CN109439782B

CN109439782B - 一种鉴别检测牛巴贝斯虫的试剂盒及检测方法

Info

Publication number: CN109439782B
Application number: CN201811565936.3A
Authority: CN
Inventors: 王锦明; 关贵全; 杨吉飞; 刘军龙; 李有全; 刘志杰; 殷宏; 罗建勋
Original assignee: Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Current assignee: Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Priority date: 2018-12-20
Filing date: 2018-12-20
Publication date: 2021-09-03
Anticipated expiration: 2038-12-20
Also published as: CN109439782A

Abstract

本发明公开一种牛巴贝斯虫鉴别检测与疾病检测的方法与试剂盒。本发明的鉴别检测牛巴贝斯虫的方法是：利用扩增引物SEQ ID No.1和SEQ ID No.2将待检牛的基因组DNA样本与牛巴贝斯虫标准质粒扩增后，进行高分辨率熔解曲线分析，根据待检样品绘制的熔解曲线与标准质粒熔解曲线的重合与否，判定待检样品中巴贝斯虫的种类。本方法囊括了国内现存的所有牛巴贝斯虫病原，可同时进行五种牛巴贝斯虫病原的鉴别检测，适用于牛巴贝斯虫种的鉴别检测和流行病学调查。

Description

一种鉴别检测牛巴贝斯虫的试剂盒及检测方法

技术领域

本发明涉及一种反刍动物巴贝斯虫的试剂盒及其非疾病检测方法，确切讲本发明涉及一种牛巴贝斯虫病检测试剂盒及非疾病诊断方法。

背景技术

牛巴贝斯虫病是由巴贝斯虫属的原虫专一性寄生于牛的红细胞内而引起的一种蜱传性的血液原虫病，其临床特征为高热、贫血、黄疸、血红蛋白尿。该病在世界各地均有流行，给畜牧业造成了巨大的经济损失。

在我国，已报道的感染牛的巴贝斯虫病原有五种，包括牛巴贝斯虫(Babeisabovis)、双芽巴贝斯虫(Babeisa bigemina)、卵形巴贝斯虫(Babeisa ovata)、大巴贝斯虫(Babeisa major)和东方巴贝斯虫(Babeisa orientalis)。其中由牛巴贝斯虫、双芽巴贝斯虫和卵形巴贝斯虫引起的巴贝斯虫病分布于甘肃、河南、陕西、河北、安徽、湖北、湖南、福建、贵州、云南等地；大巴贝斯虫主要分布于新疆，东方巴贝斯虫主要报道于我国长江以南的水牛分布区(刘钟灵等，1987；吕文祥等，1995；吕文顺等，1979；白启等，1990；白启等，1992；殷宏等，2000)。

利用建立的血清学和分子生物学方法对牛巴贝斯虫病的流行病学调查结果显示，牛巴贝斯虫的阳性率分别为6.3％-68.5％和1％-60％(吕伟等，2009；刘启生等，2013；袁利芹等，2014；李安岩等，2014；Niu et al，2015)；双芽巴贝斯虫阳性率为9.3％-30.5％和1％-62.2％。分子生物学技术对卵形巴贝斯虫调查结果显示，其平均阳性率1.5％。上述研究结果表明，牛巴贝斯虫病在我国感染率较高。

对巴贝斯虫进行鉴别检测也是寄生虫学研究的重要内容，有益于针对性地预防和控制牛巴贝斯虫病。血涂片染色后的显微镜检测是牛巴贝斯虫病检测的经典方法，但是在染虫率很低的情况下，很难检测到病原；以形态学为基础的虫种鉴别检测，需要操作者有丰富的经验，也容易出现漏检的情况。为了解决上述检测方法的缺陷，国内外的研究者建立了多重PCR、实时荧光定量PCR(Real-time PCR)、反向线状印迹(RLB)、酶联免疫吸附试验等方法对牛巴贝斯虫进行鉴别检测。这些方法敏感性和特异性较高，但每次只能鉴定出一种或两种病原体，无法同时实现多种病原的鉴别检测。因此，亟待建立一种特异性强、敏感性高，并且能同时实现多种病原鉴别检测的方法。

发明内容

本发明提供一种可同时进行五种牛巴贝斯虫病原鉴别检测的方法与试剂盒，以及利用这种试剂盒进行非疾病检测的目的。

本发明的检测牛巴贝斯虫试剂盒中至少包括SEQ ID No.1和SEQ ID No.2两条扩增引物。

本发明的检测牛巴贝斯虫试剂盒中还有含EvaGreen荧光染料qPCRMaster Mix的预混溶液。为方便检测，本发明的试剂盒中还可以有标准阳性质粒模板、阴性标准品。

本发明的非疾病检测目的的牛巴贝斯虫检测方法是：提取将待检测样品的DNA，再将所得到的待检DNA进行扩增，再将扩增产物进行高分辨率熔解曲线分析，将所得到的待检测样品的熔解曲线与标准熔解曲线进行对比，得到待检样品是否感染及感染何种牛巴贝斯虫。

本发明是在现有技术的基础上，根据18S rRNA序列分析结果，在高度保守区设计扩增引物。靶序列具有如下特征：(1)在同一虫种不同地方分离株间高度保守(核苷酸序列相似性为100％)；(2)不同虫种间至少有一个碱基的变异；利用高分辨率熔解曲线方法(HRM)对扩增产物进行熔解曲线分析，由于扩增的不同虫种的基因片段存在一个或数个碱基的差异，导致不同的虫种来源的基因片段熔解温度有细微的差别，形成不同的熔解曲线，进行研制出可同时鉴别检测五种巴贝斯虫病原的试剂盒，为牛巴贝斯虫病的快速鉴别检测、流行病学调查和防控等奠定基础。该方法具有重复性好、灵敏度高、速度快和全封闭反应等优点。目前，还没有关于利用高分辨率熔解曲线进行牛巴贝斯虫种鉴别检测方法的报道，本发明通过对反应条件的优化，检测方法具有特异性高、敏感性好和可重复性的特点，使其能更好地用于牛体巴贝斯虫的鉴别检测。

附图说明

图1实时荧光定量PCR扩增敏感性曲线。其中1为PCR扩增质粒浓度为1×10¹拷贝/μL，2为PCR扩增质粒浓度为1×10²拷贝/μL，3为PCR扩增质粒浓度为1×10³拷贝/μL，4为PCR扩增质粒浓度为1×10⁴拷贝/μL，5为PCR扩增质粒浓度为1×10⁵拷贝/μL，6为PCR扩增质粒浓度为1×10⁶拷贝/μL，7为PCR扩增质粒浓度为1×10⁷拷贝/μL，8为PCR扩增质粒浓度为1×10⁸拷贝/μL。

图2熔解曲线敏感性和重复性。牛巴贝斯虫、双芽巴贝斯虫、卵形巴贝斯虫、大巴贝斯虫和东方巴贝斯虫18sRNA重组质粒浓度分别为1.0×10⁸拷贝/μL、1.0×10⁴拷贝/μL和1.0×10¹拷贝/μL扩增产物进行熔解曲线分析。

图3应用本发明的方法对已知背景的样本进行鉴别检测的熔解曲线。

图4 30例已知背景样本基本信息。

具体实施方式

下面实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。所用引物序列合成及测序工作均由南京金斯瑞股份有限公司完成。

本发明所用引物、标准质粒和试剂如下：

(1)PCR扩增引物

上游引物：BovisB 7-F 5'-CCTGACACAGGGAGGTAGTGACAAG-3'SEQ ID No.1；

下游引物：BovisB 7-R 5'-GGCTGCTGGCACCAGACTTGCCCTCC-3'SEQ ID No.2；

扩增产物长度为120bp。

(2)标准牛巴贝斯虫18sRNA重组质粒(10⁵拷贝/μL)，重组质粒序列为：SEQ IDNo.3；

(3)标准双芽巴贝斯虫18sRNA重组质粒(10⁵拷贝/μL)，重组质粒序列为SEQ IDNo.4；

(4)标准卵形巴贝斯虫18sRNA重组质粒(10⁵拷贝/μL)，重组质粒序列为SEQ IDNo.5；

(5)标准大巴贝斯虫18sRNA重组质粒(10⁵拷贝/μL)，重组质粒序列为SEQ IDNo.6；

(6)标准东方巴贝斯虫18sRNA重组质粒(10⁵拷贝/μL)，重组质粒序列为SEQ IDNo.7；

(7)标准梨形虫阴性的牛基因组DNA(50ng/μL)；

(8)预混qPCRMaster Mix。

具体操作方法如下：

首先制备所需的五种质粒标准品。本发明包括牛巴贝斯虫、双芽巴贝斯虫、卵形巴贝斯虫、大巴贝斯虫和东方巴贝斯虫，共5个虫种的18sRNA基因重组质粒。

在具体应用时还需要有：预混qPCRMaster Mix(含EvaGreen荧光染料)、标准阳性质粒模板、阴性标准品、扩增引物。反应体系包括荧光定量PCR反应液qPCRMaster Mix 10μL，正向引物和反向引物(10pmol)各0.5μL，荧光校正液ROX Reference Dye(50×)0.4μL，标准品质粒模版1.0μL，灭菌蒸馏水7.6μL。

1、标准品的制备

牛巴贝斯虫、双芽巴贝斯虫、卵形巴贝斯虫、大巴贝斯虫和东方巴贝斯虫18sRNA重组标准质粒的制备。

(1)根据牛巴贝斯虫核糖体18S rRNA基因序列设计引物，经PCR扩增预期获得1200bp的目的片段。引物对序列为：

PIRO-F180：5'-CCATGGATAACCGTGCTAATTG-3'SEQ ID No.8

PIRO-R1380：5'-CATCTAAGGGCATCACAGACC-3'SEQ ID No.9。

(2)以实验室保存的牛巴贝斯虫、双芽巴贝斯虫、卵形巴贝斯虫、大巴贝斯虫和东方巴贝斯虫基因组DNA为模板进行扩增，PCR反应体系为：

反应条件为94℃预变性5min，然后94℃30S、55℃30S、72℃90s，35个循环，72℃延伸7min。取5μL扩增产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定。鉴定为阳性的PCR产物用琼脂糖凝胶回收纯化试剂盒(zymo)进行纯化回收，将回收的DNA片段与pClone007-T载体进行连接，反应体系如下：

配制完成后置于25℃进行1h。

(3)pClone007-T连接产物的转化以及PCR鉴定

(a)-80℃的超低温冰箱中取出DH5α感受态细胞，置于冰上融化。

(b)取连接产物10μL加入100μL的DH5α感受态细胞中，冰浴30min。

(c)42℃热激90s，置冰上2min。

(d)加入不含抗生素的LB液体培养基1mL，37℃150转，培养90min。

(e)取100μL涂布于氨苄抗性的LB平皿上，37℃倒置培养过夜。

(f)从平板上挑取单克隆菌落于500μl氨苄抗性的LB液体培养基的1.5mL EP管中，37℃220rpm振荡培养5-6小时。

(g)取1μL作为模板进行菌液PCR鉴定。将鉴定为阳性的菌液加入到5ml的LB液体培养基中进行扩摇。

(4)提取阳性克隆质粒，使用NanoDrop 2000(Thermo Scientific，America)超微量分光光度计测定质粒浓度，并将其换算成拷贝/μL，以此作为质粒标准品。将构建好的质粒标准品，稀释为1.0×10⁷-1.0×10¹拷贝/μL，以便进行敏感性测试。

2、高分辨率熔解曲线方法的反应性和灵敏度测试

(1)HRM-PCR扩增时所用反应体系和反应条件

PCR反应体系为20μL：

PCR的反应条件为：95℃预变性2min；95℃变性5s；60℃退火/延伸30s；40个循环。HRM分析：95℃60s；40℃60sec；70-85℃收集数据，温度上升速率为0.2℃/s。

扩增所用引物序列如下：

上游引物：BovisB 7-F 5'-CCTGACACAGGGAGGTAGTGACAAG-3'

下游引物：BovisB 7-R 5'-GGCTGCTGGCACCAGACTTGCCCTCC-3'

(2)灵敏度实验

利用上述所建立的反应条件方法，以牛巴贝斯虫、双芽巴贝斯虫、卵形巴贝斯虫、大巴贝斯虫和东方巴贝斯虫18sRNA重组质粒为模板，并将质粒制备成浓度为1.0×10⁸-1.0×10¹拷贝/μL的质粒标准品进行灵敏度试验。

PCR扩增时的反应体系为：

PCR扩增时的反应条件为：95℃预变性2min；95℃变性5s；60℃退火/延伸30s；40个循环。

结果参照图1，扩增曲线显示质粒浓度为1.0×10⁸拷贝/μL至1.0×10¹拷贝/μL，均能够很好地扩增，表明该HRM方法具有很好的扩增反应性。

分别对牛巴贝斯虫、双芽巴贝斯虫、卵形巴贝斯虫、大巴贝斯虫和东方巴贝斯虫18sRNA重组质粒浓度为1.0×10⁸拷贝/μL、1.0×10⁴拷贝/μL和1.0×10¹拷贝/μL扩增产物进行熔解曲线分析，标准质粒熔解曲线(图2)结果显示，不同浓度的质粒扩增产物的熔解曲线具有良好的拟合性，该方法能同时进行五种巴贝斯虫虫种的鉴别和检测。

(3)HRM重复性

牛巴贝斯虫、双芽巴贝斯虫、卵形巴贝斯虫、大巴贝斯虫和东方巴贝斯虫18sRNA质粒浓度为1.0×10⁸、1.0×10⁴和1.0×10¹拷贝/μL的标准品进行PCR扩增和熔解曲线分析。对同一批次稀释的标准品，每个浓度重复三次。然后再进行3个不同时间的稀释的标准品进行熔解曲线分析，重复该实验三次，同一虫种不同浓度质粒的熔解曲线均能够很好地重合，说明其检测结果稳定，具有良好的重复性。

(4)HRM方法对已知背景样本的鉴别检测

利用建立的HRM方法对经过测序鉴定为梨形虫阳性的牛基因组DNA样本进行HRM分析，与重组阳性质粒的熔解曲线对照比较，确定样本中的虫种类型。数据显示30例(图4)样本中牛巴贝斯虫4例、双芽巴贝斯虫3例、卵形巴贝斯虫2例、大巴贝斯虫4例、东方巴贝斯虫2例、环形泰勒虫6例、东方泰勒虫5例、中华泰勒虫4例测序结果与本发明方法检测的结果完全一致(图3)。

序列表

<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所

<120> 一种鉴别检测牛巴贝斯虫的试剂盒及检测方法日

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(扩增上游引物 BovisB 7-F)

<400> 1

cctgacacag ggaggtagtg acaag 25

<210> 2

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(扩增上游引物 BovisB 7-R)

<400> 2

ggctgctggc accagacttg ccctcc 26

<210> 3

<211> 1218

<212> DNA

<213> 牛巴贝斯虫18sRNA重组质粒(Babeisa bovis)

<400> 3

agattccatg gataaccgtg ctaattgtgt ggctaataca cgtttgaggg tttcccgcgt 60

ttactgatct tgtgatttac agtaacctgc gactcgcttt ttgcgatatt ccattcaagt 120

ttctgaccca tcagcttgac ggtagggtat tggcctcccg aggcatcgac gggtaacggg 180

gaattagggt tcgattccgg agagggagcc tgcgagacgg ctaccacatc taaggaaggc 240

agcaggcgcg caaattaccc aatcctgaca cagggaggta gtgacaagaa ataccaatac 300

ggggctactg ctctgtaatt ggcatggggg cgaccttcac cctcgcccga gtacccattg 360

gagggcaagt ctggtgccag cagccgcggt aattccagct ccaatagcgt atattaaact 420

tgttgcagtt aaaaagctcg tagttgtact ttatgtcccc cgcttggtcc tttcctcgct 480

gggacgcctc gttactttga gaaaattaga gtgtttcaag caggtttcgc ctgtataatt 540

gagcatggaa taaccttgta tgaccctgtc gtaccgttgg ttgactttgg gtaatggtta 600

ataggaacgg ttgggggcat tcgtactcga ctgtcagagg tgaaattctt agatttgtcg 660

atgacgcacg actgcgaaag catttgccaa ggacgcttcc attaatcaag aacgaaagtt 720

aggggatcga agacgatcag ataccgtcgt agtcctaacc ttaaactatg ccgtctaggg 780

attggtggtc gtcgcctcga ctccgtcagc accttgagag aaatcaaagt ctttgggttc 840

tggggggagt atggtcgcaa gtctgaaact taaaggaatt gacggaaggg caccaccagg 900

cgtggagcct gcggcttaat ttgactcaac acggggaacc tcaccaggtc cagacagcgt 960

aaggattgac aggttgattg tcctttcttg attctctggg tagtggtgca tggccgttct 1020

tagttggtgg agtgatttgt ctggttaatt ccgttaacga acgagacctt aacctgctat 1080

ttagtcgctc ggtctctttc cgtgcgcact tcatagaggg actctgcggc gtcaagctgc 1140

ggtgaggttt aaggcaataa caggtctgtg atgcccttag atgtcctggg aatcgtcgaa 1200

cggcaggcgt gcaaactg 1218

<210> 4

<211> 1300

<212> DNA

<213> 双芽巴贝斯虫18sRNA重组质粒(Babeisa bigemina)

<400> 4

cggcagtgat tagactcggt acgcgcggat cttccagaga ttccatggat aaccgtgcta 60

attgtagggc taatacaagt tcgaggcctt ttggcggcgt ttattagttc cttaaccact 120

ttttctggtg attcataata aacttgcgaa tcgcttttgc gatgttccat tcaagtttct 180

gccccatcag cttgacggta gggtattggc ctaccgaggc agcaacgggt aacggggaat 240

tagggttcga ttccggagag ggagcctgag aaacggctac cacatctaag gaaggcagca 300

ggcgcgcaaa ttacccaatc ctgacacagg gaggtagtga caagaaataa caatacaggg 360

ctttcgtctt gtaattggaa tgatggtgat gtacaacctc accagagtac caattggagg 420

gcaagtctgg tgccagcagc cgcggtaatt ccagctccaa tagcgtatat taaacttgtt 480

gcagttaaaa agctcgtagt tgtatttcag cctcgcgttt tttccctctt ttcgggtctt 540

ttcgctggct ttttttttac tttgagaaaa ttagagtgtt tcaagcagac ttttgtcttg 600

aatacttcag catggaataa tagagtagga ccttggttct attttgttgg tttcgagcct 660

tggtaatggt taataggaac ggttgggggc attcgtattt aactgtcaga ggtgaaattc 720

ttagatttgt taaagacgaa ccactgcgaa agcatttgcc aaggacgttt tcattaatca 780

agaacgaaag ttaggggatc gaagacgatc agataccgtc gtagtcctaa ccataaacta 840

tgccgactag ggattggagg tcgtcatttt ccgactcctt cagcaccttg aaaaaaatca 900

aagtctttgg gttctggggg gagtatggtc ccaagtctga aacttaaagg gattgacgga 960

agggcaccac caggtgtgga gcctgcggtt taatttgact caacacgggg aacctcagca 1020

ggtccagaca gagtaaggat tgacagattg atagctcttt tttgattctt tgggtggtgg 1080

tgcatgtccg ttattagctg gtggagtgat ttgtctggtt aattccgtta acgaacgaga 1140

ccttaacctg ctaactagct gcttggattt cgtcctcgta tgcttcttag agggactcct 1200

gtgcttcaag cgtgggggaa gtttaaggca ataacaggtc tgtgatgccc ttagatgtcc 1260

tgggaatcgt cgaacggcag gcggcaaact ggcgtaatca 1300

<210> 5

<211> 1315

<212> DNA

<213> 卵形巴贝斯虫18sRNA重组质粒(Babeisa ovata)

<400> 5

gggtacgacg gcagtgatta gaactcggta cgcgcggatc ttccagagat tcccaggaca 60

tctaagggca tcacagacct gttattgcct taaacttccc ccacgcttga agcacaggag 120

tccctctaag aagcaagcaa gagcaaatcc caagcagcta gttagcaggt taaggtctcg 180

ttcgttaacg gaattaacca gacaaatcac tccaccaact aagaacggcc atgcaccacc 240

acccaaagaa tcaagaaaga gctatcaatc tgtcaatcct tactctgtct ggacctggtg 300

aggttccccg tgttgagtca aattaagccg cgggctccac gcctggtggt gcccttccgt 360

caattccttt aagtttcaga cttgcgacca tactcccccc agaacccaaa gactttgatt 420

tctctcaagg tgctgaagga gtcggaaaat gacgacctcc aatccctagt cggcatagtt 480

tatggttagg actacgacgg tatctgatcg tcttcgatcc cctaactttc gttcttgatt 540

aatgaaaacg tccttggcaa atgctttcgc agtagttcgt ctttaacaaa tctaagaatt 600

tcacctctga cagttaaata cgaatgcccc caaccgttcc tattagccat taccaaggca 660

ctaaaccaac aaaatagaac caaggtccta ctctattatt ccatgctgaa gtattcaaga 720

caaaagtctg cttgaaacac tctaattttc tcaaagtaaa aataggccca cggcgaaacc 780

cgaaataggg aaaagccgaa gggctgaaat acaactacga gctttttaac tgcaacaagt 840

ttaatatacg ctattggagc tggaattacc gcggctgctg gcaccagact tgccctccaa 900

ttggtactct ggcgagcttt tacgtcgcca tcattccaat tacaagacga aagccctgta 960

ttgttatttc ttgtcactac ctccctgtgt caggattggg taatttgcgc gcctgctgcc 1020

ttccttagat gtggtagccg tttctcaggc tccctctccg gaatcgaacc ctaattcccc 1080

gttacccgtt gctgcctcgg taggccaata ccctaccgtc aagctgatgg ggcagaaact 1140

tgaatggaac atcgcagaag cgattcgcaa gtttattatg aatcaccgag aaagtcggtt 1200

aagaactaat aaacgccgcc aacaaaaatt ggcctcgaac ttgtattagc cctacaatta 1260

gcacggttat ccatggaatc gtcgaacggc aggcgtgcaa actggcgtaa tcagg 1315

<210> 6

<211> 1278

<212> DNA

<213> 大巴贝斯虫18sRNA重组质粒(Babeisa major)

<400> 6

ctcggtacgc gcggatcttc cagagattcc atggataacc gtgctaattg tagggctaat 60

acaagttcga ggccttttgg cggcgtttat tagtgctaaa accagcgtgt ttggtgattc 120

atgataaact tgcgaatcgc gtgagcgatg ttccattcaa gtttctgccc catcagcttg 180

acggtagggt attggcctac cgaggcagca acgggtaacg gggaattagg gttcgattcc 240

ggagagggag cctgagaaac ggctaccaca tctaaggaag gcagcaggcg cgcaaattac 300

ccaatcctga cacagggagg tagtgacaag aaataacaat acagggctaa tgtcttgtaa 360

ttggaatgat ggcgacgtaa aagctcgcca gagtaccaat tggagggcaa gtctggtgcc 420

agcagccgcg gtaattccag ctccaatagc gtatattaaa cttgttgcag ttaaaaagct 480

cgtagttgaa cttcagccgt tgcgccgtcc gactttggtt ggtgttgcgc tgtggcttat 540

ccttttactt tgagaaaatt agagtgtttc aagcagactt ttgtcttgaa tacttcagca 600

tggaataata gagtaggacc tatgttctat tttgttggtt tccgaacgtg ggtaatggtt 660

aataggaacg gttgggggca ttcgtattta actgtcagag gtgaaattct tagatttgtt 720

aaagacgaac tagtgcgaaa gcatttgcca aggacgtttt cattaatcaa gaacgaaagt 780

taggggatcg aagacgatca gataccgtcg tagtcctaac cataaactat gccgactagg 840

gattggaggt cgtcattttt ccgactcctt cagcaccttg agagaaatca aagtctttgg 900

gttctggggg gagtatggtc gcaagtctga aacttaaagg aattgacgga agggcaccac 960

caggcgtgga gcctgcggct taatttgact caacacgggg aacctcacca ggtccagaca 1020

gagttaggat tgacagattg atagctcttt cttgattctt tgggtggtgg tgcatggccg 1080

ttcttagttg gtggagtgat ttgtctggtt aattccgtta acaaacgaga ccttaacctg 1140

ctaactagcg tgcgtgactc ggtttcgttt cgcttcttag agggactcct gtgcattaag 1200

cgtgggggag gtttaaggca ataacaggtc tgtgatgccc ttagatgtcc tgggaatcgt 1260

cgaacggcag gcgtgcaa 1278

<210> 7

<211> 1203

<212> DNA

<213> 东方巴贝斯虫18sRNA重组质粒(Babeisa orientalis)

<400> 7

ttgtagggct aatacaagtt cgatgccttt tggcggcgtt tattagcttt taaaccatcc 60

tcggtttcgg tgattcataa taaacttgcg aatcgcatgc ttttgcggcg atggcccatt 120

caagtttctg acccatcagc ttgacggtag ggtattggcc taccgaggca gcaacgggta 180

acggggaatt agggttcgat tccggagagg gagcctgaga aacggctacc acatctaagg 240

aaggcagcag gcgcgcaaat tacccaatcc tgacacaggg aggtagtgac aagaaataac 300

aatacagggc tactgtcttg taattggaat gatggtgact taaaccctca ccagagtacc 360

aattggaggg caagtctggt gccagcagcc gcggtaattc cagctccaat agcgtatatt 420

aaacttgttg cagttaaaaa gctcgtagtt gaatttcagc gttttgcgtg tgcctttttg 480

gccgtctcaa ttcgcttttt ttattacttt gagaaaatta gagtgtttca agcaggcttt 540

tgtcttgaat acttgagcat ggaataatag agtaggacct tggttctatt ttgttggttt 600

tgttaccttg gtaatggtta ataggaacgg ttgggggcat tcgtatttaa ctgtcagagg 660

tgaaattctt agatttgtta aagacgaact actgcgaaag catttgccaa ggacgtttcc 720

attaatcaag aacgaaagtt aggggatcga aggcgatcag ataccgtcgt agtcctaacc 780

ataaactatg ccgactaggg attggaggtc gtcatttttc cgactccttc agcaccttga 840

gagaaatcaa agtctttggg ttctgggggg agtatggtcg caagtctgaa acttaaagga 900

attgacggaa gggcaccacc aggcgtggag cctgcggctt aatttgactc aacacgggga 960

acctcaccag gtccagacaa ggaaaggatt gacagattga tagctctttc ttgattcttt 1020

gggtagtggt gcatggccgt tcttagttgg tggagtgatt tgtctggtta attccgttaa 1080

cgaacgagac cttaacctgc tatttagctt tcgttactcg gtttcgctaa gcttcttaga 1140

gggactctgc ggcttcaagt cgcagggaag tttaaggcaa taacaggtct gtgatgccct 1200

tag 1203

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(扩增上游引物 PIRO-F180)

<400> 8

ccatggataa ccgtgctaat tg 22

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(扩增下游引物 PIRO- R1380)

<400> 9

catctaaggg catcacagac c 21

Claims

1.一种鉴别牛巴贝斯虫、双芽巴贝斯虫、卵形巴贝斯虫、大巴贝斯虫和东方巴贝斯虫五种牛巴贝斯虫的试剂盒，其特征在于试剂盒中包括有序列为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2的两条扩增引物。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于试剂盒中还有含EvaGreen荧光染料的预混荧光定量PCR扩增反应液。

3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于试剂盒中还有标准阳性质粒模板、阴性标准品。

4.非疾病检测目的牛巴贝斯虫、双芽巴贝斯虫、卵形巴贝斯虫、大巴贝斯虫和东方巴贝斯虫五种牛巴贝斯虫的检测方法，其特征在于提取待检测样品的DNA，再将所得到的待检DNA用权利要求1至3所述的任一试剂盒中的扩增引物进行扩增，再将扩增产物进行高分辨率熔解曲线分析，依据待检测样品高分辨率熔解曲线与标准的上述五种牛巴贝斯虫熔解曲线是否重复，判定待检样品是否感染及感染何种巴贝斯虫。