CN113981118A - 检测沙门氏菌的rpa-lfd方法与试剂盒及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及食品安全检测领域，公开了RPA‑LFD法快速检测沙门氏菌的引物对、方法、试剂盒及其应用。引物对为InvA‑F、InvA‑R，Stm‑F、Stm‑R，Sen‑F、Sen‑R；检测方法为提取样本总DNA，使用上述引物对进行RPA扩增反应和参数优化，应用靶标侧流层析试纸条进行检测，根据条带判读样品中是否含有沙门氏菌及其鼠伤寒、肠炎等血清型，整个检测过程可以在1小时内完成；试剂盒包括无菌双蒸水、缓冲液、标准阳性DNA、靶标侧流层析试纸条和产物稀释液。本发明包括检测沙门氏菌的引物对、方法和试剂盒，具有特异性强、简便、快速等特点，可用于沙门氏菌及其鼠伤寒和肠炎血清型的快速精准检测。

Description

检测沙门氏菌的RPA-LFD方法与试剂盒及应用
技术领域
本发明涉及食品安全检测领域，尤其涉及RPA-LFD法快速检测沙门氏菌的引物对、方法、试剂盒及应用。
技术背景
沙门氏菌(Salmonella)是一种广受关注的病原菌，不仅可以通过污染蛋、奶、肉等食品传播引发食物中毒，还可以通过感染多种动物，再传播到食物链，给食品安全带来极大危害。沙门氏菌感染可引发发热、胃肠炎、腹泻、呕吐、食欲下降、头痛、精神不振等临床症状，严重时甚至可引起败血症和菌血症而导致病人死亡。据统计，在全球范围内，沙门氏菌每年可造成9,380万人感染和155,000人死亡。在中国，由沙门氏菌引起的食物中毒占细菌性食物中毒的70％-80％。在沙门氏菌的2,600多种血清型中，肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌是引起食物中毒最常见的血清型。
沙门氏菌及其鼠伤寒和肠炎血清型快速检测方法的开发，是预防和治疗沙门氏菌病的关键所在。目前，微生物检测方法主要分为传统培养法和快速检测法，传统培养法依据形态学特征、生理学特征和生态学特征进行检测，具有方便、灵敏、特异性强、成本低等优点，但耗时费力，检测周期长(>5d)，不适合大规模快速检测。快速检测方法主要包含生理生化检测方法、免疫学检测方法和分子检测方法，这些方法具有省时省力，易于操作的特点。快速检测方法如实时定量PCR等已经成为分子研究领域非常重要的工具，但存在仪器设备昂贵、难以用于现场检测等不足。因此，亟需开发一种实用性强、操作简单、快速、成本低廉的方法，用于实时现场检测，并容易在缺少相关昂贵检测设备的基层推广。
核酸等温扩增是一种可用于现场检测的技术，可简化实验步骤，减少对昂贵仪器的依赖。其中，重组酶聚合酶扩增技术(RPA)是一种新型的恒温核酸扩增技术，被公认是可以替代PCR的核酸检测技术，其原理是利用酶重组酶、DNA聚合酶以及DNA结合蛋白来实现DNA的扩增，扩增产物在37-42℃孵育5-20分钟后即可检测。扩增产物的分析需要凝胶电泳、荧光标记和侧向流动免疫等方法，其中，侧向流动试纸(LFD)是简单、快速、直观的免疫分析方法。LFD技术通过在检测线处结合标签特异性抗体，然后将其与胶体金纳米颗粒上的第二个标签特异性抗体交联来实现检测，具有特异性强、不需昂贵仪器、扩增时间短等特点，适合于基层进行食源性致病菌的快速检测。RPA-LFD技术已应用于多种病原体的检测，包括肺炎链球菌、单核细胞增生李斯特菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌、农杆菌和鸟分枝杆菌。然而，目前的研究主要集中在单一靶点上，试纸中几种特异性抗体之间的交叉反应这一多重检测挑战亟待攻克。此外，尚未见RPA-LFD技术用于沙门氏菌及其鼠伤寒和肠炎血清型检测。
鉴于现有技术存在的问题，本发明的目的是提供一种基于RPA-LFD原理，建立快速检测沙门氏菌及其鼠伤寒和肠炎血清型的新方法。本发明系首次采用RPA-LFD法检测沙门氏菌及其鼠伤寒和肠炎血清型，具有特异性强、简便快速等特点，可用于实际样品检测，对食源性致病菌检测具有引导意义和实用价值。
发明内容
鉴于现有技术的上述缺陷，本发明解决的技术问题是提供快速检测沙门氏菌及其鼠伤寒和肠炎血清型的新方法。本方法操作简单、快速、成本低廉，不依赖于昂贵的设备，可以用于现场检测或在基层缺少相关设备的地区使用。
为实现上述目的，本发明提供了一种基于RPA-LFD法快速检测沙门氏菌的引物对，包括检测沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌和肠炎沙门氏菌的正向序列和反向序列。首先，invA、STM4495和SEN1392-SEN1393分别是沙门氏菌属、鼠伤寒沙门氏菌和肠炎沙门氏菌的特异基因，证明适合作为分子检测的靶标，通过NCBI网站上的Premier-BLAST设计了一系列的RPA引物，并通过RPA扩增优化设计的引物，筛选到分别检测沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌和肠炎沙门氏菌的RPA专用引物。RPA扩增反应所需引物的长度通常为30-36bp，GC含量通常在40％-60％，引物的设计和选择对RPA扩增反应非常重要。然而尚无专门用于RPA引物设计的软件，也还没有大量的相关研究文献为RPA引物设计原则提供依据。因此，本发明的RPA引物需要根据靶核酸序列设计多对引物，然后通过RPA反应实验对引物进行优化、筛选才能得到。
检测沙门氏菌的正向引物为InvA-F，序列如表1中SEQ ID NO:1所示；检测沙门氏菌的反向引物为InvA-R，序列如表1中SEQ ID NO:2所示。检测鼠伤寒沙门氏菌的正向引物为Stm-F，序列如表1中SEQ ID NO:3所示；检测鼠伤寒沙门氏菌的反向引物为Stm-R，序列如表1中SEQ ID NO:4所示。检测肠炎沙门氏菌的正向引物为Sen-F，序列如表1中SEQ ID NO:5所示；检测肠炎沙门氏菌的反向引物为Sen-R，序列如表1中SEQ ID NO:6所示。
表1引物序列表
Figure BDA0003417875520000021
本发明还提供了一种使用基于RPA-LFD技术的沙门氏菌快速检测方法，包括以下步骤：
步骤1、用细菌基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司)，提取样本总DNA；
步骤2、使用引物InvA-F、InvA-R、Stm-F、Stm-R、Sen-F和Sen-R，对步骤1提取的样本总DNA进行三重RPA扩增反应，得到RPA扩增产物；
步骤3、应用靶标侧流层析试纸条对步骤2得到的RPA扩增产物进行检测。靶标侧流层析试纸条的三条检测线T1、T2和T3，分别包埋检测沙门氏菌抗体(anti-FAM)、检测鼠伤寒沙门氏菌抗体(anti-TAMRA)和检测肠炎沙门氏菌抗体(anti-Digoxin)，靶标侧流层析试纸条还包括质控C线，根据试纸条上产生的条带进行判读，得出样品中是否含有沙门氏菌及其属于鼠伤寒、肠炎等血清型。
进一步地，上述步骤2还包括：在装有冻干酶粉的反应管中，依次加入RPA缓冲液、正向引物(InvA-F、Stm-F和Sen-F)、反向引物(InvA-R、Stm-R和Sen-R)、待测样本DNA、去离子水，然后振荡混匀1次；再加入MgOAc，快速离心；充分振荡混匀1次并快速离心，并置于水浴锅中反应。
进一步地，步骤2中扩增反应温度为38℃。
进一步地，步骤2中在装有冻干酶粉的PCR反应管中，依次加入RPA缓冲液29.5μL、正向引物1.5μL(InvA-F、Stm-F和Sen-F浓度为10μM，各取0.5μL)；反向引物InvA-R、Stm-R和Sen-R各0.5μL(浓度为10μM)；待测样本DNA2.0μL；采用去离子水补足体积至47.5μL，然后振荡混匀1次；在PCR管盖内部加入2.5μL MgOAc后快速离心10s；再次充分振荡混匀1次并快速离心10s；置于38℃水浴锅中反应20min。
进一步地，上述步骤3还包括：①将RPA扩增产物加入到试纸条配套的稀释液中，得到稀释后的待检样品；②吸取稀释后的待检样品，缓慢逐滴加到试纸条加样区；③根据试纸条上产生的条带判读结果。在质控C线呈现条带的情况下，分别根据以下标准做出判断：
T1线、T2线和T3线同时呈现出条带，则说明样品中含所述沙门氏菌，同时含有所述鼠伤寒和所述肠炎血清型；
T1线和T3线同时呈现出条带，而T2线不呈现条带，则说明样品中含所述沙门氏菌，同时含有所述肠炎血清型；
T1线和T2线同时呈现出条带，而T3线不呈现条带，则说明样品中含所述沙门氏菌、同时含有所述鼠伤寒血清型；
T1线呈现出条带，而T2和T3线都不呈现条带，则说明样品中不含所述鼠伤寒和肠炎这两种血清型，但含所述沙门氏菌其他血清型；
T1不呈现条带，则说明样品中不含所述沙门氏菌。
进一步地，上述步骤3还包括：①取5μL的RPA扩增产物加入到95μL试纸条配套的稀释液中，得到稀释后的待检样品；②取80μL稀释后的待检样品缓慢逐滴加入试纸条加样区；③根据试纸条上产生的条带进行判读。
进一步地，装有冻干酶粉的反应管、反应缓冲液Buffer、MgOAc、标准阳性DNA于市场购买得到(TwistAmpTM Basic Kit，Twist)；靶标侧流层析试纸条购买自南京钟鼎生物技术有限公司(Zoonbio Biotechnology，China)。
进一步地，该引物对可用于实际鸡肉样品中沙门氏菌及其鼠伤寒和肠炎血清型的快速检测。当鸡肉样品中存在沙门氏菌时，采用细菌基因组DNA提取试剂盒提取样品的总DNA，以总DNA为模板，基于本发明提供的引物对，进行RPA扩增，应用靶标侧流层析试纸条对RPA扩增产物进行检测，根据试纸条上产生的条带数目，判读样品中是否含有沙门氏菌及其属于鼠伤寒、肠炎等血清型。
本发明还提供了一种包含该引物的基于RPA-LFD法检测沙门氏菌的试剂盒，包括引物对(InvA-F、InvA-R；Stm-F、Stm-R；Sen-F、Sen-R)，无菌双蒸水、缓冲液、标准阳性DNA、靶标侧流层析试纸条和产物稀释液。靶标侧流层析试纸条包括样品区、检测区和吸水区，检测区包括三条检测线和质控线，检测线T1、T2和T3分别包埋anti-FAM、anti-TAMRA和anti-Digoxin，质控线含有链霉亲和素。
进一步地，上述试剂盒至少包括1次检测用量的引物对。
进一步地，上述试剂盒中无菌双蒸水可用于加入反应体系或作为阴性对照，其制备方法为高压灭菌双蒸水后，分装到灭菌的1.5mL EP管中。
本发明还提供了一种基于RPA-LFD法快速检测沙门氏菌的引物对在检测沙门氏菌及其鼠伤寒和肠炎血清型中的应用。
进一步地，该应用实例采用细菌基因组DNA提取试剂盒提取样品的总DNA，以总DNA为模板，利用设计的引物对进行RPA扩增，应用靶标侧流层析试纸条对RPA扩增产物进行检测，根据试纸条上产生的条带数目，来判读样品中是否含有沙门氏菌及其属于鼠伤寒、肠炎等血清型。
本发明还提供了一种基于RPA-LFD法在检测沙门氏菌及其鼠伤寒和肠炎血清型中的应用。
本发明还提供了一种基于RPA-LFD法的试剂盒在检测沙门氏菌及其鼠伤寒和肠炎血清型中的应用。
在本发明的较佳实施方式中，详细说明一种基于RPA-LFD法的快速检测沙门氏菌的方法。
在本发明的另一较佳实施方式中，详细说明验证RPA-LFD检测方法特异性的实验。
在本发明的另一较佳实施方式中，详细说明对人工污染沙门氏菌的鸡肉样品进行实际检测的过程。
与现有技术相比，本发明方法的优势如下：
1、本发明针对沙门氏菌及其鼠伤寒和肠炎血清型的特异DNA序列，设计RPA扩增引物，并基于该引物建立了沙门氏菌及其鼠伤寒和肠炎血清型的三重RPA检测方法，可对沙门氏菌及其鼠伤寒和肠炎血清型进行定性检测，同时通过靶标侧流层析试纸条对RPA扩增产物进行检测。不需要在实验室条件下即可以保证对现场样本中沙门氏菌的高效、简便、精准检测，为沙门氏菌及其鼠伤寒和肠炎血清型的检测提供便捷方法。
2、本发明提供的沙门氏菌及其血清型鼠伤寒和肠炎的RPA检测方法具有以下优势：1)本发明选用的STM4495基因和SEN1392-SEN1393基因是本研究团队过去筛选获得的。它们的特异性高，而且和invA基因的RPA引物扩增效果良好；2)本发明不需要特殊的热循环设备，只需在38℃下恒温反应即可；3)反应所需时间短，仅20min；4)结果可通过肉眼观察，现场及时判读，通过靶标侧流层析试纸条对RPA扩增产物进行检测，根据试纸条上的条带判读结果；5)可用于实际样品检测，可检测人工污染鸡肉样本中的沙门氏菌及其鼠伤寒和肠炎血清型；6)操作简便，现场检测条件下即可进行操作。
3、本发明提供的RPA引物特异性强。基于该引物建立的沙门氏菌及其鼠伤寒和肠炎血清型的RPA-LFD检测方法，具有快速简便、准确和不需要昂贵的仪器等优点，对食源性致病菌检测具有很好的实用价值。
以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
附图说明
图1是本发明的一个较佳实施例1中的RPA-LFD法快速检测的靶标侧流层析试纸条结构示意图；
图2是本发明的一个较佳实施例2中的RPA-LFD特异性试纸条检测结果；
图3是本发明的一个较佳实施例3的沙门氏菌污染鸡肉检测结果。
具体实施方式
以下参考说明书附图介绍本发明的多个优选实施例，使其技术内容更加清楚和便于理解。本发明可以通过许多不同形式的实施例来得以体现，因此本发明的保护范围并非仅限于文中提到的实施例。
实施例1
用细菌基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司)，提取供试病原菌的基因组DNA，以提取的待测样本DNA作为模板，采用本发明设计的引物，进行RPA反应，具体步骤如下：
用细菌基因组DNA提取试剂盒，提取供试病原菌的基因组DNA，向装有冻干酶粉的反应管中，依次加入RPA反应缓冲液29.5μL；正向引物InvA-F、Stm-F和Sen-F各0.5μL(浓度为10μM)；反向引物InvA-R、Stm-R和Sen-R各0.5μL(浓度为10μM)；待测样本DNA2.0μL；采用去离子水补足体积至47.5μL，然后振荡混匀1次；在PCR管盖内部加入2.5μL MgOAc后快速离心10s；再次充分振荡混匀1次并快速离心10s；置于38℃水浴锅上反应20min。
阴性对照：操作步骤同样品检测，用2.0μL双蒸水替代2.0μL模板DNA。
应用靶标侧流层析试纸条对RPA扩增产物进行检测，具体实施步骤如下：①取5μL的扩增产物加入95μL试纸条配套的稀释液中；②吸取80μL稀释好的待检样品缓慢逐滴滴加在试纸条加样区；如图1中所示的RPA-LFD法快速检测的靶标侧流层析试纸条结构示意图，靶标侧流层析试纸条包括基板，加样区在基板的一端，包括样品垫和金标结合垫，另一端是吸水区(包括吸水垫)，基板的中间部分是检测区，覆盖的是侧流层析垫，侧流层析垫上依次设置有三条检测线：T3线、T2线、T1线和一条质控C线，其中T1线、T2线和T3线分别包埋检测沙门氏菌抗体(anti-FAM)、检测鼠伤寒沙门氏菌抗体(anti-TAMRA)和检测肠炎沙门氏菌抗体(anti-Digoxin)，质控C线含有链霉亲和素，C线最靠近吸水区。稀释好的待检样品缓慢逐滴滴加在试纸条加样区，样品顺着侧流层析垫扩散，依次经过T3线、T2线、T1线和质控C线，最终到达吸水区。③侧流层析试纸条判读标准为：在质控C线呈现条带的情况下，分别根据以下标准做出判断：
T1线、T2线和T3线同时呈现出条带，则说明样品中含所述沙门氏菌，同时含有所述鼠伤寒和所述肠炎血清型；
T1线和T3线同时呈现出条带，而T2线不呈现条带，则说明样品中含所述沙门氏菌，同时含有所述肠炎血清型；
T1线和T2线同时呈现出条带，而T3线不呈现条带，则说明样品中含所述沙门氏菌、同时含有所述鼠伤寒血清型；
T1线呈现出条带，而T2和T3线都不呈现条带，则说明样品中不含所述鼠伤寒和肠炎这两种血清型，但含所述沙门氏菌其他血清型；
T1不呈现条带，则说明样品中不含所述沙门氏菌。
实施例2
为了验证RPA-LFD检测方法的特异性，以鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、婴儿沙门氏菌、大肠杆菌O157：H7、福氏志贺杆菌、金黄色葡萄球菌、阴沟肠杆菌和单核细胞增生李斯特菌为供试材料，通过本发明设计的引物，进行RPA反应，应用靶标侧流层析试纸条对RPA扩增产物进行检测。
按照实施例1的方法进行检测，检测结果如图2所示。图2是RPA-LFD特异性试纸条检测结果图，图中试纸条编号1：鼠伤寒沙门氏菌和肠炎沙门氏菌；编号2：鼠伤寒沙门氏菌；编号3：肠炎沙门氏菌；编号4：婴儿沙门氏菌；编号5：大肠杆菌ATCC 25922；编号6：阪崎肠杆菌ATCC 25914；编号7：金黄色葡萄球菌ATCC 29213；编号8：蜡样芽胞杆菌ATCC 1220；编号9：枯草芽孢杆菌ATCC 6633；编号10：阴性对照。当试纸条除了出现了一条质控线，还出现1-3条检测线，则结果为阳性，表明样本中含有沙门氏菌及其鼠伤寒、肠炎等血清型；当试纸条只出现了一条质控线，没有出现检测线，则结果是阴性，表明样本中不含有沙门氏菌；图2中显示第1-4条试纸条除了出现了一条质控线，还出现T1-T3条检测线，呈阳性，表明样本中含有沙门氏菌及其鼠伤寒、肠炎等血清型；图2中第5-10条都只出现1条质控线，呈阴性，表明样品中不含有沙门氏菌。
实施例3
本实施例主要对沙门氏菌污染鸡肉进行检测。
首先挑LB琼脂板上鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌和婴儿沙门氏菌单菌落，分别接种于LB肉汤，200rpm摇动，37℃培养过夜，得到105CFU/mL的菌液；准备5份10g不含沙门氏菌的鸡肉样品，编号为1-5号样品；1号样品加入1mL PBS；2号样品加入鼠伤寒和肠炎沙门氏菌各1mL；3号样品加入1mL婴儿沙门氏菌；4号样品加入1mL肠炎沙门氏菌；5号样品加入1mL鼠伤寒沙门氏菌；随后，1、3-5号样品各加入9mL PBS，2号样品加入8mL PBS，混匀，将其中的液体转移至15mL离心管中，先1000rpm离心6min去除较大的杂质，上清液移至新的15mL离心管，6000rpm离心6min收集沉淀。采用实施例1的方法，用细菌基因组DNA提取试剂盒提取污染鸡肉的沙门氏菌基因组DNA。然后，采用实施例1的方法对提取的DNA进行RPA扩增反应，并结合LFD对扩增产物进行检测。如图3所示，对于图中序号所列样品根据判读标准得出的结果见表2。本实例再次证明了基于RPA-LFD法检测沙门氏菌及其鼠伤寒和肠炎血清型的方法准确可靠，有很强的实用性。
表2鸡肉样品中沙门氏菌检测结果的判读标准
Figure BDA0003417875520000071
Figure BDA0003417875520000081
注：+，阳性结果；-，阴性结果。
如图3所示，1号样品是阴性对照，仅出现质控C线条带，表明样品不含有沙门氏菌；2号样品的试纸条，出现质控C线条带和T1-T3三条检测线，呈阳性，说明样品含有沙门氏菌，同时含有鼠伤寒和肠炎这两种血清型；3号样品的试纸条，出现质控C线条带和T1条带，说明样品含有沙门氏菌，但不含有鼠伤寒和肠炎这两种血清型；4号样品试纸条出现质控C线条带、T1和T3条带，说明样品含有沙门氏菌和肠炎血清型；5号样品试纸条出现质控C线条带、T1和T2条带，说明样品含有沙门氏菌和鼠伤寒血清型。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一种基于RPA-LFD法快速检测沙门氏菌的引物对，其特征在于，所述引物序列包括检测所述沙门氏菌、所述鼠伤寒沙门氏菌和所述肠炎沙门氏菌的正向序列和反向序列：检测所述沙门氏菌的正向引物为InvA-F，序列如表1中SEQ ID NO:1所示；检测所述沙门氏菌的反向引物为InvA-R，序列如表1中SEQ ID NO:2所示；检测所述鼠伤寒沙门氏菌的正向引物为Stm-F，序列如表1中SEQ ID NO:3所示；检测所述鼠伤寒沙门氏菌的反向引物为Stm-R，序列如表1中SEQ ID NO:4所示；检测所述肠炎沙门氏菌的正向引物为Sen-F，序列如表1中SEQID NO:5所示；检测所述肠炎沙门氏菌的反向引物为Sen-R，序列如表1中SEQ ID NO:6所示。
2.一种使用如权利要求1所述的引物对的快速检测沙门氏菌的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
步骤1、用细菌基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司)，提取样本总DNA；
步骤2、使用引物对InvA-F、InvA-R，Stm-F、Stm-R，Sen-F、Sen-R，对步骤1提取的样本总DNA进行三重RPA扩增反应，得到所述RPA扩增产物；
步骤3、应用靶标侧流层析试纸条对步骤2得到的RPA扩增产物进行检测，所述靶标侧流层析试纸条包括三条检测线T1、T2和T3，分别包埋检测沙门氏菌抗体(anti-FAM)、检测鼠伤寒沙门氏菌抗体(anti-TAMRA)和检测肠炎沙门氏菌抗体(anti-Digoxin)，所述靶标侧流层析试纸条还包括质控C线，根据所述检测线和所述质控线产生的条带进行判读，得出样品中是否含有沙门氏菌及其属于鼠伤寒、肠炎等血清型。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤2还包括：在装有冻干酶粉的反应管中，依次加入所述RPA反应缓冲液；正向引物：所述InvA-F、所述Stm-F和所述Sen-F；反向引物：所述InvA-R、所述Stm-R和所述Sen-R；待测样本DNA；去离子水，然后振荡混匀1次；再加入MgOAc后快速离心；充分振荡混匀1次并快速离心；置于水浴锅上反应。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤2中扩增反应温度为38℃。
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤3还包括：①取所述RPA扩增产物加入到所述靶标侧流层析试纸条配套的稀释液中，得到稀释后的待检样品；②吸取所述稀释后的待检样品缓慢逐滴滴加在试纸条加样区；③根据所述试纸条上产生的所述条带进行判读，判读标准为：在所述质控C线呈现条带的情况下，分别根据以下标准做出判断：
T1线、T2线和T3线同时呈现出条带，则说明样品中含所述沙门氏菌，同时含有所述鼠伤寒和所述肠炎血清型；
T1线和T3线同时呈现出条带，而T2线不呈现条带，则说明样品中含所述沙门氏菌，同时含有所述肠炎血清型；
T1线和T2线同时呈现出条带，而T3线不呈现条带，则说明样品中含所述沙门氏菌、同时含有所述鼠伤寒血清型；
T1线呈现出条带，而T2和T3线都不呈现条带，则说明样品中不含所述鼠伤寒和肠炎这两种血清型，但含所述沙门氏菌其他血清型；
T1不呈现条带，则说明样品中不含所述沙门氏菌。
6.一种包含如权利要求1所述的引物对的RPA-LFD法快速检测沙门氏菌的试剂盒，其特征在于，包括所述引物对InvA-F、InvA-R，Stm-F、Stm-R，Sen-F、Sen-R，无菌双蒸水、缓冲液、标准阳性DNA、靶标侧流层析试纸条和产物稀释液；所述靶标侧流层析试纸条包括样品区、检测区和吸水区，所述检测区包括三条检测线和质控线，所述检测线分别包埋anti-Digoxin、anti-TAMRA和anti-FAM；所述质控C线含有链霉亲和素。
7.一种如权利要求1所述的引物对在检测沙门氏菌及其鼠伤寒和肠炎血清型中的应用。
8.如权利要求7所述的应用方法，其特征在于，采用细菌基因组DNA提取试剂盒提取样品的总DNA，以所述总DNA为模板，以所述引物对为引物，进行RPA扩增反应，应用靶标侧流层析试纸条对所述RPA扩增产物进行检测，根据所述试纸条上条带产生的数目，来判读样品中是否含有沙门氏菌及其鼠伤寒、肠炎等血清型。
9.一种如权利要求2所述的检测沙门氏菌的方法在检测沙门氏菌及其鼠伤寒和肠炎血清型中的应用。
10.一种如权利要求6所述的检测沙门氏菌的试剂盒在检测沙门氏菌及其鼠伤寒和肠炎血清型中的应用。
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