CN107828633B - 一种核酸提取和检测的试剂装置、试剂及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明揭示了一种核酸提取和检测的试剂装置、试剂及方法，所述试剂装置包括核酸提取腔室和核酸检测腔室，所述核酸提取腔室内预封装有用于核酸提取及纯化的第一试剂，所述核酸检测腔室内预封装有用于核酸检测的第二试剂，所述第一试剂包括细胞裂解液、核酸洗涤液及核酸洗脱液；所述第二试剂包括检测多种病原体的多种PCR冻干试剂，所述多种PCR冻干试剂包括多重PCR反应缓冲液、DNA聚合酶、所述多种病原体的特异性引物及探针，以及内质控的特异性引物及探针。本发明能够在封闭的试剂装置内自动实现15种呼吸道病原体的提取、纯化和检测，且试剂的灵敏度高，操作简便，易于临床推广。

Description

一种核酸提取和检测的试剂装置、试剂及方法
技术领域
本发明涉及一种核酸提取纯化领域，尤其是涉及一种在封闭系统内对多种病原体进行核酸提取和检测的装置、试剂及方法。
背景技术
急性呼吸道感染是最常见的传染性疾病之一，在发展中国家急性呼吸道疾病占急性发病的75％，其中80％的急性上呼吸道疾病和大部分下呼吸道疾病是由细菌外的病原体引起的，其中以呼吸道病毒最为常见[1](Mahony JB.Detection of RespiratoryVirusesby Molecular Methods[J].Clinical Microbiology Reviews,2008,21(4):716-747.)。常见的呼吸道病毒包括：甲型流感病毒(Influenza A virus，FluA)、乙型流感病毒(Influenza B virus，FluB)、呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus，RSV)、人偏肺病毒(Human Metapneumovirus，HMPV)、腺病毒(Adenovirus，AdV)、人鼻病毒和肠道病毒(Human rhinovirus&Human Enterovirus，HRV&HEV)、副流感病毒1型(Parainfluenzavirus type 1，PIV1)、副流感病毒2型(Parainfluenza virus type 2，PIV2)、副流感病毒3型(Parainfluenza virus type 3，PIV3)等。除病毒外肺炎支原体(Mycoplasmapneumoniae，MP)、肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae，CP)、百日咳杆菌(Bordetellapertussis，BP)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae，Hi)、嗜肺军团菌(Legionellapneumophila，LP)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae，SP)等同样能够引起呼吸道感染，其中肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、肺炎衣原体是引起儿童社区获得性肺炎的重要致病菌。呼吸道感染的临床表现易被认知，但引起呼吸道感染的病因却很难明确。能引起呼吸道感染的病原体包括病毒、细菌、支原体和衣原体等微生物。一种病原体可引起多种临床表现，而同一临床表现却可能是由多种不同病原体感染所引起的。在3岁以下的幼儿呼吸道感染中，常出现多种呼吸道病毒共同感染的情况[2](A Kaida.Associations between Co-Detected Respiratory Viruses in Children with Acute Respiratory Infections[J].Japanese Journal of Infectious Diseases,2014,67(6):469-475.)。呼吸道感染病原体的复杂性，导致临床上难以有目的的针对相应的病原体进行治疗，从而导致患者病情无改善，甚至病情加重。而盲目的使用抗生素也易导致抗生素的滥用等问题。近年来呼吸道病原体引发的疫情时常爆发，对公共卫生安全造成极大的危害。因此，建立一套简便、快速、准确、灵敏的呼吸道病原体检测试剂不仅对于呼吸道感染的临床诊断、针对性治疗以及避免抗生素的滥用等具有重要的意义；同时也对疫情病原体的传播途径的控制、人群的预防措施也具有重要的指导意义。
传统的呼吸道病原体的检测方法主要有：1)病原体的分离培养鉴定，2)病原体的抗原检测。其中：
1)病原体的分离培养鉴定是呼吸道病原体检测的重要技术手段，其优点是对实验室环境的硬件设备要求较低，且成本低廉。其缺点是培养鉴定过程繁琐、周期长、诊断效率低。
2)病原体的抗原检测:酶联免疫吸附法(ELISA)和免疫试腺病毒纸条法是目前常用的用来诊断呼吸道病原体的免疫学方法。其优点是快速、方便、检测的样本通量高。其缺点在于检测的灵敏度低；易发生交叉反应而出现假阳性的结果；抗体的制备耗时较长；对于多变异的病毒检测的适应性低。
近年来随着分子生物学的发展，以核酸为基础的分子诊断方法因具有快捷、高效、准确、省时省力等优点，已成为呼吸道病原体检测的重要方法。目前常用的检测技术包括：多重PCR技术、多重实时荧光PCR技术、环介导等温扩增技术、靶序列富集多重PCR技术、基因芯片技术等。
其中多重PCR技术和多重实时荧光PCR技术是发展较为成熟的呼吸道病原体检测技术。多重PCR技术的优点是有较高的特异性和灵敏度以及较低的成本。
而多重实时荧光PCR技术具有实时荧光PCR和多重PCR的优点，可以在同一反应体系中高效特异地检测一种或多种病原体。不仅避免了多重PCR可能出现的污染问题，且其扩增的片段都相对较小，因此其体系的设计和优化也相对简便，结合实时荧光检测系统，可以快速的获得检测结果。显著的缩短检测的时间。多重荧光PCR的技术难点在于其中一个反应体系中加入了较多的引物探针，在反应过程中易出现引物间的非特异结合，从而出现非特异性扩增；其次不同的扩增靶标间易出现PCR扩增的偏嗜的现象。
目前已上市的多重呼吸道病原体联检试剂盒，不论采用的多重PCR技术还是多重实时荧光PCR技术或是其他的核酸检测手段，都存在同样的一个问题，即在临床使用时必需先采用其他的核酸提取试剂对呼吸道样本进行核酸提取和纯化，然后才能进行后续的核酸扩增检测。整个检测流程操作繁琐、耗时较长。而且不同提取试剂提取和纯化的效率相差较大，从而导致下游多重荧光PCR的检测结果差异大，稳定性差。另外这些检测试剂盒大多都需要低温储存和运输，对试剂的储存和运输环境要求较高。不仅如此，试剂的使用对操作人员专业技能和硬件设备的要求较高，不利于临床推广。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种在配套仪器的配合下，在一个封闭系统内，可以完成呼吸道病15种病原体核酸提取、纯化和检测整个过程的核酸提取、纯化、检测的试剂装置、试剂及方法，以简化呼吸道病原体病原分析流程。
为实现上述目的，本发明提出如下技术方案：一种核酸提取和检测的试剂装置，所述试剂装置包括核酸提取腔室和核酸检测腔室，所述核酸提取腔室内预封装有用于核酸提取及纯化的第一试剂，所述核酸检测腔室内预封装有用于核酸检测的第二试剂，所述第一试剂包括细胞裂解液、核酸洗涤液及核酸洗脱液；所述第二试剂包括检测多种病原体的多种PCR试剂，所述多种PCR试剂包括多重PCR反应缓冲液、DNA聚合酶、所述多种病原体的特异性引物及探针，以及内质控的特异性引物及探针。
优选地，所述细胞裂解液，核酸洗涤液及核酸洗脱液分别封装于不同的一个或多个核酸提取腔室内。
所述多种PCR试剂包括分别封装于不同核酸检测腔室的第一PCR试剂，第二PCR试剂，第三PCR试剂，第四PCR试剂及第五PCR试剂。
所述第一PCR试剂包括多重PCR反应缓冲液、逆转录酶、DNA聚合酶、甲型流感病毒的特异性引物及探针、乙型流感病毒的特异性引物及探针、呼吸道合胞病毒的特异性引物及探针、内质控的特异性引物及探针；
所述第二PCR试剂包括多重PCR反应缓冲液、逆转录酶、DNA聚合酶、人偏肺病毒的特异性引物及探针、腺病毒的特异性引物及探针、鼻病毒和肠病毒的特异性引物及探针、内质控的特异性引物及探针；
所述第三PCR试剂包括多重PCR反应缓冲液、逆转录酶、DNA聚合酶、副流感病毒1型的特异性引物及探针、副流感病毒2型的特异性引物及探针、副流感病毒3型的特异性引物及探针、内质控的特异性引物及探针；
所述第四PCR试剂包括多重PCR反应缓冲液、DNA聚合酶、肺炎支原体的特异性引物及探针、肺炎衣原体的特异性引物及探针、百日咳杆菌的特异性引物及探针、内质控的特异性引物及探针；
所述第五PCR试剂包括包含多重PCR反应缓冲液、DNA聚合酶、流感嗜血杆菌的特异性引物及探针、嗜肺军团菌的特异性引物及探针、肺炎链球菌的特异性引物及探针、内质控的特异性引物及探针。
所述多种PCR试剂为PCR冻干试剂。
一种核酸提取试剂，包括细胞裂解液，核酸洗涤液及核酸洗脱液，其中：
所述细胞裂解液包括：15～20mM的Tris-HCl、3～7mM的EDTA、0.05～0.08％的SDS、30～40％的TritonX-100，以及内质控质粒模板；
所述核酸洗涤液包括：5～10mM的Tris-HCl、0.1～0.5mM的EDTA及0.7％的NaCl；
所述核酸洗脱液包括1～5mM的Tris-HCl。
一种核酸检测试剂，包括第一PCR试剂，第二PCR试剂，第三PCR试剂，第四PCR试剂以及第五PCR试剂；其中：
所述第一PCR试剂包括多重PCR反应缓冲液、逆转录酶、DNA聚合酶酶、甲型流感病毒的特异性引物及探针、乙型流感病毒的特异性引物及探针、呼吸道合胞病毒的特异性引物及探针、内质控的特异性引物及探针；
所述第二PCR试剂包括多重PCR反应缓冲液、逆转录酶、DNA聚合酶、人偏肺病毒的特异性引物及探针、腺病毒的特异性引物及探针、鼻病毒和肠病毒的特异性引物及探针、内质控的特异性引物及探针；
所述第三PCR试剂包括多重PCR反应缓冲液、逆转录酶、DNA聚合酶、副流感病毒1型的特异性引物及探针、副流感病毒2型的特异性引物及探针、副流感病毒3型的特异性引物及探针、内质控的特异性引物及探针；
所述第四PCR试剂包括多重PCR反应缓冲液、DNA聚合酶、肺炎支原体的特异性引物及探针、肺炎衣原体的特异性引物及探针、百日咳杆菌的特异性引物及探针、内质控的特异性引物及探针；
所述第五PCR试剂包括包含多重PCR反应缓冲液、DNA聚合酶、流感嗜血杆菌的特异性引物及探针、嗜肺军团菌的特异性引物及探针、肺炎链球菌的特异性引物及探针、内质控的特异性引物及探针。
优选地，所述DNA聚合酶为2～3U，所述逆转录酶为5～10U，所述RNA酶抑制剂为5～10U。
所述检测病原体的特异性引物及探针的序列为：
Figure BDA0001507131820000061
Figure BDA0001507131820000071
Figure BDA0001507131820000081
其中，F为上游引物序列，R为下游引物序列，P为双标记探针序列。
本发明还提出一种核酸提取及检测方法，包括如下检测步骤：
S1，采集呼吸道感染患者的呼吸道样本；
S2，取待检测样本，注入核酸提取腔室，由预封装于不同核酸提取腔室内的细胞裂解液，核酸洗涤液以及核酸洗脱液分别对检测样本进行裂解、洗涤、脱洗处理后得到核酸提取纯化物；
S3，所述核酸提取纯化物分别流入多个不同的核酸检测腔室后，溶解分别预设于所述不同核酸检测腔室内的多种PCR试剂，以进行核酸提取纯化物的PCR扩增和荧光检测。
优选地，所述S2中，所述检测样本在核酸提取腔室内裂解后，其混合液在离心力的作用下流入核酸吸附腔室，而废液流入废液腔内。
优选地，所述多种不同PCR试剂包括分别封装于不同核酸检测腔室内的第一PCR试剂，第二PCR试剂，第三PCR试剂，第四PCR试剂以及第五PCR试剂。
优选地，所述PCR试剂是将配置好的试剂装入冻干容器进行冷冻干燥处理后封膜得到。
与现有技术相比，本发明提供的呼吸道病原体核酸提取、纯化和检测的试剂装置、试剂及方法，能一次性检测分析15种呼吸道病原体的提取及检测，检测试剂的灵敏度高，对于病原体的检测灵敏度可达到50拷贝/反应，检测的特异高，PCR偏嗜性弱。同时，检测试剂的使用操作简便，耗时短，对操作人员的专业要求低。
附图说明
图1表示本发明核酸提取和检测方法所使用的提取检测装置的示意图；
图2为第一PCR检测试剂检测四个通道阳性检测结果图；
图3为第二PCR检测试剂检测四个通道阳性检测结果图；
图4为第三PCR检测试剂检测四个通道阳性检测结果图；
图5为第四PCR检测试剂检测四个通道阳性检测结果图；
图6为第五PCR检测试剂检测四个通道阳性检测结果图。
具体实施方式
下面将结合本发明的附图，对本发明实施例的技术方案进行清楚、完整的描述。
本发明优选实施例中所揭示的核酸提取和检测的装置，通过将配置好的核酸提取、纯化及检测试剂分别预封装于所述装置中，即本发明的核酸提取、检测试剂装置，其在其他设备的配合下，在封闭装置中能自动完成15种呼吸道样本核酸的提取、纯化和检测的整个过程。且在下面实施例中，PCR检测试剂是以冻干的PCR检测试剂为例进行说明的，而在本发明的其他实施例中，PCR检测试剂可以采用玻璃化干燥的PCR试剂，或是较为稳定的液态PCR试剂等形式的试剂，这些都涵盖在本发明的保护范围内。
如图1所示，本发明所揭示的试剂装置(核酸提取、纯化及检测装置的具体结构可参见中国专利申请号为201710371949.6中揭示的装置)，其包括第一试剂腔室4，第二试剂腔室5，第三试剂腔室9，第四试剂腔室8，产物腔室6，核酸吸附腔7，核酸检测腔室1，以及检测样本的加样口3；所述核酸提取腔室内预封装有用于核酸提取及纯化的第一试剂，所述核酸检测腔室内预封装有用于核酸检测的第二试剂。
所述第一试剂包括细胞裂解液、核酸洗涤液及核酸洗脱液；其中细胞裂解液预封装于第一试剂腔室4内，核酸洗涤液预封装于第二试剂腔室5及第三试剂腔室9，核酸洗脱液预封装于第四试剂腔室8。第一试剂可以完成对病毒、支原体、衣原体、革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌的核酸提取和纯化。
具体地，第一试剂腔室4中封装有500～1000uL细胞裂解液细胞裂解液，其成分包括：15～20mM的Tris-HCl(Tris为三羟甲基氨基甲烷)、3～7mM的EDTA(乙二胺四乙酸)、0.05～0.08％的SDS(十二烷基硫酸钠)、30～40％的TritonX-100(聚乙二醇辛基苯基醚)、以及内质控质粒模板，其中Tris-HCl的PH值优选为8.3。
第二试剂腔室5和第三试剂腔室9中封装有500～1000uL核酸洗涤液，其成分包括：5～10mM的Tris-HCl、0.1～0.5mM的EDTA(乙二胺四乙酸)、以及0.7％的NaCl，其中Tris-HCl的PH优选为8.3。
第四试剂腔室8中封装有300～400uL核酸洗脱液，其成分：包括1～5mM的Tris-HCl，其PH值优选为8.3。
核酸检测腔室内预封装有用于核酸检测的第二试剂，所述第二试剂包括检测多种病原体的多种PCR试剂，具体包括第一PCR试剂，第二PCR试剂，第三PCR试剂，第四PCR试剂以及第五PCR试剂。每份PCR试剂可检测四个荧光检测通道(FAM、HEX、ROX、CY5)，其中三个荧光通道(FAM、HEX、ROX)检测三种不同的呼吸道病原体，另一个通道(CY5)检测内质控(Internal Control，IC)。
第二试剂可以检测的15种呼吸道病原体包括：甲型流感病毒(FluA)、乙型流感病毒(FluB)、呼吸道合胞病毒(RSV)、人偏肺病毒(hMPV)、腺病毒(AdV)、鼻病毒和肠病毒(HRV&HEV)、副流感病毒1型(PIV1)、副流感病毒2型(PIV2)、副流感病毒3型(PIV3)、肺炎支原体(MP)、肺炎衣原体(CP)、百日咳杆菌(BP)、流感嗜血杆菌(Hi)、嗜肺军团菌(LP)、肺炎链球菌(SP)。包含病毒、支原体、衣原体、革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌。
所述各PCR试剂的具体成分为，所述第一PCR试剂包括多重PCR反应缓冲液、逆转录酶、DNA聚合酶、甲型流感病毒的特异性引物及探针、乙型流感病毒的特异性引物及探针、呼吸道合胞病毒的特异性引物及探针、内质控的特异性引物及探针；
所述第二PCR试剂包括多重PCR反应缓冲液、逆转录酶、DNA(脱氧核糖核酸)聚合酶、人偏肺病毒的特异性引物及探针、腺病毒的特异性引物及探针、鼻病毒和肠病毒的特异性引物及探针、内质控的特异性引物及探针；
所述第三PCR试剂包括多重PCR反应缓冲液、逆转录酶、DNA聚合酶、副流感病毒1型的特异性引物及探针、副流感病毒2型的特异性引物及探针、副流感病毒3型的特异性引物及探针、内质控的特异性引物及探针；
所述第四PCR试剂包括多重PCR反应缓冲液、DNA聚合酶、肺炎支原体的特异性引物及探针、肺炎衣原体的特异性引物及探针、百日咳杆菌的特异性引物及探针、内质控的特异性引物及探针；
所述第五PCR试剂包括包含多重PCR反应缓冲液、DNA聚合酶、流感嗜血杆菌的特异性引物及探针、嗜肺军团菌的特异性引物及探针、肺炎链球菌的特异性引物及探针、内质控的特异性引物及探针。
多重PCR缓冲液包括：75mM的Tris-HCl(PH为8.0)、30mM的KCl、2.5～4.5mM的MgCl2、100μg/μL的BSA、0.2mM的dATP、0.2mM的dTTP、0.2mM的dCTP，以及0.2mM的dGTP。
DNA聚合酶为2～3U；
逆转录酶为5～10U；
RNA酶抑制剂为5～10U。
检测15种呼吸道病原体的特异性引物及探针的序列(F为上游引物序列；R为下游引物序列；P为双标记探针序列)如下表所示：
Figure BDA0001507131820000121
Figure BDA0001507131820000131
Figure BDA0001507131820000141
Figure BDA0001507131820000151
上表中，第一PCR试剂中上下游引物和探针的量为：No.1 250nM，No.2250nM，No.3125nM；No.4 200nM，No.5 200nM，No.6 100nM；No.7 250nM，No.8 250nM，No.9 125nM；No.10230nM，No.11 230nM，No.12 125nM。
第二PCR试剂中上下游引物和探针的量为：No.1 250nM，No.2 250nM，No.3 125nM；No.13 250nM，No.14 250nM，No.15 100nM；No.16 250nM，No.17 250nM，No.18 100nM；No.19230nM，No.20 230nM，No.21 150nM。
第三PCR试剂中上下游引物和探针的量为：No.1 200nM，No.2 200nM，No.3 125nM；No.22 330nM，No.23 330nM，No.24 220nM；No.25 300nM，No.26 300nM，No.27 200nM；No.28150nM，No.29 150nM，No.30 100nM。
第四PCR试剂中上下游引物和探针的量为：No.1 250nM，No.2 250nM，No.3 125nM；No.31 150nM，No.32 150nM，No.33 125nM；No.34 200nM，No.35 200nM，No.36 100nM；No.37260nM，No.38 260nM，No.39 125nM。
第五PCR试剂中上下游引物和探针的量为：No.1 200nM，No.2 200nM，No.3 125nM；No.40 230nM，No.41 230nM，No.42 125nM；No.43 200nM，No.44 200nM，No.45 150nM；No.46250nM，No.47 250nM，No.48 125nM。
核酸提取试剂的封装方法为：配制好的细胞裂解液分装入第一试剂腔室、核酸洗涤液分装入第二、三试剂腔室、核酸洗脱液分装入第四试剂腔室，并进行封膜。
第二试剂即五种PCR试剂的封装方法为：五种PCR试剂配制好后，分别分装在冻干容器中或是分别分装在核酸提取检测装置中的5个核酸检测腔室中，放入冷冻干燥设备中进行冷冻干燥处理。冷冻干燥结束后，将冻干容器中的五种冻干试剂分别分装入五个核酸检测腔室，并进行封膜；或是将冻干后的PCR检测装置直接进行封膜。
本发明核酸提取和检测的方法包括如下步骤：
步骤1、采集呼吸道感染患者的呼吸道样本：鼻咽拭子、口咽拭子、肺泡灌洗液等均可。
步骤2、取100～500μl的待检样本，样本体积可根据样品属性、提取产物需求量、及下游实验需求而增减，通过装置的加样口注入第一试剂腔室4；
步骤3、封装于第一试剂腔室内的细胞裂解液在配套仪器的作用下，对加入的样本进行充分裂解处理，裂解后的混合液在离心力的作用下流入核酸吸附腔室，在该腔室，核酸将被捕获，而废液则流入废液腔；
步骤4、封装于第二试剂腔室内的核酸洗涤液流入核酸吸附腔室对核酸进行洗涤，洗涤后核酸依然被保留在核酸吸附腔室，废液流入废液腔；
步骤5、封装于第三试剂腔室内的核酸洗涤液流入核酸吸附腔室对核酸进行洗涤，洗涤后核酸依然被保留在核酸吸附腔室，废液流入废液腔；
步骤6、封装于第四试剂腔室的核酸洗脱液流入核酸吸附腔室，将吸附的核酸洗脱，成为核酸提取纯化物，并在离心力作用下流入产物腔室；
步骤7、产物腔室中的核酸提取纯化物在配套仪器提供外力作用下，来回旋转充分混匀，然后分别流入五个核酸检测腔室。流入每个PCR检测腔室的核酸提取纯化物的量是依据配制的PCR反应体积确定的(例如：配制的每份PCR试剂终反应体积为20μL时，则将控制20μL的核酸提取液分别流入五个核酸检测腔室)。
步骤8、流入五个核酸检测腔室的核酸提取纯化产物将会分别溶解其中的PCR试剂，形成完整的PCR反应体系，在配套仪器的作用下进行后续的PCR扩增和荧光检测。
在整个检测过程中，仅需要实验操作人员在试剂装置中加入样本，样本的核酸提取、纯化和PCR荧光检测整个流程均在配套仪器中自动进行。
如图2-图6所示为本发明PCR检测试剂检测所得的结果图，其中图2为第一PCR检测试剂检测四个通道阳性检测结果图，其中曲线10代表甲型流感病毒(FluA)，曲线11代表乙型流感病毒(FluB)，曲线12代表呼吸道合胞病毒(RSV)，曲线13代表内质控(IC)。
图3为第二PCR检测试剂四个通道阳性检测结果图，其中曲线14代表人偏肺病毒(hMPV)，曲线15代表腺病毒(AdV)，曲线16代表鼻病毒和肠病毒(HRV&HEV)，曲线17代表内质控(IC)。
图4为第三PCR检测试剂四个通道阳性检测结果图，曲线18代表副流感病毒1型(PIV1)，曲线19代表副流感病毒3型(PIV3)，曲线20代表副流感病毒2型(PIV2)，曲线21代表内质控(IC)。
图5为第四PCR检测试剂四个通道阳性检测结果图:曲线22代表肺炎支原体(MP)，曲线23代表肺炎衣原体(CP)，曲线24代表百日咳杆菌(BP)，曲线25代表内质控(IC)。
图6为第五PCR检测试剂四个通道阳性检测结果图：曲线26代表流感嗜血杆菌(Hi)，曲线27代表嗜肺军团菌(LP)，曲线28代表肺炎链球菌(SP)，曲线29代表内质控(IC)。
本发明基于多重荧光PCR检测技术，针对需检测的呼吸道15种病原体的保守基因设计引物探针开发一种多重荧光PCR检测试剂，然后结合一种封闭的核酸提纯化装置，将核酸提取试剂和核酸检测试剂预先封装在装置中，在配套仪器的配合下，能够实现在一封闭系统内完成呼吸道15种病原体从核酸提取、纯化到荧光PCR检测分析的整个流程，能够极大地简化呼吸道病原体分析的流程。试剂装置中设计的核酸提取试剂可以满足对病毒、支原体、衣原体、革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌的核酸提取和纯化。试剂装置中设计的五份多重荧光PCR检测试剂，经过系统的优化，不仅保证各种病原体的检测灵敏度，降低了体系的非特异扩增，并且降低了多重PCR扩增时易出现的PCR偏嗜现象。另外，本实施例中这五份多重荧光PCR试剂均经过冷冻干燥处理，再封装在装置中，使得整个封装试剂可以在常温状态下储存和运输。
PCR反应所需的酶、寡核苷酸引物、三磷酸脱氧核苷等均需要在-20℃以下低温储存，反复冻融或存储不当，均会造成上述成分失活或性能产生变化，从而导致PCR试剂的准确性、稳定性降低甚至PCR反应失败。冷冻干燥技术是目前保持PCR反应中酶、寡核苷酸引物和探针、三磷酸脱氧核苷性能的一个有效、普遍的方法。
本发明的技术内容及技术特征已揭示如上，然而熟悉本领域的技术人员仍可能基于本发明的教示及揭示而作种种不背离本发明精神的替换及修饰，因此，本发明保护范围应不限于实施例所揭示的内容，而应包括各种不背离本发明的替换及修饰，并为本专利申请权利要求所涵盖。
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Claims (4)

1.一种核酸提取和检测的试剂装置，其特征在于：所述试剂装置包括核酸提取腔室和核酸检测腔室，所述核酸提取腔室内预封装有用于核酸提取及纯化的第一试剂，所述核酸检测腔室内预封装有用于核酸检测的第二试剂，所述第一试剂包括细胞裂解液、核酸洗涤液及核酸洗脱液；所述第二试剂包括检测多种病原体的五种PCR试剂，所述五种PCR试剂包括多重PCR反应缓冲液、DNA聚合酶、所述多种病原体的特异性引物及探针，以及内质控的特异性引物及探针；所述五种PCR试剂分别为封装于不同核酸检测腔室的第一PCR试剂，第二PCR试剂，第三PCR试剂，第四PCR试剂及第五PCR试剂；每份PCR试剂检测四个荧光检测通道，其中三个荧光通道检测三种不同的呼吸道病原体，另一个通道检测内质控，所述五种PCR试剂为PCR冻干试剂，
所述第一PCR试剂由多重PCR反应缓冲液、逆转录酶、DNA聚合酶、甲型流感病毒的特异性引物及探针、乙型流感病毒的特异性引物及探针、呼吸道合胞病毒的特异性引物及探针、内质控的特异性引物及探针组成；
所述第二PCR试剂包括由多重PCR反应缓冲液、逆转录酶、DNA聚合酶、人偏肺病毒的特异性引物及探针、腺病毒的特异性引物及探针、鼻病毒和肠病毒的特异性引物及探针、内质控的特异性引物及探针组成；
所述第三PCR试剂由多重PCR反应缓冲液、逆转录酶、DNA聚合酶、副流感病毒1型的特异性引物及探针、副流感病毒2型的特异性引物及探针、副流感病毒3型的特异性引物及探针、内质控的特异性引物及探针组成；
所述第四PCR试剂由多重PCR反应缓冲液、DNA聚合酶、肺炎支原体的特异性引物及探针、肺炎衣原体的特异性引物及探针、百日咳杆菌的特异性引物及探针、内质控的特异性引物及探针组成；
所述第五PCR试剂由多重PCR反应缓冲液、DNA聚合酶、流感嗜血杆菌的特异性引物及探针、嗜肺军团菌的特异性引物及探针、肺炎链球菌的特异性引物及探针、内质控的特异性引物及探针组成；
检测病原体的特异性引物及探针的序列为：
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Figure FDA0002967859440000031
Figure FDA0002967859440000041
其中，F为上游引物序列，R为下游引物序列，P为双标记探针序列。
2.根据权利要求1所述的核酸提取和检测的 试剂装置，其特征在于：所述细胞裂解液，核酸洗涤液及核酸洗脱液分别封装于不同的一个或多个核酸提取腔室内。
3.根据权利要求1所述的核酸提取和检测的 试剂装置，其特征在于：
所述细胞裂解液包括：15～20mM的Tris-HCl、3～7mM的EDTA、0.05～0.08％的SDS、30～40％的TritonX-100，以及内质控质粒模板；
所述核酸洗涤液包括：5～10mM的Tris-HCl、0.1～0.5mM的EDTA及0.7％的NaCl；
所述核酸洗脱液包括1～5mM的Tris-HCl。
4.根据权利要求1所述的核酸提取和检测的 试剂装置，其特征在于：所述DNA聚合酶为2～3U，所述逆转录酶为5～10U，RNA酶抑制剂为5～10U。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108342301B (zh) * 2018-05-18 2023-11-28 西安天隆科技有限公司 一种核酸提取纯化装置
WO2018214907A1 (zh) * 2017-05-24 2018-11-29 西安天隆科技有限公司 一种核酸提取纯化装置及方法
CN108753968B (zh) * 2018-06-12 2022-04-12 广州和实生物技术有限公司 一种用于检测宫颈癌pax1基因甲基化的试剂盒
CN109517927A (zh) * 2018-09-03 2019-03-26 连云港出入境检验检疫局检验检疫综合技术中心 一种甲型、乙型流感病毒快速分型检测试剂盒及其应用
CN109207640B (zh) * 2018-10-23 2023-06-02 深圳市亿立方生物技术有限公司 一种检测多种呼吸道病毒的引物组、探针组和试剂盒及其应用
CN109337793B (zh) * 2018-10-23 2022-01-25 宁波艾捷康宁生物科技有限公司 一种全自动核酸提取检测系统
CN109371008B (zh) * 2018-10-25 2021-03-26 宁波艾捷康宁生物科技有限公司 一种核酸提取扩增检测试剂盒
CN109337899A (zh) * 2018-10-25 2019-02-15 宁波艾捷康宁生物科技有限公司 一种核酸提取与pcr检测试剂盒
CN109439658A (zh) * 2018-12-27 2019-03-08 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 一种裂解液及其在液态奶中提取核酸的方法
CN111074001B (zh) * 2019-12-19 2023-03-21 苏州华益美生物科技有限公司 9种呼吸道病原体核酸协同多重pcr检测
CN110923294A (zh) * 2019-12-25 2020-03-27 苏州天隆生物科技有限公司 一种std核酸提取和检测试剂及方法
CN110923295A (zh) * 2019-12-25 2020-03-27 苏州天隆生物科技有限公司 一种vre核酸提取和检测试剂及方法
CN112410467A (zh) * 2020-11-23 2021-02-26 深圳市赛格诺生物科技有限公司 一种检测甲型和乙型流感病毒的冻干型荧光rt-pcr试剂及方法
CN113430303A (zh) * 2021-06-29 2021-09-24 杭州圣庭医疗科技有限公司 一种基于纳米孔测序仪的23种呼吸道rna病毒快速鉴定方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103484354A (zh) * 2013-07-16 2014-01-01 中国航天员科研训练中心 可提取革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌核酸的核酸提取芯片
CN106867992A (zh) * 2017-01-11 2017-06-20 上海芯超生物科技有限公司 一种全血dna提取试剂盒及提取方法
CN106947683A (zh) * 2017-05-24 2017-07-14 苏州天隆生物科技有限公司 一种核酸提取纯化装置及方法
CN107058622A (zh) * 2017-03-30 2017-08-18 德必碁生物科技（厦门）有限公司 一种多重荧光pcr法联合检测呼吸道病原体的试剂盒

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103484354A (zh) * 2013-07-16 2014-01-01 中国航天员科研训练中心 可提取革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌核酸的核酸提取芯片
CN106867992A (zh) * 2017-01-11 2017-06-20 上海芯超生物科技有限公司 一种全血dna提取试剂盒及提取方法
CN107058622A (zh) * 2017-03-30 2017-08-18 德必碁生物科技（厦门）有限公司 一种多重荧光pcr法联合检测呼吸道病原体的试剂盒
CN106947683A (zh) * 2017-05-24 2017-07-14 苏州天隆生物科技有限公司 一种核酸提取纯化装置及方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A 5′-nuclease real-time reverse transcriptase–polymerase chain reaction assay for the detection of a broad range of influenza A subtypes, including H5N1;David M. Whiley et al;《Diagnostic Microbiology and Infectious Disease 》;20051231;第335–337页 *
检测18种（型/亚型）呼吸道病毒的两种反应实时荧光定量PCR的建立及其在流行病学调查中的应用;陈钰静;《中国优秀硕士学位论文全文数据库医药卫生科技辑》;20160315;E063-3 *

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