CN115852006A

CN115852006A - 基于era技术的对虾肝肠胞虫快速检测方法及引物与探针组合

Info

Publication number: CN115852006A
Application number: CN202211648290.1A
Authority: CN
Inventors: 王孟强; 李姣冰; 胡景杰; 包振民; 王燕
Original assignee: Sanya Institute Of Oceanography Ocean University Of China; Ocean University of China
Current assignee: Sanya Institute Of Oceanography Ocean University Of China; Ocean University of China
Priority date: 2022-12-21
Filing date: 2022-12-21
Publication date: 2023-03-28

Abstract

本发明提出了基于ERA技术的对虾肝肠胞虫快速检测方法及引物与探针组合，包括一对ERA特异性引物和一条特异性荧光探针，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。本发明建立的ERA技术的对虾肝肠胞虫快速检测方法，可以明显缩短对虾肝肠胞虫的检测时间；同时操作简单，灵敏度高、特异性强，可满足快速检测的需求，且检测成本低。

Description

基于ERA技术的对虾肝肠胞虫快速检测方法及引物与探针组合

技术领域

本发明涉及病原体检测技术领域，特别涉及基于ERA技术的对虾肝肠胞虫快速检测方法及引物与探针组合。

背景技术

肝肠胞虫(Enterocytozoon hpatopenaei,EHP)又称肠胞虫，隶属于真菌界(Fungi)、微孢子门(Microsporidia)，肠胞虫属(Enterocytozoon)，是一种胞内寄生虫，主要寄生于对虾的肝胰腺上皮细胞，具有高度传染性。EHP最早于2003年在泰国斑节对虾(Penaeus monodon)中发现，随后国内外对其开展大量相关研究。近年来，EHP引起对虾生长缓慢的现象在东南亚频繁报道。从2013年开始，我国多个省市的虾类养殖基地先后发现了EHP感染，并且感染率呈上涨趋势。被感染的对虾虽不影响饲养和存活率，但对虾通常表现为生长缓慢，个体大小不均，免疫力低下，易被其他病原体感染，已成为我国对虾养殖的重要病原之一。由于目前尚无治疗EHP的有效方法，只能通过即时检测和综合防控，才能避免病原体的流行与扩散。

EHP个体微小，被感染的对虾症状不明显，因此，很难在现场确诊。传统的组织切片方法制作时间长，流程复杂，在肝肠胞虫含量低的条件下不易发现，不适合作为判断是否感染发病的技术手段。现有免疫学检测方法，虽可以检测不同种类的微孢子虫，但是灵敏度不高，易出现假阳性，抗体筛查过程缓慢，且价格昂贵。而分子生物学方法具有快速、简便和灵敏度高等特点，已成为实验室检测EHP的常规手段。目前常用的检测方法有普通PCR、巢式PCR、qRT-PCR、原位杂交、环介导等温扩增技术(LAMP)等方法。这些方法普遍存在耗时长，操作复杂，成本高昂的特点。其中LAMP技术可在恒温条件进行，但引物体系复杂，易产生假阳性。这些特点限制了上述方法的现场检测使用。因此，需开发一种快速简便的检测方法，对EHP的预防具有重要意义。本发明建立了ERA恒温荧光检测EHP的方法，快速方便，准确可靠，满足养殖场现场检测需求。

酶促重组等温扩增(Enzymatic Recombinase Amplification，ERA)是一种恒温扩增技术，反应体系中的重组酶与引物结合形成蛋白-DNA复合物,与核酸模板上的同源序列结合，同时在单链DNA结合蛋白(SSB)协助下,DNA聚合酶引导产生解链和DNA合成,最终形成新的DNA双链,从而实现高效扩增。与其他恒温扩增技术相比，ERA可在25～45℃条件下进行扩增反应，不需要热变性，对硬件设备要求低，并且核酸扩增速度较快，可在20min内获得目的扩增产物，能够在现场检测快速出具报告，极大缩短了检测时间。

发明内容

本发明为解决现有技术中出现的问题，提供了一种对虾肝肠胞虫ERA恒温荧光检测方法及引物与探针组合，可以明显缩短对虾肝肠胞虫的检测时间；同时操作简单，灵敏度高、特异性强，满足快速检测的需求，为对虾养殖中肝肠胞虫的监测提供了一种有效手段。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

本发明目的之一是，提供基于ERA技术的对虾肝肠胞虫的引物与探针组合，包括一对ERA特异性引物和一条特异性荧光探针：

正向引物：5'TTGCAGAGTGTTGTTAAGGGTTTAAGTA3'(SEQ ID NO.1)

反向引物：5'CTTCTTTAAGCTGTTTGTCTCCAACTGTATT 3'(SEQ ID NO.2)

探针：5'AGAGACGATATTTACACAGACACAGCATTT 3'(SEQ ID NO.3)(THF)5'TAGGATATGAGCTTTC 3'(SEQ ID NO.4)(C3-SPACER)

优选地，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的所述探针的3'端标记荧光报告基团，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的所述探针的5'端标记荧光淬灭基团；在所述荧光报告基团和荧光淬灭基团之间插入一个四氢呋喃。

优选地，所述荧光报告基团为FAM，荧光淬灭基团为BHQ1；在ERA体系中引入带荧光标记的探针，配合相应扩增引物，可以有效提高ERA检测的特异性。

优选地，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的所述探针，自5'端起第30位碱基T标记荧光报告基团(6FAM-dT)，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的所述探针，自5'端起第1位碱基T标记荧光淬灭基团(BHQ1-dT)；核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的所述探针，3'端还标记阻抑聚合酶延伸或扩增的修饰基团(C3-SPACER)。

本发明目的之二是，提供上述的引物与探针组合用于ERA技术的对虾肝肠胞虫的快速检测方法，包括如下步骤：

1)提取待测样本对虾的DNA；

2)以该DNA为模板，采用上述引物对和荧光探针进行ERA扩增，用荧光检测装置检测扩增体系中荧光信号的变化，判断待测样本对虾是否感染肝肠胞虫。

优选地，所述样本为成虾，则提取肝胰腺组织，所述样本为虾苗，则提取甲壳下组织。

优选地，所述ERA扩增的温度为36～42℃；推荐温度为42℃。

优选地，所述ERA扩增的反应时间为20min，共40个循环。

优选地，所述ERA扩增的反应体系包括所述引物对、所述探针、溶解剂、DNA模板和激活剂；所述引物的加量为2.0～3.0μL，探针加量为0.6-1.0μL。

优选地，ERA扩增结果判定方法如下：

ERA荧光扩增曲线呈“S”型且CT值≤35，判断为对虾肝肠胞虫阳性结果；

ERA荧光扩增曲线不呈“S”型或CT值＞35，判断为对虾肝肠胞虫阴性结果。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)操作简便。本发明涉及的检测方法可摆脱对大型仪器及专业检测实验室的依赖，在36～42℃下完成检测，无需专业操作人员，可在户外进行，有实际的使用需求。

(2)高效快速。本发明涉及的检测方法整个过程可在半小时内完成，提高对虾肝肠胞虫检测的效率。

(3)高特异及灵敏性。本发明涉及的检测方法对对虾常见病原基因组DNA，包括急性肝胰腺坏死病(Acute hepatopancreatic necrosis disease,AHPND)病原菌、传染性表皮与造血组织坏死症病毒(Infectious hypodermal and hematopoietic necrosisvirus,IHHNV)、白斑综合症病毒(white spot syndrome virus,WSSV)，均不发生非特异性扩增；检测灵敏性为10¹copies/μL。

(4)成本低。本发明所使用的设备结构简单，检测成本低，适合水产类对成本敏感的客户，适合推广使用。

附图说明

图1为最佳ERA引物对的筛选结果。其中，第一组引物对为EHP-F1/R1，第二组引物对为EHP-F2/R2。

图2为ERA扩增条件温度优化结果。其中，温度梯度为：30℃、33℃、36℃、39℃、42℃、45℃。

图3为ERA反应体系引物浓度优化结果。其中，反应体系中引物加量分别为1.5μL，2.0μL，2.5μL，3.0μL。

图4为ERA反应体系探针浓度优化结果。其中，反应体系中探针加量分别为0.6μL，0.8μL，1.0μL。

图5为本发明的灵敏性检测结果。其中，模板浓度分别为10⁵copies/μL、10⁴copies/μL、10³copies/μL、10²copies/μL、10¹copies/μL、10⁰copies/μL；NTC为阴性对照。

图6为本发明的特异性检测结果。其中，包含对虾白斑综合症病毒(WSSV)、传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)、急性肝胰腺坏死病(AHPND)病原菌和健康对虾的DNA；NTC为阴性对照。

具体实施方式

下面结合具体附图及实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是以下实施例只用于对本发明的进一步说明。

下述实施例中所使用的实验方法无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的定量实验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中的ERA荧光型核酸扩增试剂盒是苏州先达基因科技有限公司的产品，产品货号：KS103。

实施例1-引物探针设计及筛选结果

本发明以对虾肝肠胞虫胞壁蛋白SWP基因为检测靶基因，Genebank数据库中登录号为KX258197。首先在NCBI上找到SWP基因的保守区，使用primer premier 5.0软件设计了2组引物和探针，并在NCBI数据库中进行BLAST比对，引物和探针的序列如表1所示。上述引物和探针均由生工生物工程(上海)股份公司合成。

表1引物和探针序列

使用ERA荧光型核酸扩增试剂盒，对表1中设计合成的引物进行筛选。

反应体系为50μL，包含各2.1μL(10μM)的正、反向引物，0.6μL(10μM)的探针，20μL的溶解剂，2μL的阳性标准品，加无菌水至48μL。混匀后，将48μL预混液转移至每管冻干粉中，振荡混匀并短暂离心，使冻干粉充分溶解。对于每份样本，在反应管盖上加上2μL激活剂，通过短暂离心使激活剂进入预混液中，短暂振荡混匀并再次快速离心。将反应管迅速放入实时荧光定量PCR仪中，在40℃下反应20min，每30秒采集一次FAM通道荧光值。

该体系中所涉及的阳性标准品为包含EHP检测靶基因的重组质粒，将质粒进行10倍梯度稀释，选择浓度为10⁵copies/μL作为反应模板。

引物的筛选结果如图1所示，根据比较Ct值大小及荧光强度高低，选定EHP-F1/R1为最佳引物对并进行后续实验。

实施例2-ERA扩增条件温度优化

为确定ERA扩增反应的最适温度，使用EHP-F1/R1引物对进行反应试验，操作如实施例1，分别在30℃、33℃、36℃、39℃、42℃、45℃条件下进行扩增。

温度优化结果如图2所示。结果表明，ERA反应体系在36～42℃能进行较好扩增，推荐温度为42℃。

实施例3-ERA反应体系中引物探针浓度优化

为确定ERA扩增反应中引物探针最适浓度，我们测试了不同引物浓度(1.5μL，2.0μL，2.5μL，3.0μL)和探针浓度(0.6μL，0.8μL，1.0μL)，操作如实施例1，反应在42℃下进行。

引物探针浓度优化结果分别如图3，4。结果表明，ERA反应体系中引物最适浓度为400nM，探针最适浓度为120nM。

实施例4-ERA检测灵敏性试验

为确定对虾肝肠胞虫ERA扩增反应的灵敏性，以阳性标准品为模板，并将其10倍梯度稀释(1×10⁵～1×10⁰copies/μL)，以这6个浓度梯度进行扩增试验。

检测结果如5所示。结果表明：本发明的对虾肝肠胞虫ERA检测方法的灵敏性为10¹copies/μL。

实施例5-ERA检测特异性试验

为确定对虾肝肠胞虫ERA扩增反应的特异性，分别以对虾白斑综合症病毒(WSSV)、传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)、急性肝胰腺坏死病(AHPND)病原菌和健康对虾的DNA进行检测。

检测结果如6所示。结果表明：本发明的对虾肝肠胞虫ERA检测方法仅对EHP样品出现正常扩增，WSSV、IHHNV、AHPND、健康对虾样品及阴性对照(无菌水)均未出现扩增。上述结果说明，本发明的设计的引物与探针不与其他病原发生交叉反应，不会出现假阴性，特异性强。

实施例6-肝肠胞虫的ERA恒温荧光检测方法

步骤如下：

1)提取待测样本对虾的DNA；

1.1样本选择：若为成虾则取肝胰腺，若为虾苗则取甲壳下组织。

1.2样本DNA提取：采用核酸快提试剂盒、海洋动物组织DNA提取试剂盒或者传统方法提取。

2)以该DNA为模板，采用上述引物对和荧光探针进行ERA扩增，用荧光检测装置检测扩增体系中荧光信号的变化；

2.1按照下表2所述制备每份样本的预混液：

ERA反应体系组分	每管加样量/μL
		溶解剂	20
正向引物(10μM)	2
		反向引物(10μM)	2
探针(10μM)	0.6
		模板DNA	2
无菌水	21.4
		体积	48

将预混液充分振荡混匀并短暂离心。

2.2对于每份样本，将48μL预混液转移至每管冻干粉中。振荡混匀并短暂离心。

2.3对于每份样本，在反应管盖上加上2μL激活剂，小心盖紧管盖，通过短暂离心使激活剂进入预混液中。短暂振荡混匀并再次快速离心

2.4将反应管放入荧光检测装置，在42℃下反应20min，每30秒采集一次FAM通道荧光值。(检测设备：任何能激发和检测所选荧光团，并能将温度稳定于36-42℃的荧光检测仪都适用，如GS8荧光恒温扩增仪，ABI 7500，LightCycler480，CFX 96等荧光定量PCR仪等。)

2.5反应结束后，保存数据并弃置样本管。

3)结果判定。根据比较Ct值大小及荧光强度高低对对虾中肝肠胞虫进行定性检测。

其结果判定根据最终荧光扩增曲线分析待测样本，荧光曲线呈“S”型且CT值≤35，判断为对虾肝肠胞虫阳性结果；当待测样本曲线不呈“S”型或CT值＞35，判断为对虾肝肠胞虫阴性结果。

本发明选取肝肠胞虫的SWP基因作为检测的靶基因，针对靶基因序列设计了ERA检测专用引物和探针，并建立肝肠胞虫的ERA检测方法。通过实验证明：本发明的肝肠胞虫ERA检测方法可在36～42℃下30min内完成检测，灵敏性为10¹copies/μL，与我国水产行业标准推荐的nest PCR、qPCR的检测水平相当，并与WSSV、IHHNV、AHPND、健康对虾样品及阴性对照(无菌水)均未出现非特异性扩增，快速方便，准确可靠，可满足养殖场现场检测需求。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.基于ERA技术的对虾肝肠胞虫的引物与探针组合，其特征在于，包括一对ERA特异性引物和一条特异性荧光探针，所述引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2所示，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.4所示。

2.根据权利要求1的基于ERA技术的对虾肝肠胞虫的引物与探针组合，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的所述探针的3'端标记荧光报告基团，核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示的所述探针的5'端标记荧光淬灭基团；在所述荧光报告基团和荧光淬灭基团之间插入一个四氢呋喃。

3.根据权利要求2的基于ERA技术的对虾肝肠胞虫的引物与探针组合，其特征在于，所述荧光报告基团为FAM，荧光淬灭基团为BHQ1。

4.根据权利要求2的基于ERA技术的对虾肝肠胞虫的引物与探针组合，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的所述探针，自5'端起第30位碱基T标记荧光报告基团，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的所述探针，自5'端起第1位碱基T标记荧光淬灭基团；核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的所述探针，3'端还标记阻抑聚合酶延伸或扩增的修饰基团。

5.根据权利要求1～4任意一项所述的引物与探针组合用于ERA技术的对虾肝肠胞虫的快速检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)提取待测样本对虾的DNA；

6.根据权利要求5所述的引物与探针组合用于ERA技术的对虾肝肠胞虫的快速检测方法，其特征在于，所述样本为成虾，则提取肝胰腺组织，所述样本为虾苗，则提取甲壳下组织。

7.根据权利要求5所述的引物与探针组合用于ERA技术的对虾肝肠胞虫的快速检测方法，其特征在于，所述ERA扩增的温度为36～42℃。

8.根据权利要求5所述的引物与探针组合用于ERA技术的对虾肝肠胞虫的快速检测方法，其特征在于，所述ERA扩增的反应时间为20min，共40个循环。

9.根据权利要求5所述的引物与探针组合用于ERA技术的对虾肝肠胞虫的快速检测方法，其特征在于，所述ERA扩增的反应体系包括所述引物对、所述探针、溶解剂、DNA模板和激活剂；所述引物的加量为2.0～3.0μL，探针加量为0.6～1.0μL。

10.根据权利要求5所述的引物与探针组合用于ERA技术的对虾肝肠胞虫的快速检测方法，其特征在于，ERA扩增结果判定方法如下：