CN113234814A - 一种用于同时检测虾急性肝胰腺坏死症和肝肠孢子虫的多重rpa引物和探针组合物及检测方法 - Google Patents

一种用于同时检测虾急性肝胰腺坏死症和肝肠孢子虫的多重rpa引物和探针组合物及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物检测领域，特别涉及一种用于同时检测虾急性肝胰腺坏死症和肝肠孢子虫的多重RPA引物和探针组合物及检测方法。本发明公开了一种用于同时检测虾急性肝胰腺坏死症和肝肠孢子虫的多重RPA引物和探针组合物，该组合物包括用于检测虾急性肝胰腺坏死症的RPA引物和探针、用于检测肝肠孢子虫的RPA引物和探针，本发明所述的多重RPA引物和探针组合物特异性强，灵敏度高，检测结果准确。本发明还公开了一种急性肝胰腺坏死症和肝肠孢子虫的同时检测的方法，该方法成本低，不依赖复杂的仪器设备、反应快速灵敏，操作简单。

Description

一种用于同时检测虾急性肝胰腺坏死症和肝肠孢子虫的多重 RPA引物和探针组合物及检测方法
技术领域
本发明涉及生物检测领域，特别涉及一种用于同时检测虾急性肝胰腺坏死症和肝肠孢子虫的多重RPA引物和探针组合物及检测方法。
背景技术
虾是一种生活饮食中常见的水产品，在全球的需求量都是非常大的，然而微生物或病毒感染引起的虾传染病对虾养殖业危害极大。在这些传染病中，急性肝胰腺坏死综合征(AHPND) 能够在虾生长至25天时开始发病，传染快速，错过早期治疗可能造成100％的死亡率。肝肠孢子虫(EHP)虽然并不致命，但是具有传播快，临床症状不明显等特点，可以使得虾产量大大下降，对养殖户造成严重的经济损失。因此肝肠孢子虫也是目前虾养殖过程中需要时刻监控的传染病之一。目前为止，关于这两种传染病并没有有效的治疗方法，只能依靠早期诊断和传统的流行病防控措施来避免经济损失，因此在养殖场实地快速，便携地检测对于监控传染病的发展非常重要。
目前关于这两种传染病的分子诊断方法有很多，例如Nested PCR，qPCR等，这些方法虽然检测灵敏，但是都存在着一定的缺点，例如设备依赖性强，检测人员要求高，并不能满足偏远地区养殖场的检测需求。而随着检测技术的不断发展，等温扩增的方法也开始出现，例如LAMP，然而它虽然是等温扩增技术，但是它依旧需要一个相对精确的温控设备来实现最佳的反应，这也使得它的发展在很多场所还是受到限制。
发明内容
本发明旨在提供一种用于同时检测虾急性肝胰腺坏死症和肝肠孢子虫的多重RPA引物和探针组合物，该组合物特异性强，灵敏度高，检测结果准确。本发明还公开了一种急性肝胰腺坏死症和肝肠孢子虫的同时检测的方法，该方法成本低，不依赖复杂的仪器设备、反应快速灵敏，操作简单。
为了实现上述目的，本发明具体采用如下技术方案：
一种用于同时检测虾急性肝胰腺坏死症和肝肠孢子虫的多重RPA引物和探针组合物，其特征在于，所述多重RPA引物和探针组合物包括用于检测虾急性肝胰腺坏死症的RPA引物和探针、用于检测肝肠孢子虫的RPA引物和探针，其中：
所述用于检测虾急性肝胰腺坏死症的RPA正向引物、反向引物和探针序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3；
所述用于检测肝肠孢子虫的RPA正向引物、反向引物和探针序列分别如SEQ IDNO.4、 SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6。
优选的，用于检测虾急性肝胰腺坏死症的探针序列的5’端用FITC标记，3'端用C3-space 进行封闭，距离5'端的30碱基距离处用四氢呋喃取代原有碱基；
用于检测肝肠孢子虫的探针序列的5'端进行DIG标记，3'端用C3-space进行封闭，距离 5'端30碱基距离处用四氢呋喃取代原有碱基；
用于检测虾急性肝胰腺坏死症和肝肠孢子虫的反向引物进行Biotin的标记。
优选的，所述多重RPA引物和探针组合物中检测虾急性肝胰腺坏死症的RPA正向引物、反向引物和探针的摩尔比为1:1:0.3，所述用于检测肝肠孢子虫的RPA正向引物、反向引物和探针的摩尔比为1:1:0.3。
优选的，所述多重RPA引物和探针组合物中检测虾急性肝胰腺坏死症的RPA正向引物、反向引物和用于检测肝肠孢子虫的RPA正向引物、反向引物的摩尔比为3:1，所述检测虾急性肝胰腺坏死症的RPA探针与检测肝肠孢子虫的RPA探针的摩尔比为3:1。也就是说，检测虾急性肝胰腺坏死症的RPA正向引物和用于检测肝肠孢子虫的RPA正向引物的摩尔比是3:1，检测虾急性肝胰腺坏死症的RPA反向引物和用于检测肝肠孢子虫的RPA反向引物的摩尔比也是3:1。
一种同时检测虾急性肝胰腺坏死症和肝肠孢子虫的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求1～4任一项所述的用于同时检测虾急性肝胰腺坏死症和肝肠孢子虫的多重RPA引物和探针组合物。
优选的，所述试剂盒还包括dNTP、ATP、聚集剂PEG 20000、聚合酶Bsu、重组酶Uvsx、辅酶UvsY、单链结合蛋白SSB。
一种虾急性肝胰腺坏死症和肝肠孢子虫同时检测方法，所述同时检测的方法采用RPA检测方法，所述RPA扩增体系以50μL计为：
前述任一项所述的检测虾急性肝胰腺坏死症的正向引物终浓度300nM～450nM，反向引物终浓度300nM～450nM，探针终浓度90nM～135nM；
前述任一项所述的检测肝肠孢子虫的正向引物终浓度100nM～150nM、反向引物终浓度 100nM～150nM、探针终浓度30nM～45nM；
Rehydration Buffer 29.5μL；
虾DNA模板1μL；此处的虾DNA模板指的是从虾中所提取的所有的DNA，不仅包括虾自身的DNA，还包括病虾自身携带的寄生虫的DNA以及被感染的细菌的DNA。
浓度为280mM的MgOAc 2.5μL；
水；
dNTP；
ATP；
聚集剂PEG 20000；
聚合酶Bsu；
重组酶Uvsx；
辅酶UvsY；
单链结合蛋白SSB。
优选的，所述RPA扩增体系为：
检测虾急性肝胰腺坏死症的正向引物终浓度300nM～450nM，反向引物终浓度300nM～450nM，探针终浓度90nM～135nM；
检测肝肠孢子虫的正向引物终浓度100nM～150nM、反向引物终浓度100nM～150nM、探针终浓度30nM～45nM；
Rehydration Buffer 29.5μL；
虾DNA模板1μL；此处的虾DNA模板指的是从虾中所提取的所有的DNA，不仅包括虾自身的DNA，还包括病虾自身携带的寄生虫的DNA以及被感染的细菌的DNA。
浓度为280mM的MgOAc 2.5μL；
水补足至50μL；
将上述50μL混合液加入含有dNTP、ATP、聚集剂PEG 20000、聚合酶Bsu、重组酶Uvsx、辅酶UvsY、单链结合蛋白SSB的冻干粉剂或含有上述冻干粉剂的恒温扩增试剂盒中。
优选的，所述虾急性肝胰腺坏死症和肝肠孢子虫同时检测的方法的具体步骤包括如下：
(1)提取虾DNA；此处的虾DNA模板指的是从虾中所提取的所有的DNA，不仅包括虾自身的DNA，还包括病虾自身携带的寄生虫的DNA以及被感染的细菌的DNA。
(2)多重RPA扩增：使用前述任一项的扩增体系在37℃温度条件下，反应30min；
(3)结果测定：采用侧向流免疫层析试纸条对稀释后的多重RPA扩增产物进行检测。
优选的，所述侧向流免疫层析试纸条设置有抗FITC检测线、抗DIG检测线、抗Biotin 质控线。
有益效果：
本发明所述的多重RPA引物和探针组合物特异性强，灵敏度高，检测结果准确。
本发明的检测方法成本低，不依赖复杂的仪器设备、反应快速灵敏，操作简单。
附图说明
图1特殊标记RPA所获得的扩增产物及侧向流免疫层析试纸条特异性结合的检测原理图。
图2不同引物探针浓度配比单独检测AHPND和EHP结果图。
图3不同引物探针组合浓度配比双重检测结果图。
图4本发明实施例双重RPA-LFD特异性及灵敏度测试结果图。
图5双重RPA-LFD对实际样本中AHPND及EHP检测结果图。
图6巢式PCR对标方法对实际样本中AHPND及EHP检测结果图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。以下对至少一个示例性实施例的描述实际上仅仅是说明性的，决不作为对本发明及其应用或使用的任何限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
下面结合附图对本发明进行详细说明，以方便本领域技术人员理解本发明。
实验材料
急性肝胰腺坏死症感染样本、肝肠孢子虫感染样本、副溶血弧菌、创伤弧菌、霍乱弧菌、鳗弧菌、溶藻弧菌、鱼肠道弧菌由江苏省海洋渔业研究所提供；
Figure BDA0003139470670000052
nfo kit购自英国 TwistDx公司；侧向流免疫层析试纸条购自杭州优思达生物技术有限公司；磁珠基因组提取试剂盒购自天根生物技术有限公司。
样本准备
将江苏省海洋渔业研究所提供的不同地区养殖场的样本(表1)利用天根生物技术有限公司的磁珠基因组提取试剂盒提取基因组DNA，并且利用qPCR对基因组中急性肝胰腺坏死症和肝肠孢子虫进行定量。此处提取DNA步骤按照试剂盒说明步骤完成即可得到虾自身 DNA，若虾感染了细菌或寄生虫，也会同时提取得到细菌或寄生虫的DNA。
表1样本信息
Figure BDA0003139470670000051
Figure BDA0003139470670000061
Figure BDA0003139470670000071
引物和探针设计及修饰
急性肝胰腺坏死症和肝肠孢子虫检测的靶标基因分别为pirB基因(GenBankaccession number NC_025152.1)和swp基因(GenBank accession number KX258197.1)。
同时检测虾急性肝胰腺坏死症和肝肠孢子虫的多重RPA引物和探针组合物包括用于检测虾急性肝胰腺坏死症的RPA引物和探针、用于检测肝肠孢子虫的RPA引物和探针，其中：
所述用于检测虾急性肝胰腺坏死症的RPA正向引物、反向引物和探针序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3；
所述用于检测肝肠孢子虫的RPA正向引物、反向引物和探针序列分别如SEQ IDNO.4、 SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6。
如表1所示：
表2
Figure BDA0003139470670000072
其中用于pirB基因检测的探针SEQ ID NO.3的5'端进行链霉亲和素(FITC)标记，3'端用 C3-space进行封闭，距离5'端30碱基距离处用四氢呋喃(THF)取代原有碱基。用于swp基因检测的探针SEQ ID NO.6的5'端进行地高辛(DIG)标记，3'端用C3-space进行封闭，距离5' 端30碱基距离处用四氢呋喃(THF)取代原有碱基。所有反向引物均在5'端进行生物素(Biotin) 标记。修饰后的序列如表2所示：
表3
Figure BDA0003139470670000081
RPA-LFD反应体系
由于RPA反应体系内探针标记不同，侧向流免疫层析试纸条的标记也不同。在本实施例 RPA-LFD检测结果中，检测线T1标记了抗链霉亲和素FITC的抗体，所以它能够作为AHPND 检测线与带有链霉亲和素标记的AHPND特异性扩增产物进行结合，检测线T2标记了抗地高辛的抗体，所以它能够作为EHP检测线与带有地高辛标记的EHP特异性扩增产物进行结合，检测线C为质控线(图1)，图1中的A部分为RPA扩增，最终可获得带有不同标记的两种产物。B部分为双重RPA-LFD；C部分为可视化试纸条，其中检测线为T1和T2，质控线为C，由于标记不同，因此AHPND可在T1给出信号，EHP可在T2处给出信号。
RPA扩增体系经实验进行优化，优化后最佳反应体系以50μL计为：
AHPND正向引物(300nM)，反向引物(300nM)，探针(90nM)即1:1:0.3的比例进行配比；
EHP正向引物(100nM)、反向引物(100nM)、探针(30nM)同样以1:1:0.3的比例进行配比；
Rehydration Buffer 29.5μL；
模板1μL；
MgOAc(280mM)2.5μL；
水补足至50μL；
将上述50μL混合液加入含有dNTP、ATP、聚集剂PEG 20000、聚合酶Bsu、重组酶Uvsx、辅酶UvsY、单链结合蛋白SSB的冻干粉剂的RPA恒温扩增试剂盒中。
本实施例中采用的RPA恒温扩增试剂盒购自于英国TwistDx公司的
Figure BDA0003139470670000092
nfokit，简化RPA反应，该
Figure BDA0003139470670000093
nfo kit中含有dNTP、ATP、聚集剂PEG 20000、聚合酶Bsu、重组酶Uvsx、辅酶UvsY、单链结合蛋白SSB的冻干粉。
整个的实验具体流程为：
首先在该恒温扩增试剂盒中加入前述所述的修饰后的AHPND的正向引物(母液浓度为 5μM)3μL至终浓度为300nM，反向引物(母液浓度为5μM)3μL至终浓度为300nM，探针(母液浓度为2.5μM)1.8μL至终浓度90nM；
然后加入EHP修饰后的正向引物(母液浓度为5μM)1μL至终浓度为100nM，反向引物(母液浓度为5μM)1μL至终浓度为100nM，探针(母液浓度为2.5μM)0.6μL至终浓度30nM；
加入Rehydration Buffer 29.5μL；
加入虾模板1μL；此处的模板是从表1中编号为5的病虾中所提取的所有的DNA，不仅包括虾自身的DNA，还包括病虾自身携带的寄生虫的DNA以及被感染的细菌的DNA；
加入ddH2O补足至总体积50μL；
充分混匀后在37℃温度条件下，反应30min；
取1.5mL离心管加入90μL试纸条缓冲液(试纸条产品中自带)，加入10μL的RPA产物，轻轻混匀后将试纸条垂直放入，反应5min后拍照记录检测结果。
本实施例分别针对AHPND与EHP的引物探针比例进行了优化条件：
50μL的RPA扩增体系中Rehydration Buffer 29.5μL；感染AHPND或EHP的虾的模板1 μL；MgOAc(280mM)2.5μL的用量不变，修改AHPND和EHP引物和探针的浓度，余量用水补足。各实验条件如下：
Figure BDA0003139470670000091
Figure BDA0003139470670000101
上述八个实验经侧向流免疫层析试纸条测试结果如图2所示，图2上方为侧向流免疫层析试纸条实际测试结果图，图2的左侧(a)部分为使用表1中本发明的用于检测AHPND的引物和探针浓度检测感染有AHPND的病虾DNA模板的结果图，图2的右侧(b)部分为使用表1中本发明的用于检测EHP的引物和探针浓度检测感染有EHP的病虾DNA模板的结果图，从图中可以看出，AHPND的正向引物浓度和反向引物浓度分别需要不低于300nM时候，才能检测到102拷贝浓度的模板，而EHP的正向引物浓度和反向引物浓度分别在100nM时候，亦能检测到102拷贝浓度的模板，且每组正向引物:反向引物:探针比例为1:1:0.3。
本实施例另设计了五组实验，仅改变引物和探针的浓度，其他条件不变，对比两种传染病的优化条件：
50μL的RPA扩增体系中Rehydration Buffer 29.5μL；同时感染AHPND和EHP的虾的模板1μL；MgOAc(280mM)2.5μL的用量不变，修改AHPND和EHP引物和探针的浓度，余量用水补足。各实验条件如下：
Figure BDA0003139470670000102
上述五个实验经侧向流免疫层析试纸条测试结果如图3所示，图3上方为侧向流免疫层析试纸条实际测试结果图，上述五组实验中每组均设置了空白对照NTC组，即，不加入模板组，可以看出，当两种引物及探针组合的正向引物、反向引物与探针的摩尔浓度比为1:1:0.3，且AHPND的引物及探针的摩尔浓度与EHP对应的引物及探针的摩尔浓度比为3:1，且AHPND的正向引物和反向引物浓度分别为300nM～450nM之间时，检测效果较好，当AHPND 的正向引物和反向引物浓度分别为300nM，也即实验11组，检测试纸条的两组检测线最亮，也即检测效果最佳。
特异性及灵敏度检测
如图4所示，采用实验11组的最佳RPA体系对多种弧菌及虾常见感染疾病测试了双重 RPA-LFD检验试剂盒的特异性，结果表明与其他弧菌无交叉污染。
采用实验11组的最佳RPA体系对AHPND以及EHP进行灵敏度测试实验，灵敏度检测结果显示每个反应最低可以检测到102拷贝的AHPND及101拷贝的EHP。
图4中A部分为特异性实验结果，表明该发明可以有效排除多种弧菌及虾常见传染病，具有特异性。B部分中左图为EHP灵敏度，即采用实验11组所述的检测体系只检测EHP，中间图为AHPND灵敏度，即采用实验11组所述的检测体系只检测AHPND，右图为同时检测AHPND与EHP。结果表明AHPND可以检测到102拷贝/反应，EHP可以检测到101拷贝/ 反应。
实际样本检测
将表1中的60个临床样本利用磁珠基因组提取试剂盒提取基因组DNA，该基因组DNA 包括虾以及虾可能感染的细菌和寄生虫的所有的DNA，对该60组基因使用本发明的最佳RPA 扩增体系进行扩增和检测，检测结果如图5所示，图5中的N组为空白对照组，1-60编号对应表1中的样本编号。
并且以该发明及行业标准进行检测并对比结果，即巢式PCR对标方法检测该60组实际样本中AHPND及EHP，检测结果如图6所示，图6中A为AHPND巢式PCR检测结果；B 为EHP巢式PCR检测结果数据显示两者检测结果一致，表明该发明是一种可靠的检测方法。
且在实际检测过程中，本发明的检测体系的检测效率比现有方法相当。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 江苏海洋大学
<120> 一种用于同时检测虾急性肝胰腺坏死症和肝肠孢子虫的多重RPA引物和探针
组合物及检测方法
<130> 20210629
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
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<211> 29
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
catctttgac ggaatttaac cctaacaat 29
<210> 2
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
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<210> 3
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
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<210> 4
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<212> DNA
<213> 人工合成
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 6
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Claims (10)

1.一种用于同时检测虾急性肝胰腺坏死症和肝肠孢子虫的多重RPA引物和探针组合物，其特征在于，所述多重RPA引物和探针组合物包括用于检测虾急性肝胰腺坏死症的RPA引物和探针、用于检测肝肠孢子虫的RPA引物和探针，其中：
所述用于检测虾急性肝胰腺坏死症的RPA正向引物、反向引物和探针序列分别如SEQID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3；
所述用于检测肝肠孢子虫的RPA正向引物、反向引物和探针序列分别如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6。
2.根据权利要求1所述的用于同时检测虾急性肝胰腺坏死症和肝肠孢子虫的多重RPA引物和探针组合物，其特征在于，
用于检测虾急性肝胰腺坏死症的探针序列的5’端用FITC标记，3'端用C3-space进行封闭，距离5'端的30碱基距离处用四氢呋喃取代原有碱基；
用于检测肝肠孢子虫的探针序列的5'端进行DIG标记，3'端用C3-space进行封闭，距离5'端30碱基距离处用四氢呋喃取代原有碱基；
用于检测虾急性肝胰腺坏死症和肝肠孢子虫的反向引物进行Biotin的标记。
3.根据权利要求1所述的用于同时检测虾急性肝胰腺坏死症和肝肠孢子虫的多重RPA引物和探针组合物，其特征在于，所述多重RPA引物和探针组合物中检测虾急性肝胰腺坏死症的RPA正向引物、反向引物和探针的摩尔比为1:1:0.3，所述用于检测肝肠孢子虫的RPA正向引物、反向引物和探针的摩尔比为1:1:0.3。
4.根据权利要求1～3任一项所述的用于同时检测虾急性肝胰腺坏死症和肝肠孢子虫的多重RPA引物和探针组合物，其特征在于，所述多重RPA引物和探针组合物中检测虾急性肝胰腺坏死症的RPA正向引物、反向引物和用于检测肝肠孢子虫的RPA正向引物、反向引物的摩尔比为3:1，所述检测虾急性肝胰腺坏死症的RPA探针与检测肝肠孢子虫的RPA探针的摩尔比为3:1。
5.一种同时检测虾急性肝胰腺坏死症和肝肠孢子虫的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求1～4任一项所述的用于同时检测虾急性肝胰腺坏死症和肝肠孢子虫的多重RPA引物和探针组合物。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括dNTP、ATP、聚集剂PEG20000、聚合酶Bsu、重组酶UvsX、辅酶UvsY、单链结合蛋白SSB。
7.一种虾急性肝胰腺坏死症和肝肠孢子虫同时检测方法，其特征在于，所述同时检测的方法采用RPA检测方法，所述RPA扩增体系以50μL计为：
权利要求1～4任一项所述的检测虾急性肝胰腺坏死症的正向引物终浓度300nM～450
nM，反向引物终浓度300nM～450nM，探针终浓度90nM～135nM；
权利要求1～4任一项所述的检测肝肠孢子虫的正向引物终浓度100nM～150nM、反向引物终浓度100nM～150nM、探针终浓度30nM～45nM；
Rehydration Buffer 29.5μL；
虾DNA模板1μL；
浓度为280mM的MgOAc 2.5μL；
水；
dNTP；
ATP；
聚集剂PEG 20000；
聚合酶Bsu；
重组酶Uvsx；
辅酶UvsY；
单链结合蛋白SSB。
8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述RPA扩增体系为：
检测虾急性肝胰腺坏死症的正向引物终浓度300nM～450nM，反向引物终浓度300nM～450nM，探针终浓度90nM～135nM；
检测肝肠孢子虫的正向引物终浓度100nM～150nM、反向引物终浓度100nM～150nM、探针终浓度30nM～45nM；
Rehydration Buffer 29.5μL；
虾DNA模板1μL；
浓度为280mM的MgOAc 2.5μL；
水补足至50μL；
将上述50μL混合液加入含有dNTP、ATP、聚集剂PEG 20000、聚合酶Bsu、重组酶Uvsx、辅酶UvsY、单链结合蛋白SSB的冻干粉剂或含有前述冻干粉剂的RPA恒温扩增试剂盒中。
9.根据权利要求7或8所述的检测方法，其特征在于，所述虾急性肝胰腺坏死症和肝肠孢子虫同时检测的方法的具体步骤包括如下：
(1)提取虾DNA模板；
(2)多重RPA扩增：使用权利要求7或8任一项中所述的扩增体系在37℃温度条件下，反应30min；
(3)结果测定：采用侧向流免疫层析试纸条对稀释后的多重RPA扩增产物进行检测。
10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于，所述侧向流免疫层析试纸条设置有抗FITC检测线、抗DIG检测线、抗Biotin质控线。
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