CN101597649A

CN101597649A - 一种马链球菌兽疫亚种pcr检测方法及用于该方法的试剂盒

Info

Publication number: CN101597649A
Application number: CNA2009101439369A
Authority: CN
Inventors: 范红结; 李芳�; 陆承平
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2009-06-03
Filing date: 2009-06-03
Publication date: 2009-12-09
Anticipated expiration: 2029-06-03
Also published as: CN101597649B

Abstract

本发明属于流行病学和卫生检测领域。本发明涉及一种快速检测马链球菌兽疫亚种的PCR快速检测试剂盒及方法。具体而言，本发明所述试剂盒包括三对引物，分别特异性地针对类M蛋白(SzP)、纤联蛋白结合蛋白(Fnz)超氧化物歧化酶A(SodA)编码基因，可同时针对马链球菌兽疫亚种的三种毒力因子SzP、Fnz和SodA进行检测。本发明所述的多重PCR检测方法快速简便，可直接对病料检测，避免了常规细菌分离、培养和生化鉴定的复杂过程，缩短了检测时间，且操作方便，简单培训即能熟练使用。敏感性高，能检测出微量的病原。特异性强，能将马链球菌兽疫亚种和其它种类的链球菌区别开来，且无任何交叉反应。

Description

一种马链球菌兽疫亚种PCR检测方法及用于该方法的试剂盒

技术领域

本发明属于流行病学和卫生检测领域。具体而言，本发明涉及一种快速检测马链球菌兽疫亚种(Streptococcus equi subsp.zooepidemicus)的PCR快速检测试剂盒，以及使用该试剂盒进行检测的方法。

背景技术

猪链球菌病是一种严重危害世界养猪业的重要的细菌性传染病，并可引起人类的感染。该病的主要病原为马链球菌兽疫亚种(Streptococcus equi subsp.zooepidemicus)和猪链球菌2型(Streptococcus suis，type 2)。目前，对猪链球菌病的病原学诊断主要依赖于病原菌的分离、培养，费时费力。

马链球菌兽疫亚种是我国猪链球菌病的主要病原，目前尚缺乏快速、敏感的检测方法。因此，研制快速、敏感的新型检测试剂盒是当务之急。PCR检测方法快速、敏感、特异，是目前快速检测的热点之一。HASSAN等建立了PCR检测方法用于区分乳房链球菌(Streptococcus uberis)和副乳房链球菌(Streptococcus parauberis)(A.A.HASSAN，I.U.KHAN，A.ABDMLMAWJOOD，and C.LAMMLER.Evaluation of PCR Methods for RapidIdentification and Differentiation of Streptococcus uberis and Streptococcus parauberis，AmericanSociety for Microbiology Apr.2001，p.1618-1621)。但用于快速检测马链球菌兽疫亚种的PCR方法未见报道。

马链球菌兽疫亚种类M蛋白(SzP)高度抗酸，具有多种生物学功能(Timoney JF，ArliushinSC，Boschwitz JS.Comparison of the sequences and functions of Streptococcus equi M-like proteinSem and SzPse.Infect Immun，1997，65(9)：3600～3605)。其表面有调理素表位，能刺激机体产生抗调理素抗体(Timoney JF，Mukhtar M.Varability in the M proteins of the equine strains ofStreptococcus equi subsp zooepidemicus，P.15～20In W.Plowright，P D Rossdale，and J F Wade(ed)，Equine Infectious diseases VI，Cambridge 1991，R & W Publications，Newmarket，England)；能抑制补体C3b在菌体表面沉积，从而抑制机体补体系统的活化(Boschwitz JS，Timoney JF.Inhibitionof C3 deposition of Streptococcus equi by M protein：a mechanism for survival in equine blood.Infect Immun，1994，62：3515～3520)；能结合机体的纤维蛋白原，使其具有抗吞噬细胞的吞噬活性(Boschwitz JS，Timoney JF.Characterization of the antiphagocytic activity of equine fibrinogenfor Streptococcus.zooepidemicus.Microb Pathog，1994，17：121～129)。类M蛋白是该菌重要的毒力因子和保护性抗原，而马链球菌兽疫亚种无毒菌株不表达类M蛋白。因此，可尝试以类M蛋白基因为靶点，建立检测马链球菌的PCR方法，并且可以同时区分马链球菌强毒和弱毒菌株。

马链球菌兽疫亚种另外一种表面蛋白是纤联蛋白结合蛋白(fibronectin binding protein，Fnz)，该蛋白介导马链球菌兽疫亚种黏附宿主细胞，与宿主细胞上的纤联蛋白(fibronectin)结合，从而建立感染，所以纤联蛋白结合蛋白亦是马链球菌兽疫亚种重要的毒力因子(KyongsuHong(2005)Identification and characterization of a novel fibronectin-binding protein gene fromStreptococcus equi ssp.zooepidemicus strain VTU211.Immunology and Medical Microbiology 45231-237)。马链球菌兽疫亚种和猪链球菌2型均表达纤联蛋白结合蛋白，但二者同源性低于20％，而其他种的链球菌不表达该蛋白。所以马链球菌兽疫亚种的纤联蛋白结合蛋白基因可作为马链球菌兽疫亚种快速检测的靶基因，并可作为鉴别强弱毒株的靶基因之一。

超氧化物歧化酶A(SodA)是马链球菌兽疫亚种产生的一种胞外酶，能特异清除正常生命过程中产生的过量的超氧阴离子自由基，在生物体的生命活动中具有重要意义(AbdμLmawjood，A.，and C.La¨mmler，2000：Determination of intraspeciesvariations of the V2region of the SodA gene of Streptococcus equi ssp.zooepidemicus.Res.Vet.Sci.68，33-39)。在马链球菌中三个不同的亚种中，仅马链球菌兽疫亚种产生超氧化物歧化酶A。以超氧化物歧化酶A基因为靶基因，可建立PCR检测方法，区分马链球菌不同亚种。

基于上述考虑，本发明人通过大量实验，建立了可同时检测马链球菌兽疫亚种类M蛋白基因、纤联蛋白结合蛋白基因、超氧化物歧化酶A基因的多重PCR扩增体系，并在此基础上进一步优化，开发出了马链球菌兽疫亚种多重PCR检测试剂盒，以及建立了检测马链球菌兽疫亚种类M蛋白基因、纤联蛋白结合蛋白基因、超氧化物歧化酶A基因的多重PCR检测方法。所述方法和试剂盒不仅可用于该菌的快速检测，还可以区分马链球菌兽疫亚种类强毒菌株和无毒菌株。

发明内容：

本发明目的在于提供用于猪链球菌病快速诊断的多重PCR检测试剂及方法。

一个方面，本发明提供了一种用于马链球菌兽疫亚种致病性检测的多重PCR检测试剂，该试剂包括分别特异性地针对类M蛋白(SzP)、纤联蛋白结合蛋白(Fnz)超氧化物歧化酶A(SodA)编码基因的引物对，因而可同时针对马链球菌兽疫亚种的三种毒力因子SzP、Fnz和SodA进行检测，其中所述的特异性地针对SzP编码基因的引物对的核苷酸序列为：

SzP引物(正向)：5’CTA TCG GTG GTC GTA ATG GAG A3’

SzP引物(反向)：5’ACC TGC CAT AAC TGC AAG AGC T3’

其中所述的特异性地针对Fnz编码基因的引物对的核苷酸序列为：

Fnz引物(正向)：5’GAG GTG GAC CAG CTT CAC CT 3’

Fnz引物(反向)：5’GAG GAA AGA CGG TCC AGA CG 3’

其中所述的特异性地针对SodA编码基因的引物对的核苷酸序列为：

SodA引物(正向)：5’CAG CAT TCC TGC TGA CAT TCG TCA GG 3’

SodA引物(反向)：5’CTG ACC AGC CTT ATT CAC AAC CAG CC 3’

其中所述的SzP引物对、Fnz引物对与SodA引物对可以预先混合在一起，也可以独立存在于所述检测试剂中，使用时现用现配。

本发明所述的检测试剂进一步还可以含有其他PCR扩增用成分，例如，包括但不限于PCR缓冲液、MgCl₂和dNTP。

在本发明的一个优选实施方案中，该试剂为表1所列成分的混合液：

表1.马链球菌兽疫亚种多重PCR检测反应体系

成分	浓度	加入量
成分	浓度	加入量	PCR缓冲液(Mg²⁺Free，100mM Tris-HCl(pH8.3)、500mM KCl)	10倍浓缩	2.5μL
SzP引物(正向)	20mM	0.5μL	PCR缓冲液(Mg²⁺Free，100mM Tris-HCl(pH8.3)、500mM KCl)	10倍浓缩	2.5μL
SzP引物(正向)	20mM	0.5μL	SzP引物(反向)	20mM	0.5μL
Fnz引物(正向)	20mM	0.5μL	SzP引物(反向)	20mM	0.5μL
Fnz引物(正向)	20mM	0.5μL	Fnz引物(正向)	20mM	0.5μL
SodA引物(正向)	10mM	0.25μL	Fnz引物(正向)	20mM	0.5μL
SodA引物(正向)	10mM	0.25μL	SodA引物(正向)	10mM	0.25μL
MgCl₂	25mM	3.0μL	SodA引物(正向)	10mM	0.25μL
MgCl₂	25mM	3.0μL	dNTP	2.5mM	2.0μL

另一个方面，本发明提供了一种用于检测马链球菌兽疫亚种的多重PCR检测方法，该方法同时选取马链球菌兽疫亚种三种毒力因子SzP、Fnz和SodA编码基因为目的基因，使用本发明所述的特异性地针对SzP、Fnz和SodA编码基因的引物对和探针实施检测。

本发明所述方法可以直接对培养菌液进行检测，也可以对组织中携带的马链球菌兽疫亚种进行检测。在采用培养菌液作为检测材料时，菌体分离及培养须在P3实验室、按照CDC(中国疾病预防控制中心)推荐的猪链球菌分离培养程序进行。即采用扁桃体拭子采取待检猪的病料，实验室内，分别接种绵羊鲜血琼脂平板。37℃培养24h后，挑取可疑菌落接种于匹克氏增菌液，37℃培养24h后，再接种血清肉汤，37℃摇床培养后，灭活备用。在对带菌的组织，如猪扁桃体、肌肉等进行检测时，须首先采用商品化的基因组提取试剂盒提取其基因组DNA作为PCR检测用模板。

在利用本发明所述方法对待检样本实施检测时，可直接取一定量的本发明所述检测试剂，按照确立的反应体系和条件进行检测并判定结果。简而言之，本发明所述的用于检测马链球菌兽疫亚种的多重PCR检测方法包括下述步骤：

1)使用本发明所述的特异性地针对SzP、Fnz和SodA的引物对，与PCR扩增用的dNTP、MgCl₂、PCR缓冲液及聚合酶混合，得到检测预混液；

2)向上述检测预混液中加入待检菌液或从待检组织提取的基因组DNA作为模板；

3)将步骤2)中建立的扩增反应体系置于PCR仪上，按照预定扩增条件进行扩增；

4)电泳检测，观察是否有目标扩增产物出现。

在本发明中，所述的目标扩增产物出现是指，当电泳(优选为琼脂糖电泳、SDS-PAGE电泳等)检测时，同时出现750bp、540bp和230bp三个条带。

在本发明的一个优选实施方案中，取由表1所列成分组成的试剂10μL，加入0.15μLTaqDNA聚合酶(5U/μL)，加灭菌双蒸水12.85μL，制备得到预混液，然后加入2μL灭活菌液或者待检组织基因组DNA作为模板，即检测体系体积为25μL。将检测体系放入PCR仪后，设置如下条件进行反应：94℃变性4min；然后进入循环，94℃30s，55℃30s，72℃30s，共进行25个循环；最后72℃延伸10min。反应结束后电泳检测PCR扩增产物，当同时出现750bp、540bp和230bp三条带时，则判定为阳性，表示被检样品中存在马链球菌兽疫亚种。

本发明所述的马链球菌兽疫亚种类PCR快速检测试剂盒具有以下优点：(1)快速简便，可直接从病料中检测出细菌，避免了常规的细菌分离、培养和生化鉴定的复杂过程，缩短了检测时间。且操作方便，经过简单培训即能熟练使用；(2)敏感性高，PCR检测方法具有高度的敏感性，能检测出微量的病原；(3)特异性强，本发明能将马链球菌兽疫亚种和其它种类的链球菌区别开来，且没有任何交叉反应。

提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，而决不对本发明的内容和保护范围构成任何限制。除另有说明外，本申请中的所有科技术语都具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解相同的含义。本申请中引用的任一专利、专利申请和出版物在此引入作为参考。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常采用常规条件例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的方法。

实施例

实施例1：多重PCR反应体系的建立和优化

1.1引物的设计和合成

根据兽疫亚种类M蛋白基因、纤联蛋白结合蛋白、超氧化物歧化酶A基因的公开序列AY263781、DQ363208、AY938342，利用DNAStar软件自行设计三对引物，其中引物P1和P2扩增出马链球菌兽疫亚种类M蛋白基因片段的长度为750bp，引物P3和P4扩增出马链球菌兽疫亚种纤联蛋白结合蛋白基因片段的长度为540bp，引物P5和P6扩增出马链球菌兽疫亚种超氧化物歧化酶A基因片段的长度为230bp。三对引物均由TaKaRa公司合成，三对引物的序列分别为：

类M蛋白

正义引物P1：5’CTA TCG GTG GTC GTA ATG GAG A 3’

反义引物P2：5’ACC TGC CAT AAC TGC AAG AGC T 3’

纤连蛋白结合蛋白

正义引物P3：5’GAG GTG GAC CAG CTT CAC CT 3’

反义引物P4：5’GAG GAA AGA CGG TCC AGA CG 3’

超氧化物歧化酶A

正义引物P5：5’CAG CAT TCC TGC TGA CAT TCG TCA GG 3’

反义引物P6：5’CTG ACC AGC CTT ATT CAC AAC CAG CC 3’

引物合成后，将其稀释为10μmoL/L，-20℃避光保存备用。

1.2DNA模板的制备

利用蛋白酶K裂解法提取马链球菌兽疫亚种ATCC35246株基因组DNA作为PCR扩增反应的模板。

具体操作为，挑取血清Todd-Hewittbroth(THB)平板上ATCC35246单菌落，接种至含5％犊牛血清的THB液体培养基中，37℃静置培养过夜。取1ml菌液离心8000r/min 10min，弃去上清(尽量弃去液体)，弃上清的细菌备用。

取缓冲液(10mM/ml Tris-cl，1mM/ml EDTA)35μL加入0.4ug/μL的蛋白酶K 5μL配成反应体系，将上述弃去上清的细菌全部转移到反应体系中。水浴55℃反应10min，再加入80μL的CTAB/NaCl溶液，混匀，65℃水浴10min；加入等体积的氯仿/异戊醇抽提，在加入0.6体积的异丙醇沉淀、12000rpm离心20min；用75％的乙醇洗涤两次，然后在室温下干燥，将乙醇挥发，沉淀溶解于pH8.0的TE缓冲液中，-20％冻存备用。

1.3引物浓度及引物对之间比例的优化

在多重PCR检测体系中，引物浓度及引物间相互比例是多重PCR反应体系的关键，因此对引物浓度及引物对之间比例进行优化。

按正、反向引物等体积，三种引物对之间体积比为1∶1∶1、1∶1∶2、1∶2∶2和2∶2∶1，混合三种引物对混合液，共四种组合。四种组合及各引物具体用量(μl)见表2。

表2

用上述1.2中制备的基因组DNA作为PCR扩增模板，加入扩增反应所需的试剂组成表3所示的反应体系，反应同时设置阴性对照(以无菌水代替DNA模板进行)。

表3

混匀后，立即进行PCR反应。PCR循环参数为：94℃变性4min后，进入循环，94℃30s，55℃30s，72℃30s，共进行25个循环，最后72℃延伸10min。

将PCR扩增产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检测，分析引物浓度组合比对多重PCR扩增效果的影响。观察电泳结果发现，当引物M∶Fnz∶SodA为2∶2∶1时，可同时扩增出目的片段、扩增效果最好。

1.4退火温度的优化

用上述1.2中制备的基因组DNA作为PCR扩增模板，加入扩增反应所需的试剂组成表4所示的反应体系，反应同时设置阴性对照(以无菌水代替DNA模板进行)。

表4

*引物混合液中包含：引物P1、P2、P3、P4各0.5μL，引物P5、P6各0.25μL。

混匀后，立即进行PCR反应。PCR循环参数：94℃变性4min后，进入循环，94℃变性30s，退火温度^[11]分别为54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃30s，72℃延伸30s，共进行25个循环，最后72℃延伸10min。

将PCR扩增产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检测，分析退火温度对多重PCR扩增效果的影响。

观察电泳结果发现，退火温度的高低影响目的片段的扩增效果，从54℃到60℃均能扩增出目的片段，扩增量效果随温度的升高而增加，从55℃到60℃扩增量变化不大。

1.5退火时间的优化

用上述1.2中制备的基因组DNA作为PCR扩增模板，加入扩增反应所需的试剂组成表5所示的反应体系，反应同时设置阴性对照(以无菌水代替DNA模板进行)。

表5

混匀后，立即进行PCR反应。PCR循环参数：94℃变性4min后，进入循环，94℃变性时间分别为20s、30s、40s、60s，退火温度55℃退火时间分别为20s、30s、40s、60s，72℃延伸时间分别为20s、30s、40s、60s，共进行25个循环，最后72℃延伸10min。

将PCR扩增产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检测，分析退火时间对多重PCR扩增效果的影响。

观察电泳结果发现，当退火时间大于30s时扩增出清晰的目的片段。

1.6循环数的优化

用上述1.2中制备的基因组DNA作为PCR扩增模板，加入扩增反应所需的试剂组成表6所示的反应体系，反应同时设置阴性对照(以无菌水代替DNA模板进行)。

表6

混匀后，立即进行PCR反应。PCR循环参数：94℃变性4min后，进入循环，94℃变性30s，退火温度55℃30s，72℃延伸30s，分别进行30、25、20、15个循环，最后72℃延伸10min。

将PCR扩增产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检测，分析循环数对多重PCR扩增效果的影响。

观察电泳结果发现，循环数大于20开始出现条带，当循环数为30时效果目的条带清晰。

1.7反应体系及反应条件的建立

根据上述优化结果，建立的多重PCR反应体系为：

表7

*引物混合液中包含：引物P1、P2、P3、P4各1μL，引物P5、P6各0.5μL。

优化后的多重PCR反应条件是：94℃变性4min；然后进入循环，94℃30s，55℃30s，72℃30s，共进行25个循环；最后72℃延伸10min。

用SDS-PAGE电泳检测PCR扩增获得的DNA片段。

实施例2：多重PCR特异性试验

2.1菌株

2.1.1阳性菌株

马链球菌兽疫亚种ATCC35246株，1977年分离自我国四川，有ATCC收藏

马链球菌兽疫亚种CVCC552株，购自中国菌种保藏中心。

马链球菌兽疫亚种CVCC555株，购自中国菌种保藏中心。

马链球菌兽疫亚种CC株，江苏省农科院惠赠。

马链球菌兽疫亚种CT株，江苏省农科院惠赠。

马链球菌兽疫亚种CY株，江苏省农科院惠赠。

2.1.2阴性菌株

马链球菌马亚种CVCC1892株，购自中国菌种保藏中心。

停乳链球菌CVCC588株，购自中国菌种保藏中心

无乳链球菌CVCC1886株，购自中国菌种保藏中心

链球菌CVCC595株，兰氏E群猪源中国非模式株，购自中国菌种保藏中心

猪链球菌1型SH28株，本试验室保存。

猪链球菌2型HA9801株，系姚火春等从江苏1998年爆发猪链球菌病的病猪中分离，保藏号为CGMCC NO.1446。

2.2试验方法

2.2.1细菌基因组DNA的获取，

方法同1.2中所述。

2.2.2细菌类M蛋白、纤连蛋白、超氧化物歧化酶A目的基因片段的扩增

采用1.7所述的多重PCR反应体系及反应条件，方法同实施例1中所述。

2.2.3试验结果及结论

电泳结果表明：2.1.1中所列的马链球菌兽疫亚种阳性菌株均同时扩增得到三条长度分别为750bp、540bp、230bp的类M蛋白、纤连蛋白、超氧化物歧化酶A的目的基因片段；2.1.2中所列的阴性菌株中，仅与马链球菌兽疫亚种有很近同源关系的马链球菌马亚种扩增得到一条230bp的超氧化物歧化酶A基因片段，其余菌株扩增产物中均未出现任一上述基因片段。

本申请所述检测试剂及方法以同时扩增得到750bp、540bp、230bp三条基因片段为阳性判断标准。因此，本申请针对马链球菌兽疫亚种类M蛋白、纤连蛋白、超氧化物歧化酶A基因片段设计合成的引物，特异性强，进行多重PCR检测检出率100％。

实施例3：多重PCR检测方法的敏感性试验

用马链球菌兽疫亚种ATCC35246株，通过蛋白酶K裂解法提取基因组DNA作为扩增模板。

用分光光度仪测量基因组DNA的浓度，从100ng/ml开始10倍比稀释，以不同稀释度的细菌基因组DNA为模板进行多重PCR扩增。采用1.7所述的多重PCR反应体系及反应条件，方法同实施例1中所述。比较不同模板浓度对多重PCR扩增效果的影响。

结果显示，当模板量达10ng/ml时便能扩增出目的片段，并且随DNA模板量的增加扩增的目的条带逐步增强。

由此可知：本发明建立的多重PCR扩增方法具有很高的敏感性。

实施例4：多重PCR检测试剂盒的重复性试验

以本发明的不同批次PCR检测试剂盒分别对马链球菌兽疫亚种参考株ATCC35246、猪链球菌2型、马链球菌马亚种进行检测。具体检测方法同实施例1中所述。

结果显示，不同批次的PCR检测试剂盒对以上细菌PCR扩增结果完全相同。

由此可知：本发明的PCR检测试剂盒具有很好的重复性。

序列表

<110>范红结李芳陆承平

<120>一种马链球菌兽疫亚种PCR检测方法及用于该方法的试剂盒

<130>

<160>6

<170>PatentIn version 3.4

<210>1

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>引物

<222>(1)..(22)

<400>1

ctatcggtgg tcgtaatgga ga 22

<210>2

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>引物

<222>(1)..(22)

<400>2

acctgccata actgcaagag ct 22

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>引物

<222>(1)..(20)

<400>3

gaggtggacc agcttcacct 20

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>引物

<222>(1)..(20)

<400>4

gaggaaagac ggtccagacg 20

<210>5

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>引物

<222>(1)..(26)

<400>5

cagcattcct gctgacattc gtcagg 26

<210>6

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>引物

<222>(1)..(26)

<400>6

ctgaccagcc ttattcacaa ccagcc 26

Claims

1.一种用于检测马链球菌兽疫亚种(Streptococcus equi subsp.zooepidemicus)的多重PCR检测试剂，该试剂包括分别特异性地针对马链球菌兽疫亚种的类M蛋白(SzP)、纤联蛋白结合蛋白(Fnz)和超氧化物歧化酶A(SodA)编码基因的引物对。

2.权利要求1所述的多重PCR检测试剂，其中所述的特异性地针对类M蛋白编码基因的引物对的核苷酸序列为：

正向引物：5’CTATCG GTG GTC GTAATG GAG A 3’

反向引物：5’ACC TGC CATAAC TGC AAG AGC T 3’

其中所述的特异性地针对纤联蛋白结合蛋白编码基因的引物对的核苷酸序列为：

正向引物：5’GAG GTG GAC CAG CTT CAC CT 3’

反向引物：5’GAG GAAAGA CGG TCC AGA CG 3’

其中所述的特异性地针对超氧化物歧化酶A编码基因的引物对的核苷酸序列为：

正向引物：5’CAG CAT TCC TGC TGA CAT TCG TCA GG 3’

反向引物：5’CTGACC AGC CTTATT CAC AAC CAG CC 3’

3.权利要求1或2所述的多重PCR检测试剂，其中所述的三对引物可以预先混合在一起，也可以独立存在于所述检测试剂中，使用时现用现配。

4.一种检测马链球菌兽疫亚种的多重PCR检测方法，该方法包括下列步骤：

1)使用权利要求1或2所述的三对引物，与PCR扩增用的dNTP、MgCl₂、PCR缓冲液及聚合酶混合，得到检测预混液；

4)观察是否有目标扩增产物出现。

5.权利要求4所述的多重PCR检测方法，其中所述的扩增条件为：94℃变性4min；然后进入循环，94℃30s，55℃30s，72℃30s，共进行25个循环；最后72℃延伸10min。

6.权利要求4或5所述的多重PCR检测方法，其中所述的目标扩增产物出现是指，当电泳检测时，同时出现750bp、540bp和230bp三个条带。

7.权利要求6所述的多重PCR检测方法，其中所述的电泳为琼脂糖凝胶电泳或SDS-PAGE电泳。