CN110923294A - 一种std核酸提取和检测试剂及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明揭示了一种STD核酸提取和检测试剂及方法，所述试剂包括核酸提取试剂和核酸检测试剂，核酸提取试剂包括细胞裂解液、核酸洗涤液和核酸洗脱液，核酸检测试剂包括可冻干的多重PCR反应缓冲液、STD不同病原体靶标基因的特异性引物及探针，以及内标质控的特异性引物及探针等，所述STD不同病原体包括沙眼衣原体、淋球菌、解脲脲原体和微小脲原体。本发明提供了一种针对STD核酸的提取、纯化和检测分型的试剂，该试剂灵敏度高、使用操作简便，耗时短，对操作人员的专业要求低，且整个封装试剂可以在常温下运输和储存。
Description
技术领域
本发明涉及一种核酸提取纯化领域，尤其是涉及一种STD核酸提取和检测试剂及方法。
背景技术
性传播疾病(Sexually Transmitted Disease，STD)常见的病原体有以下几种：沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis，CT)、淋球菌(Neisseria gonorrhoeae，NG)、解脲脲原体(Ureaplasma urealyticum，UU)、微小脲原体(Ureaplasma parvum，UP)。
其中，目前常规的病原检测技术有：(1)、分离培养技术：病原体分离培养，是早期的病原体检测的金标准。该方法具有较高的特异性和敏感性，但临床检测时间过长，过程繁琐，不适用于大范围检测。(2)、免疫学检测：以基于抗原-抗体的免疫反应，从蛋白水平对病原体进行检测。该方法存在检测灵敏度较低，且特异性受环境等影响较大，检测的窗口期较长，无法满足诊疗需求，仅适用于初筛而不能作为及时确诊的依据，不能够识别同一类病原的不同亚型等问题。(3)、基于PCR的检测方法：包括有普通PCR，荧光PCR法，基因芯片、测序方法等PCR是从核酸水平对病原体进行检测，整个实验需要1～2小时完成。该方法的主要缺点在于进行PCR检测时需要依赖PCR仪或昂贵的实时定量PCR仪，及其它多种配套设备，以及专门的PCR实验室和专业操作人员。PCR检测无法实现即时检验、床旁诊断和无特定实验室检测条件的场景应用，因此无法满足基层、用户终端、现场的检验需求。同时，PCR检测可能存在灵敏度低，因毒性质粒丢失导致的假阴性等问题。
目前基于多重PCR或多重荧光PCR方法进行性传播疾病的病原体CT/NG/UU/UP的多重检测试剂盒，普遍存在对于CT和NG基因检测仅选择病原体内源毒力质粒基因，该质粒易出现丢失的现象，从而易导致病原体的漏检。另外大多数试剂盒仅能检测解脲脲原体，不能够区分解脲脲原体和微小脲原体。而且，这些PCR检测试剂的使用，都需要先采用手工或半自动核酸提取设备进行样本的核酸提取、纯化然后进行核酸提取产物的扩增检测。另外，这些检测试剂盒大多都需要低温储存和运输，对试剂的储存和运输环境要求较高。不仅如此，试剂的使用对操作人员专业技能和硬件设备的要求较高，不利于临床推广。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种STD核酸提取和检测试剂及方法。
为实现上述目的，本发明提出如下技术方案：一种STD核酸提取和检测试剂，所述试剂包括核酸提取试剂和核酸检测试剂，所述核酸提取试剂包括细胞裂解液、核酸洗涤液和核酸洗脱液，所述核酸检测试剂包括可冻干的多重PCR反应缓冲液、STD不同病原体靶标基因的特异性引物及探针，以及内标质控基因的特异性引物及探针，所述STD不同病原体包括沙眼衣原体、淋球菌、解脲脲原体和微小脲原体。
优选地，所述细胞裂解液包括：10～15mM的Tris-HCl、2.5～5mM的EDTA、30～40％TritonX-100，以及内质控质粒模板；
所述核酸洗涤液包括：2.5～5mM的Tris-HCl、0.1～0.2mM的EDTA、0.7％Nacl；
所述核酸洗脱液包括：1.5～2.5mM的Tris-HCl。
优选地，所述可冻干的多重PCR反应缓冲液包括：50～70mM的Tris-Hcl、15～30mM的KCl、2.5～4.5mM的MgCl2、20～40μg/μL的BSA、0.2mM的dATP、0.4mM的dUTP、0.2mM的dCTP、0.2mM的dGTP、2～3U的DNA聚合酶、0.1～0.2U的TS-UNG酶、0.3～0.5M的海藻糖、0.001～0.002M的PEG8000、0.04～0.08M甘露醇。
优选地，所述STD不同病原体靶标基因的特异性引物及探针的序列，以及内标质控的特异性引物及探针的序列为：
其中，F为上游引物序列，R为下游引物序列，P为双标记探针序列。
优选地，所述PCR检测试剂同时检测5个荧光检测通道，每个所述荧光检测通道检测一种STD病原体或内标质控。
优选地，所述STD核酸提取和检测试剂封装于一封闭的试剂装置中，所述试剂装置包括核酸提取腔室和核酸检测腔室，所述核酸提取试剂和核酸检测试剂分别封装于所述核酸提取腔室和核酸检测腔室内。
本发明还揭示了另外一种技术方案：一种STD核酸提取和检测方法，包括：
S1，采集STD感染者的待检样本；
S2，取所述待检样本，注入核酸提取腔室，由预封装于不同核酸提取腔室内的细胞裂解液，核酸洗涤液以及核酸洗脱液分别对检测样本进行裂解、洗涤、洗脱处理后得到核酸提取纯化物；
S3，所述核酸提取纯化物分别流入核酸检测腔室后，溶解预设于所述核酸检测腔室内的核酸检测试剂，以进行核酸提取纯化物的PCR扩增和荧光检测。
本发明的有益效果是：
1、本发明提供了一种性传播疾病(STD)核酸的提取、纯化和检测分型的试剂，该检测试剂的灵敏度高，对于病原体的检测灵敏度可达到50拷贝/反应，且检测试剂的使用操作简便，耗时短，对操作人员的专业要求低，另外，PCR扩增试剂采用冻干形式封装在试剂装置中，使得整个试剂可以在常温下运输和储存。
2、本发明在配套仪器的作用下，能够在同一封闭装置中完成性传播疾病(STD)四种病原体的提取、纯化和检测过程，大大简化性传播疾病(STD)CT/NG/UU/UP四种病原体的检测分析流程。
附图说明
图1是本发明试剂封装的试剂装置的正面结构示意图；
图2是本发明核酸检测试剂5个通道阳性检测结果图。
附图标记：
1、核酸检测腔室，2、核酸检测试剂，3、加样口，4、第一试剂腔室，5、第二试剂腔室，6、产物腔室，7、核酸吸附腔室，8、第四试剂腔室，9、第三试剂腔室，10、沙眼衣原体(CT)，11、淋球菌(NG)，12、解脲脲原体(UU)，13、微小脲原体(UP)，14、内标质控(IC)。
具体实施方式
下面将结合本发明的附图，对本发明实施例的技术方案进行清楚、完整的描述。
本发明所揭示的一种STD核酸提取和检测试剂及方法，能够在同一封闭装置中完成性传播疾病(STD)CT/NG/UU/UP 4种病原体核酸的提取、纯化和检测的整个过程，检测试剂的灵敏度高、使用操作简便，耗时短，对操作人员的专业要求低，且整个封装试剂可以在常温下运输和储存。
本发明所揭示的一种STD核酸提取和检测试剂，包括：核酸提取试剂和核酸检测试剂，其中，核酸提取试剂可以完成对STD核酸的提取和纯化，其包括细胞裂解液、核酸洗涤液和核酸洗脱液，具体地，细胞裂解液实施时可包括：10～15mM的Tris-HCl、2.5～5mM的EDTA、30～40％TritonX-100，以及内质控质粒模板。本实施例中，细胞裂解液含量为700～800uL，其成分包括：15mM的Tris-HCl(Tris为三羟甲基氨基甲烷)、5mM的EDTA(乙二胺四乙酸)、30％TritonX-100(聚乙二醇辛基苯基醚)，以及内质控质粒模板，其中，Tris-HCl的pH值优选为8.3。
核酸洗涤液实施时可包括：2.5～5mM的Tris-HCl、0.1～0.2mM的EDTA、0.7％Nacl。本实施例中，核酸洗涤液为700uL，其成分包括：5mM的Tris-HCl、0.1mM的EDTA、0.7％Nacl，其中，Tris-HCl的pH值优选为8.0。
核酸洗脱液实施时可包括：1.5～2.5mM的Tris-HCl。本实施例中，核酸洗脱液为300uL，其成分包括：1.5mM的Tris-HCl，其中，Tris-HCl的pH值优选为8.3。
优选地，上述核酸提取试剂为液体状态，所以可在常温下储存。
核酸检测试剂基于实时荧光PCR(聚合酶链式反应)技术，分别对STD的沙眼衣原体(CT)、淋球菌(NG)、解脲脲原体(UU)和微小脲原体(UP)进行检测分析，其包括多重荧光PCR检测所需的多重PCR反应缓冲液(PCR buffer)、DNA聚合酶(Taq酶)、STD不同病原体靶标基因的特异性引物及探针，以及内标质控的特异性引物及探针，其中，STD不同病原体包括沙眼衣原体(CT)、淋球菌(NG)、解脲脲原体(UU)和微小脲原体(UP)。优选地，核酸检测试剂为冻干的PCR检测试剂，其也可在常温下储存。该份冻干试剂可同时检测5个荧光检测通道，包含FAM、JOE、TAMRA、ROX、CY5，每个通道检测沙眼衣原体(CT)、淋球菌(NG)、解脲脲原体(UU)和微小脲原体(UP)中的任意一种病原体或内标质控。
具体地，可冻干的多重PCR反应缓冲液实施时可包括：50～70mM的Tris-Hcl、15～30mM的KCl、2.5～4.5mM的MgCl2、20～40μg/μL的BSA、0.2mM的dATP、0.4mM的dUTP、0.2mM的dCTP、0.2mM的dGTP、2～3U的DNA聚合酶、0.1～0.2U的TS-UNG酶、0.3～0.5M的海藻糖、0.001～0.002M的PEG8000、0.04～0.08M甘露醇。本实施例中，可冻干的多重PCR反应缓冲液包括：50mM的Tris-Hcl、30mM的KCl、4mM的MgCl2、20μg/μL的BSA、0.2mM的dATP、0.4mM的dUTP、0.2mM的dCTP、0.2mM的dGTP、3U的DNA聚合酶、0.2U的TS-UNG酶为、0.3M的海藻糖、0.002M的PEG8000、0.04M甘露醇。
检测STD的沙眼衣原体(CT)、淋球菌(NG)、解脲脲原体(UU)和微小脲原体(UP)的特异性引物及探针的序列，以及内标质控的特异性引物及探针的序列如下表所示：
其中，F为上游引物序列，R为下游引物序列，P为双标记探针序列。
上表中，核酸检测试剂中上下游引物和探针的量分别为：No.1 333nM，No.2333nM，No.3 167nM；No.4 233nM，No.5 233nM，No.6 117nM；No.7 167nM，No.8 167nM，No.967nM；No.10 167nM，No.11 167nM，No.12 67nM；No.13 333nM，No.14 333nM，No.15 167nM；No.16 333nM，No.17 333nM，No.18 167nM；No.19 233nM，No.20 233nM，No.21 117nM。
优选地，上述STD核酸提取和检测试剂预封装于一封闭的试剂装置(其具体结构可参见中国专利申请号为201710371949.6中揭示的核酸提取、纯化及检测装置)中，该装置在配套仪器的配合下，能够实现在一封闭系统内完成性传播疾病(STD)CT/NG/UU/UP 4种病原体核酸的提取、纯化和检测的整个过程，能够极大地简化STD核酸的提取、纯化和检测流程。
结合图1所示，所述装置具体包括第一试剂腔室4，第二试剂腔室5，第三试剂腔室9，第四试剂腔室8，产物腔室6，核酸吸附腔7，核酸检测腔室1，以及检测样本的加样口3。
其中，上述细胞裂解液预封装于第一试剂腔室4内，在第二试剂腔室5和第三试剂腔室9中封装有核酸洗涤液，核酸洗脱液预封装于第四试剂腔室8内。上述核酸检测试剂预封装于核酸检测腔室1内。
本发明所揭示的STD核酸提取和检测方法包括以下步骤：
S1，采集STD感染者的待检样本。
其中，尿道拭子或阴道拭子经生理盐水洗涤后的洗涤液等均可作为待检样本。
S2，取待检样本，注入核酸提取腔室，由预封装于不同核酸提取腔室内的细胞裂解液，核酸洗涤液以及核酸洗脱液分别对检测样本进行裂解、洗涤、洗脱处理后得到核酸提取纯化物。
具体地，取100～500μl(样本体积可根据样品属性、提取产物需求量、及下游实验需求而增减)的待检样本，通过试剂装置的加样口3，注入第一试剂腔室4，第一试剂腔室4内封装有细胞裂解液，在配套仪器的作用下，将对加入的待检样本进行充分裂解处理，裂解后的混合液在离心力的作用下流入核酸吸附腔室7，在该腔室，核酸将被捕获，而废液则流入废液腔(试剂装置背面，图1未示)。
第二试剂腔室5内的核酸洗涤液流入核酸吸附腔室7对核酸进行洗涤，洗涤后核酸依然被保留在核酸吸附腔室7，废液流入废液腔。
第三试剂腔室9内的核酸洗涤液流入核酸吸附腔室7对核酸进行洗涤，洗涤后核酸依然被保留在核酸吸附腔室7，废液流入废液腔。
第四试剂腔室8内封装的核酸洗脱液，流入核酸吸附腔室7，将吸附的核酸洗脱，成为核酸提取纯化物，并在离心力作用下流入产物腔室6。
S3，核酸提取纯化物流入核酸检测腔室后，溶解预设于核酸检测腔室内的核酸检测试剂，以进行核酸提取纯化物的PCR扩增和荧光检测。
具体地，产物腔室6中的核酸提取纯化物在配套仪器提供外力作用下，来回旋转充分混匀，然后流入核酸检测腔室1，流入核酸检测腔室1的核酸提取纯化产物将会溶解其中的核酸检测试剂2，形成完整的PCR反应体系，在配套仪器的作用下进行后续的PCR扩增和荧光检测。图2为核酸检测试剂5个通道阳性检测结果图：曲线10代表沙眼衣原体(CT)，曲线11代表淋球菌(NG)，曲线12代表解脲脲原体(UU)，曲线13代表微小脲原体(UP)，曲线14代表内质控(IC)。
在上述整个检测过程中，仅需要实验操作人员在试剂装置中加入样本，样本的核酸提取、纯化和PCR荧光检测整个流程均在配套仪器中自动进行，可以简化STD的CT/NG/UU/UP 4种病原体核酸的提取、纯化和检测的整个过程。
本发明基于多重荧光PCR检测技术，分别对检测的STD多种病原体和添加的内标质控进行引物探针的设计，开发5种荧光通道的多重荧光PCR试剂，然后结合一种封闭的核酸提取纯化装置，将核酸提取试剂和核酸检测试剂预先封装在装置中，在配套仪器的配合下，能够实现在一封闭系统内完成STD的CT、NG、UU和UP 4种病原体从核酸提取、纯化到荧光PCR检测分析的整个流程，能够极大地简化STD的CT、NG、UU和UP病原体的检测分析的流程。另外，本实施例中的核酸提取试剂为液体状态，可在常温下储存，核酸检测试剂为冻干的试剂，也可在常温下储存，从而使得整个封装试剂可以在常温状态下储存和运输。
本发明的技术内容及技术特征已揭示如上，然而熟悉本领域的技术人员仍可能基于本发明的教示及揭示而作种种不背离本发明精神的替换及修饰，因此，本发明保护范围应不限于实施例所揭示的内容，而应包括各种不背离本发明的替换及修饰，并为本专利申请权利要求所涵盖。
GATATGTTCCGAGACGGAGCTT
TAGCTGCTTCCTTCTCTTCATGAG
5’FAM-ATAACTGCCTCCCTGCTTCCCAC-3’BHQ1
CTCAAGGACCAGCAAATAATCCTT
TCCGCATCCAAACCAATTGT
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CGATTCCCCCGGATTTTC
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AAGTAGCATATGATCAAGCTCATTCA
TGTTGTAATGATACAACGAGCATCAT
5’TAMRA-TCACCTGAAACATATCCACCACCCATACT-3’BHQ1
CTTCTTAGCCATCCCAAGATTCTC
GAAACGTCGGAATAGTTCAAATCA
5’CY5-CAGATTGAGAGAGATTCAGAGAGTCACATC-3’BHQ2
Claims (9)
1.一种STD核酸提取和检测试剂，其特征在于，所述试剂包括核酸提取试剂和核酸检测试剂，所述核酸提取试剂包括细胞裂解液、核酸洗涤液和核酸洗脱液，所述核酸检测试剂包括可冻干的多重PCR反应缓冲液、STD不同病原体靶标基因的特异性引物及探针，以及内标质控基因的特异性引物及探针，所述STD不同病原体包括沙眼衣原体、淋球菌、解脲脲原体和微小脲原体。
2.根据权利要求1所述的STD核酸提取和检测试剂，其特征在于，
所述细胞裂解液包括：10～15mM的Tris-HCl、2.5～5mM的EDTA、30～40％TritonX-100，以及内质控质粒模板；
所述核酸洗涤液包括：2.5～5mM的Tris-HCl、0.1～0.2mM的EDTA、0.7％Nacl；
所述核酸洗脱液包括：1.5～2.5mM的Tris-HCl。
3.根据权利要求1所述的STD核酸提取和检测试剂，其特征在于，
所述可冻干的多重PCR反应缓冲液包括：50～70mM的Tris-Hcl、15～30mM的KCl、2.5～4.5mM的MgCl2、20～40μg/μL的BSA、0.2mM的dATP、0.4mM的dUTP、0.2mM的dCTP、0.2mM的dGTP、2～3U的DNA聚合酶、0.1～0.2U的TS-UNG酶、0.3～0.5M的海藻糖、0.001～0.002M的PEG8000、0.04～0.08M甘露醇。
4.根据权利要求1所述的STD核酸提取和检测试剂，其特征在于，所述STD不同病原体靶标基因的特异性引物及探针的序列，以及内标质控的特异性引物及探针的序列为：
其中，F为上游引物序列，R为下游引物序列，P为双标记探针序列。
5.根据权利要求5所述的STD核酸提取和检测试剂，其特征在于，所述PCR检测试剂同时检测5个荧光检测通道，每个所述荧光检测通道检测一种STD病原体或内标质控。
6.根据权利要求1所述的STD核酸提取和检测试剂，其特征在于，所述STD核酸提取和检测试剂封装于一封闭的试剂装置中，所述试剂装置包括核酸提取腔室和核酸检测腔室，所述核酸提取试剂和核酸检测试剂分别封装于所述核酸提取腔室和核酸检测腔室内。
7.一种STD核酸提取和检测方法，其特征在于，所述方法包括：
S1，采集STD感染者的待检样本；
S2，取所述待检样本，注入核酸提取腔室，由预封装于不同核酸提取腔室内的细胞裂解液，核酸洗涤液以及核酸洗脱液分别对检测样本进行裂解、洗涤、洗脱处理后得到核酸提取纯化物；
S3，所述核酸提取纯化物流入核酸检测腔室后，溶解预设于所述核酸检测腔室内的核酸检测试剂，以进行核酸提取纯化物的PCR扩增和荧光检测。
8.根据权利要求7所述的STD核酸提取和检测方法，其特征在于，
所述细胞裂解液包括：10～15mM的Tris-HCl、2.5～5mM的EDTA、30～40％TritonX-100，以及内质控质粒模板；
所述核酸洗涤液包括：2.5～5mM的Tris-HCl、0.1～0.2mM的EDTA、0.7％Nacl；
所述核酸洗脱液包括：1.5～2.5mM的Tris-HCl。
9.根据权利要求7所述的STD核酸提取和检测方法，其特征在于，
所述可冻干的多重PCR反应缓冲液包括：50～70mM的Tris-Hcl、15～30mM的KCl、2.5～4.5mM的MgCl2、20～40μg/μL的BSA、0.2mM的dATP、0.4mM的dUTP、0.2mM的dCTP、0.2mM的dGTP、2～3U的DNA聚合酶、0.1～0.2U的TS-UNG酶、0.3～0.5M的海藻糖、0.001～0.002M的PEG8000、0.04～0.08M甘露醇。
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