CN116732204B - 同时检测多种病原的多重lamp引物组、检测方法和试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种同时检测多种病原的多重LAMP引物组、检测方法和试剂盒，属于微生物检测领域。所述的多种病原为哈维氏弧菌、副溶血弧菌和石斑鱼虹彩病毒，所述的检测引物组如SEQ ID NO.1‑18，本发明还提供多重LAMP引物组在同时检测多种病原中的应用、试剂盒及检测方法，本发明方法可同时检测样品中是否含有哈维氏弧菌、副溶血弧菌或石斑鱼虹彩病毒，且特异性强、操作方便简单、无需昂贵的仪器设备。
Description
技术领域
本发明属于病原检测技术领域，具体地涉及一种同时检测多种病原的多重LAMP引物组、检测方法和试剂盒。
背景技术
石斑鱼是属于鲈形目(Perciformes)、鮨科(Serranidae)、石斑鱼属(Epinephelus)的一类鱼类的总称。其中病毒性疾病及细菌性疾病是石斑鱼疾病的重要类型。石斑鱼虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus,SGIV)是感染石斑鱼的主要病毒之一，常给石斑鱼养殖业造成严重的经济损失。哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)和副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)是石斑鱼常见的弧菌属病原菌，也可严重威胁卵形鲳鲹、对虾等其他重要水产动物的健康。并且，近年来石斑鱼经常出现被多种病原体同时感染的现状，因此加强病原的早期快速诊断和大范围筛查，研发多种病原同时检测的多目标检测手段迫在眉睫。
为了应对近年出现的一种水生动物被多种病原体同时感染的现状，多重LAMP技术应运而生，该技术既具有LAMP技术时间短、操作简单、敏感性和特异性高、产物可视化等优点，还可以实现多种病原的同时检测，大大缩短了多病原单一检测的时间，是一种比较有前景的多目标快速检测技术。目前多重LAMP检测技术已经在多种哺乳动物疾病核酸检测中使用。虽然多重LAMP技术拥有如此多的优势，但其在水生动物病原快速检测方面的研究尚处于起步阶段，已有的研究仍主要集中在对虾病原多目标快速检测方面。多重LAMP技术在石斑鱼病原多目标快速检测方面仍存在很大空白，可同时检测石斑鱼三种重要病原(石斑鱼虹彩病毒、哈维氏弧菌和副溶血弧菌)的多目标检测技术更是从未见报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种可同时检测哈维氏弧菌、副溶血弧菌和石斑鱼虹彩病毒，且特异性强、操作方便简单、无需昂贵的仪器设备的环介导等温扩增检测引物组、检测方法和检测试剂盒。
本发明利用环介导等温扩增技术，以哈维氏弧菌的Toic基因(GenBank登录号为APP06536.1)、副溶血弧菌的DNAJ基因(GenBank登录号为AWA88525.1)及石斑鱼虹彩病毒的RAD2基因(GenBank登录号为YP_164192.1)为特异靶基因，设计、筛选并优化特异性引物，建立一种多重LAMP检测方法，并优化反应条件，在反应过程中添加阳性对照组和阴性对照组，并通过钙黄绿素显色法和凝胶电泳分析检测样品组和其他两组对照的扩增产物来判断样品中是否含有哈维氏弧菌、副溶血弧菌或石斑鱼虹彩病毒，以达到方便简单，经济快速而且灵敏的检测效果，进而实现本发明的目的。
本发明的第一个目的是提供一种同时检测多种病原的多重LAMP引物组，所述的多种病原为哈维氏弧菌、副溶血弧菌和石斑鱼虹彩病毒，所述的检测引物组如SEQ ID NO.1-18，具体序列如下：
VH-F3：5’-TCCTTCGAGTTTCTCAAGCG-3’，
VH-B3：5’-TCACGTAGCGATTCGTAGCT-3’；
VH-FIP：
5’-CTAGTTGGCGACCAACCGCTCGCGCACAAGACAACCTAG-3’，
VH-BIP：
5’-TCACTGACGTACACGATGCGCCGAGTTTTCCGCCAAGACT-3’；
VH-LF：5’-GCTTTTTCTGCACGAACGAA-3’，
VH-LB：5’-AAGCACAATACGATGCAGTACTTG-3’；
VP-F3：5’-GTCTATCTGGCGAAGGCG-3’，
VP-B3：5’-ACATACGGCCAGTTTGTGTT-3’；
VP-FIP：5’-TTGCCGTCACGCTCGAAAATGTGAAATGGGTGCACCATCAGG-3’
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VP-LF：5’-TGCTCTTTCACGTGTACTTGTACG-3’，
VP-LB：5’-GAAGTTGAAGTTCCAACACTTGATG-3’；
SGIV-F3：5’-AGGGACTGAAGCTGTTGCT-3’，
SGIV-B3：5’-GGATCGCCGTCAAACACAA-3’；
SGIV-FIP：5’-AGGGTCTTGCCGGAGAGCTTCAAGAGTTCAGGTGTGGAGG-3’
SGIV-BIP：5’-ACACACAGCGTGGCAGTATCTGATAGCGTTTACGCGCCTC-3’；
SGIV-LF：5’-GTTTAGGCACACCGTAAAAT-3’，SGIV-LB：5’-TACTGTTTATGCTGTGTTGCCTCA-3’；
本发明的第二个目的是提供多重LAMP引物组在同时检测多种病原中的应用，所述的多种病原为哈维氏弧菌、副溶血弧菌和石斑鱼虹彩病毒，所述的检测为非疾病诊断和治疗的目的。
本发明的第三个目的是提供多重LAMP引物组在同时检测多种病原试剂盒中的应用，所述的多种病原为哈维氏弧菌、副溶血弧菌和石斑鱼虹彩病毒。
进一步，所述试剂盒包括环介导等温扩增反应液、Bst DNA聚合酶、含MnCl2的钙黄绿素显色液、阳性对照质控品、阴性对照质控品和多重LAMP引物组；所述的多种病原为哈维氏弧菌、副溶血弧菌和石斑鱼虹彩病毒。
进一步，所述的阳性对照质控品优选为含哈维氏弧菌的Toic基因(GenBank登录号为APP06536.1)的质粒DNA、副溶血弧菌的DNAJ基因(GenBank登录号为AWA88525.1)的质粒DNA及石斑鱼虹彩病毒的RAD2基因(GenBank登录号为YP_164192.1)的质粒DNA的混合液；所述的阴性对照质控品为超纯水。
本发明的第四个目的是提供一种同时检测多种病原的多重LAMP检测方法，所述方法非疾病诊断和治疗目的，所述的病原为哈维氏弧菌、副溶血弧菌和石斑鱼虹彩病毒，所述方法具体包括以下步骤：
(1)对样品进行收集，使用病毒和细菌DNA提取试剂盒提取病毒和细菌的基因组DNA，等比例混合后作为LAMP反应的模板；
(2)使用所述的多重LAMP引物组，与环介导等温扩增反应液、Bst DNA聚合酶、含MnCl2的钙黄绿素显色液及样品基因组DNA混合形成环介导等温扩增反应体系，进行环介导等温扩增反应；
(3)扩增反应结束后，通过钙黄绿素荧光显色法和或凝胶电泳分析检测样品中是否含有哈维氏弧菌、副溶血弧菌或石斑鱼虹彩病毒。
进一步，所述的通过钙黄绿素荧光显色法检测样品中是否含有哈维氏弧菌、副溶血弧菌或石斑鱼虹彩病毒，具体为：若扩增产物颜色为亮绿色，则样品中含有哈维氏弧菌、副溶血弧菌或石斑鱼虹彩病毒；若扩增产物颜色保持橙黄色不变，则样品中不含有哈维氏弧菌、副溶血弧菌和石斑鱼虹彩病毒。
进一步，所述的通过凝胶电泳分析检测样品中是否含有哈维氏弧菌、副溶血弧菌或石斑鱼虹彩病毒，具体为：将扩增产物进行凝胶电泳，若有梯状条带，则样品中含有哈维氏弧菌、副溶血弧菌或石斑鱼虹彩病毒；若无梯状条带，则样品中不含有哈维氏弧菌、副溶血弧菌和石斑鱼虹彩病毒。
所述的环介导等温扩增反应体系总体积25μL，包括10×ThermoPol Buffer 2.5μL，100mmol/L的MgSO41μL，10mmol/L的dNTP Mix 4μL，50μmol/L的VH-FIP、VH-BIP各0.56μL，10μmol/L的VH-F3、VH-B3各0.4μL，25μmol/L的VH-LF、VH-LB各0.48μL，50μmol/L的VP-FIP、VP-BIP各0.56μL，10μmol/L的VP-F3、VP-B3各0.4μL，25μmol/L的VP-LF、VP-LB各0.48μL，50μmol/L的SGIV-FIP、SGIV-BIP各0.48μL，10μmol/L的SGIV-F3、SGIV-B3各0.4μL，25μmol/L的SGIV-LF、SGIV-LB各0.48μL，8U Bst DNA聚合酶1μL，100mmol/L的甜菜碱1.5μL、含20mmol/LMnCl2浓度的5mmol/L钙黄绿素显色液0.5μL和基因组DNA模板1μL，余量为去离子水。
所述的环介导等温扩增反应的反应条件优选为：62℃反应30min，80℃终止反应5min。
本发明与现有技术相比的有益效果：本发明根据哈维氏弧菌的Toic基因、副溶血弧菌的DNAJ基因和石斑鱼虹彩病毒的RAD2基因设计特异性引物组，具有很好的特异性，可同时检测哈维氏弧菌、副溶血弧菌和石斑鱼虹彩病毒。本发明设计和筛选了一套特异性检测引物组以及含有该引物组的检测试剂盒和使用该检测试剂盒通过环介导等温扩增的检测方法，进而确定检测的样品中是否存在哈维氏弧菌、副溶血弧菌或石斑鱼虹彩病毒。本发明的检测引物组，检测试剂盒和检测方法具特异性强，操作方便简单，检测时间短，无需昂贵的仪器设备，可同时检测样品中是否含有哈维氏弧菌、副溶血弧菌或石斑鱼虹彩病毒三种病原等优点，特别适合基层的现场检测，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1是特异性实验中LAMP扩增产物的显色分析结果图；1：含哈维氏弧菌Toic基因的重组质粒、副溶血弧菌DNAJ基因的重组质粒及石斑鱼虹彩病毒RAD2基因的重组质粒的混合液；2：哈维氏弧菌；3：副溶血弧菌；4：石斑鱼虹彩病毒；5：溶藻弧菌；6：霍乱弧菌；7：创伤弧菌；8：拟态弧菌；9：阿尔法克弧菌；10：坎氏弧菌；11：欧氏弧菌；12：金黄色葡萄球菌；13：神经坏死病毒；14：传染性脾肾坏死病毒；15：虾血细胞虹彩病毒；16：传染性皮下及造血组织坏死病毒；17：白斑综合症病毒；18：超纯水；其中1～4为亮绿色，5～18为橙黄色。
图2是特异性实验中LAMP扩增产物的凝胶电泳结果图；M：标准分子量DL2000；1：含哈维氏弧菌Toic基因的重组质粒、副溶血弧菌DNAJ基因的重组质粒及石斑鱼虹彩病毒RAD2基因的重组质粒的混合液；2：哈维氏弧菌；3：副溶血弧菌；4：石斑鱼虹彩病毒；5：溶藻弧菌；6：霍乱弧菌；7：创伤弧菌；8：拟态弧菌；9：阿尔法克弧菌；10：坎氏弧菌；11：欧氏弧菌；12：金黄色葡萄球菌；13：神经坏死病毒；14：传染性脾肾坏死病毒；15：虾血细胞虹彩病毒；16：传染性皮下及造血组织坏死病毒；17：白斑综合症病毒；18：超纯水。
图3是灵敏性实验中LAMP扩增产物的显色分析结果图；1：1fg/ml；2：10fg/ml，3：100fg/ml，4：1pg/ml，5：10pg/ml，6：100pg/ml，7：1ng/ml，8：10ng/ml，9：100ng/ml，10：含哈维氏弧菌Toic基因的重组质粒、副溶血弧菌DNAJ基因的重组质粒及石斑鱼虹彩病毒RAD2基因的重组质粒的混合液。
图4是灵敏性实验中LAMP扩增产物的凝胶电泳结果图；1：1fg/ml；2：10fg/ml，3：100fg/ml，4：1pg/ml，5：10pg/ml，6：100pg/ml，7：1ng/ml，8：10ng/ml，9：100ng/ml，10：含哈维氏弧菌Toic基因的重组质粒、副溶血弧菌DNAJ基因的重组质粒及石斑鱼虹彩病毒RAD2基因的重组质粒的混合液；M：标准分子量DL2000。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1：引物的设计与合成
根据环介导等温扩增引物的设计原则，在GenBank数据库中查找哈维氏弧菌、副溶血弧菌及石斑鱼虹彩病毒适用于环介导等温扩增的靶基因序列，最终选择特异性较强的哈维氏弧菌的Toic基因(GenBank登录号为APP06536.1)、副溶血弧菌的DNAJ基因(GenBank登录号为AWA88525.1)及石斑鱼虹彩病毒的RAD2基因(GenBank登录号为YP_164192.1)为靶基因。根据特异性基因的特异性区域，依照环介导等温扩增引物设计原则，利用LAMP引物设计软件Primer Explore V4设计多套引物，并筛选出一组特异性最佳的引物组。
由此设计的多重环介导等温扩增检测引物为：
VH-F3：5’-TCCTTCGAGTTTCTCAAGCG-3’，
VH-B3：5’-TCACGTAGCGATTCGTAGCT-3’；
VH-FIP：5’-CTAGTTGGCGACCAACCGCTCGCGCACAAGACAACCTAG-3’，VH-BIP：
5’-TCACTGACGTACACGATGCGCCGAGTTTTCCGCCAAGACT-3’；
VH-LF：5’-GCTTTTTCTGCACGAACGAA-3’，
VH-LB：5’-AAGCACAATACGATGCAGTACTTG-3’；
VP-F3：5’-GTCTATCTGGCGAAGGCG-3’，
VP-B3：5’-ACATACGGCCAGTTTGTGTT-3’；
VP-FIP:5’-TTGCCGTCACGCTCGAAAATGTGAAATGGGTGCACCATCAGG-3’,
VP-BIP：5’-AGCTTTGCTATGGCTGCACTCGCTGACGGCACTTTTAGGCT-3’；
VP-LF：5’-TGCTCTTTCACGTGTACTTGTACG-3’，
VP-LB：5’-GAAGTTGAAGTTCCAACACTTGATG-3’；
SGIV-F3：5’-AGGGACTGAAGCTGTTGCT-3’，
SGIV-B3：5’-GGATCGCCGTCAAACACAA-3’；
SGIV-FIP:5’-AGGGTCTTGCCGGAGAGCTTCAAGAGTTCAGGTGTGGAGG-3’,SGIV-BIP：5’-ACACACAGCGTGGCAGTATCTGATAGCGTTTACGCGCCTC-3’；SGIV-LF：5’-GTTTAGGCACACCGTAAAAT-3’，SGIV-LB：5’-TACTGTTTATGCTGTGTTGCCTCA-3’。
实施例2：核酸提取
将哈维氏弧菌以及副溶血弧菌、溶藻弧菌、霍乱弧菌、创伤弧菌、拟态弧菌、阿尔法克弧菌、坎氏弧菌、欧氏弧菌分别接种到LB液体培养基中，30℃过夜培养；将金黄色葡萄球菌分别接种到LB液体培养基中，37℃过夜培养。使用细菌基因组DNA提取试剂盒提取各菌株的基因组DNA，并作为LAMP扩增反应的模板。将分别含有石斑鱼虹彩病毒、神经坏死病毒、传染性脾肾坏死病毒、虾血细胞虹彩病毒、染性皮下及造血组织坏死病毒、白斑综合症病毒的组织样品使用病毒基因组DNA提取试剂盒提取病毒基因组DNA，并作为LAMP扩增反应的模板。
实施例3：Toic、DNAJ及RAD2重组质粒的构建
分别构建哈维氏弧菌Toic基因、副溶血弧菌DNAJ基因、石斑鱼虹彩病毒RAD2基因的重组质粒DNA，制备方法为：使用T1-simple vector作为载体，分别以哈维氏弧菌的Toic基因、副溶血弧菌的DNAJ基因及石斑鱼虹彩病毒RAD2基因为DNA目的片段，通过连接酶分别将Toic、DNAJ及RAD2目标片段连接到T1-simple vector上，构建重组质粒T1-Toic、T1-DNAJ及T1-RAD2，并转化到Escherichia coli DH5α感受态细胞中，经100mg/mL氨苄青霉素筛选出阳性克隆，用质粒提取试剂盒提取重组质粒，最后经PCR检测并送测序，检测重组质粒是否构建成功。
实施例4：LAMP方法的特异性
样品的环介导等温扩增反应体系为25μL，包括10×ThermoPol Buffer 2.5μL，100mmol/L的MgSO41μL，10mmol/L的dNTP Mix 4μL，50μmol/L的VH-FIP、VH-BIP各0.56μL，10μmol/L的VH-F3、VH-B3各0.4μL，25μmol/L的VH-LF、VH-LB各0.48μL，50μmol/L的VP-FIP、VP-BIP各0.56μL，10μmol/L的VP-F3、VP-B3各0.4μL，25μmol/L的VP-LF、VP-LB各0.48μL，50μmol/L的SGIV-FIP、SGIV-BIP各0.48μL，10μmol/L的SGIV-F3、SGIV-B3各0.4μL，25μmol/L的SGIV-LF、SGIV-LB各0.48μL，8U Bst DNA聚合酶1μL，100mmol/L的甜菜碱1.5μL、含20mmol/LMnCl2浓度的5mmol/L钙黄绿素显色液0.5μL和基因组DNA模板(分别为实施例2获得的各基因组DNA)1μL，去离子水补齐至25μL。
阳性对照质控品的环介导等温扩增体系为25μL，包括10×ThermoPol Buffer2.5μL，100mmol/L的MgSO41μL，10mmol/L的dNTP Mix 4μL，50μmol/L的VH-FIP、VH-BIP各0.56μL，10μmol/L的VH-F3、VH-B3各0.4μL，25μmol/L的VH-LF、VH-LB各0.48μL，50μmol/L的VP-FIP、VP-BIP各0.56μL，10μmol/L的VP-F3、VP-B3各0.4μL，25μmol/L的VP-LF、VP-LB各0.48μL，50μmol/L的SGIV-FIP、SGIV-BIP各0.48μL，10μmol/L的SGIV-F3、SGIV-B3各0.4μL，25μmol/L的SGIV-LF、SGIV-LB各0.48μL，8U Bst DNA聚合酶1μL，100mmol/L的甜菜碱1.5μL、含20mmol/LMnCl2浓度的5mmol/L钙黄绿素显色液0.5μL和人工构建的T1-Toic、T1-DNAJ、T1-RAD2的质粒混合液1μL，去离子水补齐至25μL。
阴性对照质控品的环介导等温扩增反应体系为25μL，包括10×ThermoPol Buffer2.5μL，100mmol/L的MgSO41μL，10mmol/L的dNTP Mix 4μL，50μmol/L的VH-FIP、VH-BIP各0.56μL，10μmol/L的VH-F3、VH-B3各0.4μL，25μmol/L的VH-LF、VH-LB各0.48μL，50μmol/L的VP-FIP、VP-BIP各0.56μL，10μmol/L的VP-F3、VP-B3各0.4μL，25μmol/L的VP-LF、VP-LB各0.48μL，50μmol/L的SGIV-FIP、SGIV-BIP各0.48μL，10μmol/L的SGIV-F3、SGIV-B3各0.4μL，25μmol/L的SGIV-LF、SGIV-LB各0.48μL，8U Bst DNA聚合酶1μL，100mmol/L的甜菜碱1.5μL、含20mmol/LMnCl2浓度的5mmol/L钙黄绿素显色液0.5μL和超纯水1μL，去离子水补齐至25μL。
分别将上述3种环介导等温扩增体系混合均匀后，放入恒温水浴锅中，反应条件为62℃，30min；终止反应为80℃，5min。
在反应体系中添加了钙黄绿素显色液(含MnCl2)，在反应结束后，观察反应产物颜色是否发生变化，如颜色呈亮绿色，为阳性；颜色呈橙色，为阴性。如图1所示，钙黄绿素荧光显色法检测结果显示：哈维氏弧菌、副溶血弧菌、石斑鱼虹彩病毒和阳性对照质控品扩增产物呈亮绿色，为阳性；而溶藻弧菌、霍乱弧菌、创伤弧菌、拟态弧菌、阿尔法克弧菌、坎氏弧菌、欧氏弧菌和金黄色葡萄球菌、神经坏死病毒、传染性脾肾坏死病毒、虾血细胞虹彩病毒、传染性皮下及造血组织坏死病毒、白斑综合症病毒以及超纯水等的扩增反应产物呈橙黄色，为阴性。
环介导等温扩增反应结束后，取5μL的扩增产物，点样于2％的琼脂糖凝胶进行电泳检测，180V通电20min，如图2所示，电泳分析检测结果显示，哈维氏弧菌、副溶血弧菌、石斑鱼虹彩病毒和阳性对照质控品的扩增产物，电泳条带呈特异性梯状条带(阳性)；而溶藻弧菌、霍乱弧菌、创伤弧菌、拟态弧菌、阿尔法克弧菌、坎氏弧菌、欧氏弧菌和金黄色葡萄球菌、神经坏死病毒、传染性脾肾坏死病毒、虾血细胞虹彩病毒、传染性皮下及造血组织坏死病毒、白斑综合症病毒以及超纯水的扩增产物，其电泳结果无特异性条带(阴性)。这表明本发明的多重环介导等温扩增检测引物组具有极高的专一性，特异性强，因此可以用于快速的检测样品中是否同时含有哈维氏弧菌、副溶血弧菌或石斑鱼虹彩病毒。
实施例5：LAMP方法的灵敏度
将提取的重组质粒T1-Toic、T1-DNAJ、T1-RAD2稀释到相同的浓度并按1:1:1等体积混合，使混合质粒的终浓度为1μg/ml，再用ddH2O进行10倍梯度稀释,分别为1fg/ml，10fg/ml，100fg/ml，1pg/ml，10pg/ml，100pg/ml，1ng/ml，10ng/ml，100ng/ml，作为LAMP灵敏度检测的DNA模板。
LAMP灵敏度检测的环介导等温扩增反应体系为25μL，包括：10×ThermoPolBuffer 2.5μL，100mmol/L的MgSO41μL，10mmol/L的dNTP Mix 4μL，50μmol/L的VH-FIP、VH-BIP各0.56μL，10μmol/L的VH-F3、VH-B3各0.4μL，25μmol/L的VH-LF、VH-LB各0.48μL，50μmol/L的VP-FIP、VP-BIP各0.56μL，10μmol/L的VP-F3、VP-B3各0.4μL，25μmol/L的VP-LF、VP-LB各0.48μL，50μmol/L的SGIV-FIP、SGIV-BIP各0.48μL，10μmol/L的SGIV-F3、SGIV-B3各0.4μL，25μmol/L的SGIV-LF、SGIV-LB各0.48μL，8U Bst DNA聚合酶1μL，100mmol/L的甜菜碱1.5μL、含20mmol/LMnCl2浓度的5mmol/L钙黄绿素显色液0.5μL以及各稀释浓度的质粒混合液1μL，去离子水补齐至25μL。
LAMP扩增体系混合均匀后，放入恒温水浴锅中，反应条件为62℃，30min；终止反应为80℃，5min。
结果如图3和图4所示，本发明的环介导等温扩增检测方法的灵敏度为：100fg/ml。钙黄绿素荧光显色法检测结果为100fg/ml～100ng/ml为亮绿色(阳性)，1fg/ml、10fg/ml为橙黄色(阴性)；2％凝胶电泳结果为100fg/ml～100ng/ml有特异性条带(阳性)，1fg/ml、10fg/ml无特异性条带(阴性)；荧光显色法检测结果(图3)与凝胶电泳结果(图4)相一致，由此说明，本发明的多重环介导等温扩增检测方法的灵敏度为100fg/ml。
钙黄绿素荧光显色法与凝胶电泳分析检测结果一致，证明此方法数据可靠。可以直接通过扩增产物颜色判断样品中是否含有哈维氏弧菌、副溶血弧菌或石斑鱼虹彩病毒，极大地缩短了检测时间。
综上所述，本发明的哈维氏弧菌、副溶血弧菌和石斑鱼虹彩病毒的多重环介导等温扩增检测引物组及检测方法不仅可以快速、简便、灵敏地检测到哈维氏弧菌、副溶血弧菌或石斑鱼虹彩病毒，而且特异性强，准确性高。
Claims (10)
1.一种同时检测多种病原的多重LAMP引物组，其特征在于，所述的多种病原为哈维氏弧菌、副溶血弧菌和石斑鱼虹彩病毒，所述的多重LAMP引物组如SEQ ID NO.1-18所示。
2.权利要求1所述多重LAMP引物组在同时检测多种病原中的应用，其特征在于，所述的多种病原为哈维氏弧菌、副溶血弧菌和石斑鱼虹彩病毒，所述的检测为非疾病诊断和治疗的目的。
3.权利要求1所述多重LAMP引物组在制备同时检测多种病原试剂盒中的应用，其特征在于，所述的多种病原为哈维氏弧菌、副溶血弧菌和石斑鱼虹彩病毒。
4.根据权利要求3所述多重LAMP引物组在制备同时检测多种病原试剂盒中的应用，其特征在于，所述试剂盒包括环介导等温扩增反应液、Bst DNA聚合酶、含MnCl2的钙黄绿素显色液、阳性对照质控品、阴性对照质控品和多重LAMP引物组；所述的多种病原为哈维氏弧菌、副溶血弧菌和石斑鱼虹彩病毒。
5.根据权利要求4所述多重LAMP引物组在制备同时检测多种病原试剂盒中的应用，其特征在于，所述的阳性对照质控品为含哈维氏弧菌的Toic基因的质粒DNA、副溶血弧菌的DNAJ基因的质粒DNA及石斑鱼虹彩病毒的RAD2基因的质粒DNA的混合液；所述的阴性对照质控品为超纯水。
6.一种同时检测多种病原的多重LAMP检测方法，其特征在于，所述方法非疾病诊断和治疗目的，所述的病原为哈维氏弧菌、副溶血弧菌和石斑鱼虹彩病毒，所述方法具体包括以下步骤：
(1)对样品进行收集，使用病毒和细菌DNA提取试剂盒提取病毒和细菌的基因组DNA，等比例混合后作为LAMP反应的模板；
(2)使用权利要求1所述的多重LAMP引物组，与环介导等温扩增反应液、Bst DNA聚合酶、含MnCl2的钙黄绿素显色液及样品基因组DNA混合形成环介导等温扩增反应体系，进行环介导等温扩增反应；
(3)扩增反应结束后，通过钙黄绿素荧光显色法和或凝胶电泳分析检测样品中是否含有哈维氏弧菌、副溶血弧菌或石斑鱼虹彩病毒。
7.根据权利要求6所述方法，其特征在于，所述的通过钙黄绿素荧光显色法检测样品中是否含有哈维氏弧菌、副溶血弧菌或石斑鱼虹彩病毒，具体为：若扩增产物颜色为亮绿色，则样品中含有哈维氏弧菌、副溶血弧菌或石斑鱼虹彩病毒；若扩增产物颜色保持橙黄色不变，则样品中不含有哈维氏弧菌、副溶血弧菌和石斑鱼虹彩病毒。
8.根据权利要求6所述方法，其特征在于，所述的通过凝胶电泳分析检测样品中是否含有哈维氏弧菌、副溶血弧菌或石斑鱼虹彩病毒，具体为：将扩增产物进行凝胶电泳，若有梯状条带，则样品中含有哈维氏弧菌、副溶血弧菌或石斑鱼虹彩病毒；若无梯状条带，则样品中不含有哈维氏弧菌、副溶血弧菌和石斑鱼虹彩病毒。
9.根据权利要求6所述方法，其特征在于，所述的环介导等温扩增反应体系总体积25μL，包括10×ThermoPol Buffer 2.5μL，100mmol/L的MgSO41μL，10mmol/L的dNTP Mix 4μL，50μmol/L的VH-FIP、VH-BIP各0.56μL，10μmol/L的VH-F3、VH-B3各0.4μL，25μmol/L的VH-LF、VH-LB各0.48μL，50μmol/L的VP-FIP、VP-BIP各0.56μL，10μmol/L的VP-F3、VP-B3各0.4μL，25μmol/L的VP-LF、VP-LB各0.48μL，50μmol/L的SGIV-FIP、SGIV-BIP各0.48μL，10μmol/L的SGIV-F3、SGIV-B3各0.4μL，25μmol/L的SGIV-LF、SGIV-LB各0.48μL，8U Bst DNA聚合酶1μL，100mmol/L的甜菜碱1.5μL、含20mmol/L MnCl2浓度的5mmol/L钙黄绿素显色液0.5μL和基因组DNA模板1μL，余量为去离子水。
10.根据权利要求6所述方法，其特征在于，所述的环介导等温扩增反应的反应条件为：62℃反应30min，80℃终止反应5min。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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