CN115572774A

CN115572774A - 一种鉴定三种鸡群新发传染病病毒的方法

Info

Publication number: CN115572774A
Application number: CN202210025967.XA
Authority: CN
Inventors: 谢芝勋; 范晴; 李小凤; 谢志勤; 谢丽基; 黄娇玲; 张艳芳; 曾婷婷; 王盛; 罗思思; 李孟; 李丹
Original assignee: Guangxi Veterinary Research Institute
Current assignee: Guangxi Veterinary Research Institute
Priority date: 2022-01-11
Filing date: 2022-01-11
Publication date: 2023-01-06

Abstract

本发明公开了一种同时鉴定鸡细小病毒、鸡传染性贫血病毒(CIAV)和禽腺病毒血清4型(FADV4)这三种病毒的LAMP引物和探针组合、试剂盒及检测方法，包括三种病毒对应的3套引物组、3种不同颜色的探针，检测反应过程仅包括等温扩增和终止，最终在同一个反应管中完成三重荧光LAMP反应，反应后根据三种探针的不同颜色鉴别诊断出三种病毒，最低能检测到1copy/μL病毒DNA，整个检测过程简便、快速、无需使用昂贵仪器、成本低，特异性和敏感性高、干扰性小，能够实现现场病原检测，适用于鸡群的大规模诊断筛查。

Description

一种鉴定三种鸡群新发传染病病毒的方法

技术领域

本发明涉及兽用生物制品技术领域，特别涉及一种同时可以鉴定鸡细小病毒，鸡传染性贫血病毒和禽腺病毒血清4型这三种病毒的可视化的方法，尤其是一种三重荧光的LAMP联合鉴定的方法。

背景技术

鸡细小病毒(Chicken parvovirus，CHPV)，鸡传染性贫血病毒(Chickeninfectious anaemia virus,CIAV)和禽腺病毒血清4型(Fowl Aviadenovirus Serotype4,FADV4)是近年来造成鸡群新发传染病的常见的三种病毒，这三种病毒的共性是DNA病毒，主要感染35日龄以下雏鸡，经常混合感染，还会出现各种并发症，是引起家禽养殖的传染病传播的主要病原体。CHPV主要引起禽肠炎综合症和发育障碍与矮小综合症，以腹泻、精神沉郁、体温调节障碍、生长迟缓、饲料消耗增加为临床特征，研究表明该病在我国鸡群中普遍存在，感染率高达38.9％～88.1％，商品肉鸡的感染率较高，种鸡和蛋鸡次之。CIAV可引起鸡全身淋巴组织萎缩，特别是骨髓造血组织和淋巴组织萎缩，导致免疫抑制，临床症状为生长迟缓、贫血、骨髓再生障碍、胸腺萎缩等。不同年龄的鸡均可感染CIAV，但临床症状主要出现在10～14日龄。CIAV在全球范围内流行，我国鸡CIAV抗体阳性率高达70％，该病既可垂直传播也可水平传播，临床上呈典型或隐性感染，继发感染其它病原体导致鸡群死亡。FADV4主要引起心包积水－包涵体肝炎综合病，发病迅速、死亡率高，近年来我国禽腺病毒血清4型感染连续暴发，对我国家禽养殖造成了巨大影响。

目前三种实验室病毒鉴定的方法主要依靠传统的病毒分离、琼脂扩散试验、ELISA，以及现在常用的DNA序列测定技术、PCR检测等，这些方法或是耗时、费力、敏感性低，或是依赖专门的仪器、成本较高、或是只能做单一病毒鉴定，最多2种病毒联检等弊端。近年来,这种三种病毒的混合感染在我国的发病率呈上升趋势,对养鸡业造成了很大的经济损失。因此，急需建立快速、准确、联合的诊断方法，保障养禽业的健康发展。

环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,以下简称LAMP)技术是反应混合物在等温(58-67℃)条件下进行扩增，具有快速、简便和敏感的特性，但也由于其自身技术上的局限，全球多重LAMP方法一直未有较大的进展，无论是单重还是多重，阳性结果的荧光颜色和沉淀物颜色都一样，不能确定具体到底是由哪一种阳性反应所引起的结果，因此进行多重区分比较困难。此外，多重荧光受限于现有的荧光成像分析系统固定范围内的波长、荧光淬灭复合探针对反应的抑制、增加的引物和探针争夺反应体系，因此，还没有关于LAMP技术同时鉴定三种病原体的三重荧光LAMP检测产品或方法的相关报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种同时鉴定鸡细小病毒(CHPV)、鸡传染性贫血病毒(CIAV)和禽腺病毒血清4型(FADV4)这三种病毒的三重荧光LAMP检测方法。

为达到上述目的，本发明要求保护一种引物和探针组合物，包括3套引物和探针，分别为：根据鸡细小病毒的NS基因序列设计的外引物CHPV-F3和CHPV-B3、内引物CHPV-FIP和CHPV-BIP、环引物CHPV-Floop和CHPV-Bloop及探针CHPV-FD和CHPV-BD,其核苷酸序列依次为序列表中SEQ ID NO:1-8所示；根据鸡传染性贫血病毒的VP1基因序列设计的外引物CIAV-F3和CIAV-B3、内引物CIAV-FIP和CIAV-BIP、环引物CIAV-Floop和CIAV-Bloop及探针CIAV-FD和CIAV-BD,其核苷酸序列依次为序列表中SEQ ID NO:9-16所示；根据禽腺病毒血清4型的Hexon基因序列设计的外引物FADV4-F3和FADV4-B3、内引物FADV4-FIP和FADV4-BIP、环引物FADV4-Floop和FADV4-Bloop及探针FADV4-FD和FADV4-BD,其核苷酸序列依次为序列表中SEQ ID NO:17-24所示。

本发明要求保护的引物和探针组合物，其中的3套引物和探针，与对应SEQ ID NO:1-24所示的序列相比,分别具有不超过5个核苷酸的置换、缺失或添加，或者分别具有80％-99.99％的序列同一性，且与SEQ ID No:1-24的序列具有相同功能。

本发明要求保护的引物和探针组合物，其中的内引物CHPV-FIP和CHPV-BIP、CIAV-FIP和CIAV-BIP及FADV4-FIP和FADV4-BIP序列的5’端标记有淬灭基团，探针CHPV-FD和CHPV-BD、CIAV-FD和CIAV-BD及FADV4-FD和FADV4-BD序列的3’端标记荧光基团。

本发明要求保护的引物和探针组合物，其中的淬灭基团为BHQ系列荧光淬灭基团，荧光基团为Alexa Fluor 488、Cy5和CY3。

本发明要求保护的引物和探针组合物，其中的内引物CHPV-FIP、CHPV-BIP、CIAV-FIP、CIAV-BIP、FADV4-FIP、FADV4-BIP和对应探针CHPV-FD、CHPV-BD、CIAV-FD、CIAV-BD、FADV4-FD、FADV4-BD的核苷酸序列拥有互补配对的区域，退火后配对结合形成不发光的荧光淬灭复合探针CHPV-FIP-FD、CHPV-BIP-BD、CIAV-FIP-FD、CIAV-BIP-BD、FADV4-FIP-FD、FADV4-BIP-BD。

本发明要求保护一种鉴定三种鸡群新发传染病病毒的方法，包含参与反应的3套引物的引物和探针组合物；还包括：①制备荧光淬灭退火复合探针：多重RT-LAMP反应前，将50μM FIP与50μM FD、50μM BIP与50μM BD分别混合，加热至98℃5分钟，慢慢冷却到室温完成退火，-20℃备用，按照上述方法，分别得到CHPV、CIAV和FADV4对应的FIP-FD和BIP-BD退火复合探针；②制备反应体系：制备20μL多重RT-LAMP反应体系，包括模板1μL、10μLWarmStart 2×预混液、16U Bst 2.0WarmStart DNA聚合酶、0.66μM CHPV-FIP、0.66μMCIAV-FIP、0.66μM FADV4-FIP、0.66μM CHPV-FIP-FD退火复合探针、0.66μM CIAV-FIP-FD退火复合探针、0.66μM FADV4-FIP-FD退火复合探针、0.66μM CHPV-BIP、0.66μM CIAV-BIP、0.66μM FADV4-BIP、0.66μM CHPV-BIP-BD退火复合探针、0.66μM CIAV-BIP-BD退火复合探针、0.66μM FADV4-BIP-BD退火复合探针、0.083μM CHPV-F3、0.083μM CIAV-F3、0.083μMFADV4-F3、0.083μM CHPV-B3、0.083μM CIAV-B3、0.083μM FADV4-B3、0.17μM CHPV-Floop、0.17μM CIAV-Floop、0.17μM FADV4-Floop、0.17μM CHPV-Bloop、0.17μM CIAV-Bloop、0.17μM FADV4-Bloop，余量为水；③反应过程：包括63℃恒温60℃min的延伸反应、80℃灭活5min的终止反应；④结果检测：包括采用实时浊度仪和影像分析仪，在多个荧光通道下进行2种方式的结果判读；该方法不用于疾病的诊断与治疗。

本发明要求保护一种鉴定三种鸡群新发传染病病毒的试剂盒，包含3套引物和探针组合物、WarmStart LAMP变色预混液、标准品、阴性对照和DNA聚合酶。

本发明要求保护的鉴定三种鸡群新发传染病病毒的试剂盒，其中的DNA聚合酶为Bst 2.0WarmStart DNA聚合酶，每20μL反应体系用量为16U。

本发明要求保护的引物和探针组合物、一种鉴定三种鸡群新发传染病病毒的方法、一种鉴定三种鸡群新发传染病病毒的试剂盒，在鉴定鸡群新发传染病中的应用。

为了实现同时鉴定鸡细小病毒(CHPV)、鸡传染性贫血病毒(CIAV)和禽腺病毒血清4型(FADV4)这三种病毒的目的，本申请经过大量的创造性研究。

首先，由于LAMP检测方法结果更直观、检测速度相对更快，因此受到特别关注，但是目前多重LAMP检测方法引物设计时一般不超过2套，每种病毒包括一套引物，每套引物至少包括2组引物(外引物和内引物)，且LAMP检测结果只能区分阴阳性，不能区分由那套引物扩增的阳性结果。本发明首次成功研究并筛选出包含针对三种不同目的片段的3套引物和探针，并且每套引物包括3对引物(外引物、内引物、环引物)和1对探针)，经过引物组间的配对优化，得到本发明的3套LAMP引物的引物和探针组合物，经过性能验证，本发明的引物和探针组合物应用于检测试剂盒，检测结果特异性最好、结果最稳定。

从普通的二重LAMP到三重LAMP,并不是简单的叠加，通过大量的创造性的实验摸索和调整反应体系，最终实现在同一个反应管内三重LAMP扩增。

其次，本发明首次完成第三种荧光物质的筛选。现有的荧光成像分析系统一般具有固定的波长范围，比如，多色荧光成像分析系统(厂家：美国BIO-RAD公司、产品目录号为Universal HoodⅢ)的检测波长为：495-750nm，而蓝色荧光的波长范围为：422-455nm，也就是说多数荧光成像分析仪无法检测蓝色荧光。第三种荧光的研究过程中，比较了4种荧光基团(ROX、Alexa Flour 586、CY3、Texas Red)，最终研究发现只有CY3在570nm通道下显色,且与520nm(Alexa Fluor 488荧光基团，绿色)通道和670nm(Cy5荧光基团，红色)通道无交叉，但是，CY3荧光显橙色，并不是蓝色，由于橙色与绿色肉眼难以区分，通过编程修改成像仪代码，使荧光成像分析仪给CY3赋予蓝色，作为第三种蓝色荧光，用于三重荧光反应。

再次，荧光淬灭复合探针直接参与反应，存在对反应的抑制作用。研究发现荧光淬灭复合探针直接加入三重荧光LAMP反应，完全代替内引物FIP、BIP时，不仅荧光淬灭复合探针本身的荧光本底值高，还会对LAMP反应有一定的抑制作用，甚至完全抑制LAMP。最终研究发现使用内引物FIP(或BIP)：荧光淬灭复合探针FIP-FD(或BIP-BD)＝1：1的配比既可以降底荧光本底值，又能保证稳定扩增。

最后，多重荧光LAMP反应中存在数十条引物和探针会争夺反应体系，相互抑制。一般双重荧光LAMP反应会包括2套引物和探针，增加为三重荧光就需要增加1套引物和探针，本发明中每套引物分别包括了外引物、内引物、环引物和探针这4组引物，相当于8份引物和探针，即整个三重反应体系中共24份引物和探针，因此在LAMP反应过程中势必会争夺反应体系。最终研究发现不添加DNA聚合酶之前，整个反应被抑制，通过每20μL反应体系添加16UBst 2.0WarmStart DNA聚合酶，可以显著提高反应效率，并达到三重反应的扩增平衡，相互间不受干扰。

本发明的有益效果是:

引物和探针序列设计方面：根据鸡细小病毒(CHPV)的NS基因、鸡传染性贫血病毒(CIAV)的VP1基因和禽腺病毒血清4型(FADV4)的Hexon基因的保守区域设计出分别针对三种不同类型病毒的三套特异性引物和探针组合物，能够鉴别诊断三种鸡新发传染病，且灵敏度和特异性高。

荧光基团的优化：3套引物和探针除了设计LAMP常规的内引物、外引物、环引物以外，还增加了探针(FD和BD)，其中探针与内引物上的区域互补，并将内引物5’端标记淬灭基团，探针的3’端标记荧光基团，如前所述探针上标记的3种荧光基团的显色在各自对应通道中进行，相互之间不交叉、无干扰，退火后内引物与探针互补结合形成荧光淬灭复合探针(即不发光的复合物)，退火反应为三重荧光LAMP反应的反应前准备阶段。三重荧光LAMP反应过程中，延伸反应使探针(FD和BD)脱落，检测结果可以根据探针所带的荧光颜色进行区分。每种病毒使用FD和BD双荧光，可以大大提高反应的特异性和荧光增量，区分效果更好。

反应过程简单：通过引入三种不同颜色的荧光基团，反应前完成退火准备，检测反应过程中只需要63℃的延伸反应和80℃的终止反应这两步即可完成，反应过程简单，常规的水浴锅即可实现，不需要复杂的仪器设备。

2种结果判定方式：本发明的三重荧光LAMP恒温反应包括使用实时浊度仪实时检测反应沉淀物和使用荧光成像分析仪多通道判定荧光颜色这2种结果判定方式。首先，与常规LAMP需要开盖进行凝胶电泳观察梯形条带相比，这2种结果判定方式均无需开盖，避免了气溶胶导致实验环境污染和假阳性的不良结果；其次，可以采用2种结果判定方式，2种结果可以相互印证，结果判定更准确可靠；第三，引入商品化的LAMP变色预混液，阳性反应产物颜色由原来的粉色变成黄色，不仅肉眼即可判定结果，无需经过紫外线照射，而且阳性反应沉淀物还可以用实时浊度仪进行实时检测，更加便捷，可在基层条件差的地区开展现场检疫；第四，还可以用荧光成像分析仪多通道判定荧光颜色，当多种目的片段(混合感染样品中)出现核酸扩增时，可以区分是阳性结果的病毒类型和数量，通过在同一个反应管内应用LAMP技术联合检测三种目标病毒，尤其适合于混合感染的鉴定。

试剂盒的应用：本发明提供的三种鸡群新发传染病病毒的的试剂盒，利用本发明设计的3套引物和探针，三种荧光的LAMP反应体系和三重荧光LAMP检测方法，不仅可以实时观察对CHPV、CIAV、FADV4这三种病毒的阳性扩增结果，还能具体的区分是由CHPV、CIAV、FADV4这三种病毒中的哪一种和/或哪几种病毒引发的阳性扩增，结果观察更直观。

性能优势：本发明所述的鉴定三种鸡群新发传染病病毒的引物和探针组合物、试剂盒及其应用，仅与CHPV、CIAV、FADV4这三种病毒的DNA发生阳性反应，对于其他禽类常见病毒无交叉反应，特异性强；针对CHPV、CIAV、FADV4这三种病毒，每个反应最低都可检测到1个拷贝病毒DNA，灵敏性高。

综上所述，本发明首次成功建立了快速检测三种目标片段的三重荧光LAMP检测方法，尤其适用于快速鉴别诊断三种鸡新发传染病病毒(CHPV、CIAV、FADV4)，该三重荧光的LAMP方法具有特异性好、敏感性高、抗干扰性强，污染小、方便快捷等优点，并且检测结果可直接用肉眼观察，可以根据实时浊度仪定性观察，还可以通过影像分析仪具体判读反应产物的荧光颜色，适用于三种鸡新发传染病病毒的临床快速诊断，65分钟使用水浴锅即可完成检测检测过程操作简单，尤其适合在基层兽医站、养殖场及边境口岸进行三种鸡新发传染病的早期筛查。

附图说明

图1为鉴定三种鸡群新发传染病病毒的方法的特异性实验的结果图，样品标号1为CHPV DNA，2为CIAV DNA，3为FADV4 DNA，4为CHPV+CIAV DNA，5为CHPV+FADV4 DNA，6为CIAV+FADV4 DNA，7为CHPV+CIAV+FADV4 DNA，8为AIV cDNA，9为NDV cDNA，10为IBV cDNA，11为ARVcDNA，12为AILTV DNA，13为APV cDNA，14为MDV DNA，15为阴性对照(水)；

图2为鉴定三种鸡群新发传染病病毒的方法的敏感性实验的结果图，样品1-8分别为不同浓度的等量三种病毒(CHPV，CIAV和FDAV4)DNA的混合样品,样品标号与对应浓度关系分别为：1为1×10⁷copies/μl，2为1×10⁶copies/μl，3为1×10⁵copies/μl，4为1×10⁴copies/μl，5为1×10³copies/μl，6为1×10²copies/μl，7为1×10¹copies/μl，8为1copy/μl，样品9为阴性对照(水)；

图3为鉴定三种鸡群新发传染病病毒的方法的干扰性实验的结果图，其中样品1-8分别为不同的浓度的三种病毒(CHPV、CIAV、FADV4)DNA的混合样品，样品标号与病毒浓度关系分别为：1为10²CHPV+10²CIAV+10⁹FADV4，2为10²CHPV+10³CIAV+10⁸FADV4，3为10²CHPV+10⁴CIAV+10⁷FADV4，4为10²CHPV+10⁵CIAV+10⁶FADV4，5为10²CHPV+10⁶CIAV+10⁵FADV4，6为10²CHPV+10⁷CIAV+10⁴FADV4，7为10²CHPV+10⁸CIAV+10³FADV4，8为10²CHPV+10⁹CIAV+10²FADV4，浓度单位为copies/μl。

具体实施方式

下面结合实际应用详细描述本发明的示例性的实施例，在下面的详细描述中，为便于解释，阐述了许多具体的细节以提供对本披露实施例的全面理解。下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。然而明显地，一个或多个实施例在没有这些具体细节的情况下也可以被实施。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。

下述实施例中所使用的实验方法，如无特殊说明均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。其中；

LAMP变色预混液(含UDG)和DNA聚合酶(Bst 2.0

DNAPolymerase)购自NEB有限公司(New England Biolabs,Inc.)；DNA/RNA共提试剂盒(

Viral DNA/RNA Kit)和质粒小量提取试剂盒(

Plasmid MiniPrepKit)购自美国全世金科学公司(Axygen Scientific,Inc.)、实时浊度仪(Loopamp LA-32OC)购自日本荣研公司(Eiken Chemical Co.,Ltd.,Tokyo,Japan)；影像分析仪购自美国伯乐公司(Bio-Rad Laboratories,Inc.)；NanoDrop 2000核酸测定仪购自美国ThermoFisher Scientific公司；反转录试剂盒(PrimeScriptTM1st Strand cDNA SynthesisKit)和PMD-18T载体购自宝日医生物技术有限公司；引物委托宝日医生物技术有限公司合成。

6株鸡细小病毒(Chicken parvovirus，CHPV)毒株(Genbank登录号：KX084399、KX084401、KX133426、KU523900、KX133415、KX133418)、5株鸡传染性贫血病毒(Chickeninfectious anemia virus,CIAV)毒株(Genbank登录号：MN649254、MN649256、MK484614、MN103402、MN103404)、5株禽腺病毒4型(Fowl adenovirus group 4,FADV4)毒株(Genbank登录号：MN577977、MN577978、MN577984、MW439040、MW439043)、3类禽流感病毒(Avianinfluenza virus,AIV)毒株H3N2、H6N6和H9N2、2株新城疫病毒(Newcastle diseasevirus，NDV)毒株F48E9和LaSota、禽传染性支气管病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)毒株Mass 41、禽呼肠孤病毒(Avian reovirus，ARV)毒株S1133、鸡传染性喉气管炎病毒(Avian infectious laryngo tracheitis virus，AILTV)毒株Beijing株、禽偏肺病毒(Avian metapneumovirus，APV)毒株MN-10均由广西壮族自治区兽医研究所生物技术重点实验室保存；马立克氏病MDV活疫苗病毒(CVI988株)购自南京梅里亚动物保健品公司；70份临床样品，来源于南宁活禽市场采集的口腔及泄殖腔的棉拭子样品，临床样品已经过常规PCR检测鉴定，阳性结果送华大基因测序鉴定；按照购自北京全式金生物技术有限公司的EasyPure Viral DNA/RNA Kit中的说明书提取不同病毒和临床样品的RNA和DNA，RNA病毒按照购自宝日医生物技术有限公司的反转录试剂盒的说明书反转录成cDNA，将cDNA/DNA模板于-30℃保存备用。上述各病毒毒株，均为己知病毒，在符合生物安全操作的情况下，公众可从申请人处获得，仅可用于重复本发明试验使用，不得他用。

下述实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

本发明内容仅仅涉及采自于鸡的口腔及泄殖腔的棉拭子进行生物学信息的检测和鉴定，不是对有生命的动物体为直接实施对象，不包括将检测到的生物信息与基准数据进行比较的步骤，以及根据该生物检测信息得出具体诊断结论的步骤，因此，本发明不属于疾病的诊断方法，符合《专利法》对专利保护客体的基本要求。

本发明提供了一种鉴定三种鸡群新发传染病病毒的方法，根据本发明的总体构思，具体公开了鉴定三种鸡群新发传染病病毒的引物和探针组合物、试剂盒及检测方法和应用，引物和探针组合物包括三种病毒对应的3套引物和探针，每套引物都包含内引物、外引物、环引物和探针，其核苷酸序列依次为序列表中SEQ ID No.1-24所示，其中内引物的5’端标记有淬灭基团、探针的3’端标记荧光基团，内引物和对应的探针的核苷酸序列拥有互补配对的区域，可以结合形成不发光的荧光淬灭复合探针；反应前先制备荧光退火复合探针，反应程序为：63℃反应60分钟扩增、85℃灭活5分钟的终止反应；试剂盒配有WarmStartLAMP变色预混液、标准品和Bst 2.0WarmStart DNA聚合酶；所述的引物和探针组合物、检测方法及试剂盒可以在鉴定鸡群新发传染病中应用。

本发明的具体实施方式中，所述待测样本具体为口腔及泄殖腔的棉拭子，提取待测样本的核酸或待测病毒的核酸或待测病原微生物的核酸为使用RNA/DNA共提试剂盒提取得到的核酸，所述核酸均可为DNA、RNA、或DNA和RNA的混合物，当所述核酸中含有RNA时，先将RNA反转录为cDNA，制备好的cDNA/DNA模板于-30℃保存备用，以便再进行所述LAMP扩增反应。在进行所述LAMP扩增反应时，所述引物组包括外引物、内引物、环引物和探针，所述外引物命名后缀为F3和B3，所述内引物命名后缀为FIP和BIP，所述环引物命名后缀为Floop和Bloop，所述探针命名后缀为FD和BD，每套引物根据3种病毒类型的不同分别冠以各个病毒的简称：CHPV、CIAV、FADV4。

下面描述一下本发明鉴定三种鸡群新发传染病病毒的方法的具体实施例，具体内容如下：

实施例1、引物和探针组合物的设计

根据GenBank中鸡细小病毒(CHPV)的NS基因序列、鸡传染性贫血病毒(CIAV)的VP1基因序列和禽腺病毒血清4型(FADV4)的Hexon基因序列的保守区域，设计3套分别针对三种鸡群新发传染病病毒的引物和探针组合物，每套引物均包括外引物F3和B3、内引物FIP和BIP、环引物Floop和Bloop，以及探针FD和BD，引物序列详见序列表中SEQ ID NO:1-24所示；其中，内引物FIP和BIP和对应的探针FD和BD的核苷酸序列拥有互补配对的区域，退火后可以配对结合形成不发光的荧光淬灭复合探针；内引物FIP和BIP的5’端标记有BHQ系列荧光淬灭基团，探针FD和BD的3’端标记Alexa Fluor 488、Cy5和CY3这3种不同的荧光基团；所述引物和探针组合物由宝日医生物技术有限公司合成。

实施例2、鉴定三种鸡群新发传染病病毒的方法的三重荧光LAMP检测平台的建立

2.1、模板的提取

按照EasyPure Viral DNA/RNA Kit中的说明书提取26株不同的病毒毒株和70份临床样品的RNA和/或DNA,其中RNA病毒均先反转录成cDNA，将cDNA/DNA模板于-30℃保存备用。

2.2、标准品

将CHPV的NS基因，CIAV的VP1基因和FAVD-4的Hexon基因分别克隆到PMD-18T载体，分别得到PMD-18T-NS，PMD-18T-VP1和PMD-18T-Hexon重组质粒，用质粒小量提取试剂盒提取阳性重组菌的质粒。经过NanoDrop-2000核酸检测仪测定质粒浓度，根据阿弗加德罗数将浓度换算为拷贝数，拷贝数(copies/μL)＝质粒浓度(g/μL)×10^-9×6.02×1023/660×质粒总长度。将每种病毒对应的计算好拷贝数的质粒DNA分别稀释至3.3×10⁹～1copies/μL得到3种病毒对应的不同浓度的标准品；再将同浓度的质粒DNA按照设计完成等体积的双混和三混的混合标准品，最终制备成不同浓度为DNA单样本、双混样本和三混的标准品，该标准品中的DNA浓度为1×10⁹copies/μL-1copy/μL，置-30℃保存备用。

2.3、反应体系

反应前，制备荧光淬灭退火复合探针：50μM FIP与50μM FD混合，50μM BIP与50μMBD混合，加热至98℃5分钟，慢慢冷却到室温完成退火，-20℃备用，按照上述方法，分别得到CHPV-FIP-FD和BIP-BD退火复合探针、FADV4-FIP-FD和BIP-BD退火复合探针和CIAV-FIP-FD和BIP-BD退火复合探针。

制备反应体系：多重RT-LAMP的反应体系设定为20μL，其中，包括模板1μL、10μLWarmStart 2×预混液、16U Bst 2.0WarmStart DNA聚合酶、0.66μM CHPV-FIP、0.66μMCIAV-FIP、0.66μM FADV4-FIP、0.66μM CHPV-FIP-FD退火复合探针(含0.33μM CHPV-FIP与0.33μM荧光CHPV-FD)、0.66μM CIAV-FIP-FD退火复合探针(含0.33μM CIAV-FIP与0.33μMCIAV-FD)、0.66μM FADV4-FIP-FD退火复合探针(含0.33μM FADV4-FIP与0.33μM FADV4-FD)、0.66μM CHPV-BIP、0.66μM CIAV-BIP、0.66μM FADV4-BIP、0.66μM CHPV-BIP-BD退火复合探针(含0.33μM CHPV-BIP与0.33μM CHPV-BD)、0.66μM CIAV-BIP-BD退火复合探针(含0.33μM CIAV-BIP与0.33μM CIAV-BD)、0.66μM FADV4-BIP-BD退火复合探针(含0.33μMFADV4-BIP与0.33μM FADV4-BD)、0.083μM CHPV-F3、0.083μM CIAV-F3、0.083μM FADV4-F3、0.083μM CHPV-B3、0.083μM CIAV-B3、0.083μM FADV4-B3、0.17μM CHPV-Floop、0.17μMCIAV-Floop、0.17μM FADV4-Floop、0.17μM CHPV-Bloop、0.17μM CIAV-Bloop、0.17μMFADV4-Bloop，余量为水。

2.4、反应条件

将上述准备好20μL的反应体系的反应管置水浴锅(或LA-320C实时浊度仪)内，于63℃反应60℃min，80℃灭活5min，完成LAMP延伸扩增反应。

2.5、结果判定

试验结束后，本发明扩增结果包括2种判定方式。

结果判定方式一：是肉眼可见的阴阳性判定方式，根据LAMP扩增副产物磷酸镁所致，按照LAMP变色预混液试剂盒说明书进行肉眼可见的阴阳性判定：LAMP反应产物颜色由粉色反应液变成黄色，说明结果为阳性，如未发生颜色未发生变化，则判定结果为阴性。该判断方式不需要进行电泳和加入荧光剂，减少了反应产物对实验室的污染，实验结果可通过产物的颜色反应作出判定，大大缩短的检测的时间；而且还可以通过LA-320C实时浊度仪给出的曲线图，横坐标表示反应时间，纵坐标表示浊度强度(即RT-LAMP副产物焦磷酸镁白色沉淀的量)，观察LAMP阳性扩增的实时扩增的峰值，寻找最早进入指数增长期的用时和时长，还可以用以优化LAMP反应温度和时间等具体的反应条件。但是，该判断方式不能区分是那套引物引发的那种类型的病毒核酸发生的阳性扩增，即不能区分阳性的病原体。

结果判定方式二：使用影像分析仪进行分析三重荧光显色结果。本发明中CHPV、CIAV、FADV4对应的探针的3’端标记的荧光基团分别为Alexa Fluor 488、Cy5和CY3，因此，CHPV阳性(Alexa Fluor 488标记)在520通道下显绿色，CIAV阳性(Cy5标记)在670通道下显红色，FADV4阳性(CY3标记)在570通道下显蓝色(CY3原始色为橙色，影像仪赋予其蓝色，不影响结果判读)；该方法通过在影像分析仪的对应通道下检测反应管所携带的荧光基团颜色来判读具体的三种荧光信号的阳性结果，根据不同通道下荧光验收的不同，直观的区分出那套引物引发的那种类型的病毒核酸引发的阳性结果，即可以明确地区分该鉴定三种鸡群新发传染病病毒的阳性结果是由CHPV、CIAV、FADV4中具体的一种、或几种病毒类型引发的，从而能够在同一个反应管内应用LAMP技术联合检测三种目标病毒。

实施例3、鉴定三种鸡群新发传染病病毒的方法的性能验证

3.1、特异性

使用反应温度63℃、上述引物和探针组合物的浓度和上述确定的比例配置20μL的反应体系，恒温扩增CHPV，CIAV和FADV4的单一或混合模板，以及其它禽常见对照病毒AIV、NDV、IBV、ARV、AILTV、APV和MDV的核酸样品65分钟，以验证其特异性。26株事先完成提取备用的病毒毒株分别是CHPV毒株：KX084399、KX084401、KX133426、KU523900、KX133415、KX133418，CIAV毒株：MN649254、MN649256、MK484614、MN103402、MN103404，FADV4毒株：MN577977、MN577978、MN577984、MW439040、MW439043，AIV毒株：H3N2、H6N6和H9N2，NDV毒株F48E9和LaSota，IBV毒株Mass 41，ARV毒株S1133，AILTV Beijing株，APV MN-10株，MDVCVI988株)的cDNA或DNA为模板，以无RNAase水作为阴性对照分别加入反应体系中，反应结束后，验证反应体系的特异性。

如图1所示该特异性验证试验结果：采用实时浊度仪(多通道)监测所有15个标号反应管，结果如多通道显示：只有加入含有CHPV、CIAV、FADV4中的一种或多种的样本管，即标号为1-7的反应管形成的明显扩增，标号为1-7的反应管为阳性，而代表了禽常见对照病毒和阴性对照的标号为8-15的反应管为阴性；证明本发明可以鉴定出三种鸡群新发传染病病毒(CHPV、CIAV、FADV4)，而对这3种病毒以外的常见的禽类病毒无交叉反应。

利用影像分析仪，在对应通道下检测反应管所携带的荧光基团颜色判读结果，三种病毒混合样品中能准确区分三种目标病毒，并在相应的通道下显示对应的颜色，即6株CHPV(520通道)广西分离毒株，5株CIAV(670通道)广西分离毒株和5株FADV4(570通道)毒株均扩增呈阳性，同时3个通道对其它对照病毒(AIV、NDV、IBV、ARV、AILTV、APV和MDV)和阴性对照管均无非特异性荧光阳性信息，检测结果均为阴性。因此，该结果表明本发明所建立的三重荧光不仅能够鉴定三种鸡群新发传染病病毒，还能区分是CHPV、CIAV、FADV4的哪一种，或者哪几种的混合，特异性良好。

3.2、灵敏性

使用反应温度63℃、上述引物和探针组合物的浓度和上述确定的比例配置20μL的反应体系，扩增事先准备好的不同浓度标准品等比例混合的混合样品，反应65分钟，以验证其灵敏性。

采用实时浊度仪(多通道)和影像分析仪(包含520通道绿色、670通道红色、570通道蓝色)，在对应通道下监测所有9个标号反应管的灵敏性，结果如图2所示：样品1-8分别为不同DNA浓度的CHPV、CIAV、FADV4这三种病毒标准品等比例的混合物，其中：1为1×10⁷copies/μl，2为1×10⁶copies/μl，3为1×10⁵copies/μl，4为1×10⁴copies/μl，5为1×10³copies/μl，6为1×10²copies/μl，7为1×10¹copies/μl，8为1copy/μl，样品9为阴性对照(ddH₂O)；结果，除标号9的阴性对照为阴性以外，其他样品标号为1-8的检测结果均为阳性；对应的最低浓度管样品管8号，即对CHPV、CIAV、FADV4这3种病毒最低检出限度，该管三种病毒标准品等比例的混合物中各病毒标准品的DNA浓度为1copy/μl，由此可见，本方法对三种病毒DNA的灵敏性为1copy/μl，即该三重荧光鉴定三种鸡群新发传染病病毒的方法每个反应最低可检测到1个拷贝病毒DNA，该方法灵敏性高。

3.3、干扰性

使用反应温度63℃、上述引物和探针组合物的浓度和上述确定的比例配置20μL的反应体系，扩增事先准备好的3种病毒质粒DNA标准品不同浓度的混合样品，反应65分钟，以验证其不同病毒混合时高浓度的目标核酸是否会抑制低浓度目标核酸的特异性扩增过程，即验证不同浓度目标核酸之间是否存在干扰。

采用实时浊度仪(多通道)和影像分析仪(包含520通道绿色、670通道红色、570通道蓝色)，在对应通道下监测所有8个标号反应管的干扰性扩增情况，结果如图3所示：样品标号1-8分别为三种病毒对应的单个标准品样品按不同浓度进行混合，形成不同浓度的3种病毒目标核酸的混合物，模拟制备不同浓度混合感染样品，具体浓度情况是：1为10²CHPV+10²CIAV+10⁹FADV4，2为10²CHPV+10³CIAV+10⁸FADV4，3为10²CHPV+10⁴CIAV+10⁷FADV4，4为10²CHPV+10⁵CIAV+10⁶FADV4，5为10²CHPV+10⁶CIAV+10⁵FADV4，6为10²CHPV+10⁷CIAV+10⁴FADV4，7为10²CHPV+10⁸CIAV+10³FADV4，8为10²CHPV+10⁹CIAV+10²FADV4，其中3种病毒的标准品的浓度单位均是copies/μl，未设阴性对照。结果，标号1-8的检测结果均为阳性，且不同通道间、不同浓度配比间的阳性结果之间均无明显差异。

理论上，同一个反应管中存在多套引物同时竞争的反应体系时，高浓度的目标核酸模板在反应开始时可能会讯速夺取反应体系的组份，从而抑制低浓度目标核酸模板的特异性扩增，但是通过本发明所构建的标准品模拟不同浓度病毒混合感染的待测样品，即使某一病毒的最高浓度达到10⁹copies/μl，也不会抑制模板中最低浓度为10²copies/μl的特异性扩增，虽然不同病毒之间的浓度比最高达10⁷:1，但是实验证明：本发明所述的引物和探针组合物、反应体系、反应条件下，不同浓度病毒的目标核酸混合物之间，未见干扰抑制现象，即本发明所述鉴定三种鸡群新发传染病病毒的方法抗干扰性强。

3.4、临床样品一致性验证

使用反应温度63℃、上述引物和探针组合物的浓度和上述确定的比例配置20μL的反应体系，扩增实施例2中事先制备好的70份临床样品的cDNA/DNA，反应65分钟，以验证真实的临床样品与经典的PCR测序验证结果的一致性和本方法的结果可靠性。采用实时浊度仪(多通道)和影像分析仪(包含520通道绿色、670通道红色、570通道蓝色)，在对应通道下监测所有8个标号反应管的干扰性扩增情况，三重荧光的LAMP阳性结果的样品，送测序鉴定。结果下表2所示，CHPV阳性14份(阳性率20.0％)，CIAV阳性22份(31.4％)，FADV4阳性6份(8.5％)，CHPV+CIAV混合感染阳性4份(5.7％)，CHPV+FADV4混合感染阳性1份(1.4％)，将三重荧光LAMP鉴定的阳性结果，用PCR测序进行确证。结果：采用本发明所述的鉴定三种鸡群新发传染病病毒的方法的检测结果，用经典的PCR测序方法进行确证，结果阳性结果完全相符，阳性符合率达100％，一致性结果较好。

表2PCR测序结果与三重荧光LAMP鉴定结果的比较

注：临床样品为从南宁活禽市场采集的70份鸡口腔及泄殖腔的棉拭子，经过核酸提取得到的cDNA/DNA，表中左下角空白处为重复内容，未标结果。

本发明鉴定三种鸡群新发传染病病毒的方法，已充分所公开了所用到的LAMP引物组、标准品、试剂盒及检测方法和应用，包括三种病毒对应的3套引物和探针组合物，其中，内引物标记了淬灭基团，探针标记三种不同颜色的荧光基团，内引物和对应的探针的核苷酸序列拥有互补配对的区域，高温退火后可以配对结合形成不发光的荧光淬灭复合探针，经过LAMP等温扩增和终止，最终可以通过一个反应管中的一次LAMP反应，采用实时浊度仪(多通道)和影像分析仪(包含520通道绿色、670通道红色、570通道蓝色)这2种结果观察方式，既可以实时定量观察阳性结果，也可以区别阳性病原体，经过性能验证和临床样本验证，特异性高、敏感性高、干扰性小，最低能检测到1个混合模板拷贝/反应，有效抑制假阳性结果，临床检测效果好。本发明提供的检测方法，简便、快速、无需使用昂贵仪器、成本低，能够实现现场检测病原，适用于鸡群CHPV、CIAV和FADV4的大规模流行病学调查。

实际研究中，从基于每种病毒的保守区域还分别设计了至少2套引物(不合适的引物序列在此不再做详细说明)，研究过程中除了能保证一定的灵敏度和针对CHPV、CIAV、FADV4这3种病毒DNA的特异性阳性扩增结果以外，还需要保证筛选出的3种病毒的引物组之间不发生交叉干扰。在研发过程中，通过不同的组合最终筛选到针对本发明目的的引物和探针组合物的引物和探针序列，并且解决了三重荧光LAMP检测反应遇到的荧光成像分析仪对荧光波长范围的限定、荧光淬灭复合探针对反应的抑制、增加的引物和探针争夺反应体系等等一系列技术问题，因此，本发明所述的有益效果是在众多实验设计、验证过程中，经过了大量创造性劳动获得的，经过临床样品的特异性验证，也证明了本发明的所述可以用于本发明所述引物和探针组合物、试剂盒及检测方法具有良好的特异性、敏感性和抗干扰性，可以用于鉴定鸡群新发传染病的初筛，阴性结果也可以作为这3种病毒感染源的排出参考，后期也可以扩展应用于其他3种病毒联合鉴定平台研究的参考。

本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，使得本领域技术人员将会容易理解。但是根据已经公开的所有描述，可以对那些细节进行不同的修饰或替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

序列表

<110> 广西壮族自治区兽医研究所

<120> 一种鉴定三种鸡群新发传染病病毒的方法

<130> 20211208

<160> 24

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 1

agaggaggaa cccccctat 19

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 2

cgcttgcggt gaagtctg 18

<210> 3

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 3

acgggataaa tccctgggac cttggttctg aatccgggct 40

<210> 4

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 4

acagagacca tcgagctcct gggctcgtct ggaaatccac tc 42

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 5

tcttaccttc gttggctttt tcaa 24

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 6

agacggagat cctcagcgaa tc 22

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 7

aggtcccagg gatttatccc gt 22

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 8

ccaggagctc gatggtctct gt 22

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 9

aggccaccaa caagttcac 19

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 10

ggttgatcgg tcctcaagtc 20

<210> 11

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 11

gcagccacac agcgatagag tgccgttgga aacccctcac 40

<210> 12

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 12

cgcgctccca cgctaagatc cggcacattc ttgaaaccag 40

<210> 13

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 13

attgtaattg cagcgatacc aatcc 25

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 14

actgcggaca attcagaaag ca 22

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 15

cactctatcg ctgtgtggct gc 22

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 16

gatcttagcg tgggagcgcg 20

<210> 17

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 17

gaggtgaacc tcatggcc 18

<210> 18

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 18

ttgatgcgag tgaaggacc 19

<210> 19

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 19

tggtggcgtt tctcagcatc agacttcatg cccatggatc ac 42

<210> 20

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 20

acgctctata ctcggtgccc ggtgcgagcg ggaatgttg 39

<210> 21

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 21

ctcgagctgg ttactggtgt tg 22

<210> 22

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 22

ctccaccgcc ctcaccat 18

<210> 23

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 23

ctgatgctga gaaacgccac ca 22

<210> 24

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 24

cgggcaccga gtatagagcg t 21

Claims

1.一种引物和探针组合物，其特征在于：包括3套引物和探针，分别为：

根据鸡细小病毒的NS基因序列设计的外引物CHPV-F3和CHPV-B3、内引物CHPV-FIP和CHPV-BIP、环引物CHPV-Floop和CHPV-Bloop及探针CHPV-FD和CHPV-BD,其核苷酸序列依次为序列表中SEQ ID NO:1-8所示；

根据鸡传染性贫血病毒的VP1基因序列设计的外引物CIAV-F3和CIAV-B3、内引物CIAV-FIP和CIAV-BIP、环引物CIAV-Floop和CIAV-Bloop及探针CIAV-FD和CIAV-BD,其核苷酸序列依次为序列表中SEQ ID NO:9-16所示；

根据禽腺病毒血清4型的Hexon基因序列设计的外引物FADV4-F3和FADV4-B3、内引物FADV4-FIP和FADV4-BIP、环引物FADV4-Floop和FADV4-Bloop及探针FADV4-FD和FADV4-BD,其核苷酸序列依次为序列表中SEQ ID NO:17-24所示。

2.根据权利要求1所述的引物和探针组合物，其特征在于：所述3套引物和探针，与对应SEQ ID NO:1-24所示的序列相比,分别具有不超过5个核苷酸的置换、缺失或添加，或者分别具有80％-99.99％的序列同一性，且与SEQ ID No:1-24的序列具有相同功能。

3.根据权利要求1-2任一项所述的引物和探针组合物，其特征在于：所述内引物CHPV-FIP和CHPV-BIP、CIAV-FIP和CIAV-BIP及FADV4-FIP和FADV4-BIP序列的5’端标记有淬灭基团，所述探针CHPV-FD和CHPV-BD、CIAV-FD和CIAV-BD及FADV4-FD和FADV4-BD序列的3’端标记荧光基团。

4.根据权利要求3所述的引物和探针组合物，其特征在于：所述淬灭基团为BHQ系列荧光淬灭基团，所述荧光基团为Alexa Fluor 488、Cy5和CY3。

5.根据权利要求3所述的引物和探针组合物，其特征在于：所述内引物CHPV-FIP、CHPV-BIP、CIAV-FIP、CIAV-BIP、FADV4-FIP、FADV4-BIP和对应探针CHPV-FD、CHPV-BD、CIAV-FD、CIAV-BD、FADV4-FD、FADV4-BD的核苷酸序列拥有互补配对的区域，退火后配对结合形成不发光的荧光淬灭复合探针CHPV-FIP-FD、CHPV-BIP-BD、CIAV-FIP-FD、CIAV-BIP-BD、FADV4-FIP-FD、FADV4-BIP-BD。

6.一种鉴定三种鸡群新发传染病病毒的方法，其特征在于：

所述方法包含参与反应的权利要求1-5任一项所述的引物和探针组合物；还包括：

制备荧光淬灭退火复合探针：多重RT-LAMP反应前，将50μM FIP与50μM FD、50μM BIP与50μM BD分别混合，加热至98℃5分钟，慢慢冷却到室温完成退火，-20℃备用，按照上述方法，分别得到CHPV、CIAV和FADV4对应的FIP-FD和BIP-BD退火复合探针；

制备反应体系：制备20μL多重RT-LAMP反应体系，包括模板1μL、10μL WarmStart 2×预混液、16U Bst 2.0WarmStart DNA聚合酶、0.66μM CHPV-FIP、0.66μM CIAV-FIP、0.66μMFADV4-FIP、0.66μM CHPV-FIP-FD退火复合探针、0.66μM CIAV-FIP-FD退火复合探针、0.66μM FADV4-FIP-FD退火复合探针、0.66μM CHPV-BIP、0.66μM CIAV-BIP、0.66μM FADV4-BIP、0.66μM CHPV-BIP-BD退火复合探针、0.66μM CIAV-BIP-BD退火复合探针、0.66μM FADV4-BIP-BD退火复合探针、0.083μM CHPV-F3、0.083μMCIAV-F3、0.083μM FADV4-F3、0.083μMCHPV-B3、0.083μM CIAV-B3、0.083μM FADV4-B3、0.17μM CHPV-Floop、0.17μM CIAV-Floop、0.17μMFADV4-Floop、0.17μM CHPV-Bloop、0.17μM CIAV-Bloop、0.17μMFADV4-Bloop，余量为水；

反应过程：包括63℃恒温60℃min的延伸反应、80℃灭活5min的终止反应；

结果检测：包括采用实时浊度仪和影像分析仪，在多个荧光通道下进行2种方式的结果判读；

所述方法不用于疾病的诊断与治疗。

7.一种鉴定三种鸡群新发传染病病毒的试剂盒，其特征在于：包含权利要求1-5任一项所述的引物和探针组合物、WarmStart LAMP变色预混液、标准品、阴性对照和DNA聚合酶。

8.根据权利要求7所述的鉴定三种鸡群新发传染病病毒的试剂盒，其特征在于：所述DNA聚合酶为Bst 2.0WarmStart DNA聚合酶，每20μL反应体系用量为16U。

9.权利要求1-5任一项所述的引物和探针组合物、或者权利要求6所述的一种鉴定三种鸡群新发传染病病毒的方法，或者权利要求7-8任一项所述的一种鉴定三种鸡群新发传染病病毒的试剂盒，在鉴定鸡群新发传染病中的应用。