CN109913569B - 一种可用于羊泰勒虫检测的引物及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测羊泰勒虫病的扩增引物组、试剂盒及使用方法。本发明的羊泰勒虫病的检测试剂盒包括用于恒温扩增的一对置换引物SEQ ID No.1和SEQ ID No.2、一条交叉引物SEQ ID No.3、分别用FITC和生物素标记的探针引物SEQ ID No.4和SEQ ID No.5，以扩增所需常规试剂和层析试纸条。本发明引物、试剂盒及所建立的检测方法具有操作简便、结果直观可见、无需特殊仪器、特异性好、灵敏度高，适合基层临床样品的现场快速检测和流行病学调查，易于大规模推广使用。

Description

一种可用于羊泰勒虫检测的引物及试剂盒

技术领域

本发明涉及一种可用于检测动物寄生虫的引物序列及检测试剂盒，确切讲本发明涉及一种用于羊泰勒虫检测的引物及试剂盒。

背景技术

羊泰勒虫病(ovis Babesiosis)是梨形虫纲、泰勒科、泰勒属的原虫专一性寄生于羊的巨噬细胞、淋巴细胞和红细胞内引起的疾病的总称，是一种严重危害养羊业的蜱传性血液原虫病(Neitz,1957；Barnett,1968,1977；吕文顺，1996)。目前全世界已报道的感染羊的泰勒虫至少有6种，即莱氏泰勒虫(Theileria lestoquardi)、绵羊泰勒虫(Theileriaovis)、分离泰勒虫(Theileria separata)、隐藏泰勒虫(Theileria recondita)、吕氏泰勒虫(Theileria lunwenshuni)和尤氏泰勒虫(Theileria uilenbergi)(Alani和Herbert,1998)。

我国引起羊泰勒虫病的病原有三种，包括绵羊泰勒虫、吕氏泰勒虫和尤氏泰勒虫(殷宏，2002；李有全，2007)。该病是我国北方农区、半农半牧区及半林区绵羊和山羊的常发病之一。该病不仅影响羊的生长发育，而且死亡率较高，对羔羊和非疫区引进的养只的危害尤为严重(王长吉，1993；Luo and Yin，1997)。据调查，绵羊羔羊发病率为60.81％、致死率为81.48％；山羊羊羔的发病率为40％、致死率为85.71％。我国5省13县羊泰勒虫病调查显示，部分地区泰勒虫感染率高达93.8％。李有全等利用PCR方法对南方4省泰勒虫调查显示，阳性率为0-98％不等，给养羊业造成了严重的经济损失，严重制约了养羊业的健康可持续发展(Luo and Yin,1997；郭淑珍，2006；李有全，2012)。

泰勒虫病诊断的传统方法有依赖于形态学检测的吉姆萨血涂片染色和临床症状检测，这些方法缺乏敏感性和特异性。研究者在现代免疫学和分子生物学技术的基础上，建立了多种血清学和分子生物学检测方法，如酶联免疫吸附试验、PCR和反向线性印迹等。但是这些方法在使用过程中，需要配套的仪器设备，而且检测耗时长，对操作者技能要求较高。因此，建立一种快速、简便的检测方法，对于临床上羊泰勒虫病的检测有现实的意义，有益于针对性地预防和控制。

发明内容

本发明提供一种可克服现有技术不足的羊泰勒虫病鉴别检测的交叉引物恒温扩增试剂盒及应用，使羊泰勒虫病的检测不依赖于昂贵的仪器设备，如PCR仪等，用免疫层析试纸条进行结果的检测，结果直观可见，适用于基层临床检测的广泛使用和流行病学调查。

本发明的一对可用于检测羊泰勒虫的引物基因序列为：SEQ ID No.1和SEQ IDNo.2。

与本发明所述引物配合使用的用于检测羊泰勒虫的交叉引物和探针引物序列为：交叉引物序列为SEQ ID No.3，两条探针引物的序列分别为SEQ ID No.4和SEQ ID No.5。

本发明的羊泰勒虫检测试剂盒内至少包含有引物SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQID No.3，用FITC标记的SEQ ID No.4和用生物素标记的SEQ ID No.5，以及免疫层析试纸条。

为便于使用，本发明的羊泰勒虫检测试剂盒还包括：10×IsothermalAmplification Buffer、100mM MgSO₄、2.5mM dNTP mix，Bst DNA聚合酶。

本发明的检测试剂盒用于非疾病诊断目的检测方法是；以提取待检样品的基因组DNA为模板，用试剂盒内的引物进行扩增，将扩增产物滴加至免疫层析试纸条，随后将试纸条置于含有层析缓冲液中，根据试纸条上的质控线和检测线显色情况确定被检样品是否感染羊泰勒虫。在具体检测时，当质控线显色，检测线也显色，则判定为阳性；当质控线显色，检测线不显色，则判定为阴性；当质控线不显色，则检测结果不成立。

优选地，本发明用于非疾病诊断目的检测方法所建立的反应体系包括：10×Isothermal Amplification Buffer 2.5μL，100mM MgSO₄1.5μL，2.5mM dNTP mix 8μL，BstDNA聚合酶8U，10μM交叉引物Ovis-T-2a1s 1.25μL，10μM置换引物Ovis-T-5a、Ovis-T-4s各0.2μL，10μΜFITC标记的探针引物Ovis-T-2a 0.8μL和生物素标记的探针引物10μΜOvis-T-3a 0.8μL，被检DNA 1μL，加入ddH₂O补足25μL；所述扩增的反应条件为：61℃，80min；80℃，2min。

本发明是一种利用交叉引物扩增联合免疫层析进行检测的方法。交叉引物扩增联合免疫层析方法是以具有置换活性的Bst DNA聚合酶为基础建立的恒温扩增检测方法，检测耗时短、特异性好、灵敏度高，整个检测过程只需要一台恒温水浴锅即可完成检测反应，结果以肉眼可见的显色方式完成，所以特别适合有大量样品非实验室场所的临床检测和流行病学调查。

本发明的有益效果与优点是：

(1)操作简单易学：对操作人员试验技能要求低，具备普通PCR操作技能的人员均可胜任本操作。

(2)特异性高：本发明中有两条标记探针Ovis-T-2a、Ovis-T-3a和一条交叉引物Ovis-T-2a1s识别羊泰勒虫18S rRNA的特异序列区，保证了本方法的高度特异性。

(3)灵敏度高：本发明以多拷贝的18S rRNA基因为靶标，建立的方法灵敏度高，可以检测每个反应体系中大于1个拷贝的质粒标准品。

(4)设备要求低：恒温扩增不需要昂贵的PCR仪或荧光定量PCR仪，只要能够提供恒温的装置即可，如水浴锅、恒温箱等均可完成本检测。整个检测过程可在90min内全部完成

(5)检测结果易于判读：扩增产物经试纸条显色后，以肉眼可见的方式来读取，不需要专门的仪器来读取数据。适合于现场快速检测，具有良好的应用前景。

附图说明

附图1至4为使用本发明的检测方法进行检测后免疫层析试纸条显色的情况，其中：

图1.羊泰勒虫交叉引物等温扩增最佳反应温度的筛选。1-5号试纸条反应温度分别为58℃、61℃、63℃、65℃、68℃；

图2.羊泰勒虫交叉引物扩增最佳反应时间的筛选。1-5号试纸条反应时间分别为20min、40min、60min、80min、100min，6号试纸条为阴性对照扩增时长100min；

图3.羊泰勒虫交叉引物特异性试验。1为梨形虫阴性绵羊基因组DNA检测结果、2为莫氏巴贝斯虫临潭株，3为莫氏巴贝斯虫河北株，4为巴贝斯虫未定种新疆株，5为尤氏泰勒虫，6为吕氏泰勒虫，7为绵羊泰勒虫；

图4.羊泰勒虫交叉引物扩增灵敏度检测。1为绵羊泰勒虫18S rRNA重组质粒10⁵拷贝/μL、2为绵羊泰勒虫18S rRNA重组质粒10⁴拷贝/μL、3为绵羊泰勒虫18S rRNA重组质粒10³拷贝/μL、4为绵羊泰勒虫18S rRNA重组质粒10²拷贝/μL、5为绵羊泰勒虫18S rRNA重组质粒10¹拷贝/μL、6为绵羊泰勒虫18S rRNA重组质粒1拷贝/μL。

具体实施方式

本发明以下结合实施例进行解说，在以下内容中所述的免疫层析试纸条购自Twistdx公司。

实施例1：绵羊或山羊血液样品中泰勒虫的检测

1.血液基因组DNA提取

取200μL抗凝血用QIAamp DNA Mini Kit(Qiagen,Germany)进行血液DNA的提取，具体操作方法参照说明书进行。

2.引物设计

根据GenBank公布的莫氏巴贝斯虫临潭株、莫氏巴贝斯虫河北株、莫氏巴贝斯虫宁县株、巴贝斯虫未定种新疆株、绵羊泰勒虫、尤氏泰勒虫、吕氏泰勒虫18S rRNA基因序列，比对分析后，在种内保守，种间变异的区段设计交叉扩增引物，靶标序列选择位于18S rRNA的中部，扩增长度约为140bp。

置换引物Ovis-T-5a：5'-TGCTAATTGTAGGGCTA-3'

置换引物Ovis-T-4s：5'-CCCGTTACCCGTCGT-3'

交叉引物Ovis-T-2a1s：5'-

GTTCGAGACCTTCGGGTGGTCAGAAACTTGAATGAT-3'

探针引物Ovis-T-2a：5'-FITC-GTTCGAGACCTTCGGGT-3'

探针引物Ovis-T-3a：5'-Bio-ACCAAACCGCTTGCGG-3'

3.交叉引物恒温扩增

反应体系：

将上述反应管分别在58℃、61℃、63℃、65℃、68℃进行反应50min，80℃2min灭活。选择最佳反应温度后，进行反应时间的优化，即在选择的最优反应温度下反应20min、40min、60min、80min、100min，随后80℃2min灭活。

4.扩增产物试纸条检测

取上述反应产物10μL，滴加至层析试纸条的吸收垫上，插入装有100μL层析缓冲液的1.5ml离心管中，静置3-5min，读取实验结果。

5.检测结果判定

当质控线显色，检测线也显色，则判定为阳性；

当质控线显色，检测线不显色，则判定为阴性；

当质控线不显色，则本次检测无效。

实验结果表明(图1)，反应温度对扩增结果的影响不大，考虑到Bst聚合酶活性最佳温度，扩增反应温度选择61℃；反应时间选择80min(图2)。

实施例2：交叉引物扩增检测的特异性检测

1.血液基因组DNA提取

取-20℃保存的莫氏巴贝斯虫临潭株、莫氏巴贝斯虫河北株、巴贝斯虫未定种新疆株、绵羊泰勒虫、尤氏泰勒虫、吕氏泰勒虫、梨形虫阴性的羊抗凝血各200μL用QIAamp DNAMini-kit(Qiagen,Germany)进行的提取，具体操作步骤参照说明书进行。

2.交叉引物恒温扩增

反应体系：

将上述反应管分别在61℃进行反应80min，80℃2min灭活。

3.扩增产物试纸条检测

取上述反应产物10μL，滴加至层析试纸条的吸收垫上，插入装有100μL层析缓冲液的1.5ml离心管中，静置3-5min，读取实验结果。

4.检测结果判定

质控线显色，检测线也显色，则判定为阳性；

质控线显色，检测线不显色，则判定为阴性；

质控线不显色，则本次检测无效。

实验结果见图3，结果表明，本发明所使用的扩增引物组和探针引物具有良好的特异性，与感染羊的其它巴贝斯虫没有交叉反应。

实施例3：以绵羊泰勒虫为例进行交叉引物扩增的灵敏度试验

1.绵羊泰勒虫DNA提取

取-20℃保存的绵羊泰勒虫阳性的抗凝血200μL用QIAamp DNA Mini Kit(Qiagen,Germany)进行的提取，具体操作步骤参照说明书进行。

2.绵羊泰勒虫18S rRNA重组质粒标准品的制备

取-20℃保存的绵羊泰勒虫18S rRNA重组质粒，使用NanoDrop 2000(ThermoScientific，America)超微量分光光度计测定质粒浓度，并将其换算成拷贝/μL。以此作为质粒标准品，稀释为1.0×10⁵-1.0×10⁰拷贝/μL，以便进行敏感性测试。

3.交叉引物恒温扩增

反应体系：

将上述反应管分别在61℃进行反应80min，80℃2min灭活。

4.扩增产物分析

取上述反应产物10μL，滴加至层析试纸条的吸收垫上，插入装有100μL层析缓冲液的1.5mL离心管中，静置3-5min，读取实验结果。

质控线显色，检测线也显色，则判定为阳性；

质控线显色，检测线不显色，则判定为阴性；

质控线不显色，则本次检测无效。

实验结果见图4，结果表明，本发明所使用的扩增引物组和检测探针对羊泰勒虫具有高的灵敏度，可以检测每个反应体系中大于1个拷贝的质粒标准品。

序列表

<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所

<120> 一种可用于羊泰勒虫检测的引物及试剂盒

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(置换引物Ovis-T-5a)

<400> 1

tgctaattgt agggcta 17

<210> 2

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(置换引物Ovis-T-4s)

<400> 2

cccgttaccc gtcgt 15

<210> 3

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(交叉引物Ovis-T-2a1s)

<400> 3

gttcgagacc ttcgggtggt cagaaacttg aatgat 36

<210> 4

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(探针引物Ovis-T-2a)

<400> 4

gttcgagacc ttcgggt 17

<210> 5

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(探针引物Ovis-T-3a)

<400> 5

accaaaccgc ttgcgg 16

Claims (4)

1.一种羊泰勒虫检测试剂盒，其特征在于盒内至少包含有引物序列SEQ ID No.1、SEQID No.2 、交叉引物序列SEQ ID No.3，用FITC标记的SEQ ID No.4和用生物素标记的SEQID No.5，以及免疫层析试纸条。

2.根据权利要求1所述的羊泰勒虫检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括：10×Isothermal Amplification Buffer、100mM MgSO₄、2.5mM dNTP mix，Bst DNA聚合酶。

3.权利要求1或2所述的试剂盒用于非疾病诊断目的检测方法，其特征在于：以待检样品的血液基因组DNA为模板，用试剂盒内的引物进行扩增，扩增产物滴加至免疫层析试纸条，随后将试纸条置于含有层析缓冲液中，根据试纸条上的质控线和检测线显色情况确定被检样品是否感染羊泰勒虫。

4.根据权利要求3 所述的用于非疾病诊断目的检测方法，其特征在于所建立的反应体系包括：10×Isothermal Amplification Buffer 2.5μL，100mM MgSO₄ 1.5μL，2.5mM dNTPmix 8μL，Bst DNA聚合酶8U，10μM交叉引物Ovis-T-2a1s 1.25μL，10μM置换引物Ovis-T-5a、Ovis-T-4s各0.2μL，10μΜ FITC标记的探针Ovis-T-2a 0.8μL和生物素标记的探针10μΜOvis-T-3a 0. 8μL，被检样品基因组DNA 1μL，加入ddH₂O补足25μL；所述扩增的反应条件为：61℃，80min；80℃，2min。

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