CN103555819A - 一种马腺疫链球菌的pcr检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种可用于检测马腺疫链球菌(又称马链球菌马亚种)的PCR检测试剂盒，包括引物、dNTP、缓冲液和DNA聚合酶，其中的上游物是5’-CTATTAAAGTCTCCATTG-3’，下游引物是5'-AATGTTGTTCAAGCAAATTC-3’；PCR检测方法：提供待测样品模板；在PCR簿壁管中加入dNTP、10×buffer、引物、DNA聚合酶、待测样品和ddH2O，混匀；令簿壁管中的混合物在PCR仪上扩增；在电泳设备中电泳扩增产物；分析并进行结果判断。该PCR试剂盒配制方法简便，易于产业化生产，PCR检测方法检测马腺疫链球菌的灵敏度高、检测周期短、速度快、可操作性强、其检测精度达80个菌的模板DNA，而检测成本却相对较低，在该病的临床诊断中具有重要的应用价值。

Description

一种马腺疫链球菌的PCR检测试剂盒及其检测方法
技术领域
本发明属于微生物生物技术领域，具体内容是关于一种可用于检测马腺疫链球菌(又称马链球菌马亚种)的PCR检测试剂盒，包括引物、dNTP、缓冲液和DNA聚合酶，其中的上游引物是5'-CTATTAAAGTCTCCATTG-3’，下游引物是5'-AATGTTGTTCAAGCAAATTC-3’；PCR检测方法：提供待测样品模板；在PCR簿壁管中加入dNTP、10×buffer、引物、DNA聚合酶、待测样品和ddH2O，混匀；令簿壁管中的混合物在PCR仪上扩增；在电泳设备中电泳扩增产物；分析并进行结果判断。 
技术背景
马腺疫链球菌(Streptococcus.equi subsp equi)能够引起马腺疫(Stangles)，该病在一些发达国家流行并造成严重的经济损失，是一种高度接触性疫病，主要是在马颈部和头部出现化脓性淋巴管炎。因此，迫切需要对马腺疫链球菌进行究。美、英等国家一直十分重视马腺疫链菌的免疫和诊断研究。随着我国养马业的快速发展马腺疫的防制也越来越受重视。 
准确而快速的诊断是控制疾病的关键，在疾病暴发时显得尤其重要。因为诊断的准确性决定疾控靶标的准确性，诊断的速度决定疾控响应的速度，而疾控响应的速度又决定疾病传播的范围、疾病控制的成败和经济损失的程度。 
马链球菌传统的诊断方法主要依靠脓汁中病原微生物学分离、培养和生化试验等进行鉴定。这种方法存在诸多局限性，如马链球菌在生化试验时往往出现不一致现象，可靠性差。另外检测周期长，一般至少需要5～7d才能做出结果，不利于对患马进行及时治疗。 
随着分子生物学技术的发展，许多新的分子生物学技术正在被用来进行链球菌的分离鉴定。尤其是PCR技术近年来在检测致病菌方面得到了广泛的应用，其具有敏感性高、特异性强、快速、简便、能高通量检测、重复性好等突出优点。总之PCR技术的应用很大程度上弥补了传统鉴定方法的弊端。 
目前国内对马腺疫的诊断方面的研究极少，目前对该菌的检测仍普遍采用分离培养、生化鉴定、血清分型的传统方法，耗时耗力，不适用生产中对检测的需求。也有研究采用了16SrDNA技术做辅助诊断，该诊断技术仍需要测序和序列分析进行验证，并且特异性不强，使检测周期延长(陈新华，康立超，黄新等，马腺疫链球菌的分离与鉴定，中国兽医 杂志，2013 1(49)：38-39)，不能满足目前临床及生产实践中对该病快速简便准确的诊断方法的需求。 
发明目的 
针对目前在马腺疫的诊断和研究中对于快速简便诊断方法的需求，本发明提供了一种马腺疫链球菌PCR检测试剂盒。根据已发表的马链球菌基因序列，设计合成引物，扩增得到了567bp的基因产物。该PCR诊断方法与传统的形态染色、培养特性和生化鉴定方法相比较，具有快速、准确的优点，并且具有特异性好，灵敏度高的特点，在该病的临床诊断中具有重要的应用价值。 
发明内容
本发明建立的马链球菌马亚种PCR诊断方法具有以下特征： 
(1)自行设计的引物，利用PCR方法扩增基因片段，扩增上游引物为5-CTATTAAAGTCTCCATTG-3’，下游引物是5’-AATGTTGTTCAAGCAAATTC-3’；经该引物的扩增应得到567bp的条带。 
(2)对被检细菌的基因组的PCR扩增。 
将提取马腺疫链球菌基因组DNA，经PCR扩增后，得到567bp的条带，与预期目的片段大小相符。 
（3)对建立的马腺疫链球菌PCR检测试剂盒的敏感性检测。 
取马腺疫链球菌过夜培养物，用血球计数板计数，将菌液按106，105，104，103等，以10倍系列稀释，取DNA进行PCR反应。 
(4)建立的马腺疫链球菌PCR检测试剂盒的特异性的检测。 
选取金黄色葡萄球菌分离株GW2-1，沙门氏菌，大肠杆菌，以及兽疫链球菌等检测马腺疫链球菌PCR检测试剂盒的特异性。 
发明效果 
(1)与传统和现有的马腺疫检测方法相比该PCR检测试剂盒的检测法具有操作简便的特点。 
(2)与传统和现有的方法相比该PCR检测试剂盒的检测法具有检测速度快的优点。 
(3)该PCR检测试剂盒的检测法具有灵敏度高的特点。 
(4)该PCR检测试剂盒的检测法具有特异性强的特点，非常适用于马腺疫链球菌的准确的检测与诊断。 
附图说明
图1是马腺疫链球菌标准菌株的PCR扩增产物于1％琼脂糖凝胶中进行电泳结果图。 
M.DL2000DNAMarker；1.阳性标准菌株2.阴性对照3.空白对照 
图2是马腺疫链球菌PCR检测试剂盒的敏感性检测结果图。 
M.DL2000DNA Marker；1.1×102倍稀释马链球菌马亚种基因组；2.1×103倍稀释马链球菌马亚种基因组；3.1×104倍稀释马链球菌马亚种基因组；4.1×105倍稀释马链球菌马亚种基因组；5.1×106倍稀释马链球菌马亚种基因组；6.1×107倍稀释马链球菌马亚种基因组； 
图3是建立的马腺疫链球菌PCR检测试剂盒的特异性的检测结果图。 
M.DL2000DNAMarker；1.马链球菌马亚种2.马链球菌兽疫亚种；3.乳酸菌；4.沙门氏菌； 
5.金黄色葡萄球菌25213；6.大肠杆菌35218；7.大肠杆菌DH5α；8.空白对照 
具体实施方案
为了更好地理解本发明，通过以下实施实例予以进一步说明，但并非对本发明的限定。 
实施例1：被检细菌基因组的提取及目的基因的PCR扩增。 
基因组的提取 
将纯化好的菌株接种于3mL的TH液体培养基中，过夜培养。具体方法如下： 
(1)取过夜培养的1.5mL菌液，离心，弃去培养基，再用灭菌去离子水，400uL旋沉淀，充分混匀后，再次离心，12000rpm，5min。重复上述操作一次。 
(2)弃去上清后，加入400uL的TE缓冲液，充分混匀后加入100uL(20mg/mL)溶菌酶和5uL的RNA酶，再次充分混匀后，37℃水浴1h30min。 
(3)加入80uL10％SDS溶液，充分混匀后，37℃水浴1h30min。 
(4)加入100uL5mol/L Nacl溶液和80uL CTAB/Nacl溶液，充分混匀，37℃水浴30min，-20℃放置20min。 
(5)加入500uL酚∶氯仿抽提液(酚∶氯仿∶异戊醇＝25∶24∶1，充分混匀，12000rpm，离心10min。轻轻的吸取上清，转移至另一干净的离心管中。 
(6)重复(5)一次。 
(7)加入0.1倍体积的醋酸钠(pH＝5.2)和0.6倍体积的异戊醇，轻轻的颠倒混匀，-20℃放置20min。 
(8)离心12000rpm，10min，弃上清，沉淀用70％乙醇400ul清洗沉淀，12000rpm，8min离心，用移液器轻轻的吸出上清，敞开管口，置于室温，待乙醇挥发完全。加入20uL的TE缓冲液，充分溶解沉淀，-20℃冻存备用。 
将提取后的基因组进行凝胶电泳鉴定。 
目的基因的PCR扩增 
PCR反应体系(20uL)：灭菌双蒸水11uL，Taq酶luL，10×buffer 2uL，上游引物0.5uL，下游引物0.5uL，模板1uL，dNTP 4uL。 
PCR扩增程序为：94℃预变性5min，94℃变性30S，53℃退火30S，72℃延伸90S，循环30次，72℃延伸10min，4℃保温。 
如图1所示PCR产物用1％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，可扩增得到片段长度约为567bp的阳性产物。 
实施例2：马腺疫链球菌PCR检测试剂盒的敏感性检测。 
如图2所示取马腺疫链球菌过夜培养物，用血球计数板计数，将菌液按106，105，104，103，10倍稀释，提取DNA进行PCR反应。对检测结果的分析显示所建立的马腺疫链球菌PCR检测试剂盒最小检测限为80cfu。 
实施例3：建立的马腺疫链球菌PCR检测试剂盒的特异性的检测。 
选取金黄色葡萄球菌，沙门氏菌，大肠杆菌，以及兽疫链球菌等检测马腺疫链球菌PCR检测试剂盒的特异性。从图3中可见，仅马腺疫链球菌标准菌的DNA中出现了与目的片段大小一致的条带，该检测方法可以用于在马群中特异性检测马腺疫链球菌。 

Claims (5)

1.一种用于马腺疫链球菌PCR检测试剂盒包括引物，dNTP、缓冲液和DNA聚合酶，其特征在于，其中的上游引物是5’-CTATTAAAGTCTCCATTG-3’，下游引物是5'-AATGTTGTTCAAGCAAATTC-3’。
2.根据权利要求1所述的的特异性引物对被检测的细菌基因组进行PCR扩增应得到567bp的PCR扩增产物。
3.根据权利要求1所述的马腺疫链球菌PCR检测试剂盒，该诊断方法应当具有的敏感性为80个菌的模板DNA。
4.根据权利要求1所述的马腺疫链球菌PCR检测试剂盒，其特征是该试剂盒对金黄色葡萄球菌，沙门氏菌，大肠杆菌，以及兽疫链球菌等的扩增呈阴性结果。
5.根据权利要求1所述的马腺疫链球菌PCR检测试剂盒包括其在马腺疫临床诊断和研究中的应用。
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