CN114438263A - 一种用于检测欧洲鳗鲡圆环病毒的荧光定量pcr引物组及试剂盒 - Google Patents

一种用于检测欧洲鳗鲡圆环病毒的荧光定量pcr引物组及试剂盒 Download PDF

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林楠
许智海
高金艳
林雪金
余嘉明
林梦蝶
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Abstract

本发明公开了一种用于检测欧洲鳗鲡圆环病毒的荧光定量PCR引物组及试剂盒，试剂盒包含所述引物组，所述引物组由正向引物F、反向引物R和荧光探针Q组成，试剂盒还包括DNA聚合酶，UDG酶，2×反应缓冲液，密封液，阳性对照品、阴性对照品。本发明提供的试剂盒可直接从复杂样品中检测欧洲鳗鲡圆环病毒，具有特异性强、灵敏度高、实验重复性好、操作便捷快速的优点，不需要昂贵仪器即可完成检测，可用于欧洲鳗鲡圆环病毒的现场快速、准确检测。

Description

一种用于检测欧洲鳗鲡圆环病毒的荧光定量PCR引物组及试 剂盒
技术领域
本发明涉及一种病毒检测技术领域，尤其涉及欧洲鳗鲡圆环病毒检测技术。
背景技术
欧洲鳗鲡圆环病毒是圆环病毒科圆环病毒属成员，是引起鳗鲡病毒性疾病的病原之一。目前国外已经在海龟、鳗鲡、鲃鱼、鲶鱼等水生动物检测出圆环病毒的报道，国内关于鳗鲡病毒性疾病的研究较少，有研究者从160份急性大量死亡的疑似鳗鲡病毒性疾病病料检测出高达40.6％鳗鲡圆环病毒阳性率，这表明鳗鲡圆环病毒可能会严重危害鳗鲡养殖产业的发展。
目前对欧洲鳗鲡圆环病毒的生物学检测技术也仅基于传统PCR检测技术，其检测过程操作步骤多，耗时长，且过程易造成气溶胶污染。实时荧光定量PCR(QuantitativeReal－time PCR)是在常规PCR技术的基础上添加荧光染料或荧光探针，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，通过标准曲线对未知浓度模板进行定量分析的方法。与普通PCR技术相比，实时荧光定量PCR技术的TaqMan探针特异性强，可进行单个核苷酸的区分，同时操作更简便，检测时间更短。为欧洲鳗鲡圆环病毒的分子生物学诊断提供了一种快速、准确的检测手段。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于检测欧洲鳗鲡圆环病毒的荧光定量PCR引物组及试剂盒，以解决现有技术中缺乏欧洲鳗鲡圆环病毒的分子生物学诊断的基础。
为了达到上述目的本发明采用如下技术方案：
一种用于检测欧洲鳗鲡圆环病毒的荧光定量PCR引物组，所述引物组由正向引物F、反向引物R和荧光探针Q组成，所述正向引物F的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，反向引物R的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，荧光探针Q的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
进一步地，所述荧光探针Q的5’端标记荧光基团，3’端标记淬灭基团。
本发明还提供一种用于检测欧洲鳗鲡圆环病毒的荧光定量PCR试剂盒，其包含权利要求1所述的引物组。
更优地，试剂盒还包括DNA聚合酶，UDG酶，2×反应缓冲液，密封液，阳性对照品，阴性对照品。
更优地，所述2×反应缓冲液是含有dATP、dCTP、dGTP、dUTP的反应液。
更优地，所述DNA聚合酶为Taq酶，UDG酶为热敏型尿嘧啶-DNA糖基化酶，密封液为矿物油。
更优地，所述阳性对照品为含有欧洲鳗鲡圆环病毒检测靶标基因的质粒DNA，所述阴性对照为灭菌超纯水。
更优地，其反应体系成分组成为：终浓度为0.2～0.6μM的正向引物F，终浓度为0.2～0.6μM的反向引物R，终浓度为0.1～0.3μM的荧光探针Q引物，2×反应缓冲液12.5μL，DNA聚合酶2～5U，UDG酶0.3～0.7U，待检样品5μL，加灭菌超纯水至25μL。
更优地，其反应体系成分组成为：终浓度为0.4μM的正向引物F，终浓度为0.4μM的反向引物R，终浓度为0.2μM的荧光探针Q引物，2×反应缓冲液12.5μL，DNA聚合酶4U，UDG酶0.5U，待检样品5μL，加灭菌超纯水至25μL。
更优地，其反应体系的反应条件为50℃5min；95℃5min；95℃15s、60℃30s 45个循环。
本发明的优点包括：
(1)特异性好：本发明用于引物设计的靶标基因是欧洲鳗鲡圆环病毒DNA中的一段特异性片段(GenBank中Eecv序列登录号为KU951579.1)，针对该目的片段设计一对特异引物和一个荧光探针进行扩增，特异性强。
(2)灵敏度高：对于含有欧洲鳗鲡圆环病毒检测靶标基因的质粒DNA，最低检出限可达到101copies/μL。
(3)实验重复性高：对阴性样品进行20次重复实验，引物没有扩增；对质粒DNA浓度106copies/μL和101copies/μL各进行20次重复实验，Ct值变异系数≤5％；
(4)操作便捷：不需要使用昂贵、精密的设备，对仪器要求低，只需要一部实时荧光定量PCR仪就能反应和检测，条件比较简单。
(5)鉴定简单：可直接从复杂样品中检测欧洲鳗鲡圆环病毒，通过观察扩增曲线直接判断阴阳性，不需要繁琐的电泳等其他任何分析步骤，适合现场快速、准确检测。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明的不当限定，在附图中：
图1为实施例1中荧光定量PCR法检测欧洲鳗鲡圆环病毒的引物筛选结果示意图。
图2为实施例2欧洲鳗鲡圆环病毒实际样品测结果示意图。
图3为实施例3中荧光定量PCR法检测欧洲鳗鲡圆环病毒的质粒DNA灵敏度结果示意图。
图4为实施例4中荧光定量PCR法检测欧洲鳗鲡圆环病毒的实际样品特异性结果示意图。
图5为实施例5中荧光定量PCR法检测欧洲鳗鲡圆环病毒的阴性重复性结果示意图，其中1为阳性对照，2为阴性样本。
图6为实施例6中荧光定量PCR法检测欧洲鳗鲡圆环病毒的阳性对照稳定性结果示意图，1为106copies/μL，2为101copies/μL，3为阴性对照。
具体实施方式
下面将结合附图以及具体实施例来详细说明本发明，在此以本发明的示意性实施例及说明用来解释本发明，但并不作为对本发明的限定。
没有特殊说明的实验操作视为本技术领域实验室的常规技术手段处理。所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1引物组对检测欧洲鳗鲡病毒的荧光定量PCR的影响
一、设计引物
以欧洲鳗鲡圆环病毒特异靶标基因(GenBank中Eecv序列登录号为KU951579.1)设计引物，用引物设计软件PrimerExpress3.0.1设计两套引物，分别包括正向引物F、反向引物R、荧光探针Q，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
欧洲鳗鲡圆环病毒引物1组：
正向引物F：5’GCAATGCCGCGGTGAA 3’(SEQ ID NO:1)；
反向引物R：5’TGTGACGGGCGGTGTGT 3’(SEQ ID NO:2)；
荧光探针Q：5’CGTTCTCGGGTCTTG 3’(SEQ ID NO:3)；
荧光探针Q的5’端标记荧光基团，3’端标记淬灭基团；
欧洲鳗鲡圆环病毒引物2组：
正向引物F：：5’CCCGGCTGTGGCAAGTC 3’(SEQ ID NO:4)；
反向引物R：5’CGCCGCGTGGTTTGTAGTA3’(SEQ ID NO:5)；
荧光探针Q：5’ATGCCCGAGAACAA 3’(SEQ ID NO:6)；
荧光探针Q的5’端标记荧光基团，3’端标记淬灭基团。
二、荧光定量PCR反应：
荧光定量PCR反应体系组成为：终浓度0.4μM的正向引物F、终浓度0.4μM的反向引物R、终浓度0.2μM的荧光探针Q引物，2×反应缓冲液12.5μL，DNA聚合酶4U，UDG酶0.5U，待检样品5μL，加灭菌超纯水至25μL；
反应体系的反应条件为50℃5min；95℃5min；95℃15s、60℃30s 45个循环。
设置如下实验组参照上述反应体系、条件进行荧光定量PCR反应，每个实验组均设置2个平行组：
实验组1：采用欧洲鳗鲡圆环病毒引物1组，待检样品为阳性对照；
实验组2：采用欧洲鳗鲡圆环病毒引物2组，待检样品为阳性对照；
实验组3：采用欧洲鳗鲡圆环病毒引物1组，待检样品为阴性对照；
实验组4：采用欧洲鳗鲡圆环病毒引物2组，待检样品为阴性对照。
三、实验结果：
如图1所示，曲线1为实验组1，曲线2为实验组2，曲线3为实验组3，曲线4为实验组4。根据扩增曲线来判断检测结果。扩增曲线呈“S”形，检测结果为阳性，即检测样品中含有欧洲鳗鲡圆环病毒；无“S”形扩增曲线出现，检测结果为阴性，即检测样品不含有欧洲鳗鲡圆环病毒。曲线3和曲线4显示引物1组和引物2组均未出现非特异性扩增；曲线1和曲线2显示出峰时间相近，引物1组的荧光值高于引物2组，选择引物1组来作为检测欧洲鳗鲡圆环病毒的引物组。
实施例2一种检测欧洲鳗鲡圆环病毒荧光定量PCR检测试剂盒
一、组成
一种检测欧洲鳗鲡圆环病毒荧光定量PCR检测试剂盒，组成成分包括：一组实施例1中检测欧洲鳗鲡圆环病毒的荧光定量PCR引物1组(SEQ ID NO:1～3)，DNA聚合酶，UDG酶，2×反应缓冲液，密封液，阳性对照和阴性对照。
所述的2×反应缓冲液是含有dATP、dCTP、dGTP、dUTP等的反应液。
所述DNA聚合酶为Taq酶，UDG酶为热敏型尿嘧啶-DNA糖基化酶，密封液为矿物油。
所述阳性对照为含有欧洲鳗鲡圆环病毒检测靶标基因的质粒DNA，质粒DNA浓度为106copies/μL，所述阴性对照为灭菌超纯水。
二、使用方法
将鳗鲡组织样品1、鳗鲡组织样品2分别进行以下处理：
1、研磨至均匀状态，向离心管中加入400μL裂解液，振荡混匀30s。室温放置5～10min，10000rpm离心3min去除杂质。
2、取出试剂盒中的核酸吸附柱套管，尽可能多的转移上清液至柱子中，10000rpm离心1min。倒弃滤液后把核酸吸附柱套回收集管中，加入500μL洗涤液至吸附柱中，10000rpm离心1min。再加入400μL洗涤液，10000rpm离心1min，弃滤液，10000rpm空离3min，将核酸吸附柱转移至新的1.5mL离心管，加入100μL洗脱液至柱子的膜中央。室温静置1min，10000rpm离心1min。
3、弃去柱子，完成提取得到待检样品，于-20℃保存备用，长期保存于-80℃。
4、进行PCR反应
分别将鳗鲡组织样品1、鳗鲡组织样品2提取得到的待检样品、阳性对照、阴性对照按以下反应体系、条件进行荧光定量PCR反应：
所述试剂盒的反应体系的成分组成为：终浓度为0.4μM的正向引物F，终浓度为0.4μM的反向引物R，终浓度为0.2μM的荧光探针Q引物，2×反应缓冲液12.5μL，DNA聚合酶4U，UDG酶0.5U，待检样品5μL，加灭菌超纯水至25μL；
反应体系的反应条件为50℃5min；95℃5min；95℃15s、60℃30s 45个循环。
三、结果判定：
如图2所示，曲线1为阳性对照，曲线2为鳗鲡组织样品1，曲线3为鳗鲡组织样品2，曲线4为阴性对照，根据扩增曲线来判断检测结果。扩增曲线呈“S”形，检测结果为阳性，即检测样品中含有欧洲鳗鲡圆环病毒；无“S”形扩增曲线出现，检测结果为阴性，即检测样品不含有欧洲鳗鲡圆环病毒。
结果表明，鳗鲡组织样品1和鳗鲡组织样品2中均检测出欧洲鳗鲡圆环病毒。
实施例3灵敏度实验
实施例2所述的试剂盒检测欧洲鳗鲡圆环病毒的阳性对照灵敏度：
将阳性对照质粒DNA进行10倍梯度稀释，分别以106copies/μL、105copies/μL、104copies/μL、103copies/μL、102copies/μL、101copies/μL、100copies/μL七个梯度浓度DNA作为模板和阴性对照(灭菌超纯水)按照实施例2反应体系和条件建立检测方法，以确定试剂盒的灵敏度。
如图3所示，曲线1为106copies/μL；曲线2为105copies/μL；曲线3为104copies/μL；曲线4为103copies/μL；曲线5为102copies/μL；曲线6为101copies/μL；曲线7为100copies/μL；曲线8为阴性对照；结果表明：将阳性质粒DNA进行10倍梯度稀释后，建立的检测欧洲鳗鲡圆环病毒荧光定量PCR检测试剂盒可检测浓度为101copies/μL的阳性质粒DNA。
实施例4特异性实验
实施例2所述的试剂盒检测欧洲鳗鲡圆环病毒的实际样品特异性：
按实施例2的反应体系、条件分别对含有猪圆环病毒、鳗鲡疱疹病毒、嗜水气单胞菌、迟缓爱德华氏菌、欧洲鳗鲡圆环病毒的样品DNA进行检测。
如图4所示，曲线1为阳性对照，曲线2为含欧洲鳗鲡圆环病毒的样品DNA，曲线3为含猪圆环病毒的样品DNA，曲线4为含鳗鲡疱疹病毒的样品DNA，曲线5为含嗜水气单胞菌的样品DNA，曲线6为含迟缓爱德华氏菌的样品DNA，曲线7为阴性对照。结果表明，仅含欧洲鳗鲡圆环病毒的样品出现扩增曲线，其余样品没有扩增，显示建立的检测欧洲鳗鲡圆环病毒荧光定量PCR检测试剂盒特异性良好。
实施例5重复性实验
实施例2所述的试剂盒检测欧洲鳗鲡圆环病毒的阴性重复性：
以阴性样本为模板DNA，设置20次平行，同时设置阳性对照按照实施例2反应体系和条件建立检测方法，以确定试剂盒的阴性重复性。
如图5所示，曲线1为阳性对照，曲线2为阴性样本，阳性对照结果正常，阴性样本均未出现扩增曲线，证明该试剂盒阴性重复性良好。
实施例6稳定性实验
实施例2所述的试剂盒检测欧洲鳗鲡圆环病毒的阳性对照稳定性：
分别以浓度为106copies/μL和101copies/μL的阳性质粒为模板DNA，设置20次平行，同时设置阴性对照(灭菌超纯水)按照实施例2反应体系和条件建立检测方法，以确定试剂盒的稳定性。
如图6所示，曲线1为106copies/μL，曲线2为101copies/μL，曲线3为阴性对照，结果表明，建立的检测欧洲鳗鲡圆环病毒荧光定量PCR检测试剂盒中，阳性质粒浓度重复20次进行检测实验，重复性良好，Ct值变异系数≤5％，证明该试剂盒稳定性良好。
综上，该试剂盒可直接从基质复杂的样品中检测欧洲鳗鲡圆环病毒，具有特异性强、灵敏度高、实验重复性好、操作便捷快速的优点。基质复杂是指检测中，背景基质对检测指标存在干扰，通常指宿主基因组核酸对检测靶标的干扰。
以上对本发明实施例所提供的技术方案进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明实施例的原理以及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只适用于帮助理解本发明实施例的原理；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明实施例，在具体实施方式以及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。
Figure BDA0003514212080000101
Figure BDA0003514212080000111
Figure BDA0003514212080000121
序列表
<110> 广州双螺旋基因技术有限公司 福建省水产技术推广总站
漳浦县水产技术推广站
<120> 一种用于检测欧洲鳗鲡圆环病毒的荧光定量PCR引物组及试剂盒
<130> 2022
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 1
gcaatgccgc ggtgaa 16
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<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 3
cgttctcggg tcttg 15
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<211> 17
<212> DNA
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cccggctgtg gcaagtc 17
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<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 5
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<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 6
atgcccgaga acaa 14

Claims (10)

1.一种用于检测欧洲鳗鲡圆环病毒的荧光定量PCR引物组，其特征在于：
所述引物组由正向引物F、反向引物R和荧光探针Q组成，所述正向引物F的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，反向引物R的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，荧光探针Q的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
2.根据权利要求1所述的一种用于检测欧洲鳗鲡圆环病毒的荧光定量PCR引物组，其特征在于：
所述荧光探针Q的5’端标记荧光基团，3’端标记淬灭基团。
3.一种用于检测欧洲鳗鲡圆环病毒的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：
包含权利要求1所述的引物组。
4.根据权利要求3所述的一种用于检测欧洲鳗鲡圆环病毒的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：
还包括DNA聚合酶，UDG酶，2×反应缓冲液，密封液，阳性对照品，阴性对照品。
5.根据权利要求3所述的一种用于检测欧洲鳗鲡圆环病毒的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：
所述2×反应缓冲液是含有dATP、dCTP、dGTP、dUTP的反应液。
6.根据权利要求3所述的一种用于检测欧洲鳗鲡圆环病毒的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：
所述DNA聚合酶为Taq酶，UDG酶为热敏型尿嘧啶-DNA糖基化酶，密封液为矿物油。
7.根据权利要求3所述的一种用于检测欧洲鳗鲡圆环病毒的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：
所述阳性对照品为含有欧洲鳗鲡圆环病毒检测靶标基因的质粒DNA，质粒DNA浓度为106copies/μL，所述阴性对照为灭菌超纯水。
8.根据权利要求3所述的一种用于检测欧洲鳗鲡圆环病毒的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：
其反应体系成分组成为：终浓度为0.2～0.6μM的正向引物F，终浓度为0.2～0.6μM的反向引物R，终浓度为0.1～0.3μM的荧光探针Q引物，2×反应缓冲液12.5μL，DNA聚合酶2～5U，UDG酶0.3～0.7U，待检样品5μL，加灭菌超纯水至25μL。
9.根据权利要求8所述一种用于检测欧洲鳗鲡圆环病毒的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：
其反应体系成分组成为：终浓度为0.4μM的正向引物F，终浓度为0.4μM的反向引物R，终浓度为0.2μM的荧光探针Q引物，2×反应缓冲液12.5μL，DNA聚合酶4U，UDG酶0.5U，待检样品5μL，加灭菌超纯水至25μL。
10.根据权利要求3-9任一所述一种用于检测欧洲鳗鲡圆环病毒的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：
其反应体系的反应条件为50℃5min；95℃5min；95℃15s、60℃30s 45个循环。
CN202210160148.6A 2022-02-22 2022-02-22 一种用于检测欧洲鳗鲡圆环病毒的荧光定量pcr引物组及试剂盒 Pending CN114438263A (zh)

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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115322971A (zh) * 2022-06-14 2022-11-11 中国水产科学研究院黄海水产研究所 一种鱼类圆环病毒及应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110894550A (zh) * 2018-09-13 2020-03-20 杭州众测生物科技有限公司 鳗鲡疱疹病毒（hva）的raa恒温荧光检测方法及试剂
CN114058738A (zh) * 2021-11-25 2022-02-18 广州双螺旋基因技术有限公司 一种检测中华绒螯蟹呼肠孤病毒荧光定量pcr检测试剂盒

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110894550A (zh) * 2018-09-13 2020-03-20 杭州众测生物科技有限公司 鳗鲡疱疹病毒（hva）的raa恒温荧光检测方法及试剂
CN114058738A (zh) * 2021-11-25 2022-02-18 广州双螺旋基因技术有限公司 一种检测中华绒螯蟹呼肠孤病毒荧光定量pcr检测试剂盒

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
NCBI: "GenBank登录号:KU951579.1", NCBI GENBANK, pages 1 - 1378 *
RÉKA BORZÁK等: "Molecular detection and genome analysis of circoviruses of European eel (Anguilla anguilla) and sichel (Pelecus cultratus)", ACTA VETERINARIA HUNGARICA, vol. 65, no. 2, pages 262 - 277 *
RÉKA BORZÁK等: "Molecular detection and genome analysis of circoviruses of European eel (Anguilla anguilla) from Lake Balaton", MAGYAR MIKROBIOLÓGIAI TÁRSASÁG 2014, pages 1 *
李苗苗等: "鳗鲡圆环病毒PCR检测方法的建立及应用", 福建农业学报, vol. 33, no. 1, pages 12 - 16 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115322971A (zh) * 2022-06-14 2022-11-11 中国水产科学研究院黄海水产研究所 一种鱼类圆环病毒及应用
CN115322971B (zh) * 2022-06-14 2023-10-10 中国水产科学研究院黄海水产研究所 一种鱼类圆环病毒及应用

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