产生假阴性。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，目的在于提供一种用于区分三种猪链球菌血清型的复合PCR分型试剂盒，所述的试剂盒包含引物组；所述的引物组为SEQ ID NO：1～6所示。
本发明的另一个目的在于提供一种用于区分三种猪链球菌血清型的复合PCR分型试剂盒的应用。
为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：
一种用于区分三种猪链球菌血清型的复合PCR分型试剂盒，所述的试剂盒包含引物组；所述的引物组为：
P1:TGATAGTGATTTGTCGGGAGGG、P2:GAGTATCTAAAGAATGCCTATTG；
P3:AGCTCTAACACGAAATAAGGC、P4:GTCAAACACCCTGGATAGCCG；
和P5:TTGGTGAGATTAAATCTAGAAAAG、P6:AGCCCTTATTGTCCTCAAAT；
所述的猪链球菌为：猪链球菌2型(Streptococcus suis serotype 2，SS2)、猪链球菌7型(Streptococcus suis serotype 7，SS7)和/或马链球菌兽疫亚种(Streptococcusequi subsp.Zooepidemicus，SEZ)。
利用上述引物，对待测菌株的DNA进行扩增，扩增出252bp则为7型猪链球菌，扩增出557bp则为2型猪链球菌，扩增出1045bp则为马链球菌兽疫亚种。
上述引物组可用于制备猪链球菌血清型的检测试剂盒。
与现有技术相比，本发明具有以下优点和效果：
(1)本发明设计了3对PCR引物，采用高保真酶对样本进行特异性复合PCR扩增，所述复合PCR分型试剂盒用于区分2型、7型和马链球菌兽疫亚种三种猪链球菌血清型具有很高的准确性，假阳性低，特异性好，灵敏度高；
(2)采用本发明所述试剂盒对样品进行PCR扩增，复合PCR产物可生成1、2或3条特异性片段，灵敏度达pg级；进行鉴别的样品来源包括分离的菌种资源或动物组织、动物呼吸道分泌物等，可以直接将组织洗涤液或单菌落、菌液经沸水裂解后作为模板，省去了细菌基因组提取的繁琐，大大节约了时间、人力和成本；
(3)本发明所述检测方法操作简便、反应快速，省时，省钱，可以一次反应就可以区分3种血清型中的任何一种血清型或者多种血清型组合，满足高通量样本分型鉴定的需求，为实现快速、大通量诊断和检测猪链球菌临床菌株提供技术支撑。
附图说明
图1为猪链球菌2型、7型和马链球菌兽疫亚种三种血清型标准菌株单独PCR产物琼脂糖凝胶电泳图；
其中：M:DL2000 DNA Marker；1:阴性对照；2-3:猪链球菌马链球菌兽疫亚种、猪链球菌2型和猪链球菌7型标准菌株。
图2为猪链球菌2型、7型和马链球菌兽疫亚种三种血清型标准菌株的复合PCR产物电泳图；
其中：M:DL2000 DNA Marker；1:猪链球菌2型、7型和马链球菌兽疫亚种三种血清型标准菌株；2:阴性对照。
图3为猪链球菌临床分离菌株的复合PCR产物电泳图；
其中：M:DL2000 DNAMarker；1:阴性对照；2-24:猪链球菌临床菌株。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例，本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。
实施例1：
一种用于区分三种猪链球菌血清型的复合PCR分型试剂盒，所述的试剂盒包含引物组；所述的引物组为：
P1:TGATAGTGATTTGTCGGGAGGG；P2:GAGTATCTAAAGAATGCCTATTG；
P3:AGCTCTAACACGAAATAAGGC；P4:GTCAAACACCCTGGATAGCCG；
P5:TTGGTGAGATTAAATCTAGAAAAG；P6:AGCCCTTATTGTCCTCAAAT。
实施例2：
一种用于区分三种猪链球菌血清型的复合PCR分型试剂盒在区分猪链球菌2型、猪链球菌7型和马链球菌兽疫亚种中的应用，应用过程如下：
(1)复合PCR模板的制备：①对于临床组织样品，挑取病变严重约1cm左右的组织样品用无菌ddH2O进行洗涤，煮沸5～10min，冰浴3min，12000r/min离心1min，上清液即为复合PCR反应的模板。②对于菌株，可以在无菌操作台上，用灼烧后冷却至室温的接种环从冻干保存或甘油保存猪链球菌的安培瓶中刮取适量冻干粉或菌液涂布于TSA培养皿上；过夜培养后，用接种环挑取针尖大小，圆型，边缘整齐，泛着蓝光的单菌落，置于已加10uL无菌ddH2O的EP管内，煮沸5～10min，冰浴3min，12000r/min离心1min，上清液即为复合PCR反应的模板；本实施例选择猪链球菌的3种血清型阳性标准菌株(链球菌2型SC19，猪链球菌7型031231，马链球菌兽疫亚种TN-714097)，经沸水裂解后得到复合PCR模板；阴性对照为副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis)的DNA。
(2)复合PCR反应体系的组成：依次在PCR反应管中加入PCR预混液12.5μL，引物P1和P2各1μL，引物P3、P4、P5和P6各0.5μL，PCR模板1μL，最后补充ddH2O到终体积为25μL，混匀；
PCR预混液包括Taq酶(5U/μL)、10×ExTaq Buffer(无Mg2+)、dNTP Mixture(25mM)和MgCl2(25mM)的混合物。
(3)复合PCR产物的扩增：94℃预变性5min，94℃变性10s←→56℃退火，72℃延伸70s，30个循环；
(4)复合PCR扩增产物检测：使用1.2％琼脂糖凝胶对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后，在凝胶成像系统下观察结果。
(5)复合PCR扩增结果判断：将PCR扩增产物经过琼脂糖凝胶电泳后，共出现3条不同大小的带(见图2)，经测序具体扩增大小为252bp(SEQ ID NO.1所示)、557bp(SEQ IDNO.2所示)和1045bp(SEQ ID NO.3所示)，扩增出252bp则为7型猪链球菌，扩增出557bp则为2型猪链球菌，扩增出1045bp则为马链球菌兽疫亚种，副猪嗜血杆菌无扩增条带。
实施例3：
一种用于区分三种猪链球菌血清型的复合PCR分型试剂盒的临床应用：
实验室送检的猪肺组织，运用实施例2建立的复合PCR方法对养殖户送检的共23份肺组织进行了检测(可在2个小时内完成)，包括如下步骤：
(1)复合PCR模板的制备：对于肺组织样品，无菌条件下将组织样品用酒精擦拭消毒后，用剪刀剔除外面部分，挑取病变严重约1cm左右的组织样品用无菌ddH2O进行洗涤，煮沸5～10min，冰浴3min，12000r/min离心1min，上清液即为复合PCR反应的模板；
(2)复合PCR反应体系的组成：依次在PCR反应管中加入PCR预混液12.5μL，引物P1和P2各1μL，引物P3、P4、P5和P6各0.5μL，PCR模板1μL，最后补充ddH2O到终体积为25μL，混匀；
PCR预混液包括Taq酶(5U/μL)、10×ExTaq Buffer(无Mg2+)、dNTP Mixture(25mM)和MgCl2(25mM)的混合物。
阳性对照为实施例2中的猪链球菌菌株DNA混合物，即2型、7型和马链球菌兽疫亚种三种血清型标准菌株的DNA混合物，阴性对照为副猪嗜血杆菌。
(3)复合PCR产物的扩增：94℃预变性5min，94℃变性10s←→56℃退火，72℃延伸70s，30个循环；
(4)复合PCR扩增产物检测：使用1.2％琼脂糖凝胶对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后，在凝胶成像系统下观察结果；
(5)复合PCR扩增结果判断：将PCR扩增产物经过琼脂糖凝胶电泳后，将结果与图2进行比对。
检测结果：对临床23份组织运用猪链球菌复合PCR分型方法进行检测，结果显示共有4份样品为核酸阳性样品，其中猪链球菌血清2型为2份(图3中泳道16、24)，血清7型核酸阳性1份(图3中泳道9)，血清马链球菌兽疫亚种核酸阳性1份(图3中泳道21)。细菌分离鉴定结果也证实了猪链球菌复合PCR分型方法检测结果的正确性。阳性对照结果与实施例2中相同，图3中未做展示。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的实例，而并非对实施方式的限制。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而因此所引申的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之内。
序列表
<110> 湖北省农业科学院畜牧兽医研究所
<120> 一种用于区分三种猪链球菌血清型的复合PCR分型试剂盒及其应用
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 252
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agctctaaca cgaaataagg cactaagaaa agctagaggt aggtggattg cgttcttgga 60
ttcagatgat ttatggcacc cgagtaagct agaaaaacag cttgaattta tgaaaaataa 120
tggatattca tttacttatc acaattttga aaagattgat gaatctagtc agtctttacg 180
tgtcctggtg tcaggaccag caattgtgac tagaaaaatg atgtacaatt acggctatcc 240
agggtgtttg ac 252
<210> 2
<211> 557
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tgatagtgat ttgtcgggag ggttacttgc tacttttgat ggaaattatc aagaatctga 60
gctgcaaaag tgtcaaattg atttggaaga gataaaagag gtgcgagact taggaaatga 120
aaattttcca aatcattata tgagcggtat ctttaatagc ccttgttgca aactttataa 180
gaatatatat ataaacaaag gttttgacac tgaacagtgg ttaggagagg acttattatt 240
taatctaaat tatttaaaga atataaaaaa agtcagctat gtaaacagaa atctttattt 300
tgctagaaga ggtatacaaa gtactacaaa tacgtttaaa aaagatgttt ttattcaatt 360
agaaaattta gaagagaaaa cttttgattt gtttgttaaa atatttggtg gacaatatga 420
attttctgtt tttaaagaga cgctacagtg gcatattatt tattatagct tattaatgtt 480
caaaaatgga gatgaatcgc ttccaaagaa attgcatata tttaagtatt tatacaatag 540
gcattcttta gatactc 557
<210> 3
<211> 1045
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ttggtgagat taaatctaga aaagcttcct cataaaacta agcaatcaag tcttctgatt 60
gttattagtg gttttatgtc aaaattatta gcagccagtt accgtatccc ttatcaaaat 120
ttggtagggg ataggggctt ttatgcttac caacaaattt accctttgct aggtattatt 180
tcagctttag gtctaactgc cttacccaat gtgattgcca gtatggctca gaaaaaaaaa 240
cagctacagc tagcagctct atttaaattg caatgttgta cgagcttcct attatcagga 300
atattggtgc tgagtcataa ggcattggct agctggatgg gggcacagca gctagcacca 360
tcaattatca taacagcaat ggttttgtta acaatcccct ttatatcctt ttatagaggt 420
ttagcccagg ctgatatgaa tatggctcca acagctctga gtcaagttct tgagcagatc 480
ataagagttg ctataatcat tgctgctgct ctatgctaca gcgtgtttgg ttggacggtt 540
tatgtaacag caaatgttgc tgcttttggc aatttagtgg cgagcttagt tattttagct 600
tatttgaagc gtcatagtgc ttattcatta aaaagctttt tctcagaaga tacagttgct 660
attagagatt taacaagtct gggcttgccg accttagttt ttttactttt ttcagtttac 720
ctgcttgttt ttcaattggt agattctctt ttggtgaaaa atattttggt taattcaggc 780
ttatcagagc taacagctga aatgactaag ggtgtttacg ataggggaca gcccttgctg 840
caatttggtc tcattttttc gacagcctta tttacagcct atttaccgaa tttaacagcc 900
ttatttcatg ttgaaaggga gatctataaa gaacagagtc aatgtttctt tgagtttatc 960
ttttatttta gtctgacgtt gactgttggc tttattagta ttcttcatct gatgaatcga 1020
gccttatttg aggacaataa gggct 1045
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tgatagtgat ttgtcgggag gg 22
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gagtatctaa agaatgccta ttg 23
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
agctctaaca cgaaataagg c 21
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gtcaaacacc ctggatagcc g 21
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ttggtgagat taaatctaga aaag 24
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
agcccttatt gtcctcaaat 20

Claims (2)

1.一种用于区分三种猪链球菌血清型的复合PCR分型试剂盒，所述的试剂盒包含引物组；所述的引物组为：
P1:TGATAGTGATTTGTCGGGAGGG、P2:GAGTATCTAAAGAATGCCTATTG；
P3: AGCTCTAACACGAAATAAGGC、P4: GTCAAACACCCTGGATAGCCG；
和P5: TTGGTGAGATTAAATCTAGAAAAG、P6:AGCCCTTATTGTCCTCAAAT；
所述的猪链球菌为：猪链球菌2型（Streptococcus suis serotype 2）、猪链球菌7型（Streptococcus suis serotype 7）和/或马链球菌兽疫亚种（Streptococcus equisubsp.Zooepidemicus）。
2.权利要求1所述试剂盒中的引物组，在制备猪链球菌血清型检测试剂盒中的应用。
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