CN114717341B - 基于ttr基因的沙门氏菌检测试剂盒及非诊断性检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于ttr基因的沙门氏菌检测试剂盒及非诊断性检测方法，试剂盒含有以下特异性引物：上游外引物F3如SEQ ID NO.1所示，下游外引物B3如SEQ ID NO.2所示，上游内引物FIP如SEQ ID NO.3所示，下游内引物BIP如SEQ ID NO.4所示，上游环引物LF如SEQ ID NO.5所示，下游环引物LB如SEQ ID NO.6所示。本发明设计一条特有的LAMP引物对沙门氏菌进行检测，同时结合短时间增菌和MPN计数建立了mini‑MPN‑LAMP沙门氏菌快速定量检测方法；本发明灵敏度高，特异性好，操作简单快速，准确可靠，检测成本低。
Description
技术领域
本发明属于食品微生物技术领域，涉及一种食品微生物检测试剂盒及其检测方法，具体地说是涉及一种基于ttr基因的沙门氏菌检测试剂盒及非诊断性检测方法。
背景技术
基因的选择对于沙门氏菌的鉴定至关重要。invA基因是沙门氏菌属检测最常用的目标基因。该基因编码位于沙门氏菌致病岛(SPI)上的入侵蛋白，在沙门氏菌致病过程中起着重要的作用，是侵袭宿主细胞所需的毒力因子，大多数已发表的文献和商品化的试剂盒都以invA基因作为靶基因进行检测。
近年来，TURKI等发现分离出的12.3％的S.enterica serovar Kentucky分离株无法检测出invA基因，另外，S.enterica serovar Litchfield和Senftenberg等菌株在自然界中也可能会缺失invA，通过生物信息学分析和综合测试评价发现invA在沙门氏菌中的特异性能只能达到97.6％～97.8％。
根据沙门菌属特有的靶序列肠毒素基因序列，设计2对特殊的内、外引物(内引物FIP与BIP，外引物F3与B3)，特异性识别靶序列上的六个独立区域，为增加反应速度，还设计1对环引物(LF与LB)。利用Bst DNA聚合酶启动循环链置换反应，在肠毒素基因序列启动互补链合成，在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎环DNA混合物；从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2+结合，产生副产物(焦磷酸镁)形成白色沉淀，同时反应液pH会降低，最终可通过颜色变化观察判定结果。
MPN计数法是一种基于概率计算的计数方法，使用上比平板计数法更具灵活性，对培养基的选择性要求低，检出限可根据加样量进行调整，因此MPN计数法广泛用于食品中大肠菌群、金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌等微生物的定量检测。虽然国家标准GB 4789.4-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验》中未制定沙门氏菌的定量检测方法，但在美国分析化学家协会(AOAC)、美国环保局(EPA)等机构制定的国际标准中均有沙门氏菌MPN计数法的使用，可见MPN计数法在定量检测沙门氏菌的重要地位；但是，试管法的MPN计数法操作繁杂，DNA提取需要进行浓缩，时间较长。
发明内容
为了克服现有技术存在的不足，本发明提供了一种基于ttr基因的沙门氏菌检测试剂盒及非诊断性检测方法。
本发明所采用的技术方案为：
一种基于ttr基因的沙门氏菌检测试剂盒，含有以下特异性引物：
上游外引物F3：5’-TCAGTGGCTAAAAGTCGGTC-3’；
下游外引物B3：5’-CGCACTGTGTCCAACAGC-3’；
上游内引物FIP：
5’-GTTACCTTGCCGGACGTCCCACTTTTGGTCTGAGCTACC-3’；
下游内引物BIP：
5’-AATGCGTTAATTCCGGAGGCGCCATGGCGATGGTTTGTT-3’；
上游环引物LF：5’-CCATCAATTGCGCGTTTCG-3’；
下游环引物LB：5’-AGGCGCAAACACACTGGC-3’。
作为优选，所述试剂盒包括多孔板(具体可选48孔板)、无菌离心管(具体可选1.5mL无菌离心管)、BPW培养液、无菌生理盐水、对照标准菌株DNA、LAMP反应体系试剂(具体可选15μL)。
本发明还提供了上述基于ttr基因的沙门氏菌检测试剂盒的非诊断性检测方法，包括下述步骤：
(1)制作检测沙门氏菌的环介导等温扩增试剂盒；
(2)样品制备和DNA提取；
(3)进行沙门氏菌的环介导等温扩增反应：按照LAMP反应体系对每个提取样品进行检测，依次确证沙门氏菌阳性管数；
(4)沙门氏菌MPN的报告：按照确证的沙门氏菌阳性管数，检索MPN表，报告每g或每mL样品中沙门氏菌的MPN值。
作为优选，LAMP反应体系为：10X ThermoPol Buffer 2μL，MgSO4 1.2μL，dNTPMixture 2.8μL，50X LAMP荧光染料0.2μL，ROX参比荧光染料0.2μL，10X Primers Mix 2μL，Bst 2.0WarmStart DNA聚合酶0.8μL，DNA粗提液5μL，加无RNA酶水至20μL。
作为优选，LAMP反应条件为：65℃保温反应40min，以1min作1个循环检测荧光值，结束后按65～95℃，0.2℃/s测定溶解曲线。
作为优选，步骤(2)具体为：
(a)样品的前处理：
无菌操作称取样品，置于盛有BPW的无菌均质杯或合适容器内，均质；若样品为液态，不需要均质，振荡混匀；使用BPW增菌液对样品均液进行10倍梯度稀释，取3个浓度，每个浓度分别取1mL至3个离心管，置于36℃增菌5h后分别进行DNA提取；
(b)待测样品模板DNA的制备：
(b-1)对照标准菌株菌液制备：沙门氏菌标准菌株的DNA作阳性对照，大肠埃希氏菌DNA作为阴性对照，标准菌株接种于血平板中36℃培养24h进行活化，再接种于BPW培养基中36℃培养16h得到新鲜菌液；
(b-2)样品与对照菌株的模板DNA制备：采用快速煮沸法提取核酸，吸取1mL样液于12000r/min离心5min，移去上清液900μL，加入1mL无菌水后混匀再12000r/min离心5min，移去上清液900μL，置于100℃电热板中加热15min，迅速冷却后12000r/min离心1min，移取上清液直接用于LAMP实验；上清即作为模板DNA。
本发明使用沙门氏菌ttrRSBCA基因座对沙门氏菌进行检测，设计一条特有的LAMP引物对沙门氏菌进行检测，同时结合短时间增菌和MPN计数建立了mini-MPN-LAMP沙门氏菌快速定量检测方法；本发明灵敏度高，特异性好，操作简单快速，准确可靠，检测成本低。
附图说明
图1为沙门氏菌梯度稀释qLAMP实验图谱；
图2为沙门氏菌qLAMP标准曲线图；
图3为沙门氏菌qLAMP溶解温度箱线图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对发明作进一步说明，但发明的保护范围并不限于此。本领域的普通技术人员可以且应当知晓任何基于本发明实质精神的简单变化或者替换均应属于本发明所要求的保护范围。
实验方法：
按GB 4789.4-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验》中5.1操作，有改动。无菌操作称取25g(mL)样品，置于盛有225mL BPW的无菌均质杯或合适容器内，均质2～3min。若样品为液态，不需要均质，振荡混匀。使用BPW增菌液对样品均液进行10倍梯度稀释，取3个适宜浓度，每个浓度分别取1mL至3个离心管，置于36℃增菌5h后分别进行DNA提取和LAMP实验。
核酸提取采用快速煮沸法：吸取1mL样液12000r/min离心5min，小心移去上清液900μL，再加入1mL无菌水12000r/min离心5min，小心移去上清液900μL，置于100℃加热煮沸15min，冷却后12000r/min离心1min，上清液直接用于LAMP实验。
LAMP反应体系：10X ThermoPol Buffer 2μL，MgSO4 1.2μL，dNTP Mixture 2.8μL，50X LAMP荧光染料0.2μL，ROX参比荧光染料0.2μL，10X Primers Mix 2μL，Bst2.0WarmStart DNA聚合酶0.8μL，DNA粗提液5μL，加无菌水至20μL。反应条件：65℃保温反应40min，以1min作1个循环检测荧光值，结束后测定溶解曲线(65～95℃，0.2℃/s)。使用灭菌双蒸水代替模板作空白对照，沙门氏菌标准菌株的DNA作阳性对照，大肠埃希氏菌DNA作为阴性对照。只有阴性对照、阳性对照和空白对照同时符合时，才能判定样品检测结果。
检测反应体系：WarmStart LAMP变色预混液10μL，10X Primer Mix 2μL，加水至15μL，反应前加入样品DNA提取液5μL。使用金属浴65℃加热保温40min，观察样品颜色的变化。颜色变黄则表示检出沙门氏菌。使用灭菌双蒸水代替模板作空白对照，沙门氏菌标准菌株的DNA作阳性对照，大肠埃希氏菌DNA作为阴性对照。只有阴性对照、阳性对照和空白对照同时符合时，才能判定样品检测结果。
基于ttr基因的沙门氏菌检测试剂盒及其非诊断性检测方法
一、按下列配方制作检测沙门氏菌的环介导等温扩增试剂盒：
(1)配制LAMP反应液：
反应体系中包括：10X ThermoPol Buffer 2μL，MgSO4 1.2μL，dNTP Mixture 2.8μL，50X LAMP荧光染料0.2μL，ROX参比荧光染料0.2μL，10X Primers Mix 2μL，Bst2.0WarmStart DNA聚合酶0.8μL，DNA粗提液5μL，加无RNA酶水至20μL。反应条件：65℃保温反应40min，以1min作1个循环检测荧光值，结束后测定溶解曲线(65～95℃，0.2℃/s)。
其中，基于ttr基因的沙门氏菌检测试剂盒，含有以下特异性引物：
上游外引物F3：5’-TCAGTGGCTAAAAGTCGGTC-3’；
下游外引物B3:5’-CGCACTGTGTCCAACAGC-3’；
上游内引物FIP：
5’-GTTACCTTGCCGGACGTCCCACTTTTGGTCTGAGCTACC-3’；
下游内引物BIP：
5’-AATGCGTTAATTCCGGAGGCGCCATGGCGATGGTTTGTT-3’；
上游环引物LF:5’-CCATCAATTGCGCGTTTCG-3’；
下游环引物LB:5’-AGGCGCAAACACACTGGC-3’。
本发明的沙门氏菌梯度稀释qLAMP实验图谱、沙门氏菌qLAMP标准曲线图、沙门氏菌qLAMP溶解温度箱线图如图1、图2、图3所示，从图中可以看出，所建立的LAMP实验获得的标准曲线为y＝-2.391x+12.516，r2＝0.949，检出限为500CFU/mL，对应的溶解曲线分析表明溶解温度为87.4℃。本发明可以结合溶解曲线对扩增产物进行目标基因的识别。
二、样品制备和DNA提取
(a)样品的前处理：
无菌操作称取25g(mL)样品，置于盛有225mL BPW的无菌均质杯或合适容器内，均质2～3min。若样品为液态，不需要均质，振荡混匀。使用BPW增菌液对样品均液进行10倍梯度稀释，取3个适宜浓度，每个浓度分别取1mL至3个离心管，置于36℃增菌5h后分别进行DNA提取。
(b)待测样品模板DNA的制备：
(b-1)对照标准菌株菌液制备：
阳性对照：婴儿沙门氏菌CICC21649；阴性对照：大肠埃希氏菌CICC24188，购置于中国工业微生物菌种保藏管理中心。标准菌株接种于血平板中36℃培养24h进行活化，再接种于BPW培养基中36℃培养16h得到新鲜菌液。
(b-2)样品与对照菌株的模板DNA制备：
采用快速煮沸法提取核酸：吸取1mL样液于12000r/min离心5min，小心移去上清液900μL，加入1mL无菌水后混匀再12000r/min离心5min，小心移去上清液900μL，置于100℃电热板中加热15min，迅速冷却后12000r/min离心1min，移取上清液直接用于LAMP实验；上清即作为模板DNA。
三、进行沙门氏菌的环介导等温扩增反应：
LAMP反应体系：10X ThermoPol Buffer 2μL，MgSO4 1.2μL，dNTP Mixture2.8μL，50X LAMP荧光染料0.2μL，ROX参比荧光染料0.2μL，10X Primers Mix2μL，Bst2.0WarmStart DNA聚合酶0.8μL，DNA粗提液5μL，加无菌水至20μL。反应条件：65℃保温反应40min，以1min作1个循环检测荧光值，结束后测定溶解曲线(65～95℃，0.2℃/s)。
按照反应体系对每个提取样品进行检测，依次确证的沙门氏菌阳性管数。
四、沙门氏菌最可能数(MPN)的报告：
按照确证的沙门氏菌阳性管数，检索MPN表(见表1)，报告每g(mL)样品中沙门氏菌的MPN值。
表1速冻乌米饭的沙门氏菌定量检测结果
表2鸡胸肉混合液的沙门氏菌定量检测结果
注：本表采用稀释度为1mL、0.1mL、0.01mL浓度的稀释液计算，实际样品检测结果按照应乘以10倍计算。
从表1、表2中可以看出，试剂盒的理论检出限为3.6CFU/mL。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 丽水市质量检验检测研究院
<120> 基于ttr基因的沙门氏菌检测试剂盒及非诊断性检测方法
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> F3
<400> 1
tcagtggcta aaagtcggtc 20
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> B3
<400> 2
cgcactgtgt ccaacagc 18
<210> 3
<211> 39
<212> DNA
<213> FIP
<400> 3
gttaccttgc cggacgtccc acttttggtc tgagctacc 39
<210> 4
<211> 39
<212> DNA
<213> BIP
<400> 4
aatgcgttaa ttccggaggc gccatggcga tggtttgtt 39
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> LF
<400> 5
ccatcaattg cgcgtttcg 19
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> LB
<400> 6
aggcgcaaac acactggc 18
Claims (1)
1.一种基于ttr基因的沙门氏菌检测试剂盒的非诊断性检测方法，其特征在于包括下述步骤：
（1）制作检测沙门氏菌的环介导等温扩增试剂盒；
配制LAMP反应液：
LAMP反应体系为：10 X ThermoPol Buffer 2 μL，MgSO4 1.2 μL，dNTP Mixture 2.8 μL，50 X LAMP荧光染料0.2 μL，ROX参比荧光染料0.2 μL，10 X Primers Mix 2μL，Bst 2.0WarmStart DNA 聚合酶0.8 μL，DNA粗提液5 μL，加无RNA酶水至20 μL；反应条件：65℃保温反应40 min，以1 min作1个循环检测荧光值，结束后按65～95℃，0.2℃/s测定溶解曲线；
其中，试剂盒含有以下特异性引物：
上游外引物F3如SEQ ID NO.1所示，下游外引物B3如SEQ ID NO.2所示，上游内引物FIP如SEQ ID NO.3所示，下游内引物BIP如SEQ ID NO.4所示，上游环引物LF如SEQ ID NO.5所示，下游环引物LB 如SEQ ID NO.6所示；
（2）样品制备和DNA提取；
（a）样品的前处理：
无菌操作称取25g或25ml样品，置于盛有225 mL BPW的无菌均质杯或合适容器内，均质2～3 min；若样品为液态，不需要均质，振荡混匀；使用BPW增菌液对样品均液进行10倍梯度稀释，取3个浓度，每个浓度分别取1 mL至3个离心管，置于36 ℃增菌5 h后分别进行DNA提取；
（b）待测样品模板DNA的制备：
（b-1）对照标准菌株菌液制备：
阳性对照：婴儿沙门氏菌CICC21649；阴性对照：大肠埃希氏菌CICC24188，标准菌株接种于血平板中 36℃培养 24h进行活化，再接种于 BPW培养基中 36℃培养 16h得到新鲜菌液；
（b-2）样品与对照菌株的模板DNA制备：
采用快速煮沸法提取核酸：吸取1 mL样液于12000 r/min离心5 min，移去上清液900 μL，加入1 mL无菌水后混匀再12000 r/min离心5 min，移去上清液900 μL，置于100 ℃电热板中加热15 min，迅速冷却后12000 r/min离心1 min，移取上清液直接用于LAMP实验；上清即作为模板DNA；
（3）进行沙门氏菌的环介导等温扩增反应：按照LAMP反应体系对每个提取样品进行检测，依次确证沙门氏菌阳性管数；
LAMP反应体系：10 X ThermoPol Buffer 2 μL，MgSO4 1.2 μL，dNTP Mixture 2.8 μL，50 X LAMP荧光染料0.2 μL，ROX参比荧光染料0.2 μL，10 X Primers Mix 2μL，Bst 2.0WarmStart DNA 聚合酶0.8 μL，DNA粗提液5 μL，加无菌水至20 μL；反应条件：65℃保温反应40 min，以1 min作1个循环检测荧光值，结束后按65～95℃，0.2℃/s测定溶解曲线；
检测反应体系：WarmStart LAMP变色预混液10μL，10X Primer Mix 2μL，加水至15μL，反应前加入样品DNA提取液5μL；使用金属浴65℃加热保温40min，观察样品颜色的变化；颜色变黄则表示检出沙门氏菌；
（4）沙门氏菌MPN的报告：按照确证的沙门氏菌阳性管数，检索MPN表，报告每g或每mL样品中沙门氏菌的 MPN 值；试剂盒的理论检出限为3.6 CFU/mL。
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Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2017067942A1 (en) * | 2015-10-19 | 2017-04-27 | Institut Pasteur | Detection of microbial pathogens related to bacterial infections through amplification especially by rt-lamp |
| CN106636437A (zh) * | 2017-02-14 | 2017-05-10 | 江西省疾病预防控制中心 | 一种基于mpn与pcr的食品中沙门氏菌快速定量方法 |
| CN108034692A (zh) * | 2018-01-23 | 2018-05-15 | 丽水市食品药品与质量技术检验检测院 | 用于鉴别沙门氏菌和单增李斯特菌的检测分析方法 |
| KR20210143580A (ko) * | 2020-05-20 | 2021-11-29 | 경희대학교 산학협력단 | 살모넬라 검출용 멀티플렉스 프라이머 및 이의 용도 |
| CN116200510A (zh) * | 2022-10-24 | 2023-06-02 | 江苏农林职业技术学院 | 一种快速检测沙门氏菌的等温扩增引物对及其试剂盒和应用 |
-
2022
- 2022-03-11 CN CN202210235429.3A patent/CN114717341B/zh active Active
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2017067942A1 (en) * | 2015-10-19 | 2017-04-27 | Institut Pasteur | Detection of microbial pathogens related to bacterial infections through amplification especially by rt-lamp |
| CN106636437A (zh) * | 2017-02-14 | 2017-05-10 | 江西省疾病预防控制中心 | 一种基于mpn与pcr的食品中沙门氏菌快速定量方法 |
| CN108034692A (zh) * | 2018-01-23 | 2018-05-15 | 丽水市食品药品与质量技术检验检测院 | 用于鉴别沙门氏菌和单增李斯特菌的检测分析方法 |
| KR20210143580A (ko) * | 2020-05-20 | 2021-11-29 | 경희대학교 산학협력단 | 살모넬라 검출용 멀티플렉스 프라이머 및 이의 용도 |
| CN116200510A (zh) * | 2022-10-24 | 2023-06-02 | 江苏农林职业技术学院 | 一种快速检测沙门氏菌的等温扩增引物对及其试剂盒和应用 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| Establishment and validation of a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay targeting the ttrRSBCA locus for rapid detection of Salmonella spp. in food;Kreitlow 等;Food Control;第126卷;第1小节、第2.2-2.6小节和补充数据 * |
| Kreitlow 等.Establishment and validation of a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay targeting the ttrRSBCA locus for rapid detection of Salmonella spp. in food.Food Control.2021,第126卷第1小节、第2.2-2.6小节和补充数据. * |
| 基于ttr 基因的mini-MPN-qLAMP 法快速定量检测食 品中沙门氏菌;章小洪 等;现代食品科技;第39卷(第1期);344-351 * |
| 食品沙门氏菌环介导等温扩增技术应用研究进展;章小洪 等;食品安全质量检测学报;第12卷(第24期);9408-9414 * |
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