CN108384871A - 羊梨形虫检测与鉴别的方法与试剂盒 - Google Patents

羊梨形虫检测与鉴别的方法与试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN108384871A
CN108384871A CN201711357850.7A CN201711357850A CN108384871A CN 108384871 A CN108384871 A CN 108384871A CN 201711357850 A CN201711357850 A CN 201711357850A CN 108384871 A CN108384871 A CN 108384871A
Authority
CN
China
Prior art keywords
worm
piroplasma
ovine
babesia
seq
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201711357850.7A
Other languages
English (en)
Inventor
关贵全
王锦明
刘军龙
杨吉飞
刘爱红
李有全
罗建勋
殷宏
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Original Assignee
Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS filed Critical Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Priority to CN201711357850.7A priority Critical patent/CN108384871A/zh
Publication of CN108384871A publication Critical patent/CN108384871A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6893—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for protozoa
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开一种用于非疾病诊断的检测与鉴别羊梨形虫及其种类的方法与试剂盒。本发明的检测与鉴别方法是：提取待检测羊的血液基因组DNA得到待测样本，在反应体系内加入饱和染料再用引物SEQ ID No.1和SEQ ID No.2对重组质粒和待测样本进行PCR扩增，再进行高分辨率熔解曲线分析，根据有无扩增产物确定待测样品有无感染羊梨形虫，根据扩增产物熔解曲线与重组质粒的熔解曲线重合情况确定所感染的羊梨形虫的种类。本发明的方法可检测国内现存所有的病原，检测结果良好，而且可同时进行5种梨形虫病原的鉴别检测，适合在动物体内快速检测梨形虫。

Description

羊梨形虫检测与鉴别的方法与试剂盒
技术领域
本发明涉及一种用于非疾病诊断的检测与鉴别羊梨形虫及其种类的方法与 试剂盒。
背景技术
羊梨形虫病是由媒介蜱传播的一类血液原虫病，是由梨形虫亚纲中的泰勒 虫科和巴贝斯虫科的原虫寄生于羊的淋巴细胞和红细胞内所引起的疾病，包括 泰勒虫病和巴贝斯虫病。目前，全世界已报道的羊的泰勒虫有6种：莱氏泰勒 虫(T.lestoquardi)、绵羊泰勒虫(T.ovis)、分离泰勒虫(T.separata)、隐藏泰勒 虫(T.recondita)、尤氏泰勒虫(T.luwenshuni)和吕氏泰勒虫(T.uilenbergi)。 已经报道的感染羊的巴贝斯虫病病原有5种，即莫氏巴贝斯虫(B.motasi)、绵羊 巴贝斯虫(B.ovis)、粗糙巴贝斯虫(B.crassa)、叶状巴贝斯虫(B.foliata) 和泰氏巴贝斯虫(B.taylori)。在我国，感染羊的泰勒虫有三个种，即吕氏泰勒 虫、尤氏泰勒虫和绵羊泰勒虫。我国广泛流行的巴贝斯虫可分为两个种群，即莫氏巴贝斯虫(B.motasi)和巴贝斯虫未定种种群(Babesia sp.)。其中羊巴贝斯 虫临潭株、羊巴贝斯虫天祝株、羊巴贝斯虫河北株和羊巴贝斯虫宁县株属于莫 氏巴贝斯虫种群；而羊巴贝斯虫新疆株和羊巴贝斯虫敦煌株属于巴贝斯虫未定 种。利用ITS、HSP90、COI、COB、COX3、RPS8和TRAP基因对我国的巴贝 斯虫分离株进行分类研究表明，莫氏巴贝斯虫被分成两个小分支，即河北株/宁 县株(莫氏巴贝斯虫NB亚种)和临潭株/天祝株(莫氏巴贝斯虫LZ亚种)。羊 的梨形虫病在我国广泛流行，造成了巨大的经济损失，对我国养羊业的健康持 续发展造成了巨大的威胁。马米玲等利用酶联免疫吸附试验对我国5省13县进 行羊泰勒虫病调查显示，部分地区泰勒虫感染率高达93.8％。李有全等利用PCR
目前用于泰勒虫和巴贝斯虫感染早期鉴别诊断的方法主要有血涂片染色 法，该方法在染虫率很低的情况下很难检查出病原。分子生物学方法，如聚合 酶链式反应(PCR)、实时荧光定量PCR(Real-time PCR)、反向线状印迹(RLB)、 环介导等温扩增(LAMP)、限制性内切酶片段多态性(RFLP)、DNA探针技 术等，不能同时实现多种病原的鉴别诊断，而且操作繁琐，容易引物交叉污染 而出现假阳性。
发明内容
本发明提供一种可克服现有技术不足的、用于非疾病诊断的检测与鉴别羊 梨形虫及其种类的方法，本发明同时公开一种非疾病诊断的检测与鉴别羊梨形 虫及其种类的试剂盒。
本发明的羊梨形虫非疾病诊断的检测与鉴别方法是：构建羊巴贝斯虫未定 种、莫氏巴贝斯虫HB亚种、莫氏巴贝斯虫LT亚种、吕氏泰勒虫和尤氏泰勒虫 18sRNA重组质粒，提取待检测羊的血液基因组DNA得到待测样本，在反应体 系内加入饱和染料再用引物SEQ IDNo.1和SEQ ID No.2对重组质粒和待测样本 进行PCR扩增，再进行高分辨率熔解曲线分析，根据有无扩增产物确定待测样 品有无感染羊梨形虫，根据扩增产物熔解曲线与重组质粒的熔解曲线重合情况 确定所感染的羊梨形虫的种类。
本发明的羊梨形虫非疾病诊断的检测与鉴别方法中所用的饱和染料为 Forget-Me-NotTM qPCRMasterMix。
优选地，本发明的羊梨形虫非疾病诊断的检测与鉴别方法在PCR扩增时的 反应体系为：
PCR扩增时的反应条件为：95℃预变性2min；95℃变性5s；60℃退火/延伸30s； 40个循环；HRM分析的条件为：95℃60s；40℃60s；60-95℃收集数据，温度 上升速率为0.2℃/s。
本发明的羊梨形虫检测与鉴别的试剂盒内包括：两条引物SEQ ID No.1和 SEQ IDNo.2和饱和染料。
优选地，本发明的羊梨形虫检测与鉴别的试剂盒内还有Forget-Me-NotTMqPCRMaster Mix和标准羊巴贝斯虫未定种18sRNA重组质粒SEQ ID No.3、标 准莫氏巴贝斯虫NB亚种18sRNA重组质粒序列SEQ ID No.4、标准莫氏巴贝斯 虫LZ亚种18sRNA重组质粒SEQ ID No.5、标准吕氏泰勒虫18sRNA重组质粒 SEQ ID No.6和标准尤氏泰勒虫18sRNA重组质粒SEQ ID No.7。
本发明的方法选取梨形虫高度保守的核糖体18S rRNA基因为扩增的靶核 苷酸序列，以该基因为靶标设计扩增引物。虽然，羊巴贝斯虫未定种、莫氏巴 贝斯虫LZ亚种和莫氏巴贝斯虫NB亚种18sRNA基因序列高度保守(相似性为 94％-99％)；尤氏泰勒虫和吕氏泰勒虫18sRNA基因序列相似性95.48％，但是不 同的种和亚种之间存在个别碱基的变异，利用本发明的HRM方法可以进行虫种 的鉴别。本发明同时结合了荧光定量PCR方法的操作简便与灵敏度高的优点， 实现了羊梨形虫病原的鉴别检测，具有检测速度快，特异性好，灵敏度高，使 用步骤简单，可重复性高。本发明的方法囊括了国内现存所有的病原，检测结 果良好，而且可同时进行5种梨形虫病原的鉴别检测，适合在动物体内快速检 测梨形虫，本发明的试剂盒适用于大规模的流行病学调查。
附图说明
图1实时荧光定量PCR反应性扩增曲线。其中1为PCR扩增质粒浓度为1 ×108拷贝/μL，2为PCR扩增质粒浓度为1×107拷贝/μL，3为PCR扩增质粒 浓度为1×106拷贝/μL，4为PCR扩增质粒浓度为1×105拷贝/μL，5为PCR扩 增质粒浓度为1×104拷贝/μL，6为PCR扩增质粒浓度为1×103拷贝/μL，7为 PCR扩增质粒浓度为1×102拷贝/μL，8为PCR扩增质粒浓度为1×101拷贝/μL。
图2溶解曲线敏感性。1为尤氏泰勒虫18sRNA质粒1×108拷贝/μL、1× 105拷贝/μL和1×101拷贝/μL扩增产物的溶解曲线，2为羊巴贝斯虫未定种 18sRNA质粒1×108拷贝/μL、1×105拷贝/μL和1×101拷贝/μL扩增产物的溶 解曲线，3为莫氏巴贝斯虫LZ亚种18sRNA质粒1×108拷贝/μL、1×105拷贝/ μL和1×101拷贝/μL扩增产物的溶解曲线，4为莫氏巴贝斯虫NB亚种18sRNA 质粒1×108拷贝/μL、1×105拷贝/μL和1×101拷贝/μL扩增产物的溶解曲线， 5为尤氏泰勒虫18sRNA质粒1×108拷贝/μL、1×105拷贝/μL和1×101拷贝/ μL扩增产物的溶解曲线。
图3差异曲线。1为尤氏泰勒虫18sRNA差异曲线，2为羊巴贝斯虫未定种 18sRNA差异曲线，3为莫氏巴贝斯虫LZ亚种18sRNA差异曲线，4为莫氏巴贝斯 虫NB亚种18sRNA差异曲线，5为尤氏泰勒虫18sRNA差异曲线。
图4实测HRM分析结果。
具体实施方式
下面提供具体实施方案对本发明做更详细阐述。下面实施例中的实验方法， 如无特殊说明，均为常规方法。所用引物序列合成及测序工作均由南京金斯瑞 股份有限公司完成。
本发明所用引物、标准质粒和试剂如下：
(1)PCR扩增引物
上游引物：SEQ ID No.1
PIRO-F 5'-CGAACGAGACCTTAACCTGCTA-3'
下游引物：SEQ ID No.2
PIRO-R 5'-GGCATCACAGACCTGTTATTGCC-3'
扩增产物长度为120bp
(2)标准羊巴贝斯虫未定种18sRNA重组质粒(101拷贝/μL)SEQ ID No.3；
重组质粒序列为：
CCATGGATAACCGTGCTAATTGTAGGGCTAATACAAGTTCGATGCCTTTTTGGCGGCGTTTATTAGTTTTTTAAACCTCTTTTTTTCGGTGATTCATAATAAACTTGCGAATCGCATGCTTTTGCGGCGATGGCCCATTCAAGTTTCTGACCCATCAGCTTGACGGTAGGGTATTGGCCTACCGAGGCAGCAACGGGTAACGGGGAATTAGGGTTCGATTCCGGAGAGGGAGCCTGAGAAACGGCTACCACATCTAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATCCTGACACAGGGAGGTAGTGACAAGAAATAACAATACAGGGCTATTGTCTTGTAATTGGAATGATGGTGACTTAAACCCTCACCAGAGTACCAATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTATATTAAACTTGTTGCAGTTAAAAAGCTCGTAGTTGAATTTCAGCGTTGTTCTCGTGTTCCCTTTTTGCGGGTTTCGTCTACTTCGCTTTGTTTTTATTACTTTGAGAAAATTAGAGTGTTTCAAGCAGGCTTTTGTCTTGAATACTTGAGCATGGAATAATAGAGTAGGACCTTGGTTCTTCTTTGTTGGTTTTTGTTACCTTGGTAATGGTTAATAGGAACGGTTGGGGGCATTCGTATTTAACTGTCAGAGGTGAAATTCTTAGATTTGTTAAAGACGAACTACTGCGAAAGCATTTGCCAAGGACGTTTCCATTAATCAAGAACGAAAGTTAGGGGATCGAAGACGATCAGATACCGTCGTAGTCCTAACCATAAACTATGCCGACTAGGGATTGGAGGTCGTCATTTTTCTTCGACTCCTTCAGCACCTTGAGAGAAATCAAAGTCTTTGGGTTCTGGGGGGAGTATGGTCGCAAGTCTGAAACTTAAAGGAATTGACGGAAGGGCACCACCAGGCGTGGAGCCTGCGGCTTAATTTGACTCAACACGGGGAACCTCACCAGGTCCAGACAAAGTTAGGATTGACAGATTGATAGCTCTTTCTTGATTCTTTGGGTAGTGGTGCATGGCCGTTCTTAGTTGGTGGAGTGATTTGTCTGGTTAATTCCGTTAACGAACGAGACCTTAACCTGCTATTTAGCTTTGGTTACTTTTGGTTTCTTTTAAGCTTCTTAGAGGGACTCTGCGGCTTCAAGTCGCAGGGAAGTTTAAGGCAATAACAGGTCTGT GATGCCCTTAGATG。
(3)标准莫氏巴贝斯虫NB亚种18sRNA重组质粒(101拷贝/μL)SEQ ID No.4；
重组质粒序列为：
CCATGGATAACCGTGCTAATTGTAGGGCTAATACAAGTTCGATGCCTTTTGGCGGCGTTTATTAGCTTTTAAACCAATTGTTGGTGATTCATAATAAACTTGCGAATCGCTTGTGCGATGTTCCATTCAAGTTTCTGCCCCATCAGCTTGACGGTAGGGTATTGGCCTACCGAGGCAGCAACGGGTAACGGGGAATTAGGGTTCGATTCCGGAGAGGGAGCCTGAGAAACGGCTACCACATCTAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATCCTGACACAGGGAGGTAGTGACAAGAAATAACAATACAGGGCATATGTCTTGTAATTGGAATGATGCCGACTTAAACCCTCGGCAGAGTACCAATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTATATTAAACTTGTTGCAGTTAAAAAGCTCGTAGTTGAATTTCAGCCCTTCGGCTTGCGTTTTTTCGCTTCTGCCGTGGGCTTTTCAGTTTACTTTGAGAAAATTAGAGTGTTTCAAGCAGACTTTTGTCTTGAATACTTCAGCATGGAATAATAGAGTAGGACCTTGGTTCTATTTTGTTGGTTTTTGAGCCTTGGTAATGGTTAATAGGAACGGTTGGGGGCATTCGTATTTAACTGTCAGAGGTGAAATTCTTAGATTTGTTAAAGACGAACTAGTGCGAAAGCATTTGCCAAGGACGTTTTCATTAATCAAGAACGAAAGTTAGGGGATCGAAGACGATCAGATACCGTCGTAGTCCTAACCATAAACTATGCCGACTAGGGATTGGAGGTCGTCATTTGTGACTCCTTCAGCACCTTGAGAGAAATCAAAGTCTTTGGGTTCTGGGGGGAGTACGGTCGCAAGTCTGAAACTTAAAGGAATTGACGGAAGGGCACCACCAGGCGTGGAGCCTGCGGCTTAATTTGACTCAACACGGGGAACCTCACCAGGTCCAGACAGAGTAAGGATTGACAGATTGATAGCTCTTTCTTGATTCTTTGGGTGGTGGTGCATGGCCGTTCTTAGTTGGTGGAGTGATTTGTCTGGTTAATTCCGTTAACGAACGAGACCTTAACCTGCTAACTAGCTGTGCGGAGTAGGTCCGCGTTTGCTTCTTAGAGGGACTCCTGCGCTTGAAGCGTGGGGTAAGTTTAAGGCAATAACAGGTCTGTGATGCCCTTAGATG。
(4)标准莫氏巴贝斯虫LZ亚种18sRNA重组质粒(101拷贝/μL)SEQ ID No.5；
重组质粒序列为：
CCATGGATAACCGTGCTAATTGTAGGGCTAATACAAGTTCGATGCCTTTTGGCGGCGTTTATTAGCTTTTAAACCAATTTGTTGGTGATTCATAATAAACTTGCGAATCGCTTTAGCGATGTTCCATTCAAGTTTCTGCCCCATCAGCTTGACGGTAGGGTATTGGCCTACCGAGGCAGCAACGGGTAACGGGGAATTAGGGTTCGATTCCGGAGAGGGAGCCTGAGAAACGGCTACCACATCTAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATCCTGACACAGGGAGGTAGTGACAAGAAATAACAATACAGGGCATATGTCTTGTAATTGGAATGATGCCGACTTAAACCCTGGGCAGAGTACCAATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTATATTAAACTTGTTGCAGTTAAAAAGCTCGTAGTTGAATTTCAGCCCTTCGGCTTGCGCTTGTCGCTGTTGCCGTGGGCTTTTTTGTTTACTTTGAGAAAATTAGAGTGTTTCAAGCAGACTTTTGTCTTGAATACTTCAGCATGGAATAATAGAGTAGGACCTTGGTTCTATTTTGTTGGTTTTTGAGCCTTGGTAATGGTTAATAGGAACGGTTGGGGGCATTCGTATTTAACTGTCAGAGGTGAAATTCTTAGATTTGTTAAAGACGAACTAGTGCGAAAGCATTTGCCAAGGACGTTTTCATTAATCAAGAACGAAAGTTAGGGGATCGAAGACGATCAGATACCGTCGTAGTCCTAACCATAAACTATGCCGACTAGGGATTGAAGGTCGTCATTTTTGGACTCCTTCAGCACCTTGAGAGAAATCAAAGTCTTTGGGTTCTGGGGGGAGTATGGTCGCAAGTCTGAAACTTAAAGGAATTGACGGAAGGGCACCACCAGGCGTGGAGCCTGCGGCTTAATTTGACTCAACACGGGGAACCTCACCAGGTCCAGACAGAGTAAGGATTGACAGATTGATAGCTCTTTCTTGATTCTTTGGGTGGTGGTGCATGGCCGTTCTTAGTTGGTGGAGTGATTTGTCTGGTTAATTCCGTTAACGAACGAGACCTTAACCTGCTAACTAGCGTTTCGGATATTGTCCCGTTTTTGCTTCTTAGAGGGACTCCTGCGCTTGAAGCGTGGGG TAAGTTTAAGGCAATAACA。
(5)标准吕氏泰勒虫18sRNA重组质粒(101拷贝/μL)SEQ ID No.6；
重组质粒序列为：
CCATGGATAACCGTGCTAATTGTAGGGCTAATACATGTTCGAGACCTTCGGGTGGCGTTTATTAGACCTAAAACCAAACCACTTGTGGTGTTCGGTGATTCATAATAAACTTGCGAATCGCAGCTTCGGCAGCGATGTATCATTCAAGTTTCTGACCTATCAGCTTTGGACGGTAGGGTATTGGCCTACCGGGGCAACGACGGGTAACGGGGAATTAGGGTTCGATTCCGGAGAGGGAGCCTGAGAAACGGCTACCACATCTAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATCCTGACACAGGGAGGTAGTGACAAGAAATAACAATACGGGGCTTAATGTCTTGTAATTGGAATGATGGGAATTTAAACCTCTTCCAGAGTATCAATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTATATTAAAATTGTTGCAGTTAAAAAGCTCGTAGTTGAATTTCTGCTGCATTACATTTATTCTTTTATTTGATTATTTGTATTGTGGCTTATTTCAGTTATAAAATTTATTTTTATTACTGAATTTTTACTTTGAGAAAATTAGAGTGCTCAAAGCAGGCTTTTGCCTTGAATAGTTTAGCATGGAATAATAAAGTAGGACTTTGGTTCTATTTTGTTGGTTTTAGGTACCAAAGTAATGGTTAATAGGAACAGTTGGGGGCATTCGTATTTAACTGTCAGAGGTGAAATTCTTAGATTTGTTAAAGACGAACTACTGCGAAAGCATTTGCCAAGGATGTTTTCATTAATCAAGAACGAAAGTTAGGGGATCGAAGACGATCAGATACCGTCGTAGTCCTAACCATAAACTATGCCGACTAGAGATTGGAGGTCGTCAGTTTTTACGACTCCTTCAGCACCTTGAGAGAAATCAAAGTCTTTGGGTTCTGGGGGGAGTATGGTCGCAAGGCTGAAACTTAAAGGAATTGACGGAAGGGCACCACCAGGCGTGGAGCCTGCGGCTTAATTTGACTCAACACGGGGAAACTCACCAGGTCCAGACAAAGGAAGGATTGACAGATTGATAGCTCTTTCTTGATTCTTTGGGTGGTGGTGCATGGCCGTTCTTAGTTGGTGGAGTGATTTGTCTGGTTAATTCCGTTAACGAACGAGACCTTAACCTGCTAAATAGGATACAAGAATAATTTTTTTAAATGTCTTGTGATCGCTTCTTAGAGGGACTTTACGATTATAAATCGTAAGGAAGTTTAAGGCAATAACAGGTCTGTGATGCCCTT AGATG。
(6)标准尤氏泰勒虫18sRNA重组质粒(101拷贝/μL)SEQ ID No.7
重组质粒序列为：
CCATGGATAACCGTGCTAATTGTAGGGCTAATACATGTTCGAGACCTTCGGGTGGCGTTTATTAGACCTAAAACCAAACCGCTTGCGGTGTCCGGTGATTCATAATAAACTTGCGAATCGCAGCTTCGGCCGCGATGTATCATTCAAGTTTCTGACCTATCAGCTTTGGACGGTAGGGTATTGGCCTACCGGGGCAACGACGGGTAACGGGGAATTAGGGTTCGATTCCGGAGAGGGAGCCTGAGAAACGGCTACCACATCTAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATCCTGACACAGGGAGGTAGTGACAAGAAATAACAATACGGGGCTTAACGTCTTGTAATTGGAATGATGGGAATCTAAACCTCTTCCAGAGTATCAATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTATATTAAAATTGTTGCAGTTAAAAAGCTCGTAGTTGAATTTCTGCCGCCCCGCCTCTGCCCCTCGACGGGCGTTTGCGCCGCGGCTTTTTCGGATTATGCTTGCATTTTCCGAGTGTTACTTTGAGAAAATTAGAGTGCTCAAAGCAGGCTTTTGCCTTGAATAGTTTAGCATGGAATAATAGAGTAGGACTTTGGTTCTATTTTGTTGGTTTTAGGTACCAAAGTAATGGTTAATAGGAACAGTTGGGGGCATTCGTATTTAACTGTCAGAGGTGAAATTCTTAGATTTGTTAAAGACGAACTACTGCGAAAGCATTTGCCAAGGATGTTTTCATTAATCAAGAACGAAAGTTAGGGGATCGAAGACGATCAGATACCGTCGTAGTCCTAACCATAAACCATGCCGACTAGAGATTGGAGGTCGTCAGTTTTTACGACTCCTTCAGCACCTTGAGAGAAATCAAAGTCTTTGGGTTCTGGGGGGAGTATGGTCGCAAGGCTGAAACTTAAAGGAATTGACGGAAGGGCACCACCAGGCGTGGAGCCTGCGGCTTAATTTGACTCAACACGGGGAAACTCACCAGGTCCAGACAAAGGAAGGATTGACAGATTGATAGCTCTTTCTTGATTCTTTGGGTGGTGGTGCATGGCCGTTCTTAGTTGGTGGAGTGATTTGTCTGGTTAATTCCGTTAACGAACGAGACCTTAACCTGCTAAATAGGGTGCGGGAGTAGGCTTCGCCGTCCCGCGACCGCTTCTTAGAGGGACTTTGCGGTTATAAATCGCAAGGAAGTTTAAGGCAATAACAGGTCTGTGATGCCCTTAGATG。
(7)标准梨形虫阴性羊基因组DNA(10ng/μL)；
(8)预混qPCRMasterMix(2×)
具体操作方法如下：
要建立HRM分析方法，首先制备方法所需的质粒标准品。本发明包括尤氏 泰勒虫、吕氏泰勒虫、巴贝斯虫未定种、莫氏巴贝斯虫LZ亚种、莫氏巴贝斯虫 NB亚种5个虫种的18sRNA基因重组标准质粒。利用基因重组技术将其克隆到 pMD19-Tsimple载体中，构建出重组质粒，并进行相应的PCR鉴定和测序鉴定， 最后经定量后作为待建立方法的标准品。
在具体应用时还需要有：预混qPCRMaster Mix、标准阳性质粒模板、阴性 质控标准品、扩增引物。在本实施案例中荧光定量PCR反应液qPCRMaster Mix 10μL，和正向引物和反向引物各0.2μL，荧光校正液ROX Reference DyeⅡ(50 ×)0.4μL，标准品质粒模版1.0μL灭菌蒸馏水8.2μL。
1、标准品的制备
尤氏泰勒虫、吕氏泰勒虫、巴贝斯虫未定种、莫氏巴贝斯虫LZ亚种、莫氏 巴贝斯虫NB亚种18sRNA重组质粒标准品的制备。
(1)根据羊梨形虫核糖体18S rRNA基因序列，使用Primerpremier 5.0和 Oligo 7设计引物，预期获得的目的片段为1240bp，由南京金斯瑞有限公司合成。 引物对序列为：
PIRO-F140：5’-CCATGGATAACCGTGCTAATTG-3’SEQ ID No.8；
PIRO-R1380：5’-CATCTAAGGGCATCACAGACC-3’SEQ ID No.9。
(2)以实验室保存的尤氏泰勒虫、吕氏泰勒虫、巴贝斯虫未定种、巴贝斯 虫未定种、莫氏巴贝斯虫LZ亚种、莫氏巴贝斯虫NB亚种的DNA为模板进行 扩增，采用50μL的PCR反应体系，反应条件为94℃预变性3min，然后94℃ 30S、52℃30S、72℃1min，30个循环，72℃延伸7min。取5μL扩增产物用 1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。鉴定为阳性的PCR产物用琼脂糖凝胶回收纯化试剂盒 (zymo)进行纯化回收，将回收的DNA片段与pMD19-simple载体进行连接，反应体系如下：
配制完成后置于16℃进行连接过夜。
(3)pMD19-simple连接产物的转化以及PCR鉴定
(a)-80℃的超低温冰箱中取出DH5α感受态细胞，置于冰上融化。
(b)取连接产物10μL加入100μL的DH5α感受态细胞中，冰浴30分钟。
(c)42℃热激90s，置冰上2min。
(d)加入不含抗生素的LB液体培养基1ml，37℃150转，培养90min。
(e)取100μL涂布于氨苄抗性的LB平皿上，37℃倒置培养过夜。
(f)从平板上挑取单克隆菌落于500μL氨苄抗性的LB液体培养基的1.5ml EP 管中，37℃220rpm振荡培养5-6小时。
(g)取1μL作为模板进行菌液PCR鉴定。将鉴定为阳性的菌液加入到5ml 的LB液体培养基中进行扩摇。
(4)鉴定为阳性的克隆提取质粒，使用NanoDrop 2000/2000C(ThermoScientific，America)超微量分光光度计测定质粒浓度，并将其换算成拷贝/μL， 以此作为质粒标准品。将构建好的质粒标准品，系列稀释为终浓度为1.0×108 -1.0×101拷贝/μL，以便进行敏感性测试。
2、高分辨率溶解曲线方法的反应性和灵敏度测试
(1)HRM-PCR扩增时所用反应体系和反应条件
PCR反应体系为20μL：
PCR的反应条件为：95℃预变性2min；95℃变性5s；60℃退火/延伸30s； 40个循环。HRM分析：95℃60s；40℃60sec；60-95℃收集数据，温度 上升速率为0.2℃/s。
扩增所用引物序列如下：
上游引物：PIRO-F 5'-CGAACGAGACCTTAACCTGCTA-3'
下游引物：PIRO-R 5'-GGCATCACAGACCTGTTATTGCC-3'
(2)灵敏度实验
利用上述所建立的实时荧光定量PCR方法，每个样品重复三次分别检测尤 氏泰勒虫、吕氏泰勒虫、巴贝斯虫未定种、莫氏巴贝斯虫LZ亚种、莫氏巴贝斯 虫NB亚种18sRNA重组质粒。取不同稀释浓度1.0×108-1.0×101拷贝/μL的质 粒标准品进行灵敏度试验。
PCR扩增时的反应体系为：
PCR扩增时的反应条件为：95℃预变性2min；95℃变性5s；60℃退火/延伸 30s；40个循环。
HRM分析的条件为：95℃60s；40℃60s；60-95℃收集数据，温度上升速 率为0.2℃/s。
本发明的方法对样本的分析结果见表1
表1 应用本发明的方法对样本的分析结果
样本编号 基因型 样本编号 基因型
1 莫氏巴贝斯虫NB亚种 2 莫氏巴贝斯虫LZ亚种
3 吕氏泰勒虫 4 尤氏泰勒虫
3 莫氏巴贝斯虫LZ亚种 6 莫氏巴贝斯虫NB亚种
7 巴贝斯虫未定种 8 莫氏巴贝斯虫LZ亚种
9 巴贝斯虫未定种 10 巴贝斯虫未定种
11 尤氏泰勒虫 12 莫氏巴贝斯虫LZ亚种
13 巴贝斯虫未定种 14 吕氏泰勒虫
15 莫氏巴贝斯虫LZ亚种 16 巴贝斯虫未定种
结果参见图1，扩增曲线显示质粒浓度为1.0×108拷贝/μL至1.0×101拷 贝/μL，均能够很好地扩增，且Ct值均小于35，表明该HRM方法具有很好的 扩增反应性。
分别对尤氏泰勒虫、吕氏泰勒虫、巴贝斯虫未定种、莫氏巴贝斯虫LZ亚种、 莫氏巴贝斯虫NB亚种18sRNA重组质粒浓度为1.0×108拷贝/μL、1.0×105拷 贝/μL和1.0×101拷贝/μL扩增产物进行溶解曲线分析，标准质粒溶解曲线(图 2)结果显示，不同浓度的质粒扩增产物的溶解曲线具有良好的拟合性，5个组 的不同虫株能够很好的区分。差异曲线(图3)显示，5个组的不同虫株也能够 很好的区分。
(3)HRM重复性
取尤氏泰勒虫、吕氏泰勒虫、巴贝斯虫未定种、莫氏巴贝斯虫LZ亚种、莫 氏巴贝斯虫NB亚种18sRNA质粒浓度为1.0×108、1.0×105和1.0×101拷贝 /μL的标准品进行PCR扩增和溶解曲线分析。对同一批次稀释的标准品，每个 浓度重复检测四次。然后再进行3个不同时间的稀释的标准品进行溶解曲线分 析，反复重复该实验三次，同一虫种不同浓度质粒的溶解曲线均能够很好地重 合，说明其检测结果稳定，具有良好的重复性。
(4)HRM方法对未知样本的检测
利用建立的HRM方法对19例确定梨形虫阳性的DNA样本进行HRM分析， 与重组阳性质粒的熔解曲线对照比较，依此确定样本中的虫种类型，并根据HRM 分析结果(图4)针对每种基因型随机挑选2个样本在南京金斯瑞生物工程有限 公司进行测序验证。
本发明的实验数据显示19例(表1)样本中尤氏泰勒虫阳性2例、吕氏泰 勒虫阳性2例、巴贝斯虫未定种5例、莫氏巴贝斯虫LZ亚种5例、莫氏巴贝斯 虫NB亚种2例。测序结果与本发明方法检测的结果完全一致。
序列表
<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所
<120> 羊梨形虫检测与鉴别的试剂盒
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(PIRO-F)
<400> 1
cgaacgagac cttaacctgc ta 22
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(PIRO-R)
<400> 2
ggcatcacag acctgttatt gcc 23
<210> 3
<211> 1240
<212> DNA
<213> 标准羊巴贝斯虫未定种(18sRNA重组质粒)
<400> 3
ccatggataa ccgtgctaat tgtagggcta atacaagttc gatgcctttt tggcggcgtt 60
tattagtttt ttaaacctct ttttttcggt gattcataat aaacttgcga atcgcatgct 120
tttgcggcga tggcccattc aagtttctga cccatcagct tgacggtagg gtattggcct 180
accgaggcag caacgggtaa cggggaatta gggttcgatt ccggagaggg agcctgagaa 240
acggctacca catctaagga aggcagcagg cgcgcaaatt acccaatcct gacacaggga 300
ggtagtgaca agaaataaca atacagggct attgtcttgt aattggaatg atggtgactt 360
aaaccctcac cagagtacca attggagggc aagtctggtg ccagcagccg cggtaattcc 420
agctccaata gcgtatatta aacttgttgc agttaaaaag ctcgtagttg aatttcagcg 480
ttgttctcgt gttccctttt tgcgggtttc gtctacttcg ctttgttttt attactttga 540
gaaaattaga gtgtttcaag caggcttttg tcttgaatac ttgagcatgg aataatagag 600
taggaccttg gttcttcttt gttggttttt gttaccttgg taatggttaa taggaacggt 660
tgggggcatt cgtatttaac tgtcagaggt gaaattctta gatttgttaa agacgaacta 720
ctgcgaaagc atttgccaag gacgtttcca ttaatcaaga acgaaagtta ggggatcgaa 780
gacgatcaga taccgtcgta gtcctaacca taaactatgc cgactaggga ttggaggtcg 840
tcatttttct tcgactcctt cagcaccttg agagaaatca aagtctttgg gttctggggg 900
gagtatggtc gcaagtctga aacttaaagg aattgacgga agggcaccac caggcgtgga 960
gcctgcggct taatttgact caacacgggg aacctcacca ggtccagaca aagttaggat 1020
tgacagattg atagctcttt cttgattctt tgggtagtgg tgcatggccg ttcttagttg 1080
gtggagtgat ttgtctggtt aattccgtta acgaacgaga ccttaacctg ctatttagct 1140
ttggttactt ttggtttctt ttaagcttct tagagggact ctgcggcttc aagtcgcagg 1200
gaagtttaag gcaataacag gtctgtgatg cccttagatg 1240
<210> 4
<211> 1211
<212> DNA
<213> 标准莫氏巴贝斯虫(NB亚种18sRNA重组质粒)
<400> 4
ccatggataa ccgtgctaat tgtagggcta atacaagttc gatgcctttt ggcggcgttt 60
attagctttt aaaccaattg ttggtgattc ataataaact tgcgaatcgc ttgtgcgatg 120
ttccattcaa gtttctgccc catcagcttg acggtagggt attggcctac cgaggcagca 180
acgggtaacg gggaattagg gttcgattcc ggagagggag cctgagaaac ggctaccaca 240
tctaaggaag gcagcaggcg cgcaaattac ccaatcctga cacagggagg tagtgacaag 300
aaataacaat acagggcata tgtcttgtaa ttggaatgat gccgacttaa accctcggca 360
gagtaccaat tggagggcaa gtctggtgcc agcagccgcg gtaattccag ctccaatagc 420
gtatattaaa cttgttgcag ttaaaaagct cgtagttgaa tttcagccct tcggcttgcg 480
ttttttcgct tctgccgtgg gcttttcagt ttactttgag aaaattagag tgtttcaagc 540
agacttttgt cttgaatact tcagcatgga ataatagagt aggaccttgg ttctattttg 600
ttggtttttg agccttggta atggttaata ggaacggttg ggggcattcg tatttaactg 660
tcagaggtga aattcttaga tttgttaaag acgaactagt gcgaaagcat ttgccaagga 720
cgttttcatt aatcaagaac gaaagttagg ggatcgaaga cgatcagata ccgtcgtagt 780
cctaaccata aactatgccg actagggatt ggaggtcgtc atttgtgact ccttcagcac 840
cttgagagaa atcaaagtct ttgggttctg gggggagtac ggtcgcaagt ctgaaactta 900
aaggaattga cggaagggca ccaccaggcg tggagcctgc ggcttaattt gactcaacac 960
ggggaacctc accaggtcca gacagagtaa ggattgacag attgatagct ctttcttgat 1020
tctttgggtg gtggtgcatg gccgttctta gttggtggag tgatttgtct ggttaattcc 1080
gttaacgaac gagaccttaa cctgctaact agctgtgcgg agtaggtccg cgtttgcttc 1140
ttagagggac tcctgcgctt gaagcgtggg gtaagtttaa ggcaataaca ggtctgtgat 1200
gcccttagat g 1211
<210> 5
<211> 1192
<212> DNA
<213> 标准莫氏巴贝斯虫(LZ亚种18sRNA重组质粒)
<400> 5
ccatggataa ccgtgctaat tgtagggcta atacaagttc gatgcctttt ggcggcgttt 60
attagctttt aaaccaattt gttggtgatt cataataaac ttgcgaatcg ctttagcgat 120
gttccattca agtttctgcc ccatcagctt gacggtaggg tattggccta ccgaggcagc 180
aacgggtaac ggggaattag ggttcgattc cggagaggga gcctgagaaa cggctaccac 240
atctaaggaa ggcagcaggc gcgcaaatta cccaatcctg acacagggag gtagtgacaa 300
gaaataacaa tacagggcat atgtcttgta attggaatga tgccgactta aaccctgggc 360
agagtaccaa ttggagggca agtctggtgc cagcagccgc ggtaattcca gctccaatag 420
cgtatattaa acttgttgca gttaaaaagc tcgtagttga atttcagccc ttcggcttgc 480
gcttgtcgct gttgccgtgg gcttttttgt ttactttgag aaaattagag tgtttcaagc 540
agacttttgt cttgaatact tcagcatgga ataatagagt aggaccttgg ttctattttg 600
ttggtttttg agccttggta atggttaata ggaacggttg ggggcattcg tatttaactg 660
tcagaggtga aattcttaga tttgttaaag acgaactagt gcgaaagcat ttgccaagga 720
cgttttcatt aatcaagaac gaaagttagg ggatcgaaga cgatcagata ccgtcgtagt 780
cctaaccata aactatgccg actagggatt gaaggtcgtc atttttggac tccttcagca 840
ccttgagaga aatcaaagtc tttgggttct ggggggagta tggtcgcaag tctgaaactt 900
aaaggaattg acggaagggc accaccaggc gtggagcctg cggcttaatt tgactcaaca 960
cggggaacct caccaggtcc agacagagta aggattgaca gattgatagc tctttcttga 1020
ttctttgggt ggtggtgcat ggccgttctt agttggtgga gtgatttgtc tggttaattc 1080
cgttaacgaa cgagacctta acctgctaac tagcgtttcg gatattgtcc cgtttttgct 1140
tcttagaggg actcctgcgc ttgaagcgtg gggtaagttt aaggcaataa ca 1192
<210> 6
<211> 1280
<212> DNA
<213> 标准吕氏泰勒虫(18sRNA重组质粒)
<400> 6
catggataac cgtgctaatt gtagggctaa tacatgttcg agaccttcgg gtggcgttta 60
ttagacctaa aaccaaaccc gcttgcggtt aacggtgatt cataataaac ttgcgaatcg 120
cagcttttgc ggcgatgtat cattcaagtt tctgacctat cagcttgacg gtagggtatt 180
ggcctactga ggcaacgacg ggtaacgggg aattagggtt cgattccgga gagggagcct 240
gagaaacggc taccacatct aaggaaggca gcaggcgcgc aaattaccca atcctgacac 300
agggaggtag tgacaagaaa taacaatacg gggctttatg tcttgtaatt ggaatgatgg 360
gaatttaaac ctcttccaga gtatcaattg gagggcaagt ctggtgccag cagccgcggt 420
aattccagct ccaatagcgt atattaaaat tgttgcagtt aaaaagctcg tagttgaatt 480
tctgctgcat tgcatcttct ttttgatgag ttgatgtatt gtggcttatt tcggatgata 540
cttgtattat ccggatgatt actttgagaa aattagagtg ctcaaagcag gcttttgcct 600
tgaatagttt agcatggaat aataaagtag gactttggtt ctattttgtt ggttttaggt 660
accaaagtaa tggttaatag gaacagttgg gggcattcgt atttaactgt cagaggtgaa 720
attcttagat ttgttaaaga cgaactactg cgaaagcatt tgccaaggat gttttcatta 780
atcaagaacg aaagttaggg gatcgaagac gatcagatac cgtcgtagtc ctaaccataa 840
actatgccga ctagagattg gaggtcgtca gtttttacga ctccttcagc accttgagag 900
aaatcaaagt ctttgggttc tggggggagt atggtcgcaa ggctgaaact taaaggaatt 960
gacggaaggg caccaccagg cgtggagcct gcggcttaat ttgactcaac acggggaaac 1020
tcaccaggtc cagacaaagg aaggattgac agattgatag ctctttcttg attctttggg 1080
tggtggtgca tggccgttct tagttggtgg agtgatttgt ctggttaatt ccgttaacga 1140
acgagacctt aacctgctaa ataggatgcg gatataagct tttgctgtcc cgtgatcgct 1200
tcttagaggg actttgcggt tataaatcgc aaggaagttt aaggcaataa caggtctgtg 1260
atgcccttag atgtcctggg 1280
<210> 7
<211> 1272
<212> DNA
<213> 标准尤氏泰勒虫(18sRNA重组质粒)
<400> 7
ccatggataa ccgtgctaat tgtagggcta atacatgttc gagaccttcg ggtggcgttt 60
attagaccta aaaccaaacc gcttgcggtg tccggtgatt cataataaac ttgcgaatcg 120
cagcttcggc cgcgatgtat cattcaagtt tctgacctat cagctttgga cggtagggta 180
ttggcctacc ggggcaacga cgggtaacgg ggaattaggg ttcgattccg gagagggagc 240
ctgagaaacg gctaccacat ctaaggaagg cagcaggcgc gcaaattacc caatcctgac 300
acagggaggt agtgacaaga aataacaata cggggcttaa cgtcttgtaa ttggaatgat 360
gggaatctaa acctcttcca gagtatcaat tggagggcaa gtctggtgcc agcagccgcg 420
gtaattccag ctccaatagc gtatattaaa attgttgcag ttaaaaagct cgtagttgaa 480
tttctgccgc cccgcctctg cccctcgacg ggcgtttgcg ccgcggcttt ttcggattat 540
gcttgcattt tccgagtgtt actttgagaa aattagagtg ctcaaagcag gcttttgcct 600
tgaatagttt agcatggaat aatagagtag gactttggtt ctattttgtt ggttttaggt 660
accaaagtaa tggttaatag gaacagttgg gggcattcgt atttaactgt cagaggtgaa 720
attcttagat ttgttaaaga cgaactactg cgaaagcatt tgccaaggat gttttcatta 780
atcaagaacg aaagttaggg gatcgaagac gatcagatac cgtcgtagtc ctaaccataa 840
accatgccga ctagagattg gaggtcgtca gtttttacga ctccttcagc accttgagag 900
aaatcaaagt ctttgggttc tggggggagt atggtcgcaa ggctgaaact taaaggaatt 960
gacggaaggg caccaccagg cgtggagcct gcggcttaat ttgactcaac acggggaaac 1020
tcaccaggtc cagacaaagg aaggattgac agattgatag ctctttcttg attctttggg 1080
tggtggtgca tggccgttct tagttggtgg agtgatttgt ctggttaatt ccgttaacga 1140
acgagacctt aacctgctaa atagggtgcg ggagtaggct tcgccgtccc gcgaccgctt 1200
cttagaggga ctttgcggtt ataaatcgca aggaagttta aggcaataac aggtctgtga 1260
tgcccttaga tg 1272
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(PIRO-F140)
<400> 8
ccatggataa ccgtgctaat tg 22
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(PIRO- R1380)
<400> 9
catctaaggg catcacagac c 21

Claims (5)

1.羊梨形虫非疾病诊断的检测与鉴别方法，其特征在于：构建羊巴贝斯虫未定种、莫氏巴贝斯虫HB亚种、莫氏巴贝斯虫LT亚种、吕氏泰勒虫和尤氏泰勒虫18sRNA重组质粒，提取待检测羊的血液基因组DNA得到待测样本，在反应体系内加入饱和染料再用引物SEQ ID No.1和SEQ ID No.2对重组质粒和待测样本进行PCR扩增，再进行高分辨率熔解曲线分析，根据有无扩增产物确定待测样品有无感染羊梨形虫，根据扩增产物熔解曲线与重组质粒的熔解曲线重合情况确定所感染的羊梨形虫的种类。
2.根据权利要求1所述的羊梨形虫非疾病诊断的检测与鉴别方法，其特征在于所用的饱和染料为Forget-Me-NotTMqPCRMasterMix。
3.根据权利要求1所述的羊梨形虫非疾病诊断的检测与鉴别方法，其特征在于PCR扩增时的反应体系为：
PCR扩增时的反应条件为：95℃预变性2min；95℃变性5s；60℃退火/延伸30s；40个循环；
HRM分析的条件为：95℃60s；40℃60s；60-95℃收集数据，温度上升速率为0.2℃/s。
4.羊梨形虫检测与鉴别的试剂盒，其特征在于试剂盒内包括：两条引物SEQ ID No.1和SEQ ID No.2和饱和染料。
5.根据权利要求4所述的羊梨形虫检测与鉴别的试剂盒，其特征在于试剂盒内有Forget-Me-NotTMqPCRMasterMix和标准羊巴贝斯虫未定种18sRNA重组质粒SEQ ID No.3、标准莫氏巴贝斯虫NB亚种18sRNA重组质粒序列SEQ ID No.4、标准莫氏巴贝斯虫LZ亚种18sRNA重组质粒SEQ ID No.5、标准吕氏泰勒虫18sRNA重组质粒SEQ ID No.6和标准尤氏泰勒虫18sRNA重组质粒SEQ ID No.7。
CN201711357850.7A 2017-12-17 2017-12-17 羊梨形虫检测与鉴别的方法与试剂盒 Pending CN108384871A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711357850.7A CN108384871A (zh) 2017-12-17 2017-12-17 羊梨形虫检测与鉴别的方法与试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711357850.7A CN108384871A (zh) 2017-12-17 2017-12-17 羊梨形虫检测与鉴别的方法与试剂盒

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN108384871A true CN108384871A (zh) 2018-08-10

Family

ID=63076267

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201711357850.7A Pending CN108384871A (zh) 2017-12-17 2017-12-17 羊梨形虫检测与鉴别的方法与试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108384871A (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109136398A (zh) * 2018-09-15 2019-01-04 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种检测犬巴贝斯虫试剂盒及检测方法
CN109234402A (zh) * 2018-10-08 2019-01-18 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种牛泰勒虫鉴别检测的方法和试剂盒
CN109439782A (zh) * 2018-12-20 2019-03-08 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种鉴别检测牛巴贝斯虫的试剂盒及检测方法
CN110283922A (zh) * 2019-07-01 2019-09-27 海南大学 一种用于检测羊吕氏泰勒虫的pcr引物、检测试剂及检测方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103382500A (zh) * 2013-04-18 2013-11-06 华南农业大学 用于检测蓝氏贾第虫人畜共患基因型的hrm引物及其应用
CN104561344A (zh) * 2015-01-24 2015-04-29 中国农业科学院兰州兽医研究所 可检测与区分不同种羊巴贝斯虫的引物对与试剂盒
CN104818330A (zh) * 2015-04-30 2015-08-05 中国农业科学院兰州兽医研究所 用于区分和检测牛梨形虫的试剂盒及制备与使用方法
CN105349700A (zh) * 2015-11-27 2016-02-24 广东省实验动物监测所 一种快速鉴别小鼠细小病毒mvm株与mpv株的hrm检测方法及引物
CN106399559A (zh) * 2016-11-16 2017-02-15 广东省农业科学院动物卫生研究所 一种检测猪肺炎支原体的引物对、试剂盒及Syto9荧光定量PCR‑HRM检测方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103382500A (zh) * 2013-04-18 2013-11-06 华南农业大学 用于检测蓝氏贾第虫人畜共患基因型的hrm引物及其应用
CN104561344A (zh) * 2015-01-24 2015-04-29 中国农业科学院兰州兽医研究所 可检测与区分不同种羊巴贝斯虫的引物对与试剂盒
CN104818330A (zh) * 2015-04-30 2015-08-05 中国农业科学院兰州兽医研究所 用于区分和检测牛梨形虫的试剂盒及制备与使用方法
CN105349700A (zh) * 2015-11-27 2016-02-24 广东省实验动物监测所 一种快速鉴别小鼠细小病毒mvm株与mpv株的hrm检测方法及引物
CN106399559A (zh) * 2016-11-16 2017-02-15 广东省农业科学院动物卫生研究所 一种检测猪肺炎支原体的引物对、试剂盒及Syto9荧光定量PCR‑HRM检测方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
B SALIM ET,AL.: "Rapid detection and identification of Theileria equi and Babesia caballi by high-resolution melting (HRM) analysis", 《PARASITOL RES.》 *
徐宗可 等: "建立在PCR-RFLP方法基础上的羊梨形虫的种类鉴定", 《中国兽医科学》 *
罗建勋 等: "我国牛羊梨形虫病病原的收集与鉴定", 《中国寄生虫学与寄生虫病杂志 》 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109136398A (zh) * 2018-09-15 2019-01-04 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种检测犬巴贝斯虫试剂盒及检测方法
CN109234402A (zh) * 2018-10-08 2019-01-18 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种牛泰勒虫鉴别检测的方法和试剂盒
CN109439782A (zh) * 2018-12-20 2019-03-08 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种鉴别检测牛巴贝斯虫的试剂盒及检测方法
CN109439782B (zh) * 2018-12-20 2021-09-03 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种鉴别检测牛巴贝斯虫的试剂盒及检测方法
CN110283922A (zh) * 2019-07-01 2019-09-27 海南大学 一种用于检测羊吕氏泰勒虫的pcr引物、检测试剂及检测方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Mohania et al. Molecular approaches for identification and characterization of lactic acid bacteria
CN108384871A (zh) 羊梨形虫检测与鉴别的方法与试剂盒
CN103981256B (zh) 一种沙门氏菌crispr分型方法
Afshari et al. Genotyping of Clostridium perfringens isolated from broiler meat in northeastern of Iran
CN104726566B (zh) 多重pcr检测肠道新发原虫试剂盒及检测方法
CN105936935B (zh) 一种快速鉴定特定血清型沙门菌的pcr检测试剂盒
CN109136398A (zh) 一种检测犬巴贝斯虫试剂盒及检测方法
Treven Strategies to develop strain-specific PCR based assays for probiotics
CN109337995B (zh) 土拉杆菌及其亚种的pcr检测方法和试剂盒
CN101381767A (zh) 旋毛虫通用型实时荧光pcr检测方法
CN106244690B (zh) 一种快速鉴定肠炎沙门菌、鸡白痢/鸡伤寒沙门菌以及都柏林沙门菌的多重pcr检测试剂盒
CN108893526A (zh) 一种微小隐孢子虫荧光lamp检测方法
CN107190103A (zh) 同时检测三种鱼类病毒的多重pcr引物组、试剂盒及方法
CN102864229A (zh) 快速检测空肠弯曲菌的lamp试剂盒
JP3525259B2 (ja) ペクチネータス属菌の検出
CN108611442A (zh) 一种检测猪非典型瘟病毒的荧光定量rt-pcr引物和探针及方法与应用
CN108103152A (zh) 一种鳗利斯顿氏菌快速检测方法
CN108504756A (zh) 基于特异性序列的维氏气单胞菌检测引物、试剂盒、检测方法及其开发方法
CN113832241A (zh) 一种rpa-lfs快速检测杀鲑气单胞菌的探针及引物组、试剂盒、检测方法
AU2019100071A4 (en) Pcr detection kit for rapidly identifying salmonella of specific serotypes
JP2007020423A (ja) 腸内細菌群検出用核酸断片
CN109609668B (zh) 一种鼠伤寒沙门菌mlva分型的检测引物组、试剂盒及其应用
CN105154439B (zh) 对蜂房哈夫尼亚菌g5902，g5903，g5904，g5906特异的核苷酸序列
CN105112406B (zh) 对蜂房哈夫尼亚菌g5897，g5898，g5900特异的核苷酸及其应用
CN111057776A (zh) 李斯特属和6种常见李斯特菌特异性新分子靶标及其快速检测方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20180810