CN106636437A

CN106636437A - 一种基于mpn与pcr的食品中沙门氏菌快速定量方法

Info

Publication number: CN106636437A
Application number: CN201710077676.4A
Authority: CN
Inventors: 刘道峰; 刘成伟; 游兴勇; 周厚德; 刘洋
Original assignee: Jiangxi Provincial Center For Disease Control And Prevention
Current assignee: Jiangxi Provincial Center For Disease Control And Prevention
Priority date: 2017-02-14
Filing date: 2017-02-14
Publication date: 2017-05-10

Abstract

本发明公开了一种新型快速的食品及食品相关样本中沙门氏菌的定量方法。基于MPN及PCR的技术原理，首先对食品样本进行梯度稀释，每稀释度取多管稀释液非选择性增菌后，提取增菌样本的总细菌DNA后以特异性沙门氏菌属引物扩增，根据不同稀释度下扩增阳性管数目估算原始样本中沙门氏菌的污染量。整个检测过程可以在两个工作日内完成，相比传统基于平板分离及生化确证的MPN法可有效缩短检测流程、节省工作量。方法简便易操作，结果准确，特别适用于食品安全风险评估等工作中对鲜活生冷等食品样本中沙门氏菌污染剂量或带菌水平的快速估计。

Description

一种基于MPN与PCR的食品中沙门氏菌快速定量方法

技术领域

本发明属于检测领域，涉及沙门氏菌的检测方法。

背景技术

沙门氏菌分布广泛，学界共识认为该菌是食品中污染程度最高的一类菌，在世界各地的细菌性食物中毒病例统计中，由沙门氏菌引起的案例数常占首位或次位。迄今为止，世界范围内已经报道的沙门氏菌血清型大于2600种。沙门氏菌导致的伤寒、副伤寒、发热等是发展中国家最为常见的疾病，在环境卫生条件较差的地区甚至会导致死亡。有报道显示，每年全球有大约9400万例肠胃炎以及15.5万例死亡病例均是由沙门氏菌导致，其中有85%是食物引起的。

在中国，沙门氏菌对食品安全的污染同样严重，作为首要的食源性致病因素，沙门氏菌导致了近70%~80%的食源性疾病。Yang等结果显示，在全国范围内抽检的539份即食食品中，有19份检出了沙门氏菌，总检出率达3.52%，大部分阳性样本污染程度为0.3~10 MPN/g，部分样本甚至污染水平高达110 MPN/g。申请人项目组为了解本省（江西省）食品中食源性沙门氏菌污染情况，抽检本省13类3437份食品，并对分离的沙门菌进行血清型鉴定试验。结果显示，所检3437份食品中检出受沙门菌污染样本155份，沙门菌检出率达4.51%，其中生禽肉、生畜肉中的沙门菌检出率分别高达27.4%、13.7%，意味着，在我省平均每4份生禽肉样本就有1份污染了沙门氏菌。综上所述，沙门氏菌在全国乃至世界范围内对食品安全构成了严重威胁，而我省的污染情况尤为严重。

常规的检测沙门氏菌的方法为培养法，该方法涉及到前增菌、选择性增菌培养、生化鉴定以及血清分型等后续鉴定步骤。此法虽是目前微生物鉴定和仲裁结果判定的标准方法，但通常需要花费数天的检测时间，需要特殊的操作环境及繁琐的步骤，且方法为定性方法，无法实现定量检测，无法满足食品安全风险评估等工作对食品样本中沙门氏菌定量检测的需要。

另外，也有研究者采用免疫学或者荧光定量的分子生物学手段实现了沙门氏菌的定量检测，但方法定量均依赖于预设的标准曲线，一旦检测环境、试剂、操作步骤、检测样本等出现改变就会导致定量结果出现偏差。

发明内容

本发明的目的在于提供一种食品及相关样本中的沙门氏菌携带量（污染量）的评估方法。

本发明所提供的方法基于MPN（Most Probable Number，最大或然数）及PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应）的技术原理。所述方法不依赖于预设标准曲线，在实现沙门氏菌的定量的前提下又兼具PCR方法的快速、准确的优点。

整个检测过程可以在两个工作日内完成，相比传统基于培养的方法可有效缩短检测流程、节省工作量；相比其他沙门氏菌定量方法，本法无需建立标准曲线，规避了不同样本及检测环境的差异的影响。方法简便易操作，结果准确，特别适用于食品安全风险评估等工作中对鲜活生冷等食品样本中沙门氏菌污染剂量或带菌水平的快速估计。过程见图1。

技术方案具体如下：

一种基于MPN与PCR的食品中沙门氏菌快速定量方法，包括以下步骤：（1）食品样本的梯度稀释；（2）菌的复苏及增菌培养；（3）DNA的提取；（4）沙门氏菌属特异性引物PCR扩增及PCR结果检测；（5）MPN法估计原样本中沙门氏菌浓度；

食品样本的梯度稀释过程包括：称取25g或25mL食品样本加入225mL无菌BPW中，拍击式均质25s或其他方式充分震摇混合，使食品样本表面或内部可能存在的沙门氏菌散布于BPW中，静置数秒所得上清液作为1:10样本稀释液。吸取1:10稀释液1 mL，注入含有9 mL BPW的试管内，振摇试管混匀，制备1:100的稀释液。另取1 mL灭菌吸管，按上条操作依次制备10倍递增稀释液，每递增稀释一次，换用1支1 mL灭菌吸管；

菌的复苏及增菌培养过程包括：根据对检样污染情况的估计，选择三个连续的适宜稀释度，每个稀释度接种3支含有9mL BPW的试管，每管接种1 mL。置36 ℃±1 ℃恒温箱内，培养8 h～18 h；

DNA的提取过程包括但不限于：分别取上述增菌液1 mL，8000 r/min离心，弃去上清液以去除有机酸等细菌代谢产物对PCR的不利影响，无菌水重悬后采用玻璃珠法、磁珠法、微柱法或有机溶剂萃取法提取并纯化细菌DNA；

沙门氏菌属特异性引物PCR扩增及PCR结果检测步骤包括但不限于：将前述步骤得到的DNA样本作为模板，以沙门氏菌属特异性引物进行PCR扩增，扩增可直接采用或荧光定量PCR法或PCR-电泳法或在扩增体系中加入不影响扩增的DNA染料，扩增后直接于激发光下观察荧光强度以确证每份扩增中是否有PCR扩增产物的存在；

MPN法估计原样本中沙门氏菌浓度步骤包括：根据PCR为沙门氏菌阳性的试管管数，查MPN检索表（附表1）或通过MPN软件，报告每g（mL）食品样品中沙门氏菌的MPN值。

有益效果

本发明相比现有技术具有如下优点：

1、本发明所述方法省时省力，有效缩短了检测流程及检测人员工作量。

2、本发明所述方法结合了MPN法及PCR法，实现了食品及相关样本中沙门氏菌的定量化，且定量不依赖于标准曲线，结果受检测条件等影响小，准确可靠。

3、采用非选择性、低营养含量的培养基进行增菌，既有效防止样本中携带的微量死菌DNA引起的假阳性现象，也能有效复苏“活的不可培养”状态的沙门氏菌，避免导致假阴性结果带来的定量不准。

附图说明

图1是检测流程图

图2是本方法在不同牛奶样本中加标回收实验结果图。

具体实施方式

实施例1

1、样本预处理（生肉样本为例）

用无菌剪刀与无菌镊子剪取生肉样本有代表性部位样品25 g置于盛有225 mL BPW（缓冲蛋白胨水）的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1 min～2 min，制成样本1:10稀释液。如样本为冷冻产品，应在45 ℃以下不超过15 min，或2 ℃～5 ℃不超过18 h解冻。

用灭菌吸管吸取1:10稀释液1 mL，注入含有9 mLBPW的试管内，振摇试管混匀，制备1:100的稀释液。

另取1 mL灭菌吸管，按上条操作依次制备10倍递增稀释液，每递增稀释一次，换用1支1 mL灭菌吸管。

根据对检样污染情况的估计，选择三个连续的适宜稀释度，每个稀释度接种3支含有9mL BPW的试管，每管接种1 mL。置36 ℃±1 ℃恒温箱内，培养8 h～18 h。

、增菌液核酸提取

取培养后增菌液1 mL，8000 r/min离心，弃去上清液以去除有机酸等细菌代谢产物对PCR的不利影响，无菌水重悬至10⁸~10⁹ CFU/mL(约0.5~1 OD)。

取1 mL菌悬液，加入玻璃珠少许，充分旋转混合震摇1 min，于沸水浴中加热10min。13000 r/min，离心10 min。

将上清液小心地移至新的洁净1.5ml离心管，作为后续PCR反应模板。如有必要，可进一步用微柱、磁珠等商业化产品进行纯化，以去除PCR反应抑制物。该模板可以4 ℃存放过夜，若长久保存需-20 ℃冻存。

、PCR荧光定量扩增

对步骤2中提取到的核酸进行PCR荧光定量检测。为确保检测方法的特异性，避免假阳性结果的出现，选择属间特异性高、属内敏感度好的基因序列扩增是十分有必要的。本发明根据沙门氏菌的invA基因实施检测，采用的引物序列为：F:CGCCCTGTCTACTTATACATGCT; R:GGTCAAAATAGCCGTAACAACCAATAC。扩增片段长度为190 bp。

荧光定量PCR的反应体系如下(25 μL)：

SYBR Premix Ex Taq (2×) 12.5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL，ROXReference Dye Ⅱ(50×) 0.5 μL，DNA模板5.0 μL，dd水6.0 μL

扩增条件如下：

（1）预变性：95℃，30 s;

（2）变性: 95℃，10 s；

（3）退火、延伸：60℃，40 s；

（4）（2）~（3）步骤扩增40个循环，在每个循环的60℃延伸后收集荧光信号。

（5）完成最后一个循环后，采用热熔解曲线法检验扩增为特异性的。

本扩增体系中，将Ct值小于等于35的扩增算作阳性结果。

、 MPN法估计样本中沙门氏菌含量

根据步骤3中，荧光定量PCR的检测结果。统计每个稀释度中阴性结果和阳性结果个数，查MNP表来计算得到沙门氏菌的个数，MNP表见附表1。跟据相应稀释度换算后查表所得数值即为每克（毫升）原样本中沙门氏菌含量。

附表1 最可能数（MPN）检索表

每g（mL）检样中沙门氏菌最大可能数（MPN）检索表

、加标回收实验

申请者采用传统国标法筛选出10份不含沙门氏菌，但含有其他高背景微生物的生牛乳样本。

在上述10份生牛乳中分别添加平板计数后的纯培养沙门氏菌至浓度为每毫升（生牛乳）：6.0×10⁰、6.0×10¹、6.0×10²、6.0×10³、6.0×10⁴、6.0×10⁵。

按照本发明所述方法分别对这10份生牛乳沙门氏菌含量进行测定，得到每毫升生牛乳中沙门氏菌的含量。将测得的沙门氏菌含量结果（计算每个加标浓度下的平均值及各样本间标准差）以原始添加浓度为因变量作图，见附图2。

从附图2可以看出，通过本发明建立的方法和标准添加的沙门氏菌量有极高的相关性，R ²=0.9918，相同加标浓度下不同牛奶样本检测结果偏差也较小。说明本方法在不同样本及不同的沙门氏菌菌含量时均具备较高的准确度。

Claims

1.一种基于MPN与PCR的食品中沙门氏菌快速定量方法，其特征在于步骤：（1）食品样本的梯度稀释；（2）菌的复苏及增菌培养；（3）DNA的提取；（4）沙门氏菌属特异性引物PCR扩增及PCR结果检测；（5）MPN法估计原样本中沙门氏菌浓度；

食品样本的梯度稀释过程：称取25g或25mL食品样本加入225mL无菌BPW中，拍击式均质25s或其他方式充分震摇混合，使食品样本表面或内部可能存在的沙门氏菌散布于BPW中，静置数秒所得上清液作为1:10样本稀释液；吸取1:10稀释液1 mL，注入含有9 mL BPW的试管内，振摇试管混匀，制备1:100的稀释液；另取1 mL灭菌吸管，按上条操作依次制备10倍递增稀释液，每递增稀释一次，换用1支1 mL灭菌吸管；

菌的复苏及增菌培养过程：根据对检样污染情况的估计，选择三个连续的适宜稀释度，每个稀释度接种3支含有9mL BPW的试管，每管接种1 mL；置36 ℃±1 ℃恒温箱内，培养8 h～18 h；

DNA的提取过程：分别取上述增菌液1 mL，8000 r/min离心，弃去上清液以去除有机酸等细菌代谢产物对PCR的不利影响，无菌水重悬后采用玻璃珠法、磁珠法、微柱法或有机溶剂萃取法提取并纯化细菌DNA；

沙门氏菌属特异性引物PCR扩增及PCR结果检测步骤：将前述步骤得到的DNA样本作为模板，以沙门氏菌属特异性引物进行PCR扩增，扩增可直接采用或荧光定量PCR法或PCR-电泳法或在扩增体系中加入不影响扩增的DNA染料，扩增后直接于激发光下观察荧光强度以确证每份扩增中是否有PCR扩增产物的存在；

MPN法估计原样本中沙门氏菌浓度步骤：根据PCR为沙门氏菌阳性的试管管数，查MPN检索表（附表1）或通过MPN软件，报告每g（mL）食品样品中沙门氏菌的MPN值。