CN110157837A

CN110157837A - 一种检测小反刍兽疫病毒和蓝舌病病毒的引物及方法

Info

Publication number: CN110157837A
Application number: CN201810335578.0A
Authority: CN
Inventors: 谢芝勋; 范晴; 谢志勤; 熊文婕; 黄娇玲; 张艳芳; 曾婷婷; 谢丽基
Original assignee: Guangxi Veterinary Research Institute
Current assignee: Guangxi Veterinary Research Institute
Priority date: 2018-04-16
Filing date: 2018-04-16
Publication date: 2019-08-23
Anticipated expiration: 2038-04-16
Also published as: CN110157837B

Abstract

本发明提供了一种检测小反刍兽疫病毒和蓝舌病病毒的引物及方法。本发明设计筛选出的引物组合，最终首次成功实现了在同一个反应管里，通过多重荧光RT‑LAMP检测方法，简单、快速和准确的鉴别出小反刍兽疫病毒(PPRV)和蓝舌病病毒(BTV)。本发明提供的用于检测小反刍兽疫病毒(PPRV)和蓝舌病病毒(BTV)的多重荧光RT‑LAMP引物及方法，特异性好、敏感性高、干扰性小，最低能检测到100个混合模板拷贝/反应，并能有效抑制假阳性结果。本发明提供的引物及方法，通过荧光基团所显示颜色的不同直观准确的判断结果，并只需一台水浴锅即可完扩增,成本低廉，操作方便，是一种简便，快速，低成本的诊断方法，适用于BTV和PPRV的大规模流行病学调查。

Description

一种检测小反刍兽疫病毒和蓝舌病病毒的引物及方法

技术领域

本发明属于病毒检测技术领域，具体涉及一种检测小反刍兽疫病毒和蓝舌病病毒的引物及方法

背景技术

小反刍兽疫和蓝舌病是两种重要的反刍动物急性传染病。小反刍兽疫是由副粘病毒科(paramyxoviridae)麻疹病毒属(morbillivirus)小反刍兽疫病毒(Peste despetitsruminants，PPRV)引起，可通过接触传染，主要感染山羊、绵羊、鹿等小反刍兽，其发病率可高达90％～100％，病死率严重情况下能达到50％～100％。PPRV只有1个血清型，根据基因进化树将该病毒分为4个系(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ)。2007年在中国西藏首次发现PPRV疫情，2014年PPRV再次掀起，疫情已蔓延近20多个省份，给我国畜牧业造成了巨大的经济损失。蓝舌病是由呼肠孤病毒科(reoviridae)环状病毒属(orbivirus)蓝舌病病毒(Bluetonguevirus，BTV)引起，可通过库蠓等昆虫染感宿主，蓝舌病的发病率为50％-75％，病死率为20-50％。目前已知BTV有27个血清型，随着各国疫情的频繁暴发，新血清型还在不断出现，给该病的防控造成巨大的困难。两种病均对羊易感，表现出体温升高，口鼻黏膜充血，乳头和蹄部冠状带等处发生水泡及溃疡，且在临床上存在混合感染，仅凭临床症状不易区分，必须借助实验室手段进行鉴别诊断。蓝舌病和小反刍兽疫已被OIE列为多种动物共患病，我国农业部将其规定为Ⅰ类动物传染病，是国内动物防疫和出入境检疫检验机构监测和防控的重点，需要采取紧急严厉的强制预防、控制和扑灭措施，准确地鉴别诊断是其防控的首要环节。

目前，可用于检测蓝舌病和小反刍兽疫的方法包括病毒分离鉴定、免疫琼脂扩散、ELISA、RT-PCR、LAMP等，其中LAMP是2000年Notomi等人开发出的一种新型核酸扩增方法，恒温扩增，操作简便，反应快速，成本低，已广泛应用在疾病诊断和基因筛选上。近几年来，LAMP以其方便快速的优势受到广泛学者的关注，但也由于其技术的局限，多重LAMP方法一直未有较大进展。与PCR特异性目的条带不同，LAMP产物电泳呈梯状条带；LAMP检测无论是单重还是多重，其沉淀物和颜色变化，阳性结果呈现的方式都是一样，不能确定具体到底是哪一种病原反应所引起的结果，所以进行多重区分比较困难。

小反刍兽疫和蓝舌病，两种病症状相似，难以区分，临床上很容易误诊，目前，蓝舌病和小反刍兽疫在我国传播快、跨度大、风险高、形势严峻，且两种病尚无有效治疗药物，只能依靠疫苗进行预防。因此急需了解蓝舌病和小反刍兽疫的流行情况，为我国蓝舌病和小反刍兽疫防控方案的制定提供依据。

因此，急需开发一种快速、准确、简便、成本低廉的鉴别检测PPRV和BTV的相关产品和方法，为蓝舌病和小反刍兽疫的防治和大规模的流行病学调查提供技术保障。

发明内容

本发明提供了一种检测小反刍兽疫病毒(PPRV)和蓝舌病病毒(BTV)的相关产品和方法，能满足临床上快速、准确、简便的检测诊断这两种病毒，且成本低廉，为蓝舌病和小反刍兽疫的防治和大规模的流行病学调查提供技术保障。

本发明的一个目的是提供一种可同时检测小反刍兽疫病毒和蓝舌病病毒的方法，所述方法包括：进行环介导等温扩增反应，其中，用于检测小反刍兽疫病毒的引物序列中的至少一条序列和用于检测蓝舌病病毒的引物序列中的至少一条序列，分别用不同颜色的荧光基团进行标记。

具体的，所述方法不包括专利法第二十五条所述的疾病的诊断和治疗方法。

具体的，所述方法包括下述1)-7)中的至少一种：

1)所述荧光基团标记在环介导等温扩增反应中的内引物FIP的5’端；

2)用于检测蓝舌病病毒的引物序列根据蓝舌病病毒的NS3基因序列设计；

3)用于检测小反刍兽疫病毒的引物序列根据小反刍兽疫病毒的N基因序列设计；

4)所述环介导等温扩增反应，参与所述反应的引物共2套：一套为根据蓝舌病病毒的NS3基因序列设计的外引物F3和B3，内引物FIP和BIP；另一套为根据小反刍兽疫病毒的N基因序列设计的外引物F3和B3，内引物FIP和BIP；

5)所述环介导等温扩增反应，其中所述反应的反应体系包括，每25μL反应体系中包括10×缓冲液2.5μL，15U Bst DNA聚合酶，20U AMV逆转录酶，内引物各40pmol，外引物各5pmol，1μL模板；

具体的，所述10×缓冲液的成分为：pH8.8的200MmTris–HCl，100mMKCl，80mMMgSO₄，100mM(NH₄)₂SO₄，1％Tween20，8Mbetain，14mM dNTPs，其中1％为体积百分数；

6)所述环介导等温扩增反应，其中所述反应的反应过程包括58-68℃反应115分钟；

具体的，所述反应的反应过程包括62℃反应115分钟；

7)所述环介导等温扩增反应，其中所述反应的反应过程还包括终止反应，所述终止反应包括80℃作用5分钟。

具体的，所述环介导等温扩增反应，参与所述反应的引物包括下述1)-8)中的至少一种：

1)序列表中SEQ ID №：1所示核苷酸序列；或将序列表中SEQ ID №：1所示核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列表中SEQ ID №：1所示核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列；

2)序列表中SEQ ID №：2所示核苷酸序列；或将序列表中SEQ ID №：2所示核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列表中SEQ ID №：2所示核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列；

3)序列表中SEQ ID №：3所示核苷酸序列；或将序列表中SEQ ID №：3所示核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列表中SEQ ID №：3所示核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列；

4)序列表中SEQ ID №：4所示核苷酸序列；或将序列表中SEQ ID №：4所示核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列表中SEQ ID №：4所示核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列；

5)序列表中SEQ ID №：5所示核苷酸序列；或将序列表中SEQ ID №：5所示核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列表中SEQ ID №：5所示核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列；

6)序列表中SEQ ID №：6所示核苷酸序列；或将序列表中SEQ ID №：6所示核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列表中SEQ ID №：6所示核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列；

7)序列表中SEQ ID №：7所示核苷酸序列；或将序列表中SEQ ID №：7所示核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列表中SEQ ID №：7所示核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列；

8)序列表中SEQ ID №：8所示核苷酸序列；或将序列表中SEQ ID №：8所示核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列表中SEQ ID №：8所示核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列。

所述相同功能具体为可用于检测或特异性扩增小反刍兽疫病毒PPRV和/或蓝舌病病毒BTV。

具体的，所述序列表中SEQ ID №：3所示核苷酸序列和/或SEQ ID №：7所示核苷酸序列的5’端标记有荧光基团。

具体的，所述序列表中SEQ ID №：3所示核苷酸序列的5’端标记有FAM荧光基团和/或SEQ ID №：7所示核苷酸序列的5’端标记有CY5荧光基团。

本发明的另一个目的是提供一种引物组合物，所述引物组合物包括下述1)-8)中的至少一种：

本发明的还一个目的是提供一种试剂盒，所述试剂盒包括本发明任一所述的引物组合物。

本发明的再一个目的是提供本发明任一所述方法、本发明任一所述引物组合物、本发明所述试剂盒的应用。

具体的，所述应用包括在下述1)-6)中的至少一种中的应用：

1)鉴别小反刍兽疫病毒PPRV和/或蓝舌病病毒BTV；

2)制备用于鉴别小反刍兽疫病毒PPRV和/或蓝舌病病毒BTV的试剂盒或相关产品；

3)检测待测病原微生物是否为小反刍兽疫病毒PPRV和/或蓝舌病病毒BTV；

4)制备用于检测待测病原微生物是否为小反刍兽疫病毒PPRV和/或蓝舌病病毒BTV的试剂盒或相关产品；

5)检测待测样本中是否含有小反刍兽疫病毒PPRV和/或蓝舌病病毒BTV；

6)制备用于检测待测样本中是否含有小反刍兽疫病毒PPRV和/或蓝舌病病毒BTV的试剂盒或相关产品。

所述任一应用不包括专利法第二十五条所述的疾病的诊断和治疗方法。

本发明的有益效果包括：

本发明设计了多套引物，优化筛选特异性引物组合，最终首次成功实现了在同一个反应管里，通过多重荧光RT-LAMP检测方法，简单、快速和准确的鉴别出小反刍兽疫病毒(PPRV)和蓝舌病病毒(BTV)。

本发明建立的用于检测小反刍兽疫病毒(PPRV)和蓝舌病病毒(BTV)的多重荧光RT-LAMP引物及方法，特异性好，能高效扩增目的基因，而对其它病原核酸无扩增；敏感性好，最低能检测到100个混合模板拷贝/反应；能有效抑制假阳性结果：由于荧光基团镶嵌在内引物FIP上，扩增过程中比普通引物更需要消耗能量，引物与模板DNA分子碰撞要求高，可以有效抑制假阳性；结果读取方便、准确：本发明使用了两种新型荧光基团，FAM和CY5,这两种荧光基团的激发光和吸收光均不同，因此可呈现不同的颜色，FAM吸收波为520nm，呈黄绿色，CY5吸收波为670nm，呈大红色，不同的荧光基团，仅能在特定的通道下观察到，通过荧光基团所显示颜色的不同判断结果，能准确判断病原，这比仅凭沉淀物观察、加染料肉眼观察颜色变化等方式更准确，是第一次真正意义上实现了PPRV和BTV的多重LAMP鉴别检测。

本发明建立的用于检测小反刍兽疫病毒(PPRV)和蓝舌病病毒(BTV)的多重荧光RT-LAMP方法，一次可以检测两种病原，并继承了LAMP的优点：不需要昂贵的仪器设备，成本低廉，操作方便，只需一台水浴锅即可完扩增,非常适合现场基层检疫。临床使用中若只需要检测阳性不合格样品，不需要区分这两种病原，可以使用加染料后，凭肉眼观察颜色变化的方法判断结果。

综上所述，本发明所建立的BTV和PPRV多重荧光RT-LAMP检测引物及方法是一种简便，快速，低成本的诊断方法，适用于BTV和PPRV的大规模流行病学调查。

附图说明

图1为多重荧光RT-LAMP特异性实验结果图，其中A为670荧光通道下电泳图，图中的条带均为大红色；B为520荧光通道下电泳图，图中条带的颜色均为黄绿色；C为670和520双通道下电泳图，图中条带均为大红色和黄绿色的混合色；图1A-图1C中的1～13依次代表不同毒株的扩增结果，具体的：1:PPRV,2:BTV,3:PPRV+BTV,4～13分别依次为:FMDV,VSV,BVDV,IBRV,EHDV,MV,RPV,GTPV，SPPV,阴性对照。

图2为多重荧光RT-LAMP敏感性实验结果图，其中A为浊度扩增曲线图；B为670荧光通道下电泳图，图中的条带均为大红色；C为670和520双通道下电泳图，图中条带均为大红色和黄绿色的混合色；D为520荧光通道下电泳图，图中条带的颜色均为黄绿色；图2A-图2D中的1～8依次代表10⁷～10⁰拷贝/μl的反转录RNA标准品(含等量PPRVN基因RNA和BTVNS3基因RNA)的扩增结果，9代表阴性对照的扩增结果。

图3为多重荧光RT-LAMP干扰性试验结果图，其中A为520荧光通道下电泳图，图中条带的颜色均为黄绿色；B为670荧光通道下电泳图，图中的条带均为大红色；C为670和520双通道下电泳图，图中条带均为大红色和黄绿色的混合色；图3A-图3C中的1～6依次代表样品1～样品6的扩增结果，样品1：PPRV(10⁸copies/μL)+BTV(10⁴copies/μL)，样品2：PPRV(10⁴copies/μL)+BTV(10⁸copies/μL)，样品3：PPRV(10⁷copies/μL)+BTV(10³copies/μL)，样品4：PPRV(10⁴copies/μL)+BTV(10⁷copies/μL)，样品5：PPRV(10⁶copies/μL)+BTV(10²copies/μL)，样品6：PPRV(10²copies/μL)+BTV(10⁶copies/μL)。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

具体的，下述实施例中所用的LAMP RNA扩增试剂盒，Loopamp LA-320C实时浊度仪购自日本荣研公司；RNA/DNA抽提试剂盒，质粒小量提取试剂盒购自全式金公司；premixTaqPCR试剂盒购自大连宝生物公司；pGM-T载体购自天根公司；T7体外转录试剂盒购自Fermentas公司；BstDNA聚合酶购自new England公司；NanoDrop 2000核酸测定仪购自美国ThermoFisher Scientific公司；多色荧光成像分析系统购自美国BIO-RAD公司。

下述实施例及其具体说明用于解释和理解本发明，并不构成对本发明的不当限定。

实施例1、一种同时检测BTV和PPRV的多重荧光RT-LAMP方法的建立

(一)引物设计

下载Genebank上已登录的BTV的NS3基因和PPRV的N基因序列，用MEGA5.0进行比对分析，利用primer premier5.0和Primer explore V4设计2套LAMP特异性引物。每套引物针对6个位点，包括4条引物：外引物F3和B3，内引物FIP(FIP＝F1c+F2)和BIP(BIP＝B1c+B2)，两条内引物的5’端分别标记不同的荧光基团，PPRV-FIP标记FAM荧光，在520nm波长下显黄绿色，BTV-FIP标记CY5荧光，在670nm波长下呈大红色。引物由大连宝生物公司合成,HPLC级纯化。引物的具体核苷酸序列如表1所示。

表1

表1中，引物PPRV-F3、PPRV-B3、PPRV-FIP、PPRV-BIP、BTV-F3、BTV-B3、BTV-FIP、BTV-BIP的核苷酸序列分别依次为序列表中SEQ ID №：1-SEQ ID №：8所示的核苷酸序列；其中，引物PPRV-FIP在序列表中SEQ ID №：3所示的核苷酸序列的5’端标记了荧光基团FAM；引物BTV-FIP在序列表中SEQ ID №：7所示的核苷酸序列的5’端标记了荧光基团CY5。

(二)模板制备

取250μL待测物、病毒细胞培养物或病料处理液参照全式金DNA/RNA试剂盒说明书，提取样品总RNA/DNA，即得提取的核酸模板，将提取的核酸模板置-70℃保存，备用。

(三)RT-LAMP反应体系

每25μL反应体系包括：10×buffer2.5μL，15U of Bst DNA聚合酶，20U AMV逆转录酶，内引物PPRV-FIP，PPRV-BIP，BTV-FIP,BTV-BIP各40pmol，外引物PPRV-F3，PPRV-B3，BTV-F3，BTV-P3各5pmol，1μL提取的核酸模板。其中10×buffer的成分为200MmTris–HCl(pH8.8)，100mMKCl，80mMMgSO₄，100mM(NH₄)₂SO₄，1％Tween20，8Mbetaine，and14mM dNTPs；其中1％为体积百分数。

(四)反应过程

将步骤(三)反应体系的各组份混合均匀，置恒温仪或水浴62℃(或58-68℃范围内均可)反应115分钟，80℃作用5min终止反应。

(五)结果检测

电泳：由于LAMP反应产物是长度不等的DNA片断的混合物，呈现大量梯状条带，Marker对这些片断的指示无意义，考虑成本原因，多重荧光RT-LAMP电泳时不需要使用Marker。

电泳结果通过荧光检测仪的520荧光通道、670nm荧光通道或520/670nm双通道检测结果。

若临床检测中只需要检测阳性不合格样品不需要区分BTV和PPRV这两种病原，可以使用加染料后，凭肉眼观察颜色变化的方法判断结果。染料我们推荐使用钙黄绿素为指示剂，将300μM氯化锰与25μM钙黄绿素按1：10混匀为荧光染料工作液，每个反应管取1μL荧光染料工作液加入反应试剂一起反应，避免开盖污染。

实施例2、方法的验证实验

(一)特异性实验

为了评估实施例1所建立的多重荧光RT-LAMP方法的特异性，利用实施例1所述的多重荧光RT-LAMP反应体系和反应过程对表2中常见羊病毒病的毒株进行扩增，实验结果如表2和图1所示。

表2和图1实验结果表明，实施例1所提供的多重荧光RT-LAMP引物和方法仅扩增BTV和PPRV核酸，对FMDV，VSV，BVDV，MV，IBRV，EHDV，RPV，GTPV，SPPV检测结果均为阴性，该结果表明实施例1所提供的多重荧光RT-LAMP引物和方法特异性好。

表2

GVRI:广西兽医研究所；YNCIQ：云南出入境检疫检测局；CVCC:中国兽药监察所

表2中的蓝舌病广西分离株(1型，16型)由广西兽医研究所分离获得；蓝舌病灭活病毒(4型，8型，9型，15型，17型，18型)，小反刍兽疫灭活病毒，口蹄疫(FMDV)灭活病毒(O型、A型、AsiaⅠ型)，水泡性口炎(VSV)灭活病毒(NJ型，IND型)，鹿流行性出血热(EHDV)灭活病毒，麻疹(MV)灭活病毒由云南出入境惠赠；牛瘟病毒(RPV)，牛病毒性腹泻病毒(BVDV)，牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)，山羊痘病毒(GTPV)，绵羊痘病毒(SPPV)购自中国兽医药品监察所。

(二)灵敏度实验

标准品的制备

将外引物(PPRV-F3和PPRV-F3,BTV-F3和BTV-B3)PCR产物克隆到pGM-T载体，构建pGM-T-PPRV和pGM-T-BTV重组质粒，用试剂盒提取阳性重组质粒，参照T7体外转录试剂盒说明书将重组质粒体外转录为RNA。NanoDrop 2000核酸测定仪测定体外转录RNA的浓度，根据阿弗加德罗常数将浓度转换为拷贝数，-70℃保存备用。拷贝数(copies/μL)＝质粒浓度(g/μL)×10^-9×6.02×10²³/660×3100(质粒总长度)。将计算好拷贝数的体外反转录RNA作10倍梯度稀释，浓度为1×10⁸～1拷贝/μL，再将同浓度的两种体外反转录RNA等体积混合，制备成标准品。

上述体外反转录RNA标准品(含等量PPRVN基因RNA和BTVNS3基因RNA)浓度为1×10⁷～1拷贝/μL，共8个梯度，每个浓度取1μL作为模板，利用实施例1所述的多重荧光RT-LAMP反应体系和反应过程进行反应。

敏感性实验结果见图2A。将多重荧光RT-LAMP产物进行2％琼脂糖电泳，结果见图2B、图2C、图2D，特异性目的条带亮度随模板拷贝数梯度的降低而下降。结果表明多重荧光RT-LAMP检测体系的灵敏度可达100拷贝/μL，该方法灵敏度高。

(三)干扰性实验

将上述(二)中制备的PPRV和BTV体外反转录RNA标准样品按不同浓度进行组合，制备不同浓度模拟混合感染样品：样品1：PPRV(10⁸copies/μL)+BTV(10⁴copies/μL)，样品2：PPRV(10⁴copies/μL)+BTV(10⁸copies/μL)，样品3：PPRV(10⁷copies/μL)+BTV(10³copies/μL)，样品4：PPRV(10⁴copies/μL)+BTV(10⁷copies/μL)，样品5：PPRV(10⁶copies/μL)+BTV(10²copies/μL)，样品6：PPRV(10²copies/μL)+BTV(10⁶copies/μL)，利用实施例1所述的多重荧光RT-LAMP反应体系和反应过程进行反应，测试高浓度模板是否会抑制低浓度模板的扩增。

结果如图3所示，对不同浓度模拟混合感染样品的检测发现，当一个模板浓度高而另一个模板浓度较低时，多重荧光RT-LAMP仍然可同时检测到两个模板，不影响彼此扩增效率，干扰性小。

(四)临床样品的检测

从广西各地羊场采集样品168份：抗凝血84份，眼分泌物30份，鼻黏液42份，组织样品12份(淋巴结6份，脾脏6份)。其中组织样品采集自6头疑似BTV,表现典型病症的山羊：流鼻涕、口唇水肿，舌发绀，口腔黏膜和鼻腔黏膜存在出血、糜烂，解剖发现脾脏肿大，出血，淋巴结发生水肿。抗凝血离心收集血细胞，抽提样品RNA；眼拭子和鼻黏液拭子用双蒸馏水洗脱，抽提样品RNA；组织样品加PBS研磨后离心取上清，抽提样品RNA。用实施例1所建立的多重荧光RT-LAMP方法对抽提好的RNA进行检测，同时用OIE推荐的BTV荧光RT-PCR和PPRV荧光RT-PCR进行检测,并测序所有阳性样品荧光RT-PCR产物，评估多重荧光RT-LAMP的临床检测效果。

用实施例1所建立的多重荧光RT-LAMP检测方法对168份临床样品进行检测，实验结果见表3，小反刍兽疫阳性样品6份，感染率为3.6％，蓝舌病阳性样品22份的感染率为13.1％；未检测到小反刍兽疫和蓝舌病混合感染样品，混合感染率为0％。

与OIE推荐的单重荧光RT-PCR方法比较，实施例1建立的多重荧光RT-LAMP检测BTV的敏感性和特异性分别为91.7％(22/24)，100％(144/144)，检测PPRV的敏感性和特异性分别为100％(6/6)、100％(162/162)。与OIE推荐的单重荧光RT-PCR方法比较，实施例1建立的多重荧光RT-LAMP漏检2个BTV阳性样品。漏检的2个BTV样品荧光CT值也较高，起峰较晚，说明其病毒含量较低。测序结果表明，漏检的2个样品确实为BTV阳性样品。说明多重荧光RT-LAMP敏感性较荧光RT-CPR微低。但多重荧光RT-LAMP比单重荧光RT-PCR成本低，一次可以检测两种病原，不需要昂贵的仪器设备，操作方便，只需一台水浴锅即可完扩增,非常适合现场基层检疫。

所有阳性样品荧光RT-PCR产物测序结果显示，所有样品均为对应病毒，无假阳性结果。该实验结果表明实施例1建立的多重荧光RT-LAMP方法临床检测效果好。

表3

以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制，但凡采用等同替换或等效变换的形式所获得的技术方案，均应落在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 广西壮族自治区兽医研究所

<120> 一种检测小反刍兽疫病毒和蓝舌病病毒的引物及方法

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

caagtttagt gcaggagcct 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cctctgctgt gataccaagc 20

<210> 3

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ccaaagttca ggccccccat tgcctctcct ctggagctat gc 42

<210> 4

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cggcctattt ccgtctcgga cagccgcgat tacagagct 39

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gttgcccttg aaatattgga taaag 25

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gtcatgtgta tgatagctct ctttt 25

<210> 7

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cgtacgatgc gaatgcagct tgtcaaacac tactggtgct acgc 44

<210> 8

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gaagcgtttc gtgatgatgt gagatctgtt cattaacatg acgttt 46

Claims

1.一种可同时检测小反刍兽疫病毒和蓝舌病病毒的方法，其特征在于，所述方法包括：进行环介导等温扩增反应，其中，用于检测小反刍兽疫病毒的引物序列中的至少一条序列和用于检测蓝舌病病毒的引物序列中的至少一条序列，分别用不同颜色的荧光基团进行标记。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括下述1)-7)中的至少一种：

3.根据权利要求1和/或2所述的方法，其特征在于，所述环介导等温扩增反应，参与所述反应的引物包括下述1)-8)中的至少一种：

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述序列表中SEQ ID №：3所示核苷酸序列和/或SEQ ID №：7所示核苷酸序列的5’端标记有荧光基团。

5.根据权利要求3和/或4任一所述的方法，其特征在于，所述序列表中SEQ ID №：3所示核苷酸序列的5’端标记有FAM荧光基团和/或SEQ ID №：7所示核苷酸序列的5’端标记有CY5荧光基团。

6.一种引物组合物，其特征在于，所述引物组合物包括下述1)-8)中的至少一种：

7.根据权利要求6所述的引物组合物，其特征在于，所述序列表中SEQ ID №：3所示核苷酸序列和/或SEQ ID №：7所示核苷酸序列的5’端标记有荧光基团。

8.根据权利要求6和/或7任一所述的引物组合物，其特征在于，所述序列表中SEQ ID№：3所示核苷酸序列的5’端标记有FAM荧光基团和/或SEQ ID №：7所示核苷酸序列的5’端标记有CY5荧光基团。

9.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求6、7和/或8任一所述的引物组合物。

10.权利要求1、2、3、4和/或5任一所述方法、权利要求6、7和/或8任一所述引物组合物、权利要求9所述试剂盒的应用。