WO2004053462A2 - Procede de detection de microorganismes a l'aide d'un dispositif de filtration par flux tangentiel - Google Patents

Procede de detection de microorganismes a l'aide d'un dispositif de filtration par flux tangentiel Download PDF

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WO2004053462A2
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Bénédicte POURIMA
Stéphane Legastelois
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Electricite De France (Edf)
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    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/01—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials specially adapted for biological cells, e.g. blood cells
    • G01N2015/019—Biological contaminants; Fouling

Definitions

  • the present invention relates to the field of biological and environmental analysis. More specifically, the present invention relates to a method for detecting organisms and especially target microorganisms. This process is particularly applicable to pathogenic microorganisms contained in complex media, in low concentration.
  • complex media is intended to mean media containing suspended organic, organic and mineral materials, and in particular target microorganisms.
  • microorganisms can be present in very small quantities in complex environments such as river water, sewage, sludge, liquid food processing environments, etc.
  • centrifuged or flocculated microorganisms are found in the presence of contaminants which will inhibit subsequent analysis methods such as the Polymerization Chain Reaction. These contaminants can also distort these analyzes.
  • the laboratories are therefore awaiting a detection process and microorganisms, in particular pathogenic microorganisms, which is suitable for large samples, which make it possible to recover the entire population of microorganisms contained in the samples and to eliminate largely the contaminants in the samples.
  • a first objective of the present invention is to overcome the drawbacks mentioned above by proposing a method for detecting microorganisms suitable for the analysis of samples of large volume, coming from complex media.
  • Another object of the present invention is to provide a method for detecting microorganisms which preserves the integrity of the latter.
  • Another objective of the present invention is to propose a method for detecting microorganisms which can easily be coupled with the various existing detection and identification techniques.
  • the Applicant has had the merit of surprisingly and unexpectedly highlighting that the Cytomate® device marketed by the company Baxter and initially intended for the hematological field, in particular for washing blood cells, could be used to concentrate microorganisms of interest contained in a large volume sample from complex media.
  • the present invention therefore relates to a method for detecting microorganisms present in a liquid sample, characterized in that it mainly comprises the following steps: - concentrating said microorganisms by means of a tangential flow filtration device;
  • this method comprises a prior step of enlarging said microorganisms.
  • This magnification step comprises the following sub-steps: introducing into the sample particles larger than that of the target microorganisms; > form a microorganism - particle complex by reversible adsorption of said microorganisms on said particles.
  • the method according to the invention comprises an additional step consisting in isolating the microorganisms from said particles prior to the step of revealing the microorganisms.
  • the step consisting in isolating the microorganisms from said particles comprises the following substeps:
  • the tangential flow filtration device is a device for washing and concentrating blood cells.
  • This washing device for concentrating blood cells is the CytoMate® device, sold by the company Baxter.
  • the Cytomate® device was presented to the public at the seventh annual ISHAGE (International Society for Hematotherapy and Graft Engineering) symposium, which was held in Quebec in June 2001.
  • the particles are particles consisting of a material taken from the group comprising: silica, maghemite, magnetite, polymers such as polystyrene, polymethylmefhacrylate, polyester and / or mixtures thereof, or any compound equivalent.
  • the method comprises an additional step of selection of purified microorganisms.
  • This step occurs before identification.
  • This selection is made by affinity reaction.
  • Such a reaction is preferably carried out by means of magnetic particles directed specifically against the target microorganisms.
  • Such particles advantageously carry on their surface antibodies directed specifically against the target microorganisms. It can then be easy to recover the target microorganisms fixed on the particles by retaining said particles by means of a suitable device such as a magnet.
  • a suitable device such as a magnet.
  • One such technique is, for example, IMS (Immuno-Magnetic Separation).
  • the identification step consists of _: _ - marking the purified and optionally selected microorganisms; - reveal the said microorganisms, thus marked.
  • the labeling step can advantageously be carried out in the device for washing and concentrating blood cells. Indeed, once purified, the microorganisms can be incubated with the excess marker in an appropriate suspension. Once the incubation period has ended, the microorganism-marker complexes are separated from the excess marker by passing said suspension through the tangential flow filtration device. The marker is then removed and the labeled microorganisms are recovered and ready to be revealed by the appropriate technique.
  • the markers used can be, by way of example, antibodies coupled to a fluorochrome or an enzyme, fluorescent microparticles, substrates of specific enzyme (s) of the target microorganism.
  • s specific enzyme
  • any other marker known to those skilled in the art can advantageously be used.
  • Methods for identifying microorganisms can be taken from the group comprising: culture, Polymerization Chain Reaction, cytometry, immunoassay techniques, biochips or any equivalent technique.
  • the invention relates, in another object, to a method for detecting microorganisms the size of which is greater than 2.5 ⁇ m, in a liquid sample which comprises:
  • a concentration step comprising the following sub-steps: a) washing and concentration of the sample from the “source” bag and storage in the “washing” bag; b) rinsing of the “source” pocket and transfer of the rinsing volume to the “washing” pocket; c) transfer of the concentrated sample from the “washing” pocket to the “final collection” pocket; d) transfer of the buffer from the “buffer” pocket to the “washing” pocket and manual stirring of the latter; e) introduction of air into the “washing” bag and manual stirring of the latter in order to rinse the tubing; f) transfer of the remainder from the "washing” pocket to the "final collection”pocket; g) transfer of the buffer from the “buffer” pocket to .
  • Microorganisms which can advantageously be detected by this method are, for example, amoebas, Cryptosporidium or any microorganism of equivalent or greater size.
  • Another object of the invention is a process for the concentration of microorganisms smaller than 1.5 ⁇ m in a liquid sample, characterized in that it comprises:
  • a step of enlarging microorganisms comprising the following sub-steps: a) introducing into the sample particles of size larger than that of the target microorganisms; b) forming a microorganism-particle complex by reversible interaction of said microorganisms on said particles.
  • a step of concentrating the microorganism-particle complexes comprising the following sub-steps: c) washing and concentration of the sample from the “source” bag and storage in the “washing” bag; d) rinsing of the “source” pocket and transfer of the rinsing volume to the “washing” pocket; e) transfer of the concentrated sample from the “washing” pocket to the “final collection” pocket; f) transfer of the tampon from the “tampon” pocket to the “washing” pocket; g) introduction of air into the “washing” bag and manual stirring of the latter; h) transfer of the remainder from the "washing” pocket to the "final collection” pocket; i) transfer of the tampon from the “tampon” pocket to the “washing” pocket; j) transfer of the buffer from the "washing” pocket to the "final collection” pocket. k) manual washing of the "washing” pocket by transferring the buffer from the "tampon” pocket to the "washing” pocket
  • the prior step of enlarging the microorganisms in one of the variants of the invention is particularly advantageous when the size of the target microorganisms is less than the cut-off threshold of the tangential filtration system.
  • the Applicant has developed this protocol for concentrating pathogenic microorganisms whose size is less than the cut-off threshold of the tangential filtration system.
  • These microorganisms are artificially and reversibly enlarged to prevent them from passing through the filter during the concentration process. This magnification is done by fixing the target microorganism on particles as described above, which have a diameter greater than the cutoff threshold of the tangential filtration system.
  • Microorganisms can therefore be easily concentrated in the device
  • CytoMate® the complexes are retained on the filter of the tangential flow filtration system, while the contaminants pass through the filter and are collected in a waste container. The microorganism - particle complexes thus concentrated can then be easily recovered in order to be identified extemporaneously.
  • the particles used for the enlargement of the microorganisms can also be specific particles of the target microorganisms, so that the microorganism-particle complex can be the subject of a subsequent identification step.
  • the invention also relates to a method for detecting microorganisms of size less than 1.5 ⁇ m, in a liquid sample, characterized in that it comprises:
  • a step of enlarging microorganisms comprising the following sub-steps: a) introducing into the sample particles of size larger than that of the target microorganisms; b) forming a microorganism-particle complex by reversible interaction of said microorganisms on said particles.
  • a step of concentrating the microorganism-particle complexes comprising the following sub-steps: c) washing and concentration of the sample from the “source” bag and storage in the “washing” bag; d) rinsing of the “source” pocket and transfer of the rinsing volume to the “washing” pocket;
  • a step consisting in isolating the microorganisms from said particles comprising the following substeps: e) transfer of buffer (of elution) into the bag of. "washing” f) circulation of the liquid for 30 minutes (incubation in the elution buffer) g) washing and concentration of the mixture in the "washing" bag using the elution buffer; h) recovery of microorganisms in the “waste” pocket and of particles in the “final collection” pocket; and - a step of identifying the microorganisms thus recovered.
  • the population of purified microorganisms can be very easily recovered, in an original way, by carrying out a new concentration step using CytoMate®.
  • the particles concentrate on the filter while microorganisms smaller than the filter threshold, pass through it and follow the same path as the contaminants during the first concentration step. They are then collected in a blank container, which has taken the place of the waste container from the first stage of concentration.
  • the suspension of purified microorganisms can be used as it is for detection and possibly their quantification, using one of the techniques described above.
  • Such a process is particularly suitable for microorganisms taken from the group comprising Legionella, Pseudomonas, Salmonella, Staphylococcus, Escherichia coli, Enterovirus.
  • Another object of the invention relates to the use of a device for washing and concentrating blood cells for the detection of microorganisms in a liquid sample.
  • a final object of the invention relates to the use of a device for washing and concentrating blood cells for the detection of microorganisms in a liquid sample.
  • Such a device is advantageously the CytoMate® device, sold by the company Baxter.
  • This device includes a tangential filtration system, with a cutoff threshold of 4 ⁇ m. It therefore makes it possible to retain microorganisms having a size greater than 4 ⁇ m.
  • Example 1 Tests on CytoMate® concentrator.
  • the first series of tests aims to assess the effectiveness of the program and the concentration protocol.
  • Civaux is sent to DRD Chatou.
  • the samples were analyzed by the "Most Probable Number” (NPP) method which is a statistical method by counting on a Petri dish.
  • the starting sample is placed in pocket n ° 4 (source pocket) of CytoMate®.
  • the liquid circulates in the tangential filtration system which eliminates particles smaller than 4 ⁇ m. As the concentration is achieved, the volume of the washing bag decreases to reach the fixed minimum volume (approximately 50 ml).
  • the washing bag is rinsed with 100 ml of buffer, this fraction will be recovered and analyzed.
  • the washing bag is again rinsed with 100 ml of buffer. This fraction is this time collected manually, after having cut the lower capillary of the pocket. This makes it possible to recover the large particles which have settled at the bottom of the pocket and which could not be recovered by the device.
  • the concentration program used includes a phase of evacuation of the concentrate by pushing air allowing a more efficient recovery.
  • the fraction eliminated in the trash was not analyzed because the previous tests showed very little or no loss.
  • kit bags, tubing, filter, pumping device washing pause for cells in the "source” bag (programmed final volume of
  • the fractions recovered and cultured are: the concentrate the "rinsing" fraction the "pocket” fraction
  • the analysis of the results is based on the comparison of the intervals defined by the lower (L.inf) and upper (L.sup) limits of the data.
  • the number of total Naegleria (Nt) of the control is included in the range [L.inf- L.sup] of the concentrates.
  • the number of control Nt is therefore equivalent to that of the concentrates (1, 2 and 3).
  • the NPP value of concentrates 2 and 3 is included in the range [L.inf-L.sup] of the control.
  • the sample used during the second series of repetitions was particularly loaded with MES, the volume treated is 0.75L instead of IL.
  • the MPN value for the control of series 1 is included in the range [L.inf-L.sup] of the concentrates.
  • the number of total Naegleria in the control is equivalent to that of the concentrates.
  • the number of amoebae in the test 2 concentrate is comparable to that of the control. In series 2, only test 2 gives results similar to the control. In series 3, two out of three tests give repeatable results. The number of amoebae in the concentrates is equivalent to that of the control. The repeatability is less striking when comparing the results in Naegleria fowleri. -Discussion.
  • the average concentration factor is 13.
  • the system efficiently concentrates the sample while respecting viability.
  • the number of amoebae present in the concentrate is equivalent to the number 10 of amoebae present in the control sample.
  • amoebae The majority of amoebae are in the concentrate. The number of residual amoebae is low in the "rinsing" fraction and tiny or even zero in the "pocket” fraction.
  • the Naegleria fowleri number results show greater variations than the total Naegleria results.
  • the number of Nf present in the concentrates is equivalent to that of the controls.
  • the sample thus diluted twice is concentrated by CytoMate® using the _35_ same program as before.
  • the volume treated is IL.
  • the control sample is diluted 1/10 and 1/100.
  • the number of amoebae in the concentrates follows the dilution factor applied to the initial sample.
  • the system therefore makes it possible to concentrate and recover a very small number of amoebae (10 / Liter).
  • the number of amoebas present in the concentrates varies in proportion to the dilution factor. In addition, the values are comparable to those of the corresponding control.
  • the apparatus makes it possible to concentrate samples containing a very small number of cells, of the order of 10 amoebas / L.
  • the system is able to concentrate without saturating IL of reconstituted sample containing high concentrations of MES (100, 150, 200 mg / L).
  • the CytoMate® concentrates the reconstituted samples without problem, the limit volume of treatment is not reached in any experiment.
  • Saturation is dependent on the diameter of the MES and not on the concentration.
  • CytoMate® allows you to concentrate, without loss, a living natural sample while respecting the viability of the amoeba.
  • a sample of a volume of IL is reduced to 70 ml, that is to say a concentration factor of 14.
  • This pre-concentration method can be envisaged downstream of different analysis techniques such as:
  • the CytoMate® pre-concentration method coupled with the NPP counting method would reduce the current detection limit from 200 amoebae / L to 15 amoebae / L.

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Abstract

La présente invention concerne un procédé de détection de microorganismes présents dans un échantillon liquide, caractérisé en ce qu'il comprend principalement les étapes suivantes : - concentrer lesdits microorganismes au moyen d'un dispositif de filtration par flux tangentiel; - récupérer lesdits microorganismes ainsi concentrés; et- identifier lesdits microorganismes.Le dispositif de filtration par flux tangentiel utilisé est avantageusement un dispositif de lavage et de concentration de cellules sanguines.

Description

PROCEDE DE DETECTION DE MICROORGANISMES A L'AIDE D'UN DISPOSITIF DE FILTRATION PAR FLUX TANGENTIEL
La présente invention concerne le domaine de l'analyse biologique et environnementale. Plus précisément, la présente invention se rapporte à un procédé de détection d'organismes et spécialement de microorganismes cibles. Ce procédé est particulièrement applicable aux microorganismes pathogènes contenus dans les milieux complexes, en faible concentration.
Par milieux complexes, on entend les milieux contenant des matières biologiques, organiques et minérales en suspension, et notamment les microorganismes cibles.
La réglementation concernant la présence de microorganismes pathogènes dans le domaine environnemental et dans le domaine agroalimentaire est de plus en plus stricte. En effet, la détection de tout microorganisme susceptible d'être nuisible pour l'homme doit être réalisée dans un délai de plus en plus court et avec une sensibilité de plus en plus importante.
Ces microorganismes peuvent être présents en très faible quantité dans des milieux complexes tels que les eaux de rivières, les eaux d'égouts, les boues, les milieux liquides agroalimentaires, etc...
Pour pouvoir les mettre en évidence, il est donc nécessaire de réaliser des prélèvements suffisamment conséquents afin de s'assurer de récupérer une quantité minimale de microorganismes. Il faut ensuite les concentrer, les isoler et les identifier. Plusieurs méthodes de concentration existent, parmi lesquelles on peut citer la centrifugation, la floculation et la filtration sur membrane ou dans des systèmes de capsules filtrantes, comme par exemple le dispositif Envirochec ® pour Cryptosporidium.
Ces méthodes, bien que référencées, présentent plusieurs inconvénients majeurs. Elles sont peu adaptées pour traiter des échantillons de grand volume.
Elles sont traumatisantes pour les microorganismes à concentrer. Ainsi, à l'issue de ces traitements, plus de 50% des microorganismes disparaissent ou sont détruits.
Elles sont également peu sélectives : les microorganismes centrifugés ou floculés se retrouvent en présence de contaminants qui inhiberont les méthodes d'analyses ultérieures telles que la Réaction de Polymérisation en Chaîne. Ces contaminants peuvent également fausser ces analyses. Les laboratoires sont donc dans l'attente d'un procédé de détection et de microorganismes, en particulier des microorganismes pathogènes, qui soit adapté aux échantillons de grand volume, qui permettent de récupérer la population entière de microorganismes contenus dans les échantillons et d'éliminer en grande partie les contaminants contenus dans les échantillons.
Un premier objectif de la présente invention est de pallier les inconvénients cités supra en proposant un procédé de détection de microorganismes adapté à l'analyse d'échantillons de grand volume, issus de milieux complexes. Un autre objectif de la présente invention est de proposer un procédé de détection de microorganismes qui préserve l'intégrité de ces derniers.
Un autre objectif de la présente invention est de proposer un procédé de détection de microorganismes qui puisse facilement être couplé avec les différentes techniques de détection et d'identification existantes.
Pour atteindre ces objectifs, la demanderesse a eu le mérite de mettre en évidence de façon surprenante et inattendue que le dispositif Cytomate® commercialisé par la société Baxter et initialement destiné au domaine hématologique, en particulier au lavage des cellules sanguines, pouvait être utilisé pour concentrer des microorganismes d'intérêt contenus dans un échantillon de grand volume issu de milieux complexes.
La présente invention concerne donc un procédé de détection de microorganismes présents dans un échantillon liquide, caractérisé en ce qu'il comprend principalement les étapes suivantes : - concentrer lesdits microorganismes au moyen d'un dispositif de filtration par flux tangentiel ;
- récupérer lesdits microorganismes ainsi concentrés ; et
- identifier lesdits microorganismes.
Selon une première variante avantageuse de l'invention, ce procédé comporte une étape préalable de grossissement desdits microorganismes.
Cette étape de grossissement comprend les sous-étapes suivantes : introduire dans l'échantillon des particules de taille supérieure à celle des microorgamsmes cibles ; > former un complexe microorganisme - particule jpar adsorption réversible desdits microorganismes sur lesdites particules. Selon une seconde variante avantageuse, le procédé selon l'invention comporte une étape supplémentaire consistant à isoler les microorganismes desdites particules préalablement à l'étape de révélation des microorganismes.
De façon remarquable, l'étape consistant à isoler les microorganismes desdites particules comprend les sous-étapes suivantes :
> mettre les complexes microorganisme - particule en suspension dans une solution appropriée ;
> désolidariser les microorganismes desdites particules par tout moyen approprié, en particulier chimique ; séparer les microorganismes des particules par passage de ladite suspension dans le dispositif de filtration par flux tangentiel et concentration desdites particules ; et
> récupérer lesdits microorganismes.
Avantageusement, le dispositif de filtration par flux tangentiel est un dispositif de lavage et de concentration de cellules sanguines.
Ce dispositif de lavage est de concentration de cellules sanguines est le dispositif CytoMate®, commercialisé par la société Baxter. Le dispositif Cytomate® a été présenté au public lors du septième symposium annuel ISHAGE (International Society for Hematotherapy and Graft Engineering), qui s'est tenu à Québec en juin 2001.
De façon avantageuse, les particules sont des particules constituées d'un matériau pris dans le groupe comprenant : la silice, la maghémite, la magnétite, les polymères tels que le polystyrène, le polyméthylméfhacrylate, le polyester et/ou leurs mélanges, ou tout composé équivalent.
Selon une variante avantageuse de l'invention, le procédé comporte une étape supplémentaire de sélection de microorganismes purifiés. Cette étape intervient avant l'identification. Cette sélection se fait par réaction par affinité. Une telle réaction est préférentiellement effectuée au moyen de particules magnétiques dirigées spécifiquement contre les microorganismes cibles. De telles particules portent avantageusement à leur surface des anticorps dirigés spécifiquement contre les microorganismes cibles. Il peut être alors aisé de récupérer les microorganismes cibles, fixés sur les particules en retenant lesdites particules au moyen d'un dispositif approprié tel qu'un aimant. Une telle technique est par exemple l'IMS (Immuno-Magnetic Séparation).
Selon un mode de réalisation particulier, l'étape d'identification consiste à_:_ - marquer les microorganismes purifiés et éventuellement sélectionnés ; - révéler lesdits microorganismes, ainsi marqués.
L'étape de marquage peut être avantageusement réalisée dans le dispositif de lavage et de concentration de cellules sanguines. En effet, une fois purifiés, les microorganismes peuvent être incubés avec le marqueur en excès dans une suspension appropriée. Une fois la période d'incubation achevée, les complexes microorganisme - marqueur sont séparés du marqueur en excès par passage de ladite suspension dans le dispositif de filtration par flux tangentiel. Le marqueur est alors éliminé et les microorganismes marqués sont récupérés et prêts à être révélés par la technique appropriée.
Les marqueurs utilisés peuvent être à titre exemplatif, des anticorps couplés à un fluorochrome ou une enzyme, des microparticules fluorescentes, des substrats d'enzyme(s) spécifique(s) du microorganisme cible. Toutefois, tout autre marqueur connu de l'homme du métier peut avantageusement être utilisé.
Des méthodes d'identification des microorganismes peuvent être prises dans le groupe comprenant : la mise en culture, la Réaction de Polymérisation en Chaîne, la cytométrie, les techniques d'immuno-essai, les biopuces ou tout technique équivalente.
L'invention concerne dans un autre objet, un procédé de détection de microorganismes dont la taille est supérieure à 2,5 μm, dans un échantillon liquide qui comprend :
- une étape de concentration comprenant les sous-étapes suivantes : a) lavage et concentration de l'échantillon de la poche « source » et stockage dans la poche « lavage » ; b) rinçage de la poche « source » et transfert du volume de rinçage dans la poche « lavage » ; c) transfert de l'échantillon concentré de la poche « lavage » vers la poche « collecte finale » ; d) transfert du tampon de la poche « tampon » vers la poche « lavage » et agitation manuelle de cette dernière ; e) introduction d'air dans la poche « lavage » et agitation manuelle de cette dernière afin de rincer la tubulure ; f) transfert du reliquat de la poche « lavage » vers la poche « collecte finale » ; g) transfert du tampon de la poche « tampon » vers.la poche « lavage » ; h) transfert du tampon de la poche « lavage » vers la poche « collecte finale ». i) lavage manuel de la poche « lavage » par transfert de tampon de la poche « tampon » vers la poche « lavage » ; j) récupération des microorganismes dans la poche « collecte finale » ; et
- une étape d'identification des microorgamsmes ainsi concentrés.
Des microorganismes pouvant être avantageusement détectés par ce procédé, sont par exemple, les amibes, les Cryptosporidium ou tout microorganisme de taille équivalente ou supérieure.
Un autre objet de l'invention est un procédé de concentration de microorganismes de taille inférieure à 1,5 μm, dans un échantillon liquide, caractérisé en ce qu'il comprend :
- une étape de grossissement de microorganismes comprenant les sous-étapes suivantes : a) introduire dans l'échantillon des particules de taille supérieure à celle des microorganismes cibles ; b) former un complexe microorganisme - particule par interaction réversible desdits microorganismes sur lesdites particules. - une étape de concentration des complexes microorganisme - particule comprenant les sous-étapes suivantes : c) lavage et concentration de l'échantillon de la poche « source » et stockage dans la poche « lavage » ; d) rinçage de la poche « source » et transfert du volume de rinçage dans la poche « lavage » ; e) transfert de l'échantillon concentré de la poche « lavage » vers la poche « collecte finale » ; f) transfert du tampon de la poche « tampon » vers la poche « lavage » ; g) introduction d'air dans la poche « lavage » et agitation manuelle de cette dernière ; h) transfert du reliquat de la poche « lavage » vers la poche « collecte finale » ; i) transfert du tampon de la poche « tampon » vers la poche « lavage » ; j) transfert du tampon de la poche « lavage » vers la poche « collecte finale ». k) lavage manuel de la poche « lavage » par transfert de tampon de la poche « tampon » vers la poche « lavage » ;
1) récupération des complexes microorganisme - particule dans la poche « collecte finale ».
L'étape préalable de grossissement des microorganismes dans une des variantes de _ l'invention est particulièrement avantageuse quand la taille des microorganismes cibles est inférieure au seuil de coupure du système de filtration tangentielle. En effet, la demanderesse a mis au point ce protocole permettant de concentrer des microorganismes pathogènes dont la taille est inférieure au seuil de coupure du système de filtration tangentielle. Ces microorganismes sont grossis artificiellement et de façon réversible, afin de les empêcher de passer à travers le filtre lors du processus de concentration. Ce grossissement se fait par fixation du microorganisme cible sur des particules telles que décrites ci-dessus, qui présentent un diamètre supérieur au seuil de coupure du système de filtration tangentielle.
Les microorganismes peuvent donc être facilement concentrés dans le dispositif
CytoMate®. En effet, les complexes sont retenus sur le filtre du système de filtration par flux tangentiel, alors que les contaminants passent à travers le filtre et sont récupérés dans un conteneur à déchets. Les complexes microorganisme - particule ainsi concentrés peuvent alors être facilement récupérés afin d'être identifiés extemporanément.
Les particules utilisées pour le grossissement des microorganismes peuvent être également des particules spécifiques des microorganismes cibles, de telle sorte que le complexe microorganisme — particule peut faire l'objet d'une étape d'identification subséquente.
Selon un autre objet, l'invention concerne également, un procédé de détection de microorganismes de taille inférieure à 1,5 μm, dans un échantillon liquide, caractérisé en ce qu'il comprend :
- une étape de grossissement de microorganismes comprenant les sous-étapes suivantes : a) introduire dans l'échantillon des particules de taille supérieure à celle des microorganismes cibles ; b) former un complexe microorganisme - particule par interaction réversible desdits microorganismes sur lesdites particules.
- une étape de concentration des complexes microorganisme - particule comprenant les sous-étapes suivantes : c) lavage et concentration de l'échantillon de la poche « source » et stockage dans la poche « lavage » ; d) rinçage de la poche « source » et transfert du volume de rinçage dans la poche « lavage » ;
- une étape consistant à isoler les microorganismes desdites particules comprenant les sous-étapes suivantes : e) transfert de tampon (d'élution) dans la poche de. "lavage" f) circulation du liquide pendant 30 minutes (incubation dans le tampon d'élution) g) lavage et concentration du mélange dans la poche de "lavage" en utilisant le tampon d'élution ; h) récupération des microorganismes dans la poche « déchets » et des particules dans la poche « collecte finale » ; et - une étape d'identification des microorganismes ainsi récupérés.
Selon le procédé, la population de microorganismes purifiés peut être très facilement récupérée, de façon originale, en procédant à une nouvelle étape de concentration au moyen du CytoMate®. Les particules se concentrent sur le filtre alors que les microorganismes de taille inférieure au seuil du filtre, passent à travers celui-ci et suivent la même voie que les contaminants lors de la première étape de concentration. Ils sont alors récupérés dans un conteneur vierge, qui a pris la place du conteneur à déchets de la première étape de concentration.
La suspension de microorganismes purifiés peut être utilisée en l'état pour la détection et éventuellement leur quantification, via une des techniques décrites ci-dessus.
Un tel procédé est particulièrement adapté aux microorganismes pris dans le groupe comprenant les Legionella, Pseudomonas, Salmonella, Staphylococcus, Escherichia coli, Entérovirus.
Un autre objet de l'invention concerne l'utilisation d'un dispositif de lavage et de concentration de cellules sanguines pour la détection de microorganismes dans un échantillon liquide
Un dernier objet de l'invention concerne l'utilisation d'un dispositif de lavage et de concentration de cellules sanguines pour la détection de microorganismes dans un échantillon liquide.
Un tel dispositif est avantageusement le dispositif CytoMate®, commercialisé par la société Baxter. Ce dispositif comporte un système de filtration tangentielle, avec un seuil de coupure de 4 μm. Il permet donc de retenir les microorganismes présentant une taille supérieure à 4 μm.
D'autres détails et avantages de l'invention apparaîtront plus clairement à la lumière de l'exemple donné ci-dessous, uniquement à titre indicatif et à fin d'illustration.
EXEMPLE
Exemple 1 : Essais sur automate de concentration CytoMate®.
Deux séries d'essais ont été réalisées_sur des échantillons naturels vivants prélevés dans une tranche de la centrale de Civaux puis acheminés à la DRD Chatou. La première série d'essais a pour but d'évaluer l'efficacité du programme et du protocole de concentration.
Lors de la deuxième série d'essais, le système a été validé par des répétitions interessais et par l'évaluation de la sensibilité.
1.1/ Evaluation du protocole et du programme de concentration par le CytoMate®
a. Déroulement des essais. Chaque jour, un échantillon est prélevé dans une tranche de la centrale nucléaire de
Civaux et est acheminé à la DRD Chatou.
Les échantillons ont été analysés par la méthode du « Nombre le Plus Probable » (NPP) qui est une méthode statistique par dénombrement sur boite de Pétri
b. Principe de la concentration par le CytoMate®.
L'échantillon de départ est placé dans la poche n°4 (poche source) du CytoMate®.
Il est pompé et transféré dans la poche de lavage. A partir de la poche de lavage, le liquide circule dans le système de filtration tangentielle qui permet d'éliminer les particules inférieures à 4 μm. Au fur et à mesure que la concentration est réalisée, le volume de la poche de lavage diminue pour atteindre le volume minimal fixé (environ 50 ml).
Le "concentrât" ainsi obtenu est transféré vers la poche n° 3 (poche finale).
La poche de lavage est rincée par 100 ml de tampon, cette fraction sera récupérée et analysée. La poche de lavage est de nouveau rincée par 100 ml de tampon. La fraction est cette fois récupérée manuellement, après avoir sectionné le capillaire inférieur de la poche. Ceci permet de récupérer les grosses particules qui ont décanté au fond de la poche et qui n'ont pu être récupérées par l'appareil.
1.2/ Essais de concentration sur échantillon vivant.
Ces essais ont pour but d'évaluer :
- la répétabilité inter-essais ;
- la sensibilité de la méthode Cytomate® ; - la capacité de concentration en fonction de la quantité de matières en suspension de l'échantillon (MES). Les échantillons utilisés sont prélevés sur une tranche du CNPE Civaux puis acheminés à la DRD Chatou le jour même afin de pouvoir traiter des amibes naturelles vivantes.
A. Répétabilité inter-essai.
- Principe.
La concentration de IL d'échantillon issu du CNPE Civaux par le CytoMate® est répétée 3 fois avec un nouveau kit à chaque essai. Trois séries de répétitions inter-essais ont ainsi été réalisées sur des journées différentes.
Trois fractions (concentrât, rinçage et poche) sont récupérées et mises en culture. En témoin, l'échantillon non concentré est directement mis en culture. Le programme de concentration utilisé comprend une phase d'évacuation du concentrât par poussée d'air permettant une récupération plus efficace. La fraction éliminée dans la poubelle n'a pas été analysée car les essais précédents ont montré une perte très faible voire nulle.
- Programme CytoMate® :
- installation du kit (poches, tubulures, filtre, dispositif de pompage) pause lavage des cellules de la poche « source » (volume final programmé de
20ml, coefficient de lavage « réduction » de 1, rinçage de la poche
« source » avec 100ml de tampon) - transfert de l'échantillon concentré de la poche « lavage » vers la poche
« collecte finale » (volume de rinçage des tubulures 10 ml pour essai 1 du
26/08/02 puis 1 ml pour le reste des essais) transfert du tampon vers la poche « lavage » (vol 30 ml) pause « air », la poche « lavage » est agitée manuellement, - transfert la poche « lavage » vers la poche « collecte finale » (volume d'air pour le rinçage des tubulures = 100 ml). Retrait du tuyau 2 au moment de l'affichage « rinçage.... » (Concentrât) pause « rinçage » transfert du tampon vers la poche « lavage » (volume 100ml) - pause « ix » transfert de la poche « lavage » vers la poche « collecte finale ». Retrait du tuyau 2 quand s'affiche « rinçage de la poche « lavage »... » pour transférer tout le liquide (Rinçage) fin du programme manuellement, on effectue un lavage de la poche « lavage » par « transfert de tampon vers la poche « lavage », vol 100 ml », on coupe la partie inférieure de la poche au niveau de la tubulure d'entrée de liquide (Poche).
Les fractions récupérées et mises en culture sont : le concentrât la fraction « rinçage » la fraction « poche »
- Résultats.
L'analyse des résultats est basée sur la comparaison des intervalles définis par les limites inférieures (L.inf) et supérieures (L.sup) des données.
a- Première série de répétition.
Tableau 1 : Nombre d'amibes présentes dans IL d'échantillon analysé directement
Figure imgf000011_0001
Tableau 2 ;
Nombre d'amibes présentes dans chacune des fractions récupérées après concentration par le CytoMate®
Figure imgf000011_0002
Le nombre de Naegleria totales (N.t) du témoin est compris dans l'intervalle [L.inf- L.sup] des concentrats. Le nombre de N.t du témoin est donc équivalent à celui des concentrats (1, 2 et 3). Réciproquement, la valeur NPP des concentrats 2 et 3 est comprise dans l'intervalle [L.inf-L.sup] du témoin.
Le nombre d'amibes des fractions « rinçage » et « poche » est largement inférieur à celui du concentrât. La très grande majorité des amibes se trouve dans le concentrât.
b- Deuxième série de répétition.
Tableau 3 :
Nombre d'amibes présentes dans 0.75 L d'échantillon analysé directement
Figure imgf000012_0001
Tableau 4 :
Nombre d'amibes présentes dans chacune des fractions récupérées après concentration par le CytoMate®
Figure imgf000012_0002
L'échantillon utilisé lors de la deuxième série de répétitions était particulièrement chargé en MES, le volume traité est de 0.75L au lieu de IL.
Les résultats des essais 1, 2 et 3 sont équivalents. La méthode semble répétable. Le nombre d'amibes du concentrât des essais 2, 3 et 4 est équivalent à celui du témoin. Le système concentre de façon efficace tout en respectant la viabilité de l'amibe. Le nombre d'amibes dans les fractions "rinçage" et "poche" est dix fois inférieur à celui du concentrât. La quantité d'amibes restante dans la poche est non-significative.
c. Troisième série de répétition.
Tableau 5 ; Nombre d'amibes présentes dans l'échantillon témoin analysé directement
Figure imgf000013_0001
Tableau 6 :
Nombres d'amibes présentes dans chacune des fractions récupérées après concentration par le CytoMate®
Figure imgf000013_0002
Les valeurs des concentrats sont équivalentes entre elles et à celle du témoin. Cette 3ιeme série démontre également une bonne répétabilité de la méthode.
d. Récapitulatif des essais de répétabilité inter-essais.
Le récapitulatif sépare les résultats exprimés en Naegleria totales des résultats exprimés en Naegleria fowleri. Tableau 7 :
Comparaison du nombre de Naegleria totales présentes dans le témoin et dans les concentrats de CytoMate®
Figure imgf000014_0001
La valeur NPP du témoin de la série 1 est comprise dans l'intervalle [L.inf-L.sup] des concentrats. Le nombre de Naegleria totales du témoin est équivalent à celui des concentrats.
Dans les séries 2 et 3, les trois essais sont répétables.
Les valeurs des concentrats sont équivalentes aux valeurs des témoins correspondants.
Tableau 8 : Comparaison du nombre de Naegleria fowleri présentes dans le témoin et dans les concentrats de CytoMate®
Figure imgf000014_0002
Les résultats en Naegleria fowleri sont légèrement différents. Dans la série 1, deux essais sont répétables mais les valeurs sont supérieures aux valeurs témoins.
Le nombre d'amibes du concentrât de l'essai 2 est comparable à celui du témoin. Dans la série 2, seul l'essai 2 donne des résultats similaires au témoin. Dans la série 3, deux essais sur trois donnent des résultats répétables. Le nombre d'amibes des concentrats est équivalent à celui du témoin. La répétabilité est moins marquante lorsque l'on compare les résultats en Naegleria fowleri. -Discussion.
Les variations inter-essais sont relativement faibles. 5 La répétabilité est considérée comme concluante.
Le facteur moyen de concentration est de 13.
Comme il a déjà été observé précédemment, le système concentre l'échantillon de façon efficace tout en respectant la viabilité.
En effet, le nombre d'amibes présentes dans le concentrât est équivalent au nombre 10 d'amibes présentes dans l'échantillon témoin.
La majorité des amibes est dans le concentrât. Le nombre d'amibes résiduelles est faible dans la fraction "rinçage" et infime voire nul dans la fraction "poche".
Les variations parfois importantes des valeurs NPP ne sont pas significatives car 15 ces variations sont inhérentes à l'incertitude de la méthode NPP.
Les résultats en nombre de Naegleria fowleri présentent de plus grandes variations que les résultats Naegleria totales.
Les intervalles [L.inf-L.sup] des témoins se chevauchent avec les intervalles [L.inf-L.sup] des concentrats. Le nombre de Nf présentes dans les concentrats est 20 équivalent à celui des témoins.
L'ensemble des résultats montre une bonne reproductibilité de la méthode.
B. Sensibilité du CytoMate.
25
- Principe.
Afin de déterminer la limite minimum de la méthode de concentration, des essais ont été réalisés sur un échantillon d'eau naturellement contaminée, non traité et dilué en eau de Civaux autoclavée. 30 Les eaux utilisées pour les dilutions sont des eaux de Civaux utilisées lors des essais du mois de juin, autoclavées afin d'éliminer les amibes.
Ces essais de sensibilité ont été répétés sur des échantillons prélevés lors de journées différentes.
L'échantillon ainsi dilué deux fois est concentré par le CytoMate® en utilisant le _35_ même programme queprécédemment. Le volume traité est de IL.
Les fractions "concentrât", "rinçage" et "poche" sont mises en culture. - Résultats.
a. Premier essai.
L'échantillon témoin est dilué au 1/10 et au 1/100.
Tableau 9
Nombre d'amibes présentes dans l'échantillon Témoin
Figure imgf000016_0001
Tableau 10 ; Sensibilité de la méthode de concentration, résultats exprimés en nombre d'amibes présentes dans les fractions
Figure imgf000016_0002
Le nombre d'amibes des concentrats suit le facteur de dilution appliqué à l'échantillon de départ. Le système permet donc de concentrer et de récupérer un très faible nombre d'amibes (10/Litre).
b. Deuxième essai Tableau 11 :
Nombre d'amibes présentes dans l'échantillon témoin
Figure imgf000017_0001
Tableau 12 ; SensibiMté de la méthode de concentration, résultats exprimés en nombres d'amibes présentes dans les fractions
Figure imgf000017_0002
Pour la dilution au 1/100, les boîtes étaient complètement envahies par des non Naegleria, d'où une difficulté d'évaluer la fraction du concentrât.
Cependant, les résultats de l'échantillon dilué au 1/10 semblent confirmer les résultats du premier essai.
c. Troisième essai.
Tableau 13 : Nombre d'amibes dans l'échantillon témoin
Figure imgf000017_0003
Tableau 14 :
Sensibilité de la méthode de concentration, résultats exprimés en nombre d'amibes présentes dans les fractions
Figure imgf000018_0002
Les résultats sont similaires aux précédents.
- Discussion.
Le nombre d'amibes présentes dans les concentrats varie proportionnellement au facteur de dilution. De plus les valeurs sont comparables à celles du témoin correspondant. L'appareil permet de concentrer des échantillons contenant un très faible nombre de cellules, de l'ordre de 10 amibes/L.
C. Capacité de pré-concentration en fonction de la charge en MES.
MES = matières en suspension
L'eau de Civaux analysée lors des essais du mois de juin, provoquant une saturation du système de concentration dès un volume de IL, avait une teneur en MES de l'ordre de 100 mg/L en poids sec.
- Préparation de l'échantillon.
Des eaux de Seine autoclavées puis filtrées sur une membrane de porosité 0,45 μm sont artificiellement contaminées en MES issues de centrale, à différentes concentrations. Les échantillons sont préparés avec différentes teneurs en MES :
- 5 L à l0 mg/L
- 3 L à 20 mg/L
- 2 L à 50 mg/L
Figure imgf000018_0001
- 1 L à 150 mg/L
- 1 L à 200 mg/L Ces échantillons sont traités par le CytoMate®. Un nouveau programme est utilisé de manière à traiter l'échantillon en 5 pompages de liquide afin d'évaluer le volume limite.
- Programme CytoMate®. - installation du kit
- pause échantillon 1
- lavage de la poche « source » (réduction 1, rinçage poche de lavage 50ml, volume final 20 ml)
- pause échantillon 2 - lavage de la poche « source » (réduction 1, rinçage poche de lavage 50ml, volume final 20 ml)
- pause échantillon 3
- lavage de la poche « source » (réduction 1, rinçage poche de lavage 50ml, volume final 20 ml) - pause échantillon 4
- lavage de la poche « source » (réduction 1, rinçage poche de lavage 50ml, volume final 20 ml)
- pause échantillon 5
- lavage de la poche « source » (réduction 1 , rinçage poche de lavage 50ml, volume final 20 ml)
- pause mix
- transfert de poche « lavage » vers la poche « collecte finale » (évacuation par l'air en retirant le tuyau 2 « tampon »)
- transfert du tampon dans la poche « lavage » - transfert de la poche « lavage » vers la poche « collecte finale » (évacuation par l'air).
- Résultats.
a. Evaluation du volume de saturation en fonction de la charge en MES. Tableau 15
Capacité de concentration par le CytoMate en fonction de la concentration en MES
Figure imgf000020_0001
- Discussion.
Les échantillons d'eaux reconstituées à différentes concentrations ne saturent pas l'appareil.
Le système est capable de concentrer sans saturer IL d'échantillon reconstitué comportant de fortes concentrations de MES (100, 150, 200 mg/L).
Le CytoMate® concentre sans problème les échantillons reconstitués, le volume limite de traitement n'est atteint dans aucune expérience.
Ces échantillons ont été préparés avec une eau préalablement filtrée sur une membrane de porosité 0,45 μm. Cette étape élimine une grande partie des particules colloïdales qui sont souvent responsables de la saturation des filtres.
La saturation est dépendante du diamètre des MES et non de la concentration.
Conclusion.
Le CytoMate® permet de concentrer, sans perte, un échantillon naturel vivant tout en respectant la viabilité de l'amibe.
Un échantillon d'un volume de IL est ramené à 70 mL, soit un facteur de concentration de 14.
La reproductibilité des essais démontre la robustesse de la méthode.
L'évaluation de la sensibilité a montré que la concentration minimum traitée est très basse, de l'ordre de 10 amibes/L.
Des échantillons reconstitués de teneurs différentes en MES ont été concentrés sans entraîner de saturation du système de filtration. Une suspension de IL à 200 mg/L de MES a ainsi été traitée par l'appareil.
"Cependant^ il" à été observé qu'un échantillon naturel de rL~ à ïOΘ-mg/L~de ES~ provoque la saturation du CytoMate®. La capacité de concentration d'un échantillon reconstitué n'est pas extrapolable à un échantillon naturel où la qualité et le diamètre des MES varient énormément d'un échantillon à l'autre.
Par conséquent, une validation sur différents échantillons naturels devra être réalisée.
Cette méthode de pré-concentration est envisageable en aval de différentes techniques d'analyses telles que :
- la mise en culture - la PCR
- la Cytométrie.
La méthode de pré-concentration par le CytoMate® couplée à la méthode de dénombrement NPP permettrait de ramener la limite de détection actuelle de 200 amibes/L à 15 amibes/L.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de détection de microorganismes présents dans un échantillon liquide, caractérisé en ce qu'il comprend principalement les étapes suivantes : - concentrer lesdits microorganismes au moyen d'un dispositif de filtration par flux tangentiel ;
- récupérer lesdits microorganismes ainsi concentrés ; et
- identifier lesdits microorganismes.
2. Procédé de détection selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comporte une étape préalable de grossissement desdits microorganismes.
3. Procédé de détection selon la revendication précédente, caractérisé en ce que l'étape de grossissement comprend les sous-étapes suivantes : - introduire dans l'échantillon des particules de taille supérieure à celle des microorganismes cibles ;
- former un complexe microorganisme - particule par interaction réversible desdits microorganismes sur lesdites particules.
4. Procédé de détection selon la revendication précédente, caractérisé en ce qu'il comporte une étape supplémentaire consistant à isoler les microorganismes desdites particules préalablement à l'étape de révélation des microorganismes.
5. Procédé selon la revendication précédente, caractérisé en ce que l'étape consistant à isoler les microorganismes desdites particules comprend les sous-étapes suivantes :
- mettre les complexes microorganisme - particule en suspension dans une solution appropriée ; désolidariser les microorganismes desdites particules par tout moyen approprié, en particulier chimique ; - séparer les microorganismes des particules par passage de ladite suspension dans le dispositif de filtration par flux tangentiel et concentration desdites particules ; et
- récupérer lesdits microorganismes.
6_._ JProçédé -selon Hune des revendications précédentes, caractérisé en ce que le dispositif de filtration par flux tangentiel est un dispositif de lavage et de concentration de cellules sanguines.
7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 3 à 6, caractérisé en ce que les particules sont des particules constituées d'un matériau pris dans le groupe comprenant : la silice, la maghémite, la magnétite, les polymères tels que le polystyrène, le polyméthylméthacrylate, le polyester et/ou leurs mélanges, ou tout composé équivalent.
8. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comporte une étape supplémentaire de sélection des microorganismes purifiés par réaction par affinité.
9. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'étape d'identification consiste à :
- marquer les microorganismes purifiés et éventuellement sélectionnés ;
- révéler lesdits microorganismes ainsi marqués.
10. Procédé selon la revendication précédente, caractérisé en ce que les microorganismes sont identifiés par une méthode prise dans le groupe comprenant : la mise en culture, la Réaction de Polymérisation en Chaîne, la cytométrie, les techniques d'immuno-essai, les biopuces ou tout technique équivalente.
11. Procédé de détection de microorganismes de taille supérieure à 1,5 μm, dans un échantillon liquide, caractérisé en ce qu'il comprend : - une étape de concentration comprenant les sous-étapes suivantes : a) lavage et concentration de l'échantillon de la poche « source » et stockage dans la poche « lavage » ; b) rinçage de la poche « source » et transfert du volume de rinçage dans la poche « lavage » ; c) transfert de l'échantillon concentré de la poche « lavage » vers la poche « collecte finale » ; d) transfert du tampon de la poche « tampon » vers la poche « lavage » ; e) introduction d'air dans la poche « lavage » et agitation manuelle de cette dernière afin de rincer la tubulure ; f) transfert du reliquat de la poche « lavage » vers la poche « collecte finale » ; g) transfert du tampon de la poche « tampon » vers la poche « lavage » ; h) transfert du tampon de la poche « lavage » vers la poche « collecte finale » ; i) lavage manuel de la poche « lavage » par transfert de tampon de la poche
« tampon » vers la poche « lavage » ; j) récupération des microorganismes dans la poche « collecte finale » ; et - une étape d'identification des microorganismes contenus dans la poche « collecte finale ».
12. Procédé de concentration de microorganismes de taille inférieure à 1,5 μm, dans un échantillon liquide, caractérisé en ce qu'il comprend :
- une étape de grossissement de microorganismes comprenant les sous-étapes suivantes : a) introduire dans l'échantillon des particules de taille supérieure à celle des microorganismes cibles ; b) former un complexe microorganisme - particule par interaction réversible desdits microorganismes sur lesdites particules.
- une étape de concentration des complexes microorganisme - particule comprenant les sous-étapes suivantes : c) lavage et concentration de l'échantillon de la poche « source » et stockage dans la poche « lavage » ; d) rinçage de la poche « source » et transfert du volume de rinçage dans la poche « lavage » ; e) transfert de l'échantillon concentré de la poche « lavage » vers la poche « collecte finale » ; f) transfert du tampon de la poche « tampon » vers la poche « lavage » ; g) introduction d'air dans la poche « lavage » et agitation manuelle de cette dernière ; h) transfert du reliquat de la poche « lavage » vers la poche « collecte finale » ; i) transfert du tampon de la poche « tampon » vers la poche « lavage » ; j) transfert du tampon de la poche « lavage » vers la poche « collecte finale ». k) lavage manuel de la poche « lavage » par transfert de tampon de la poche
« tampon » vers la poche « lavage » ; 1) récupération des complexes microorganisme - particule dans la poche « collecte finale ».
13. Procédé de détection de microorganismes de taille inférieure à 1,5 μm, dans un échantillon liquide, caractérisé en ce qu'il comprend :
- une étape de grossissement de microorganismes comprenant les sous-étapes suivantes :
Figure imgf000024_0001
microorganismes cibles ; b) former un complexe jmiçroorganisme - particule par interaction réversible desdits microorganismes sur lesdites particules ; - une étape de concentration des complexes microorganisme - particule comprenant les sous-étapes suivantes : c) lavage et concentration de l'échantillon de la poche « source » et stockage dans la poche « lavage » ; d) rinçage de la poche « source » et transfert du volume de rinçage dans la poche « lavage » ;
- une étape consistant à isoler les microorganismes desdites particules comprenant les sous-étapes suivantes : e) transfert de tampon d'élution dans la poche de "lavage" ; f) circulation du liquide pendant 30 minutes (incubation dans le tampon d'élution) ; g) lavage et concentration du mélange dans la poche de "lavage" en utilisant le tampon d'élution ; h) récupération des microorganismes dans la poche « déchets » et des particules dans la poche « collecte finale » ; et
- une étape d'identification des microorganismes contenus dans la poche « déchets ».
14. Utilisation d'un dispositif de lavage et de concentration de cellules sanguines pour la détection de microorganismes dans un échantillon liquide.
15. Utilisation d'un dispositif de lavage et de concentration de cellules sanguines pour la concentration et le lavage de microorganismes dans un échantillon liquide.
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