CN116200510A - 一种快速检测沙门氏菌的等温扩增引物对及其试剂盒和应用 - Google Patents

一种快速检测沙门氏菌的等温扩增引物对及其试剂盒和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种等温扩增引物对，所述等温扩增引物对的序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。本发明还公开了等温扩增引物对在制备检测沙门氏菌的试剂或试剂盒中的应用。本发明还公开了一种沙门氏菌快速检测试剂盒，所述检测试剂盒包括所述的等温扩增引物对。本发明还公开了所述的荧光检测试剂盒在检测环境或食品中的沙门氏菌的应用。本发明还公开了一种快速检测沙门氏菌的方法，所述检测方法用时短，操作简单快速，有效防止非特异性扩增，灵敏度高，特异性强，适用范围广，即时检测，适于第三方医学检验机构及基层现场检测；为食品监管、医疗卫生、疫病防控、出入境等单位快速筛查和检测沙门氏菌提供了新的技术支撑。

Description

一种快速检测沙门氏菌的等温扩增引物对及其试剂盒和应用
技术领域
本发明涉及一种致病菌的检测方法，尤其涉及一种快速检测沙门氏菌的等温扩增引物对及其试剂盒和应用，属于分子生物学检测技术领域。
背景技术
沙门氏菌是一种全球范围内流行的可引起人畜共患的重要革兰氏阴性杆菌，其包含超过2600种能够在多种宿主中引起感染的血清型。沙门氏菌的感染源主要包括牛奶、鸡蛋、肉类及其加工制品、蔬菜等，其感染后主要寄生于哺乳动物和禽类动物的肠道中。人类食用被沙门氏菌污染的食物后，主要表现为恶心、呕吐、腹痛、腹泻、伤寒等急性症状。据有关统计，在世界各国的细菌性食物中毒病例中，沙门氏菌引起的食物中毒常位居前列。同时，在我国，沙门氏菌污染引起的食物中毒也常居首位。此外，沙门氏菌也是动物饲料和宠物食品中的重要致病性微生物。因此，沙门氏菌感染不仅造成巨大的经济和社会损失，同时严重威胁着人和动物的生命健康安全。快速精准地检测沙门氏菌，对于及时、有效地预防沙门氏菌感染和流行具有十分重要的意义。
传统的沙门氏菌检测方法主要包括细菌分离培养和血清学检测。沙门氏菌分离培养法结果准确，但步骤繁琐、用时较长(通常需要5～7天)。基于血清学检测的免疫学方法操作简单，但灵敏度和特异性有待提高，且难以实现高通量检测。目前，以聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)为代表的核酸检测方法以其高灵敏度和特异性等优势已广泛应用于沙门氏菌等病原微生物的快速检测。然而，常规PCR方法需依赖存在安全风险的琼脂糖凝胶电泳实验，且操作较为繁琐、费时。实时荧光定量PCR方法虽然无需使用琼脂糖凝胶电泳即对靶标进行快速定量检测，但仪器和试剂成本较高，且需要训练有素的操作人员进行操作，因而难以在基层检验检疫机构中广泛使用。因此，建立一种灵敏特异、成本可控、用户友好且适于现场即时检测的沙门氏菌分子检测方法对于有效防控其传播和感染具有非常重要的意义。
Bst DNA聚合酶来源于含有来自Bacillus stearothermophilus DNA聚合酶基因的大肠杆菌菌株。该蛋白具有5’到3’的聚合酶活性，但不具有5’到3’的核酸外切酶活性。由于其在合适的温度条件下具有良好的DNA合成性能，现已被广泛应用于DNA扩增、合成测序等方面。该酶的出现，极大地促进核酸扩增方法的进步，特别是在等温扩增方法中的应用。但目前的等温扩增方法，对靶基因的序列特征、长度等均有一定的要求，限制了等温扩增方法的进一步应用。因此，亟需一种操作简便、灵敏、特异，且对靶基因序列没有特殊限制的等温扩增方法。
根据目前已公开的专利或文献中基于核酸的沙门氏菌检测方法包括常规PCR、荧光定量PCR、数字PCR、免疫PCR、核酸杂交、环介导等温扩增、重组酶聚合酶扩增、交叉引物恒温扩增技术、基因芯片等。但是，这些方法均有着各自的局限性，如需使用琼脂糖凝胶电泳、检测试剂和仪器成本高、操作步骤繁琐、引物设计对靶序列有一定限制或缺乏成熟的引物设计策略、反应体系复杂等。
近年来，以免疫学原理为基础的胶体金试纸技术正逐步探索应用于核酸检测。这类方法简单、方便，通过比色即可快速判断核酸扩增结果。但是，由于非特异性扩增产物同样也具有与目标产物相同的特征，因而容易导致假阳性的判定结果。因此，有效解决潜在的非特异性扩增产物对结果判断的干扰是核酸试纸检测技术的关键之一。此外，为了更有利于实现病原体的早期检测，核酸检测技术的灵敏度也亟待提高。因此，本领域亟需一种操作简单、灵敏特异、结果可靠且用户友好的沙门氏菌快速检测试剂盒及其非诊断性检测方法。
发明内容
发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供一种等温扩增引物对，所述等温扩增引物对的序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。
本发明还要解决的技术问题是提供等温扩增引物对在制备检测沙门氏菌的试剂或试剂盒中的应用。
本发明还要解决的技术问题是提供一种沙门氏菌快速检测试剂盒，所述检测试剂盒包括所述的等温扩增引物对。
本发明还要解决的技术问题是提供一种荧光检测试剂盒在检测环境或食品中的沙门氏菌的应用。
本发明还要解决的技术问题是提供一种该检测用时短，操作简单快速，有效防止非特异性扩增，灵敏度高，特异性强，适用范围广，即时检测，适于第三方医学检验机构及基层现场检测；为食品监管、医疗卫生、疫病防控、出入境等单位快速筛查和检测沙门氏菌提供了新的技术支撑的沙门氏菌快速检测方法。
为解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：
本发明提供一种等温扩增引物对，所述等温扩增引物对的序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。
其中，所述引物对的正向引物和反向引物的5’或3’端均标记标记物，所述标记物包括生物素、地高辛、氨基、羧基、巯基或荧光基团中的一种或几种。
其中，所述等温扩增引物对的工作浓度为0.5～1.5μM。
本发明还提供了等温扩增引物对在制备检测沙门氏菌的试剂或试剂盒中的应用。
本发明还提供了一种沙门氏菌快速检测试剂盒，所述检测试剂盒包括所述的等温扩增引物对。
其中，所述检测试剂盒还包括等温扩增缓冲液、dNTPs、聚乙二醇、甜菜碱、Bst DNA聚合酶、石墨烯纳米片、无酶水、阳性对照和阴性对照。
其中，所述检测试剂盒为荧光检测试剂盒。
本发明还提供了一种荧光检测试剂盒在检测环境或食品中的沙门氏菌的应用。
本发明还提供了一种快速检测沙门氏菌的方法，包括以下步骤：在待测液中加入所述的等温扩增引物对或检测试剂盒中的试剂，当荧光信号值大于等于15时，待测液中含有沙门氏菌；当荧光信号值小于15时，待测液中没有沙门氏菌。
其中，所述沙门氏菌包括鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌、海德堡沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌、里丁沙门氏菌、火鸡沙门氏菌、印第安纳沙门氏菌、山夫登堡沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、纽波特沙门氏菌或鸭沙门氏菌中的一种或几种。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：
检测用时短，操作简单快速，有效防止非特异性扩增，灵敏度高，特异性强，适用范围广，即时检测，适于第三方医学检验机构及基层现场检测；为食品监管、医疗卫生、疫病防控、出入境等单位快速筛查和检测沙门氏菌提供了新的技术支撑，具有广阔的市场前景和较大的社会、经济效益。
附图说明
图1为沙门氏菌备选引物扩增沙门氏菌参考株(阳性对照组)荧光试纸测试结果图；
图2为沙门氏菌备选引物扩增无模板对照(阴性对照组)荧光试纸测试结果图；
图3为沙门氏菌备选引物实时荧光检测方法验证结果图；
图4为石墨烯纳米片在扩增反应中的作用验证；
图5为沙门氏菌等温扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果图；
图6为快速检测阳性对照和阴性对照重复性结果图；
图7为沙门氏菌荧光试纸检测方法的灵敏度结果图；
图8为沙门氏菌荧光试纸检测方法的特异性结果图；
图9为沙门氏菌荧光试纸检测方法的抗干扰测试结果图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的技术方案作进一步说明。
根据美国生物技术信息中心基因序列数据库GenBank中已公开的沙门氏菌全基因组序列(Salmonella Enteritidis NZ_CP019681，Salmonella Newport NZ_CP013685，Salmonella Typhimurium NZ_CP017728，Salmonella Thompson NZ_CP019196，SalmonellaKentucky NZ_CP104049，Salmonella Montevideo NZ_CP017971，Salmonella GallinarumNZ_CP019035，Salmonella Pullorum NZ_CP022963，Salmonella Diarizonae NZ_CP011289，Salmonella Saintpaul NZ_CP019206，Salmonella Heidelberg NZ_CP016565)，使用BLASTn、DNASTAR、Mega 5.0等多序列分析工具进行基因组序列比对分析，以筛选沙门氏菌特异性保守基因。根据筛选出的特异性基因ttrA、ttrB以及ttrS的保守序列区域，利用Primer Premier 5.0、Oligo 6.0、NUPACK(http://www.nupack.org/)等引物设计及分析工具进行等温扩增引物的设计。所设计引物进一步通过BLASTn和Primer-BLAST进行特异性验证，备选引物信息如表1(基于沙门氏菌基因组特异性基因保守区域设计的备选等温扩增引物)：
表1
Figure BDA0003904590560000041
实施例1沙门氏菌快速扩增引物的设计
以沙门氏菌参考株ATCC14028(浓度约1×106CFU/mL)基因组为模板，20μL反应体系包括：2μL的10×等温扩增缓冲液(其组分包括200mM Tris-HCl，100mM(NH4)2SO4，500mMKCl，20mM MgSO4，1％ Triton X-100，pH 8.6～8.8)、2μL dNTPs(包含dGTP、dCTP、dATP、dTTP，浓度均为10mM)、2μL PEG-200、1μL甜菜碱(10mM)、0.8μL Bst DNA聚合酶(8000U/mL)、1μL石墨烯纳米片分散液(20ng/μL)、3μL模板和4.2μL无酶水。将反应体系配制于微型反应管中，同时设置阴性对照(灭菌双蒸水)。使用表1中的多对引物(10μM)各2μL分别制备反应体系，保证引物的工作浓度为0.5～1.5μM范围内。分别将含有不同反应体系的反应管混匀后瞬时离心，将反应管置于恒温水浴锅中，反应程序为：63℃，30分钟。反应结束后，向反应管中加入90μL运行缓冲液(0.1M Tris，0.01M EDTA，0.05M NaCl)，吹打混匀后滴入试纸加样窗口。静置2分钟，使用荧光分析仪读取荧光信号。
如图1和图2所示，除基于ttrA基因的扩增引物(ttrA-F/R)的阳性对照和阴性对照均无明显的荧光信号外，使用ttrB基因的扩增引物(ttrB-F/R)和ttrS基因的扩增引物(ttrS-F/R)基因的阳性对照产物均有明显的荧光信号值，且阴性对照反应产物的荧光信号较弱。此外，基于ttrB基因的引物(ttrB-F/R)阳性对照扩增产物的荧光信号显著高于ttrS基因扩增引物(ttrS-F/R)。因此，优选基于ttrB基因的扩增引物(ttrB-F/R)作为后续实验的等温扩增引物。
实施例2荧光定量方法验证
以沙门氏菌参考株ATCC14028(浓度约1×106CFU/mL)基因组为模板，20μL反应体系包括：2μL的10×等温扩增缓冲液(其组分包括200mM Tris-HCl，100mM(NH4)2SO4，500mMKCl，20mM MgSO4，1％ Triton X-100，pH 8.6～8.8)、2μL dNTPs(包含dGTP、dCTP、dATP、dTTP，浓度均为10mM)、2μL PEG-200、1μL甜菜碱(10mM)、0.8μL Bst DNA聚合酶(8000U/mL)、1μL Eva Green(20×)、3μL模板和4.2μL无酶水。将反应体系配制于微型反应管中，同时设置阴性对照(灭菌双蒸水)。使用表1中的多对引物(10μM)各2μL分别制备反应体系。分别将含有不同反应体系的反应管混匀后瞬时离心，将反应管分别置于普通PCR仪中。反应程序为：74℃1秒，60℃1秒，共45个循环。反应结束后，通过扩增产物的荧光曲线观察备选引物并验证结果。
如图3所示，使用ttrA基因的扩增引物(ttrA-F/R)的阳性对照和阴性对照均无可见荧光曲线，使用ttrB基因的扩增引物(ttrB-F/R)和ttrS基因的扩增引物(ttrS-F/R)的阳性对照产物均有明显的荧光曲线，且阴性对照均无明显的荧光曲线。同时，基于ttrB基因的扩增引物(ttrB-F/R)阳性对照产物的荧光强度高于ttrS基因扩增引物(ttrS-F/R)。结果表明，基于ttrB基因的扩增引物(ttrB-F/R)可作为后续实验的等温扩增引物，与实施例1的实验结果相同。
实施例3石墨烯纳米片在扩增反应中的作用探索
为了降低无模板扩增时的荧光试纸测试信号，本实验选取浓度为10ng/μL的石墨烯纳米片分散液进行验证，反应体系设置为：2μL的10×等温扩增缓冲液(其组分包括200mMTris-HCl，100mM(NH4)2SO4，500mM KCl，20mM MgSO4，1％ Triton X-100，pH8.6～8.8)、2μLdNTPs(包含dGTP、dCTP、dATP、dTTP，浓度均为10mM)、2μL PEG-200、1μL甜菜碱(10mM)、引物ttrB-F和ttrB-R(10μM)各2μL、0.8μL Bst DNA聚合酶(8000U/mL)、1μL石墨烯纳米片分散液(20ng/μL)、3μL模板和4.2μL无酶水。将反应体系配制于微型反应管中，同时设置阴性对照(灭菌双蒸水)。将含有反应体系的反应管混匀后瞬时离心，将反应管置于恒温水浴锅中。反应程序为：63℃，30分钟。反应结束后，向反应管中加入90μL运行缓冲液(0.1M Tris，0.01MEDTA，0.05M NaCl)，吹打混匀后滴入试纸加样窗口。静置2分钟，使用荧光分析仪读取荧光信号。
如图4所示，当反应体系中加入石墨烯纳米片后，沙门氏菌参考株基因组和阴性对照的扩增产物荧光信号均有所降低，且阴性对照已无明显的荧光信号(荧光曲线峰靠近x轴)。结果表明，石墨烯纳米片可以有效增强本发明方法中阳性和阴性结果的对比度，有利于实际应用。
实施例4沙门氏菌等温扩增产物凝胶电泳结果观察
以沙门氏菌参考株ATCC14028(浓度约1×106CFU/mL)基因组为模板，20μL反应体系包括：2μL的10×等温扩增缓冲液(其组分包括200mM Tris-HCl，100mM(NH4)2SO4，500mMKCl，20mM MgSO4，1％ Triton X-100，pH 8.6～8.8)、2μL dNTPs(包含dGTP、dCTP、dATP、dTTP，浓度均为10mM)、2μL PEG-200、1μL甜菜碱(10mM)、引物ttrB-F和ttrB-R(10μM)各2μL、0.8μL Bst DNA聚合酶(8000U/mL)、1μL石墨烯纳米片分散液(20ng/μL)、3μL模板和4.2μL无酶水。将反应体系配制于微型反应管中，同时设置阴性对照(灭菌双蒸水)。将含有反应体系的反应管混匀后瞬时离心，将反应管置于恒温水浴锅中。反应程序为：63℃，60分钟。反应结束后，使用浓度为3％(w/v)的琼脂糖凝胶电泳观察扩增产物。
如图5所示，使用基于ttrB基因的优选扩增引物(ttrB-F/R)，阳性对照的扩增产物呈现典型的梯状条带，而阴性对照的扩增产物则无可见条带，上述结果与荧光试纸检测结果一致。实验结果表明，本发明沙门氏菌等温扩增方法结果可靠。
实施例5沙门氏菌快速荧光检测方法的重复性测试
以沙门氏菌参考株ATCC14028(浓度约1×106CFU/mL)基因组为模板，20μL反应体系包括：2μL的10×等温扩增缓冲液(其组分包括200mM Tris-HCl，100mM(NH4)2SO4，500mMKCl，20mM MgSO4，1％ Triton X-100，pH 8.6～8.8)、2μL dNTPs(包含dGTP、dCTP、dATP、dTTP，浓度均为10mM)、2μL PEG-200、1μL甜菜碱(10mM)、引物ttrB-F和ttrB-R(10μM)各2μL、0.8μL Bst DNA聚合酶(8000U/mL)、1μL石墨烯纳米片分散液(20ng/μL)、3μL模板和4.2μL无酶水。将反应体系配制于微型反应管中，同时设置阴性对照(灭菌双蒸水)。将含有反应体系的反应管混匀后瞬时离心，将反应管置于恒温水浴锅中。反应程序为：63℃，30分钟。反应结束后，向反应管中加入90μL运行缓冲液(0.1M Tris，0.01M EDTA，0.05M NaCl)，吹打混匀后滴入试纸加样窗口。静置2分钟，使用荧光分析仪读取荧光信号。
结果如图6和表2所示，通过对沙门氏菌参考株ATCC14028基因组和阴性对照(灭菌双蒸水)分别进行10次扩增测试，两种样品的扩增产物荧光信号均相对稳定(变异系数分别约为0.08和0.38)，有利于实际应用。同时，根据阴性对照的反应产物荧光值计算出cutoff值(阴性对照扩增产物的荧光信号均值加上3倍的标准偏差)为15。
表2
Figure BDA0003904590560000071
Figure BDA0003904590560000081
注：CV表示变异系数。
实施例6沙门氏菌快速荧光检测试剂盒的敏感性测试
将沙门氏菌参考株ATCC14028从约1×106CFU/mL进行10倍梯度稀释至1×106CFU/mL、1×105CFU/mL、1×104CFU/mL、1×103CFU/mL、1×102CFU/mL、1×101CFU/mL和1×100CFU/mL，并设置阴性对照组。反应体系和程序如下所示：
20μL扩增反应体系包括：2μL的10×等温扩增缓冲液(其组分包括200mM Tris-HCl，100mM(NH4)2SO4，500mM KCl，20mM MgSO4，1％ Triton X-100，pH 8.6～8.8)、2μLdNTPs(包含dGTP、dCTP、dATP、dTTP，浓度均为10mM)、2μL PEG-200、1μL甜菜碱(10mM)、引物ttrB-F和ttrB-R(10μM)各2μL、0.8μL Bst DNA聚合酶(8000U/mL)、1μL石墨烯纳米片分散液(20ng/μL)、3μL模板和4.2μL无酶水。将反应体系配制于微型反应管中，同时设置阴性对照(灭菌双蒸水)。将含有反应体系的反应管混匀后瞬时离心，将反应管置于恒温水浴锅中。反应程序为：63℃，30分钟。反应结束后，向反应管中加入90μL运行缓冲液(0.1M Tris，0.01M EDTA，0.05M NaCl)，吹打混匀后滴入试纸加样窗口。静置2分钟，使用荧光分析仪读取荧光信号。
检测结果如图7所示，荧光扩增曲线对应的核酸标准物质模板浓度分别约为1×106CFU/mL、1×105CFU/mL、1×104CFU/mL、1×103CFU/mL、1×102CFU/mL、1×101CFU/mL，且荧光信号值均大于15，而1×100CFU/mL和阴性对照组(NTC组)的扩增产物荧光信号峰靠近x轴，且荧光信号值小于15。因此，本发明试剂盒的检测灵敏度为1×101CFU/mL，具有较高的实际应用价值。
实施例7沙门氏菌快速荧光检测试剂盒的特异性测试
将鼠伤寒沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌、海德堡沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌、里丁沙门氏菌、火鸡沙门氏菌、印第安纳沙门氏菌、山夫登堡沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、纽波特沙门氏菌、鸭沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌、宋内志贺氏菌、普通变形杆菌、奇异变形杆菌、福氏志贺氏菌、枯草芽孢杆菌、巴氏杆菌的菌株分别进行培养、提取基因组DNA，按照实施例3确定的优化反应体系和反应条件进行快速扩增。
20μL扩增反应体系包括：2μL的10×等温扩增缓冲液(其组分包括200mM Tris-HCl，100mM(NH4)2SO4，500mM KCl，20mM MgSO4，1％ Triton X-100，pH 8.6～8.8)、2μLdNTPs(包含dGTP、dCTP、dATP、dTTP，浓度均为10mM)、2μL PEG-200、1μL甜菜碱(10mM)、引物ttrB-F和ttrB-R(10μM)各2μL、0.8μL Bst DNA聚合酶(8000U/mL)、1μL石墨烯纳米片分散液(20ng/μL)、3μL模板和4.2μL无酶水。将反应体系配制于微型反应管中，同时设置阴性对照(灭菌双蒸水)。将含有反应体系的反应管混匀后瞬时离心，将反应管置于恒温水浴锅中。反应程序为：63℃，30分钟。反应结束后，向反应管中加入90μL运行缓冲液(0.1M Tris，0.01M EDTA，0.05M NaCl)，吹打混匀后滴入试纸加样窗口。静置2分钟，使用荧光分析仪读取荧光信号。
表3
Figure BDA0003904590560000091
Figure BDA0003904590560000101
注：表格结果一栏中，“+”表示阳性，“－”表示阴性。
表4
Figure BDA0003904590560000102
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Figure BDA0003904590560000111
结果如图8所示，仅沙门氏菌参考菌株显示出特异性荧光曲线(荧光信号值大于15)，非沙门氏菌参考/分离株以及阴性对照(NTC)均无可见的荧光曲线峰(荧光信号值小于15)(表3)。此外，本发明沙门氏菌等温扩增引物序列使用BLASTn、Primer-BLAST等序列分析工具验证表明，扩增引物可特异性匹配不同分群的沙门氏菌血清型，且与非沙门氏菌无交叉反应性(表4)。
结果表明，本发明快速荧光检测方法的特异性好，具有较高的检测应用价值。
实施例8沙门氏菌快速荧光检测试剂盒的抗干扰测试
将肠炎沙门氏菌(保藏编号：ATCC13076)、大肠杆菌(保藏编号：ATCC25922)、肺炎克雷伯氏菌(保藏编号：ATCC700603)、普通变形杆菌(保藏编号：CMCC49027)和宋内志贺氏菌(保藏编号：CMCC51592)接种脑心浸液肉汤培养基进行培养，再将培养液使用灭菌双蒸水稀释1000倍后使用商品化的细菌基因组DNA提取试剂盒提取细菌基因组。将提取的基因组DNA分为2份，一份为肠炎沙门氏菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌、普通变形杆菌和宋内志贺氏菌参考株1:1:1:1:1混合物，另一份为大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌、普通变形杆菌和宋内志贺氏菌参考株1:1:1:1混合物，同时设置阴性对照(灭菌双蒸水)。按照实施例3确定的优化反应体系和反应条件进行快速等温扩增。
20μL扩增反应体系包括：2μL的10×等温扩增缓冲液(其组分包括200mM Tris-HCl，100mM(NH4)2SO4，500mM KCl，20mM MgSO4，1％ Triton X-100，pH 8.6～8.8)、2μLdNTPs(包含dGTP、dCTP、dATP、dTTP，浓度均为10mM)、2μL PEG-200、1μL甜菜碱(10mM)、引物ttrB-F和ttrB-R(10μM)各2μL、0.8μL Bst DNA聚合酶(8000U/mL)、1μL石墨烯纳米片分散液(20ng/μL)、3μL模板和4.2μL无酶水。将反应体系配制于微型反应管中，同时设置阴性对照(灭菌双蒸水)。将含有反应体系的反应管混匀后瞬时离心，将反应管置于恒温水浴锅中。反应程序为：63℃，30分钟。反应结束后，向反应管中加入90μL运行缓冲液(0.1M Tris，0.01M EDTA，0.05M NaCl)，吹打混匀后滴入试纸加样窗口。静置2分钟，使用荧光分析仪读取荧光信号。
结果如图9所示，含沙门氏菌的混合物扩增后对应的检测线显示出明显的荧光信号峰，不含沙门氏菌的混合物和阴性对照(NTC)的扩增产物对应的检测线荧光信号较弱(低于15)。验证结果表明，本发明方法具有较好的抗干扰能力，有利于实际应用。
实施例9检测试剂盒的组装
根据表1中的基于ttrB基因设计的沙门氏菌特异性扩增引物委托南京擎科生物科技有限公司进行合成，使用灭菌双蒸水将正向引物(ttrB-F)和反向引物(ttrB-R)均稀释成10μM，等体积混合后得到检测引物。使用商品化的细菌基因组DNA提取试剂盒提取沙门氏菌ATCC14028(浓度不低于1×105CFU/mL)基因组DNA作为阳性对照；核酸扩增试剂：10×反应缓冲液(其组分包括200mM Tris-HCl，100mM(NH4)2SO4，500mM KCl，20mM MgSO4，1％ TritonX-100，pH 8.6～8.8)、dNTPs(包含dGTP、dCTP、dATP、dTTP，浓度均为10mM)、Bst DNA聚合酶(8U/μL)、甜菜碱(10mM)、PEG-200、石墨烯纳米片分散液(20ng/μL)、扩增引物、阳性对照以及阴性对照(灭菌双蒸水)。荧光免疫层析试纸组成包括底板、吸水纸、硝酸纤维膜、结合垫、样品垫。底板上粘贴硝酸纤维膜，硝酸纤维膜的一端连接吸水纸、另一端粘贴结合垫，结合垫上搭接样品垫。硝酸纤维膜上设有一条包被有二抗的控制线，还设有一条与控制线平行的包被有抗A抗体(能与正向引物5’端标记物特异结合)的检测线。结合垫包被有荧光微球抗B抗体(能与反向引物5’端标记物特异结合)偶联物。所述试纸条装在卡壳中，上盖设置有加样窗口和信号读取窗口，其中加样窗口与样品垫对应，信号读取窗口与检测线、控制线相对应。
将以上所涉试剂和产品共同包装，再配以产品使用说明书(包括产品保存条件、反应体系配制方法、反应程序设置和结果判定方法等)，组装成本发明所述的基于核酸等温扩增的沙门氏菌荧光法快速检测试剂盒。
实施例10临床分离样本验证
用实施例3的方法对临床送检的215份疑似沙门氏菌病样本(弱雏、死胚等)进行检测，同时使用沙门氏菌国家标准(GB/T 4789.4-2008)中的方法进行沙门氏菌鉴定。
表5
Figure BDA0003904590560000131
结果如表5所示，本发明提供的检测方法检出23份待检样品为沙门氏菌阳性，检测结果与国标检测方法一致。此外，与国标法检测沙门氏菌需要5～7天时间相比，本发明方法检测沙门氏菌最快仅需约半小时，具有显著优势。验证结果表明，本发明所建立的检测方法具有较好的临床应用价值。

Claims (10)

1.一种等温扩增引物对，其特征在于，所述等温扩增引物对的序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。
2.根据权利要求1所述的引物对，其特征在于，所述引物对的正向引物和反向引物的5’或3’端均标记标记物，所述标记物包括生物素、地高辛、氨基、羧基、巯基或荧光基团中的一种或几种。
3.根据权利要求1所述的引物对，其特征在于，所述等温扩增引物的工作浓度为0.5～1.5μM。
4.权利要求1～3任一项所述的等温扩增引物对在制备检测沙门氏菌的试剂或试剂盒中的应用。
5.一种沙门氏菌快速检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括权利要求1所述的等温扩增引物对。
6.根据权利要求5所述的沙门氏菌快速检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括等温扩增缓冲液、dNTPs、聚乙二醇、甜菜碱、Bst DNA聚合酶、石墨烯纳米片、无酶水、阳性对照和阴性对照。
7.根据权利要求5或6所述的沙门氏菌快速检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒为荧光检测试剂盒。
8.一种权利要求7所述的荧光检测试剂盒在检测环境或食品中的沙门氏菌的应用。
9.一种快速检测沙门氏菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：在待测液中加入权利要求1所述的扩增引物对或权利要求7所述的检测试剂盒中的试剂，当荧光信号值大于等于15时，待测液中含有沙门氏菌；当荧光信号值小于15时，待测液中没有沙门氏菌。
10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于，所述沙门氏菌包括鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌、海德堡沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌、里丁沙门氏菌、火鸡沙门氏菌、印第安纳沙门氏菌、山夫登堡沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、纽波特沙门氏菌或鸭沙门氏菌中的一种或几种。
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