CN109913565B - 一种用于检测副溶血弧菌的试剂盒、引物对、探针及方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于检测副溶血弧菌的试剂盒、引物对、探针及方法。所述的试剂盒包括RPA反应体系，所述的RPA反应体系包括RPA引物探针混合液，所述RPA引物探针混合液包括一引物对和探针，所述引物对中上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。本发明引物特异性强、灵敏度高、检测结果准确。将检测副溶血弧菌的RPA技术与胶体金测流层析试纸条结合能够实现副溶血弧菌的快速检测，能最少检测到10pg的副溶血弧菌DNA。

Description

一种用于检测副溶血弧菌的试剂盒、引物对、探针及方法

技术领域

本发明属于食源性致病菌快速诊断技术领域，具体涉及一种用于检测副溶血弧菌的试剂盒、引物对、探针及方法。

背景技术

副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是普遍存在于世界海洋和河口环境中的一种嗜盐性革兰阴性菌，是引起沿海地区食物中毒的首要病因。人感染后发病症状有腹泻、恶心、呕吐及发热，甚至脱水昏迷，给人类健康和水产品质量卫生带来极大的安全隐患。随着海产品消售量日益增加，建立副溶血弧菌的快速准确的检测方法，对海产品的质量检测和人类的健康至关重要。能够为疾病的有效治疗和防控争取宝贵时间，最大限速地减少损失和疾病流行的风险。

核酸体外扩增是分子生物学、遗传学、医学等研究领域最常用的技术之一。常规PCR技术以其能够检测DNA而一直被作为诊断多种疫病的金标方法。但是PCR需要特殊的热循环设备，不利于基层推广使用。重组聚合酶扩增(Recombinase PolymeraseAmplification,RPA)技术是由英国公司TwistDx Inc开发的一种可以替代传统PCR的新型核酸检测技术。其最显著的优势在于：(1)可在25～43℃的恒温下实现特定核酸序列的扩增，并在5～20min内观察结果。(2)RPA技术设备要求低，扩增过程不仅可采用传统的反应管，还可在纸片等反应载体上进行。(3)通过结合探针或横向流动试纸条(LFD)等方法，可实现扩增产物的定量分析或可视化判别。RPA技术主要依赖于三种酶：能结合单链核酸的重组酶、单链结合蛋白和链置换DNA聚合酶。这三种酶的混合物在常温下也有活性，最佳反应温度在37-40℃左右。重组酶与引物结合形成的蛋白-DNA复合物，能在双链DNA中寻找同源序列。一旦引物定位了同源序列，就会发生链交换反应形成并启动DNA合成，对模板上的目标区域进行指数式扩增。被替换的DNA链与单链结合蛋白结合，防止进一步替换。在这个体系中，由两个相对的引物起始一个合成事件。整个过程进行得非常快，一般可在十分钟之内获得可检出水平的扩增产物。RPA作为一种操作简便、反应快速、灵敏度高、特异性强、无需精密仪器的检测技术，是目前最有潜力成为快速分子诊断的工具，其在疾病诊断、食品安全检测、转基因作物检测、病原学检测及防疫现场检测等多个领域中都具有良好的应用前景，而且RPA技术对实验设备的要求非常低，使得该技术在经济条件差，资源不足的区域具有广阔的应用前景。RPA技术在病原学检测领域的研究已经逐渐成为热门。

副溶血弧菌可引起急性感染，常常伴有群体感染和流行的特点，副溶血弧菌诊断方法主要有的分离鉴定、常规PCR、血清学方法和荧光定量PCR等，然而该检测方法周期需要很长时间；常规PCR和荧光定量PCR均需特殊仪器，血清学方法存在敏感性低、特异性差等缺点，无法及时对临床样品进行快速检测，因此无法给临床控制疫病提供及时的指导。因此，迫切寻找一种副溶血弧菌的现场快速检测诊断技术。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是为了克服现有技术中使用RPA检测副溶血弧菌灵敏度低、且特异性不强等缺陷，提供一种用于检测副溶血弧菌的试剂盒、引物对、探针及方法。本发明的引物和探针特异性强，能够检测副溶血弧菌，为快速检测副溶血弧菌提供一种有效方法，便于食品、环境和临床检测使用，不需要特殊设备的现场诊断新方法。

现有技术中不乏有关副溶血弧菌特异性基因的披露，例如tlh基因、toxR基因以及groE等基因。其中，tlh基因已被多个实验室证明其在实际的PCR操作中不够特异。由此可见，针对特定菌株的特异性基因并不必然能够用于RPA引物的设计。况且根据本领域常识，适用于PCR方法的引物还不适用于RPA，目前没有专门的软件或网站用于RPA引物的设计，也没有明确的数据显示引物中哪些序列会影响扩增效率，只能通过设计多个候选引物进行筛选，通过实验者摸索和实验验证确定适合RPA检测的引物和探针。此外，与PCR相比，RPA方法要求的是长序列引物和长序列探针，这样必然会增加引物和探针的设计难度，相对于PCR和LAMP而言，更易形成引物-引物，引物-探针之间的互作，这些都需要实验摸索和验证。例如本领域公认的在PCR中能够使用的副溶血弧菌特异性基因——toxR基因，本发明人通过实验验证，证明根据该基因设计的引物并不适用于RPA检测。这进一步增加了针对副溶血弧菌特异性基因的RPA检测进行引物设计的难度。也印证了发明RPA方法的公司在其说明书中所提及的：适用于PCR的引物不一定使用于RPA，所以要建立一套敏感、特异的RPA检测方法，引物和探针的筛选是其中的重点和难点。

本发明提供一种用于检测副溶血弧菌的试剂盒，其包括RPA反应体系，所述的RPA反应体系包括RPA引物探针混合液，所述RPA引物探针混合液包括一引物对和探针，所述引物对中上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

较佳地，所述下游引物的5’端采用生物素(biotin)进行标记。

较佳地，所述探针的5’端采用异硫氰酸荧光素标记，如SEQ ID NO.3所示的序列和如SEQ ID NO.4所示的序列之间用四氢呋喃(THF)替代原有的胞嘧啶(C)；所述探针的3’端标记Spacer C3；更佳地，标记后的探针如5’-FAM-SEQ ID NO.3-THF-SEQ ID NO.4-SpacerC3-3’所示。

在本发明一较佳实施例中，所述试剂盒的扩增反应体系包括：2.1μL浓度为10μM的所述上游引物、2.1μL浓度为10μM的所述下游引物、0.6μL浓度为10μM的所述探针、29.5μL所述水化缓冲液、12.2μL双蒸水以及2.5μL浓度为280μM醋酸钠。

为了更直观、准确地判定检测结果，所述的试剂盒较佳地还包括阴性对照和/或阳性对照。

所述的阴性对照优选双蒸水。

所述的阳性对照优选副溶血弧菌DNA。

本发明中所述的RPA优选RPA-LF(recombinase polymerase amplification-lateral flow assay)。

本发明还提供一种用于检测副溶血弧菌的引物对，所述引物对中上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

较佳地，所述的上游引物的5’端采用生物素进行标记。较佳地，所述的检测为RPA检测，优选RPA-LF检测。

本发明还提供一种用于检测副溶血弧菌的探针，所述的探针的核苷酸序列如SEQID NO.3和SEQ ID NO.4所示；较佳地，所述探针的5’端采用异硫氰酸荧光素标记，如SEQ IDNO.3所示的序列和如SEQ ID NO.4所示的序列之间用四氢呋喃(THF)替代原有的胞嘧啶(C)；所述探针的3’端标记Spacer C3；更佳地，标记后的探针如5’-FAM-SEQ ID NO.3-THF-SEQ ID NO.4-Spacer C3-3’所示。

较佳地，所述的检测为RPA检测，优选RPA-LF检测。

本发明还提供一种用于检测副溶血弧菌的组合，所述的组合包括如上所述的引物对，以及如上所述的探针；较佳地，所示的检测为RPA检测，优选RPA-LF检测。

本发明还提供如上所述的引物对、如上所述的探针，或者如上所述的组合在制备检测副溶血弧菌的试剂或试剂盒中的应用。

本发明还提供一种非诊断目的的检测副溶血弧菌的方法，其包括如下步骤：

(1)使用DNA提取试剂提取待检样品中的总DNA；

(2)以步骤(1)提取的总DNA为模板，利用如上所述试剂盒中的RPA反应体系进行RPA反应，所述RPA反应中扩增反应的时间优选20min、温度优选37℃或者39℃；所述的RPA优选RPA-LF；

(3)分析检测结果。

本发明另一较佳实施例中，步骤(2)中所述RPA反应的加样顺序和反应条件为：首先将RPA反应体系中除了醋酸镁以外的成分加到Twist

Basic试剂盒提供的冻干酶复合物反应管中，然后将醋酸镁之外的成分加入到冻干酶复合物反应管的盖子中，盖上盖子，瞬离后启动反映，将反应管放置于恒温金属浴中，37℃恒温孵育30min。

步骤(2)中所得扩增产物为一端标记荧光素(FAM)，一端标记生物素的双标记产物。

步骤(2)中所述扩增反应的温度可为30℃～45℃，例如30℃、35℃、37℃、39℃、40℃或者45℃。

步骤(3)中所述检测结果的分析方法可为本领域常规，例如直接电泳、试纸条层析方法以及荧光检测方法等。在本发明一较佳实施例中，将步骤(2)所得双标记产物进行稀释，并用

GenLine HybriDetect MGHD1胶体金侧流层析试纸条对稀释后的RPA扩增产物进行检测。

所述胶体金侧向流免疫层析试纸条中的有色颗粒是纳米金颗粒，所述纳米金颗粒采用抗荧光素抗体包被。所述胶体金侧向流免疫层析试纸条上包被有链霉亲和素的检测线和包被抗兔抗体的质控线；若胶体金侧向流免疫层析试纸条的检测线出现条带，而且质控线出现条带，则表明该样品中含有副溶血弧菌，若仅是质控线上出现条带，则表明样品中不含副溶血弧菌。具体地：

将RPA扩增产物稀释50倍，取10μL放置于

GenLine HybriDetectMGHD1试纸条加样垫上，使用胶体金测流层析试纸条进行检测。

优选地，所述胶体金测流层析试纸条中胶体金采用抗FAM抗体包被，所用加样垫为硝酸纤维膜。

优选地，利用胶体金侧向流免疫层析试纸条的具体方法为：将2μL扩增产物使用PBST缓冲液(0.01MPBS，0.05％Tween-20)稀释50倍，取10μL稀释产物滴加于样品垫上，将试纸条样品垫一端放入盛有100μL PBST缓冲液的Ep管中，3-5分钟后取出试纸条拍照保存结果。

根据上述的方法，所述胶体金侧向层析试纸条上链霉亲和素测试线和抗兔二抗质控线；若胶体金侧向层析试纸条链霉亲和素测试线出现条带，且抗兔二抗质控线正常，表明该样品中含有副溶血弧菌；若仅是抗兔二抗质控线上出现条带，则表明该样品中不含副溶血弧菌。

此外，也可以使用琼脂糖凝胶电泳进行产物分析，在靶基因存在的情况下，RPA反应有上游引物、下游引物、探针扩增目的片段，合适的引物可以通过琼脂糖凝胶电泳方式进行筛选，以确保能够检测到目的产物。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：

(1)本发明设计的RPA引物特异性强、灵敏度高、检测结果准确。

(2)本发明的检测方法将检测副溶血弧菌的RPA技术与胶体金测流层析试纸条结合能够实现副溶血弧菌的快速检测，能最少检测到10pg的副溶血弧菌DNA，本发明的检测方法特异性试验结果良好，重复性试验表明具有良好的稳定性，为有效检测副溶血弧菌提供了一种快速、特异、不需要复杂热循环仪的现场诊断方法，有利于副溶血弧菌感染的鉴别诊断，同时也可以免除昂贵的仪器投入，以便于基层推广使用。

(3)本发明可以作为规模化渔场的快速现场诊断方法，可以作为副溶血弧菌的净化检测方法，同时也为副溶血弧菌的分子流行病学调查、诊断试纸条的研制与开发提供了试验依据和技术参考。

(4)将引物和探针标记后，可以用本发明中提及的胶体金层析试纸条检测扩增产物无需跑胶，这种方式不需要特殊仪器或非常专业的技术人员即可操作，因此更简单、快速，所以更适合现场快速诊断。

附图说明

图1为本发明使用示意图。

图2为RPA-Basic试剂盒引物筛选结果。

图3为RPA-LF的其他引物和探针的筛选结果。

图4为RPA-LF的其他引物和探针的筛选结果。

图5为本发明RPA反应最佳反应温度试纸条检测结果。

图6为本发明RPA反应最佳反应时间试纸条检测结果。

图7为本发明RPA反应特异性检测的试纸条检测结果。

图8为本发明RPA反应准确性检测的试纸条检测结果。

图9为本发明RPA反应灵敏度检测试纸条检测结果。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

以下实施例中使用的RPA试剂盒为Twist

nfo试剂盒，购自英国TwistDxInc公司，其中，重组酶、单链结合蛋白和链置换DNA聚合酶是以冻干粉的形式存在于试剂盒所提供的RPA反应管中，使用时直接使用试剂盒中提供的试剂进行稀释，整个RPA反应在RPA反应管中进行。反应结束后，利用胶体金层析试纸条检测扩增产物，然后根据出现的条带情况判定结果，使用示意图见图1。

实施例1引物筛选

设计无标记的上下游引物，用RPA Basic试剂盒分别进行扩增，取条带均一，特异性好的引物进一步标记，并在上下游引物之间设计一个带标记的探针。

本发明人副溶血弧菌toxR基因设计了6对引物，结果特异性均不好，并针对靶标基因NC_004605.1设计了1对引物，特异性很好，进而设计了RPA-LF中用的引物和探针。

引物序列如表1(F指上游引物，R指下游引物)。

表1

2、上述7对引物使用RPA Basic试剂盒对其进行扩增，副溶血弧菌DNA浓度均为100ng/μL。结果如图2(自左至右分别为F1+R1、F2+R2、F4+R4、F5+R5、F6+R6、F7+R7、F8+R8)所示，所有引物对均扩增出正确大小的目标条带，但其中引物对F2+R2、F4+R4、F8+R8扩增出的条带最清楚，所以选取上述三对引物进行下一步实验。

3、根据使用Basic试剂盒筛选的引物设计探针，并将筛选的引物标记生物素。所使用的引物及探针如下表中所示。

表2

4、本次筛选了共3对引物，分别设计了对应的探针，在下游引物5’端分别标记生物素(biotin)，探针5’端分别标记异硫氰酸荧光素(FAM)，在探针30bp和15bp之间用四氢呋喃(THF)替代原有的核苷酸，3’端标记Spacer C3。加入对应模板，使用

nfo试剂盒获得扩增产物，使用

GenLineHybriDetect侧流层析试纸条检测扩增产物，结果表明除引物对F4+R4及其探针组合外，其他引物对及其探针组合的特异性均不好，经过条件优化仍然出现假阳性结果，确定是引物和探针或靶基因toxR本身存在非特异性，结果如图3和图4所示，图3是F2+R2引物对及其探针组合的RPA-LF图，1是无菌水，副溶血弧菌；2-6分别为副溶血弧菌、霍乱弧菌、拟态弧菌、溶藻弧菌和创伤弧菌的DNA模板。图4是F8+R8引物对及其探针组合的RPA-LF图，1是无菌水，副溶血弧菌；2-6分别为副溶血弧菌、霍乱弧菌、拟态弧菌、溶藻弧菌和创伤弧菌的DNA模板。所以选取F4+R4及其探针组合用于接下来的试验。

实施例2用于检测副溶血弧菌的RPA方法的建立

(1)引物的设计与合成

引物的特异性是本实验所建立方法的重要因素。根据GenBank登录的NC-004605.1的基因序列，利用primer5软件设计引物，通过BLAST软件比对分析，初步验证其特异性。引物合成由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

所述RPA引物的核苷酸序列为：

上游引物P1(RPA-154-F；引物编号F4)：

5’-ATTTCTGAGCTTATTGGCGGTTTCTGTCGG-3’(SEQ ID NO.1)；

下游引物P2(Biotin-RPA-154-R；引物编号R4)：

5’-Biotin-TAACAGGCTCGCAAACGAATGAAAAGGTGG-3’(SEQ ID NO.2)

探针(RPA-154-Probe)：

(Carboxyfluorescein/FAM)-SEQ ID NO.3-(THF/dSpacer)-SEQ ID NO.4-SpacerC3-3’

SEQ ID NO.3：CAAGAGTCAACGTCGCCTGAAACTGTTCAC

SEQ ID NO.4：ACTACACCGTCGGCA

上述引物和探针所在靶基因序列如下：

ATTTCTGAGCTTATTGGCGGTTTCTGTCGGCCAAGAGTCAACGTCGCCTGAAACTGTTCACCACTACACCGTCGGCAGTGTGTTTTATGATGAAGACGCACAAGTTTCCGAAACGCCACTAGCACCACCTTTTCATTCGTTTGCGAGCCTGTTA(SEQ ID NO.5)

实施例3反应温度优化

采用30℃、35℃、37℃、39℃、40℃及45℃总共6个温度来评估RPA最佳反应温度，每个体系模板使用量为100ng。采用Twist

nfo试剂盒进行RPA扩增，所述RPA扩增反应的加样顺序和反应条件为：首先将RPA反应体系中除了醋酸镁之外的成分加入到Twist

nfo试剂盒提供的冻干酶复合物反应管中，然后将醋酸镁加入到反应管盖子内，盖上盖子瞬时离心，使醋酸镁进入反应体系中，然后将反应管放入相应温度的恒温金属浴中孵育30min。

所述RPA扩增反应体系为50μL：10μM上游引物和10μM下游引物各2.1μL、探针0.6μL(浓度为10μM；以下所用探针若无特殊说明，浓度均为10μM)、Rehydration Buffer 29.5μL、ddH₂O 12.2μL、DNA模板1μL和280mM醋酸镁2.5μL。

反应结束后，利用

GenLine HybriDetect MGHD1试纸条检测扩增产物，然后根据出现的条带情况判定结果。结果如图5中所示，1为空白对照，2-7孵育温度依次为30℃、35℃、37℃、39℃、40℃、45℃孵育温度为37℃及39℃时条带最亮，由于37℃刚好为人体体温；临床使用时较为方便所以选择37℃为最适反应温度。

实施例4反应时间优化

采用5min、10min、15min、20min及25min总共5个时间段来评估RPA最佳反应时间，每个体系模板使用量为100ng。采用Twist

nfo试剂盒进行RPA扩增，所述RPA扩增反应的加样顺序和反应条件为：首先将RPA反应体系中除了醋酸镁之外的成分加入到Twist

nfo试剂盒提供的冻干酶复合物反应管中，然后将醋酸镁加入到反应管盖子内，盖上盖子瞬时离心，使醋酸镁进入反应体系中，然后将反应管放入39℃恒温金属浴中反应相应时间。

所述RPA扩增反应体系为50μL：10μM上游引物和10μM下游引物各2.1μL、探针0.6μL、Rehydration Buffer 29.5μL、ddH₂O 12.2μL、DNA模板1μL和280mM醋酸镁2.5μL。

反应结束后，利用

GenLine HybriDetect MGHD1试纸条检测扩增产物，然后根据出现的条带情况判定结果。结果如图6中所示，1为空白对照，2-6依次为反应时间5min、10min、15min、20min及25min，5min时试纸条出现条带，随着反应时间延长，条带逐渐变深，当反应时间为20min时条带深浅稳定，待反应时间为25min时也不再加深，所以选择20min为最适反应时间。

实施例5细菌特异性试验

分别以副溶血弧菌、霍乱弧菌、溶藻弧菌、拟态弧菌、创伤弧菌、沙门氏菌、单细胞增生李斯特菌样品、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌为模版，采用Twist

nfo试剂盒进行RPA扩增，验证合成RPA引物的特异性。所述RPA扩增反应的加样顺序和反应条件为：首先将RPA反应体系中除了醋酸镁外的成分加入到Twist

nfo试剂盒提供的冻干酶复合物反应管中，然后将醋酸镁加入到反应管盖子内，盖上盖子瞬时离心，使醋酸镁进入反应体系中，然后将反应管放入39℃恒温水金属浴中孵育20min。

所述RPA扩增反应体系为50μL：10μM上游引物和10μM下游引物各2.1μL、探针0.6μL、Rehydration Buffer 29.5μL、ddH₂O 12.2μL、DNA模板1μL和280mM醋酸镁2.5μL。

反应结束后，利用

GenLine HybriDetect MGHD1试纸条检测扩增产物，然后根据出现的条带情况判定结果。如图7所示，1为空白对照，2-10依次为副溶血弧菌、溶藻弧菌、拟态弧菌、霍乱弧菌、创伤弧菌、大肠杆菌、单细胞增生性李斯特菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌，只有副溶血弧菌出现阳性条带，证明本发明设计的RPA引物特异性强。

实施例6不同血清型副溶血弧菌检测试验

选取副溶血弧菌国内主要流行血清型菌株进行有效性检测，包括SH112(O3:K6)、ATCC33847(O3:K6)、ATCC17802(O1:KI)、VP262(O10:KIII)、VP299(O1:KI)、VP64(O3:K6)、VP207(O4:K8)、VP502(O2:KI)共8株副溶血弧菌进行RPA试验，所有菌株DNA浓度均为100ng/μL，采用Twist

nfo试剂盒进行RPA扩增，验证合成RPA引物的特异性。所述RPA扩增反应的加样顺序和反应条件为：首先将RPA反应体系中除了醋酸镁之外的成分加入到Twist

nfo试剂盒提供的冻干酶复合物反应管中，然后将醋酸镁加入到反应管盖子内，盖上盖子瞬时离心，使醋酸镁进入反应体系中，然后将反应管放入39℃恒温水金属浴中孵育20min。

所述RPA扩增反应体系为50μL：10μM上游引物和10μM下游引物各2.1μL、探针0.6μL、Rehydration Buffer 29.5μL、ddH₂O 12.2μL、DNA模板1μL和280mM醋酸镁2.5μL。

反应结束后，利用

GenLine HybriDetect MGHD1试纸条检测扩增产物，然后根据出现的条带情况判定结果。如图8所示，1为空白对照，2-9依次为SH112、VP58、VP59、VP262、VP299、VP64、VP207、VP502，所有菌株均扩增出明亮的T线，结果显示，本发明所设计的引物和所建立的方法能够有效检测副溶血弧菌菌株，适用于多种血清型菌株。

实施例7灵敏性试验

将提取的副溶血弧菌的DNA进行10倍连续倍比稀释，分别以稀释后的不同浓度的DNA为模版进行RPA反应，以确定该引物的灵敏度。

所述RPA扩增反应体系为50μL：10μM上游引物和10μM下游引物各2.1μL、探针0.6μL、Rehydration Buffer 29.5μL、ddH₂O 12.2μL、DNA模板1μL和280mM醋酸镁2.5μL。

反应结束后，利用

GenLine HybriDetect MGHD1试纸条检测扩增产物，然后根据出现的条带情况判定结果。图9为副溶血弧菌RPA引物灵敏性检测测结果。图中1为空白对照，2-9依次为100ng、10ng、1ng、100pg、10pg、5pg、1pg、100fg，本发明中RPA引物最低检测线为10pg(经试验发现：2×10⁸CFU个副溶血弧菌可提取6.75×10⁶pg的DNA模板，即30CFU个细菌可提取1pgDNA，故此处10pg对应于3×10²CFU)，表明灵敏性高。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，虽然上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明做了详尽的描述，但是在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的要求保护的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业科学院上海兽医研究所;南京农业大学

<120> 一种用于检测副溶血弧菌的试剂盒、引物对、探针及方法

<130> P19010927C

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> F4

<400> 1

atttctgagc ttattggcgg tttctgtcgg 30

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> R4

<400> 2

taacaggctc gcaaacgaat gaaaaggtgg 30

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 探针

<400> 3

caagagtcaa cgtcgcctga aactgttcac 30

<210> 4

<211> 15

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 探针

<400> 4

actacaccgt cggca 15

<210> 5

<211> 154

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物和探针所在靶基因序列

<400> 5

atttctgagc ttattggcgg tttctgtcgg ccaagagtca acgtcgcctg aaactgttca 60

ccactacacc gtcggcagtg tgttttatga tgaagacgca caagtttccg aaacgccact 120

agcaccacct tttcattcgt ttgcgagcct gtta 154

Claims (15)

1.一种用于检测副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）的试剂盒，其包括RPA反应体系，其特征在于，所述的RPA反应体系包括RPA引物探针混合液，所述RPA引物探针混合液包括一引物对和探针，所述引物对中上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示；所述探针如下式所示：5’-FAM-SEQ ID NO. 3-THF-SEQID NO. 4-Spacer C3-3’。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述RPA反应体系包括：2.1 μL浓度为10 μM的所述上游引物、2.1 μL浓度为10 μM的所述下游引物、0.6 μL浓度为10 μM的所述探针、29.5 μL水化缓冲液、12.2μL双蒸水以及2.5 μL浓度为280 μM的醋酸钠。

3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括阴性对照和/或阳性对照。

4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述的阴性对照为双蒸水；

所述的阳性对照为副溶血弧菌DNA。

5.如权利要求1~4任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述的RPA为RPA-LF。

6.一种用于检测副溶血弧菌的寡核苷酸组，所述的寡核苷酸组包括一对引物对以及一个探针，所述引物对中上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示；所述探针如下式所示：

5’-FAM-SEQ ID NO. 3-THF-SEQ ID NO. 4-Spacer C3-3’。

7.如权利要求6所述的寡核苷酸组，其特征在于，所述的检测为RPA检测。

8.如权利要求7所述的寡核苷酸组，其特征在于，所述的RPA检测为RPA-LF检测。

9.如权利要求6~8任一项所述的寡核苷酸组在制备检测副溶血弧菌的试剂或试剂盒中的应用。

10.一种非诊断目的的检测副溶血弧菌的方法，其特征在于，其包括如下步骤：

（1）使用DNA提取试剂提取待检样品中的总DNA；

（2）以步骤（1）提取的总DNA为模板，利用权利要求1~5任一项所述试剂盒中的RPA反应体系进行RPA反应；

（3）分析检测结果。

11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，步骤（2）中所述RPA反应中扩增反应的时间为20 min、温度为37℃或39℃。

12.如权利要求10所述的方法，其特征在于，步骤（2）中所述的RPA为RPA-LF。

13.如权利要求10所述的方法，其特征在于，步骤（2）中所得扩增产物为一端标记荧光素，一端标记生物素的双标记产物。

14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，步骤（3）中的分析方法为用Milenia ®GenLine HybriDetect MGHD1胶体金侧流层析试纸条对所述双标记产物进行检测。

15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述的双标记产物为稀释后的双标记产物。

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