CN109234402A - 一种牛泰勒虫鉴别检测的方法和试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种牛泰勒虫病检测试剂盒及非疾病诊断方法。本发明的检测试剂盒中包括有两条扩增引物SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，以及含有EvaGreen荧光染料的qPCRMaster Mix预混反应液。本发明的牛泰勒虫病检测试剂盒及非疾病诊断方法是以的扩增引物连同标准质粒同时进行扩增，再将扩增产物进行高分辨率溶解曲线分析，将所得到的待检样品的高分辨率溶解曲线与标准泰勒虫熔解曲线进行对比，得到待检样品是否感染及感染何种泰勒虫。本发明具有较高的灵敏度和可重复性，使用步骤简单，弥补了当前病原学检测方法难以进行鉴定到种和一次只能检测一种病原的不足。

Description

一种牛泰勒虫鉴别检测的方法和试剂盒

技术领域

本发明涉及一种用于检测动物寄生虫的试剂盒及使用方法，特别是一种牛 泰勒虫病的检测试剂盒，及其非疾病检测目的的使用方法。

背景技术

牛泰勒虫病(Bovine theileriosis)是一种蜱传性的血液原虫病，由顶复门、 梨形虫纲、泰勒属的多种泰勒虫引起，该病流行范围广，在全世界均有分布， 给养牛业造成了巨大的经济损失，严重制约了养牛业的健康持续发展(Sager et al. 1998；Gebrekidan etal.2016)。在我国，引起牛泰勒虫病的病原主要有三种：环 形泰勒虫(Theileriaannulata)、中华泰勒虫(Theileria sinensis)和东方泰勒虫 (Theileria orientalis)(Yang et al.1965)。环形泰勒虫毒力较强，致死率高达40％， 是引起地中海泰勒虫病/热带泰勒虫病的主要病原。中华泰勒虫最早于1995年由 中国农业科学院兰州兽医研究所虫媒传播疫病病原研究组从甘肃黄牛体内分离 而来(Bai et al.2002；Li et al.2009)。东方泰勒虫属于毒力较弱的泰勒虫群，包括 瑟氏泰勒虫、水牛泰勒虫和东方泰勒虫(Gubbelset al.2000；Gubbels et al.2002； Stewart et al.1996；Uilenberg et al.1985)。

我国关于牛泰勒虫病报道的最早源于贵州，随后该病在多个省份均有零星 的报道，包括辽宁、吉林、甘肃、四川、广西、湖南、江苏、河北等(Luo et al.1997)。 流行病学调查结果显示，环形泰勒虫在我国主要流行于西北的荒漠和半荒漠草 原地带，东北的大兴安岭及长白山和华北地区，其感染率为1.6-90％，死亡率为 4-46.4％(黄国顺，1994；Luo andLu 1997；Yin et al.2008；李亚琼等，2015；海尼 木古丽等，2017)。东方泰勒虫在我国的分布范围更为广泛，感染牛多数呈带虫 隐形感染状态，在某些地区的感染率高达97.5％(Luoet al.1997)。中华泰勒虫仅

目前，牛泰勒虫检测方法有血涂片和淋巴组织活检法、血清学方法、分子 生物学方法。利用传统血涂片和淋巴组织活检涂片是进行泰勒虫急性感染检测 最可靠的方法。但是在染虫率很低或感染早期，该方法很难发现虫体，也难以 鉴定到种，也存在一定的局限性。国内外学者利用半套式PCR、实时荧光定量 PCR(Real-time PCR)、酶联免疫吸附试验等对泰勒虫进行检测。分子生物学方 法和酶联免疫吸附试验具有高敏感性和特异性的特点，但每次只能鉴定出一种 病原体，无法同时实现多种病原的鉴别检测。

发明内容

本发明提供了一种可克服现有技术不足的用于国内现存的牛泰勒虫病原鉴 别检测的试剂盒，以及用这种试剂盒进行疾病与非疾病检测的方法。

本发明的检测牛泰勒虫试剂盒包括两条扩增引物SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。

本发明的检测牛泰勒虫试剂盒种还含有EvaGreen荧光染料的qPCRMaster Mix预混液。为了便于虫种的鉴别检测，本发明的试剂盒中还有标准阳性质粒模 板、阴性标准品。

本发明的试剂盒可同时鉴别检测环形泰勒虫、中华泰勒虫、东方泰勒虫。

本发明的非疾病检测目的的使用方法为：提取待检样品基因组DNA，将所 得到的待检DNA和标准质粒DNA用试剂盒中的扩增引物进行扩增，对扩增得 到的产物进行高分辨率熔解曲线分析，依据待检样品形成的熔解曲线与标准泰 勒虫对应的熔解曲线的重合情况，判定样品感染的泰勒虫种。

本发明利用环形泰勒虫、中华泰勒虫、东方泰勒虫18sRNA基因序列的保 守性特征(基因序列相似性为95.3-99.9％)，基于基因序列比对分析结果，在保 守区域设计扩增引物，扩增的靶序列在不同的虫种间存在个别碱基的差异，使 其扩增产物的熔解温度存在一定的差异，可以形成不重合的熔解曲线，从而可 以进行不同虫种的鉴别检测。靶序列具有如下特征：(1)在同一虫种不同地方 分离株间高度保守(核苷酸序列相似性为100％)；(2)不同虫种间至少有一个 碱基的变异；利用高分辨率溶解曲线方法(HRM)对扩增产物进行熔解曲线分 析，由于扩增的基因序列存在一个或数个碱基的差异，导致不同的基因序列熔解温度有细微的差别，形成不同的熔解曲线，进行研制出可同时鉴别检测三种 牛泰勒虫(环形泰勒虫、中华泰勒虫、东方泰勒虫)的试剂盒。

本发明的检测方法具有重复性好、灵敏度高、反应速度快和全封闭反应等 优点，使其能更好地用于牛泰勒虫的鉴别检测。目前，还没有关于利用高分辨 率熔解曲线进行牛泰勒虫种鉴别检测方法的报道。

本方法囊括了国内现存的牛泰勒虫病原，检测范围广，可用于牛泰勒虫种 的鉴别检测和流行病学调查。

附图说明

图1实时荧光定量PCR扩增敏感性。其中1为PCR扩增质粒浓度为1×10⁷拷贝/μL，2为PCR扩增质粒浓度为1×10⁶拷贝/μL，3为PCR扩增质粒浓度为 1×10⁵拷贝/μL，4为PCR扩增质粒浓度为1×10⁴拷贝/μL，5为PCR扩增质粒浓 度为1×10³拷贝/μL，6为PCR扩增质粒浓度为1×10²拷贝/μL，7为PCR扩增质 粒浓度为1×10¹拷贝/μL。

图2熔解曲线敏感性。1为环形泰勒虫18sRNA质粒1×10⁷拷贝/μL、1×10⁴拷贝/μL和1×10¹拷贝/μL扩增产物的溶解曲线，2为东方泰勒虫18sRNA 质粒1×10⁷拷贝/μL、1×10⁴拷贝/μL和1×10¹拷贝/μL扩增产物的溶解曲线， 3为中华泰勒虫18sRNA质粒1×10⁷拷贝/μL、1×10⁴拷贝/μL和1×10¹拷贝/ μL扩增产物的溶解曲线。

图3已知背景野外样品检测结果。1：环形泰勒虫(1-3号样品)熔解曲线；2： 大巴贝斯虫(13号样品)熔解曲线；3：东方泰勒虫(7-9号样品)熔解曲线；4： 卵形巴贝斯虫(12号样品)熔解曲线；5：双芽巴贝斯虫(11号样品)熔解曲 线；6：中华泰勒虫(4-6号样品)熔解曲线；7:东方巴贝斯虫熔解曲线(7-9号 样品)；8：牛巴贝斯虫(10号样品)熔解曲线。

图4为应用本发明的方法对样本进行分析后的结果。

具体实施方式

下面提供具体实施方案对本发明做更详细阐述。下面实施例中的实验方法， 如无特殊说明，均为常规方法。所用引物序列合成及基因测序均由南京金斯瑞 股份有限公司完成。

本发明所用引物、标准质粒和试剂如下：

(1)PCR扩增引物

SEQ ID NO.1上游引物：Bovis T-4F 5'-GGCGTTTATTAGACCTAAAACC-3'

SEQ ID NO.2下游引物：Bovis T-4R 5'-GGTCAGAAACTTGAATGATACATCG-3'

扩增产物长度为110bp

(2)标准环形泰勒虫18sRNA重组质粒(Theileria annulata，10⁵拷贝/μL)；

重组质粒序列SEQ ID NO.3为：

GGATAACCGTGCTAATTGTAGGGCTAATACATGTTCGAGGCCATTTGGCGG CGTTTATTAGACCTAAAACCAAACCGCTTGCGGTGTCCGGTGATTCATAATA AATATGCGAATCGTACTCTGTACGATGTATCATTCAAGTTTCTGACCTATCA GCTTTGGACGGTAGGGTATTGGCCTACCGGGGCAACGACGGGTAACGGGG AATTAGGGTTCGATTCCGGAGAGGGAGCCTGAGAAACGGCTACCACATCT AAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATCCTGACACAGGGAGGTA GTGACAAGAAATAACAATACGGGGCTTAAAGTCTTGTAATTGGAATGATGG GAATTTAAACCTCTTCCAGAGTATCAATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGC AGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTATATTAAAATTGTTGCAGTTAAA AAGCTCGTAGTTGAATTTCTGCTGCATTGCTTGTGTCCCTCTGGGGTCTGTG CATGTGGCTTTTTTCGGACGGAGTTTCTTTGTCTGAATGTTTACTTTGAGAA AATTAGAGTGCTCAAAGCAGGCTTTCGCCTTGAATAGTTTAGCATGGAATA ATAAAGTAGGACTTTGGTTCTATTTTGTTGGTTTTAGGTACCAAAGTAATGGTTAATAGGAACAGTTGGGGGCATTCGTATTTAACTGTCAGAGGTGAAATTC TTAGATTTGTTAAAGACGAACTACTGCGAAAGCATTTGCCAAGGATGTTTT CATTAATCAAGAACGAAAGTTAGGGGATCGAAGACGATCAGATACCGTCGT AGACCTAACCATAAACTATGCCGACTAGAGATTGGAGGTCGTCAGTTTTTA CGACTCCTTCAGCACCTTGAGAGAAATCAAAGTCTTTGGGTTCTGGGGGG AGTATGGTCGCAAGGCTGAAACTTAAAGGAATTGACGGAAGGGCACCACC AGGCGTGGAGCCTGCGGCTTAATTTGACTCAACACGGGGAAACTCACCAG GTCCAGACAAAGGAAGGATTGACAGATTGATAGCTCTTTCTTGATTCTTTG GGTGGTGGTGCATGGCCGTTCTTAGTTGGTGGAGTGATTTGTCTGGTTAAT TCCGTTAACGAACGAGACCTTAACCTGCTAAATAGGGTACGGGAATAAGTT TCTACTGTCCCGTTATCGCTTCTTAGAGGGACTTTGCGGTTATAAATCGCAA GGAAGTTTAAGGCAATAACAGGTCTGTGATGCCCTTAGATGTCC

(3)标准中华泰勒虫18sRNA重组质粒(Theileria sinensis，10⁵拷贝/μL)；

重组质粒序列SEQ ID NO.4为：

GGATAACCGTGCTAATTGTAGGGCTAATACATGTTCGAGACCTTCGGGTGG CGTTTATTAGACCTAAAACCAAACCGCTTGCGGTGCCCGGTGATTCATAAT AAACTTGCGAATCGCGGCTTTGCTGCGATGTATCATTCAAGTTTCTGACCTA TCAGCTTTGGACGGTAGGGTATTGGCCTACCGGGGCAGCGACGGGTAACG GGGAATTAGGGTTCGATTCCGGAGAGGGAGCCTGAGAAACGGCTACCACA TCTAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATCCTGACACAGGGAGG TAGTGACAAGAAATAACAATACGGGGCTTAATGTCTTGTAATTGGAATGAT GGGAATTTAAACCTCTTCCAGAGTATCAATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCA GCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTATATTAAAATTGTTGCAGTTA AAAAGCTCGTAGTTGAATTTCTGCTGCATCGTCGCATCTCTTGCTGAGTGC TTCGTTTCGGCTTATTTCGGATTGATTTTTTCTTTCCGGATGATTACTTTGAG AAAATTAGAGTGCTCAAAGCAGGCTTTTGCCTTGAATAGTTTAGCATGGAA TAATAAAGTAGGACTTTGGTTCTATTTTGTTGGTTTTAGGTACCAAAGTAATGGTTAATAGGAACAGTTGGGGGCATTCGTATTTAACTGTCAGAGGTGAAAT TCTTAGATTTGTTAAAGACGAACTACTGCGAAAGCATTTGCCAAGGATGTT TTCATTAATCAAGAACGAAAGTTAGGGGATCGAAGACGATCAGATACCGTC GTAGTCCTAACCATAAACTATGCCGACTAGAGATTGGAGGTCGTCAGTTTTT ACGACTCCTTCAGCACCTTGAGAGAAATCAAAGTCTTTGGGTTCTGGGGG GAGTATGGTCGCAAGGCTGAAACTTAAAGGAATTGACGGAAGGGCACCAC CAGGCGTGGAGCCTGCGGCTTAATTTGACTCAACACGGGGAAACTCACCA GGTCCAGACAAAGGAAGGATTGACAGATTGATAGCTCTTTCTTGATTCTTT GGGTGGTGGTGCATGGCCGTTCTTAGTTGGTGGAGTGATTTGTCTGGTTAA TTCCGTTAACGAACGAGACCTTAACCTGCTAAATAGGATGCGGGAATAGGC TTTTGCTGTCCCGTTATCGCTTCTTAGAGGGACTTTGCGGTTATAAATCGCA AGGAAGTTTAAGGCAATAACAGGTCTGTGATGCCCTTAGATGTCC

(4)标准东方泰勒虫18sRNA重组质粒(Theileria orientalis，10⁵拷贝/μL)；

重组质粒序列SEQ ID NO.5为：

GGATAACCGTGCTAATTGTAGGGCTAATACATGTTCGAGACCTTCGGGTGG CGTTTATTAGACCTAAAACCAATCCGTGCCAAACACGGTTCCCGGTGATTC ATAATAAACTTGCGAATCGCTTTACTTAGCGATGTATCATTCAAGTTTCTGA CCTATCAGCTTTGGACGGTAGGGTATTGGCCTACCGGGGCAACGACGGGTA ACGGGGAATTAGGGTTCGATTCCGGAGAGGGAGCCTGAGAAACGGCTACC ACATCTAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATCCTGACACAGGG AGGTAGTGACAAGAAATAACAATACGGGGCTTAATGTCTTGTAATTGGAAT GATGGGAATTTAAACCTCTTCCAGAGTATCAATTGGAGGGCAAGTCTGGTG CCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTATATTAAATTTGTTGCAG TTAAAAAGCTCGTAGTTGAATTTCTGCTGCATTACATTTCTCTTGTTTGAGT TTGTTATTGTGGCTTATTTCGGATTGATTTTTATCATTCCGGATGATTACTTTG AGAAAATTAGAGTGCTCAAAGCAGGCTTTTGCCTTGAATAGTTTAGCATGG AATAATAGAGTAGGACTTTGGTTCTATTTTGTTGGTTTTAGGTACCAAAGTA ATGGTTAATAGGAACAGTTGGGGGCATTCGTATTTAACTGTCAGAGGTGAA ATTCTTAGATTTGTTAAAGACGAACTACTGCGAAAGCATTTGCCAAGGATG TTTTCATTAATCAAGAACGAAAGTTAGGGGATCGAAGACGATCAGATACCG TCGTAGTCCTAACCATAAACTATGCCGACTAGAGATTGGAGGTCGTCAGTT TTTACGACTCCTTCAGCACCTTGAGAGAAATCAAAGTCTTTGGGTTCTGGG GGGAGTATGGTCGCAAGGCTGAAACTTAAAGGAATTGACGGAAGGGCACC ACCAGGCGTGGAGCCTGCGGCTTAATTTGACTCAACACGGGGAAACTCAC CAGGTCCAGACAAAGGAAGGATTGACAGATTAATAGCTCTTTCTTGATTCT TTGGGTGGTGGTGCATGGCCGTTCTTAGTTGGTGGAGTGATTTGTCTGGTT AATTCCGTTAACGAACGAGACCTTAACCTGCTAAATAGGATGCGGGAATAA ACTTTGGTTGTCCCGTTATCGCTTCTTAGAGGGACTTTGCGGTTATAAATCG CAAGGAAGTTTAAGGCAATAACAGGTCTGTGATGCCCTTAGATGTCC

(6)标准泰勒虫阴性牛基因组DNA(50ng/μL)；

(8)预混qPCRMasterMix

具体操作方法如下：

首先制备所需的质粒标准品。本发明包括环形泰勒虫、中华泰勒虫和东方泰 勒虫，共3个虫种的18sRNA基因重组质粒。

在具体应用时还需要有：预混qPCRMaster Mix(含EvaGreen荧光染料)、 标准阳性质粒模板、阴性标准品、扩增引物。反应体系包括荧光定量PCR反应 液qPCRMasterMix 10μL，正向引物和反向引物(10pmol)各0.5μL，荧光校正 液ROX Reference Dye(50×)0.4μL，标准品质粒模版1.0μL，灭菌蒸馏水7.6μL。 1、标准品的制备

环形泰勒虫、中华泰勒虫和东方泰勒虫18sRNA重组标准质粒的制备。

(1)根据三种泰勒虫18S rRNA基因序列，使用Primerpremier 5.0设计引 物，预期获得的目的片段约为1240bp，由南京金斯瑞有限公司合成。引物对序 列为：

PIRO-F140：5'-CCATGGATAACCGTGCTAATTG-3'

PIRO-R1380：5'-CATCTAAGGGCATCACAGACC-3'

(2)以实验室保存的环形泰勒虫、中华泰勒虫和东方泰勒虫基因组DNA 为模板进行扩增，PCR反应体系为：

反应条件为94℃预变性5min，然后94℃30S、55℃30S、72℃1min，35 个循环，72℃延伸7min。取5μL扩增产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定。鉴定 为阳性的PCR产物用琼脂糖凝胶回收纯化试剂盒(zymo)进行纯化回收，将回 收的DNA片段与pClone007-T载体进行连接，反应体系如下：

配制完成后置于25℃进行1h。

(3)pClone007-T连接产物的转化以及PCR鉴定

(a)-80℃的超低温冰箱中取出DH5α感受态细胞，置于冰上融化。

(b)取连接产物10μL加入100μL的DH5α感受态细胞中，冰浴30min。

(c)42℃热激90s，置冰上2min。

(d)加入不含抗生素的LB液体培养基1mL，37℃150转，培养90min。

(e)取100μL涂布于氨苄青霉素抗性的LB平皿上，37℃倒置培养过夜。

(f)从平板上挑取单克隆菌落于500μl氨苄青霉素抗性的LB液体培养基的 1.5mLEP管中，37℃220rpm振荡培养5-6小时。

(g)取1μL作为模板进行菌液PCR鉴定。将鉴定为阳性的菌液加入到5ml 的LB液体培养基中进行扩摇。

(4)鉴定为阳性的克隆提取质粒，使用NanoDrop 2000/2000C(ThermoScientific，America)超微量分光光度计测定质粒浓度，并将其换算成拷贝/μL， 以此作为质粒标准品。将构建好的质粒标准品，系列稀释为终浓度为1.0×10⁷ -1.0×10¹拷贝/μL，以便进行敏感性测试。

2、高分辨率溶解曲线方法的反应性和灵敏度测试

(1)HRM-PCR扩增时所用反应体系和反应条件

PCR反应体系为20μL：

PCR的反应条件为：95℃预变性2min；95℃变性5s；60℃退火/延伸30s； 40个循环。HRM分析：95℃60s；40℃60sec；70-85℃收集数据，温度上升 速率为0.2℃/s。

扩增所用引物序列如下：

SEQ ID NO.1上游引物：Bovis T-4F 5'-GGCGTTTATTAGACCTAAAACC-3'

SEQ ID NO.2下游引物：Bovis T-4R 5'-GGTCAGAAACTTGAATGATACATCG-3'

(2)灵敏度实验

利用上述所建立的实时荧光定量PCR方法，每个样品三个重复分别检测环 形泰勒虫、中华泰勒虫和东方泰勒虫18sRNA重组质粒。取不同稀释浓度1.0× 10⁷-1.0×10¹拷贝/μL的质粒标准品进行灵敏度试验。

PCR扩增时的反应体系为：

PCR扩增时的反应条件为：95℃预变性2min；95℃变性5s；60℃退火/延伸 30s；40个循环。

HRM分析的条件为：95℃60s；40℃60s；70-85℃收集数据，温度上升速 率为0.2℃/s。

结果参照图1，扩增曲线显示质粒浓度为1.0×10⁷拷贝/μL至1.0×10¹拷 贝/μL，均能够很好地扩增，表明该方法具有很好的扩增反应性。

分别对环形泰勒虫、中华泰勒虫和东方泰勒虫18sRNA重组质粒浓度为 1.0×10⁷拷贝/μL、1.0×10⁴拷贝/μL和1.0×10¹拷贝/μL扩增产物进行溶解曲线分 析，标准质粒溶解曲线(图2)结果显示，不同浓度的质粒扩增产物的溶解曲线 具有良好的拟合性，该方法能同时进行三种泰勒虫种的鉴别检测。

(3)HRM重复性

环形泰勒虫、中华泰勒虫和东方泰勒虫18sRNA质粒浓度为1.0×10⁷、1.0 ×10⁴和1.0×10¹拷贝/μL的标准品进行PCR扩增和溶解曲线分析。对同一批 次稀释的标准品，每个浓度重复三次。然后再进行3个不同时间的稀释的标准 品进行溶解曲线分析，反复重复该实验三次，同一虫种不同浓度质粒的溶解曲 线均能够很好地重合，说明其检测结果稳定，具有良好的重复性。

(4)HRM方法对已知样本的检测

利用建立的HRM方法对经过测序鉴定为泰勒虫阳性的基因组DNA样本进 行HRM分析，与重组阳性质粒的熔解曲线对照比较，依此确定样本中的泰勒虫 种。

数据显示14例(表1)样本中环形泰勒虫3例、中华泰勒虫3例、东方泰 勒虫3例；牛巴贝斯虫、双芽巴贝斯虫、东方巴贝斯虫、卵形巴贝斯虫、大巴 贝斯虫各1例，测序结果与本发明方法检测的结果完全一致(图3)。

序列表

<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所

<120> 一种牛泰勒虫鉴别检测的方法和试剂盒

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(上游引物：Bovis T-4F)

<400> 1

ggcgtttatt agacctaaaa cc 22

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(下游引物：Bovis T-4R)

<400> 2

ggtcagaaac ttgaatgata catcg 25

<210> 3

<211> 1268

<212> DNA

<213> 标准环形泰勒虫18sRNA重组质粒序列(环形泰勒虫Theileria annulata)

<400> 3

ggataaccgt gctaattgta gggctaatac atgttcgagg ccatttggcg gcgtttatta 60

gacctaaaac caaaccgctt gcggtgtccg gtgattcata ataaatatgc gaatcgtact 120

ctgtacgatg tatcattcaa gtttctgacc tatcagcttt ggacggtagg gtattggcct 180

accggggcaa cgacgggtaa cggggaatta gggttcgatt ccggagaggg agcctgagaa 240

acggctacca catctaagga aggcagcagg cgcgcaaatt acccaatcct gacacaggga 300

ggtagtgaca agaaataaca atacggggct taaagtcttg taattggaat gatgggaatt 360

taaacctctt ccagagtatc aattggaggg caagtctggt gccagcagcc gcggtaattc 420

cagctccaat agcgtatatt aaaattgttg cagttaaaaa gctcgtagtt gaatttctgc 480

tgcattgctt gtgtccctct ggggtctgtg catgtggctt ttttcggacg gagtttcttt 540

gtctgaatgt ttactttgag aaaattagag tgctcaaagc aggctttcgc cttgaatagt 600

ttagcatgga ataataaagt aggactttgg ttctattttg ttggttttag gtaccaaagt 660

aatggttaat aggaacagtt gggggcattc gtatttaact gtcagaggtg aaattcttag 720

atttgttaaa gacgaactac tgcgaaagca tttgccaagg atgttttcat taatcaagaa 780

cgaaagttag gggatcgaag acgatcagat accgtcgtag acctaaccat aaactatgcc 840

gactagagat tggaggtcgt cagtttttac gactccttca gcaccttgag agaaatcaaa 900

gtctttgggt tctgggggga gtatggtcgc aaggctgaaa cttaaaggaa ttgacggaag 960

ggcaccacca ggcgtggagc ctgcggctta atttgactca acacggggaa actcaccagg 1020

tccagacaaa ggaaggattg acagattgat agctctttct tgattctttg ggtggtggtg 1080

catggccgtt cttagttggt ggagtgattt gtctggttaa ttccgttaac gaacgagacc 1140

ttaacctgct aaatagggta cgggaataag tttctactgt cccgttatcg cttcttagag 1200

ggactttgcg gttataaatc gcaaggaagt ttaaggcaat aacaggtctg tgatgccctt 1260

agatgtcc 1268

<210> 4

<211> 1270

<212> DNA

<213> 标准中华泰勒虫18sRNA重组质粒序列(中华泰勒虫Theileria sinensis)

<400> 4

ggataaccgt gctaattgta gggctaatac atgttcgaga ccttcgggtg gcgtttatta 60

gacctaaaac caaaccgctt gcggtgcccg gtgattcata ataaacttgc gaatcgcggc 120

tttgctgcga tgtatcattc aagtttctga cctatcagct ttggacggta gggtattggc 180

ctaccggggc agcgacgggt aacggggaat tagggttcga ttccggagag ggagcctgag 240

aaacggctac cacatctaag gaaggcagca ggcgcgcaaa ttacccaatc ctgacacagg 300

gaggtagtga caagaaataa caatacgggg cttaatgtct tgtaattgga atgatgggaa 360

tttaaacctc ttccagagta tcaattggag ggcaagtctg gtgccagcag ccgcggtaat 420

tccagctcca atagcgtata ttaaaattgt tgcagttaaa aagctcgtag ttgaatttct 480

gctgcatcgt cgcatctctt gctgagtgct tcgtttcggc ttatttcgga ttgatttttt 540

ctttccggat gattactttg agaaaattag agtgctcaaa gcaggctttt gccttgaata 600

gtttagcatg gaataataaa gtaggacttt ggttctattt tgttggtttt aggtaccaaa 660

gtaatggtta ataggaacag ttgggggcat tcgtatttaa ctgtcagagg tgaaattctt 720

agatttgtta aagacgaact actgcgaaag catttgccaa ggatgttttc attaatcaag 780

aacgaaagtt aggggatcga agacgatcag ataccgtcgt agtcctaacc ataaactatg 840

ccgactagag attggaggtc gtcagttttt acgactcctt cagcaccttg agagaaatca 900

aagtctttgg gttctggggg gagtatggtc gcaaggctga aacttaaagg aattgacgga 960

agggcaccac caggcgtgga gcctgcggct taatttgact caacacgggg aaactcacca 1020

ggtccagaca aaggaaggat tgacagattg atagctcttt cttgattctt tgggtggtgg 1080

tgcatggccg ttcttagttg gtggagtgat ttgtctggtt aattccgtta acgaacgaga 1140

ccttaacctg ctaaatagga tgcgggaata ggcttttgct gtcccgttat cgcttcttag 1200

agggactttg cggttataaa tcgcaaggaa gtttaaggca ataacaggtc tgtgatgccc 1260

ttagatgtcc 1270

<210> 5

<211> 1275

<212> DNA

<213> 标准东方泰勒虫18sRNA重组质粒(东方泰勒虫Theileria orientalis)

<400> 5

ggataaccgt gctaattgta gggctaatac atgttcgaga ccttcgggtg gcgtttatta 60

gacctaaaac caatccgtgc caaacacggt tcccggtgat tcataataaa cttgcgaatc 120

gctttactta gcgatgtatc attcaagttt ctgacctatc agctttggac ggtagggtat 180

tggcctaccg gggcaacgac gggtaacggg gaattagggt tcgattccgg agagggagcc 240

tgagaaacgg ctaccacatc taaggaaggc agcaggcgcg caaattaccc aatcctgaca 300

cagggaggta gtgacaagaa ataacaatac ggggcttaat gtcttgtaat tggaatgatg 360

ggaatttaaa cctcttccag agtatcaatt ggagggcaag tctggtgcca gcagccgcgg 420

taattccagc tccaatagcg tatattaaat ttgttgcagt taaaaagctc gtagttgaat 480

ttctgctgca ttacatttct cttgtttgag tttgttattg tggcttattt cggattgatt 540

tttatcattc cggatgatta ctttgagaaa attagagtgc tcaaagcagg cttttgcctt 600

gaatagttta gcatggaata atagagtagg actttggttc tattttgttg gttttaggta 660

ccaaagtaat ggttaatagg aacagttggg ggcattcgta tttaactgtc agaggtgaaa 720

ttcttagatt tgttaaagac gaactactgc gaaagcattt gccaaggatg ttttcattaa 780

tcaagaacga aagttagggg atcgaagacg atcagatacc gtcgtagtcc taaccataaa 840

ctatgccgac tagagattgg aggtcgtcag tttttacgac tccttcagca ccttgagaga 900

aatcaaagtc tttgggttct ggggggagta tggtcgcaag gctgaaactt aaaggaattg 960

acggaagggc accaccaggc gtggagcctg cggcttaatt tgactcaaca cggggaaact 1020

caccaggtcc agacaaagga aggattgaca gattaatagc tctttcttga ttctttgggt 1080

ggtggtgcat ggccgttctt agttggtgga gtgatttgtc tggttaattc cgttaacgaa 1140

cgagacctta acctgctaaa taggatgcgg gaataaactt tggttgtccc gttatcgctt 1200

cttagaggga ctttgcggtt ataaatcgca aggaagttta aggcaataac aggtctgtga 1260

tgcccttaga tgtcc 1275

Claims (4)

1.一种鉴别检测牛泰勒虫试剂盒，其特征在于检测试剂盒中包括有两条扩增引物SEQID NO.1和SEQ ID NO.2。

2.根据权利要求1所述的一种鉴别检测牛泰勒虫试剂盒，其特征在于检测试剂盒中含有EvaGreen荧光染料的qPCRMasterMix预混反应液。

3.根据权利1或2所述的一种鉴别检测牛泰勒虫试剂盒，其特征是试剂盒中还有标准阳性质粒模板、阴性标准品。

4.非疾病检测牛泰勒虫检测方法，其特征在于提取将待检测样品的DNA，再将所得到的待检DNA用权利要求1至3所述试剂盒中的扩增引物连同标准质粒同时进行扩增，再将扩增产物进行高分辨率溶解曲线分析，将所得到的待检样品的高分辨率溶解曲线与标准泰勒虫熔解曲线进行对比，得到待检样品是否感染及感染何种泰勒虫。