FR2933989A1

FR2933989A1 - Procede de purification de microorganismes presents dans des echantillons liquides

Info

Publication number: FR2933989A1
Application number: FR0804039A
Authority: FR
Inventors: Stephane Coupe; Dorothee Jary
Original assignee: Commissariat a lEnergie Atomique CEA
Current assignee: Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA
Priority date: 2008-07-16
Filing date: 2008-07-16
Publication date: 2010-01-22
Anticipated expiration: 2028-07-16
Also published as: WO2010007255A2; EP2318539A2; FR2933989B1; US20120009560A1; WO2010007255A3

Abstract

La présente invention concerne un procédé de traitement d'échantillons liquides en vue de la détection d'éventuels micro-organismes pathogènes en très petite quantité. Plus précisément, ce procédé consiste en une étape générique de capture et de concentration de micro-organismes sur une surface échangeuse d'ions, suivie d'un traitement de lyse in situ des microorganismes. La mise en oeuvre de ce procédé permet l'obtention d'une solution d'acides nucléiques extrêmement concentrée et purifiée. Ce procédé est adapté à un traitement en continu d'échantillons liquides. L'invention se rapporte également à un dispositif d'analyse d'échantillons liquides pour la biologie, la santé ou l'environnement adapté à la mise en oeuvre du procédé selon l'invention.

Description

1 L'invention concerne le domaine de la détection globale de micro-organismes pathogènes éventuellement faiblement représentés dans les prélèvements à analyser et dont l'incidence en santé publique, que ce soit humaine ou animale, peut être considérable.

La présente invention concerne plus précisément un procédé de traitement: d'échantillons liquides en vue de la détection d'éventuels micro-organismes pathogènes en très petites quantités. Plus précisément, ce procédé consiste en une étape générique de capture et de concentration de micro-organismes, suivie d'un traitement de lyse in situ des microorganismes. La mise en oeuvre de ce procédé permet l'obtention d'une solution d'acides nucléiques extrêmement concentrée et purifiée. Ce procédé est en outre adapté à un traitement en contin.~ d'échantillons liquides. Elle concerne aussi des dispositifs d'analyse d'échantillons liquides pour la biologie, la santé ou l'environnement ; notamment de dispositifs collecteur- concentrateur cellulaires et moléculaires, et, plus généralement, de dispositifs intégrés de traitement des échantillons. Problème de la qualité des échantillons Les échantillons à traiter peuvent être de composition biologique et physico-chimique complexe. Les caractéristiques rendant l'analyse de l'échantillon difficile résident essentiellement dans la variabilité de la biomasse totale, de la force ionique, du pH, de la présence de colloïdes, de petites molécules de décomposition de matières organiques, ou encore de substances chimiques artificielles dans ledit échantillon. Ainsi il est fréquent que les échantillons à analyser contiennent une flore microbiologique ubiquitaire plus ou moins concentrée, sans réelle incidence sur la santé publique ou les études scientifiques réalisées. C'est par exemple le cas des échantillons d'eaux (industrielles, environnementales) et des coliformes qu'ils peuvent contenir, ces bactéries n'étant pathogènes qu'à des fortes concentrations ; cela est aussi valable pour les échantillons obtenus à partir d'air, de boues ou bien encore cle selles. Dans de nombreux cas, la recherche de micro-organismes peu concentrés ou faiblement représentés dans un échantillon peut s'avérer nécessaire, par exemple dans le cas de la détection de pathogènes susceptibles de coloniser les circuits d'eaux de boissons, les eaux industrielles ou environnementales ou l'air. Il s'agit le plus souvent de virus, bactéries, protozoaires, amibes, champignons, levures, algues, vers... Cette détection est essentielle puisque ces pathogènes peuvent alors être responsables de maladies graves parmi lesquelles le choléra, la légionellose, la typhoïde, dans lesquelles on peut observer les symptômes suivants : diarrhée, dysenterie, gastroentérite.

Dans le cas d'un échantillon complexe en raison, par exemple, d'une très forte charge microbienne totale, ou encore d'un échantillon riche en colloïdes, etc. la détection d'un micro-organisme très dilué est rendue difficile. Nécessité d'une surveillance microbiologique Etant données les contaminations possibles des eaux par des 10 agents infectieux, il est nécessaire de pouvoir surveiller avec une fréquence suffisante la charge des micro-organismes pathogènes. Dans le cas des eaux environnementales, les contrôles permettent d'engager si besoin des mesures de prévention en terme de fréquentation humaine ou anima e, en limitant l'accès aux sites par exemple, et en terme de prélèvement à 15 destination de traitement pour les réseaux d'eau potable, entre autres. Dans le cas des réseaux d'eaux industrielles, le suivi microbiologique permet d'engager des actions de désinfection ou de traitement de l'eau ou des installations industrielles avant rejet dans l'environnement, et ainsi de respecter les normes microbiologiques réglementaires. 20 Une surveillance de la qualité microbiologique de l'air est soumise aux mêmes problématiques avec les mêmes conséquences sanitaires que celles définies pour les eaux. Optimisation des méthodes de traitement de l'échantillon La plupart des techniques conventionnelles utilisées pour le 25 traitement des échantillons liquides de grands volumes présentent plusieurs inconvénients. Elles traitent des échantillons ponctuels, sont peu sensibles en raison des faibles rendements de purifications et des fortes dilutions nécessaires avant les analyses biologiques. Enfin, elles sont longues, nécessitent de lourds équipements et reviennent chères en moyens humains et matériels. 30 La technique de référence repose sur une identification et un dénombrement des micro-organismes par culture sur différents milieux sélectifs. C'est une technique dont la mise en oeuvre est longue, souvent supérieure à 24 heures et qui peut être biaisée à la fois par la flore commensale mais aussi par la présence de micro-organismes en retard de croissance ou même viables mais non

3 cultivables et pourtant pathogènes. De plus, cette méthode peut ne pas prendre en compte les micro-organismes à croissance lente. Une autre technique permet une quantification rapide de la population microbienne totale par mesure d'activité enzymatique. Cette technique présente 'intérêt de prendre en compte les bactéries viables mais non cultivables. En revanche, elle ne permet pas l'identification spécifique des micro-organismes. Enfin d'autres techniques permettent des réponses plus spécifiques. C'est le cas des captures microbiennes à l'aide d'anticorps spécifiques. Toutefois, le temps de réponse est encore souvent long et la technique peut présenter des défauts de sensibilité et de spécificité en raison de réactions croisées. De la même façon, l'utilisation de sondes nucléiques marquées permet une détection très spécifique après hybridation avec leurs cibles. L'inconvénient réside ici dans le faible nombre de cibles par cellules qui rend cette technique peu sensible et mal adaptée à la détection de micro-organismes peu concentrés. Depuis quelques années, cet inconvénient a été surmonté par l'utilisation des techniques d'amplification génique en temps réel, par exemple par PCR ou NASBA. Toutefois la plupart des techniques nécessitent d'abord un traitement lourd par filtration, centrifugation ou par précipitation. Or, les filtres ou culots générés sont respectivement souvent saturés ou compacts, contiennent de nombreuses molécules et particules difficilement caractérisables, dont on sait qu'elles interfèrent fortement avec les procédés biologiques d'analyses, type interactions antigène û anticorps ou amplifications géniques. Il est donc souvent nécessaire de diluer très fortement les échantillons pour éviter les inhibitions des réactions de détection, et éviter les résultats faux négatifs.

Enfin, les prélèvements sont réalisés ponctuellement au cours du temps avec des fréquences pouvant être variables. Les résultats obtenus correspondent donc à des images instantanées d'un état de contamination d'un environnement particulier. Ils ne peuvent pas prendre en compte les variabilités de contaminations liées à l'environnement.

L'analyse des travaux de développement de systèmes intégrés miniaturisés jusqu'à l'échelle micrométrique montre que l'étape de préparation des échantillons est cruciale et très difficile à intégrer, et ce d'autant plus lorsque l'ensemble des étapes préparatives est prise en charge par le même microsystème, de la capture des éléments à rechercher jusqu'à l'obtention des molécules pures et ultra concentrées.

II apparaît donc qu'un système capable de capturer et concentrer les micro-organismes en continu sur un temps relativement long serait plus informatif de l'état de contamination d'un environnement qu'un prélèvement ponctuel, et permettrait à la fois une meilleure concentration et une meilleure purification. Globalement cela permettrait de pouvoir travailler avec des systèmes types laboratoire sur puce et d'éviter par exemple les dilutions nécessaires avant les amplifications géniques telles qu'elles sont pratiquées aujourd'hui. Par conséquent, il est utile de développer un système intégré 10 répondant aux critères suivants : 1. une large plage d'utilisation permettant des stratégies simples et génériques de traitements d'échantillons, 2. un changement d'échelle important de l'échantillon à traiter et pouvant être intégré aux microsystèmes, 15 3. une forte capacité de purification et de concentration pour permettre l'analyse de tout l'échantillon et permettre la détection des micro-organismes traces (dont le nombre peut être inférieur à 10 dans 100 ml), 4. un temps de préparation rapide, inférieur à 20 minutes. C'est à ces différentes exigences que répond le procédé selon 20 l'invention. Il a été montré que certains polymères peuvent adsorber des bactéries (Deponte et al. Anal Bioanal Chem. 2004 Jun;379(3):419-26.), des virus (Yamaguchi et al. J Virol Methods. 2003 Dec; 114(1):11-9.) ou des molécules chimiques (Boom et al. J Clin Microbiol. 1990 Mar; 28(3):495-503 ; United States 25 Patent US 5,342,931 "Process for purifying DNA on hydrated silica" ; United States Patent US 5,503,816 "Silicate compounds for DNA purification") avec de bonnes performances en terme de cinétique, de purification et de saturation. Certains systèmes ont été développés pour l'extraction d'ADN à partir d'échantillons de sang, d'un volume de quelques millilitres. L'ADN extrait est 30 purifié et ensuite élué dans 100 pl au moins (King Fisher, Easy Mag). Cependant, aucune de ces méthodes ne revêt un caractère générique, ni ne décrit la possibilité de réaliser une lyse des microorganismes in situ. La Demanderesse a maintenant mis en évidence la possibilité d'appliquer un prétraitement à des échantillons liquides susceptibles de contenir des microorganismes en vue d'une analyse ultérieure des acides nucléiques desdits échantillons liquides. Le procédé mis en oeuvre dans cette invention repose sur l'utilisation de surfaces échangeuses d'ions pour réaliser l'ensemble des étapes de préparation 5 d'acides nucléiques, de la capture des micro-organismes jusqu'à la purification et la concentration des acides nucléiques (ADN et ARN). Pour résumer, les avantages du procédé et du dispositif décrits sont : • une capture générique ; • un fort degré de concentration des microorganismes et, éventuellement, des acides nucléiques ; • un fort degré de purification des microorganismes et, éventuellement, des acides nucléiques ; • une intégration simple dans les systèmes automatisés. Plus spécifiquement, la présente invention se rapporte à un procédé de traitement d'un échantillon liquide en vue d'une analyse des acides nucléiques des micro-organismes susceptibles d'être contenus dans ledit échantillon consistant en : (A) la capture des microorganismes contenus dans ledit échantillon 20 liquide par adsorption desdits micro-organismes sur une première surface active échangeuse d'ions, anions et/ou cations ; et (B) la lyse desdits microorganismes in situ. Le caractère générique du procédé provient de sa capacité à pouvoir être mis en oeuvre pour l'ensemble des micro-organismes définis ci-dessous 25 et des acides nucléiques sans distinction de spécificité particulière pouvant a priori les différencier les uns des autres. Par échantillon liquide , on entend un prélèvement d'eau industrielle (par exemple, provenant de circuit de refroidissement), d'eau environnementale, ou encore d'eau potable destinée à la consommation humaine ou 30 animale et par extension tout échantillon dans lequel le ou les éléments à détecter sont en solution ou en suspension. Cet échantillon peut lui-même avoir été obtenu à partir d'un prélèvement ou autre échantillon contenant les éléments d'intérêts, par exemple un fluide corporel, un prélèvement d'air, obtenu par traitement physique et/ou chimique, et/ou biologique selon toute méthode adaptable par l'homme du 35 métier. De préférence, il s'agit d'échantillons aqueux ou à forte composante aqueuse. 15

6 De façon à éviter toute contamination exogène, les prélèvements sont préférentiellement réalisés dans des conditions de grande propreté avec du matériel stérile. Dans le cas d'analyse de la qualité microbiologique de l'air, les échantillons liquides sont préparés selon des techniques connues de l'homme du métier (voir notamment la publication de Stachowiak JC, Shugard EE, Mosier BP, Renzi RF, Caton PF, Ferko SM, Van de Vreugde JL, Yee DD, Haroldsen BL, VanderBoot VA. Autonomous microfluidic sample preparation system for protein profile-based detection of aerosolized bacterial cells and spores. Anal Chem. 2007 Aug. 1;79(15):5763-70). Le volume des échantillons liquides est compris entre 1 et 100 ml, de préférence, il est de 10 ml. De préférence, l'échantillon liquide est tel : - qu'il ne contient pas, ou une quantité négligeable, c'est-à-dire 15 inférieure à 5 % en poids par rapport au poids total de l'échantillon, de détergents ioniques ; - que sa concentration saline n'excède pas 2 M et est préférentiellement inférieure à 200 mM ; - que son pH n'excède pas 10, de préférence, son pH est proche de 20 la neutralité. Par micro-organismes , on entend les virus enveloppés ou non enveloppés, les bactéries végétatives à Gram positif et négatif, les bactéries sous forme sporulée, les protozoaires, les champignons microscopiques et levures, le microplaricton, les pollens, les cellules animales et les cellules végétales que l'on 25 veut capturer, et/ou concentrer, et/ou purifier, et/ou détecter. Par surface active échangeuse d'ions , on entend toutes surfaces échangeuses d'ions (anions ou cations), plus ou moins fortes, permettant l'adsorption des micro-organismes, ou de leurs constituants jusqu'au niveau moléculaire. De préférence, la surface active est choisie parmi les résines échangeuses d'ions fortes. 30 De manière préférentielle, la surface active sera une surface échangeuse d'anions ou résine arionique. Par surface échangeuse d'anions ou résine anionique , on 35 entend une surface portant des fonctions chimiques chargées quelles que soient les conditions de pH. C'est par exemple le cas des amines quaternaires, dont toutes les liaisons sont engagées avec des radicaux autres que des protons. Ainsi par exemple,

7 le polyéthylène imine (PEI) est un échangeur fort d'anions puisqu'une fraction des amines est quaternaire alors que le diéthyl amino éthyle (DEAE) est un échangeur faible puisque aucune amine n'est quaternaire. Ainsi, une surface échangeuse forte d'anions est d'autant plus forte que la proportion d'amine quaternaire est importante.

On peut classer les résines anioniques (échange d'anion) selon le Tableau I ci-après. fortes groupements aminés quaternaires groupements aminés tertiaires faibles groupements aminés secondaires et primaires Tableau I On peut classer les résines cationiques (échange d'un cation) selon le Tableau II ci-après. fortes groupements sulfoniques (groupement SO3 ) intermédiaire groupements phosphores faibles groupements carboxyméthyle ou carboxylique Tableau II Les surfaces échangeuses d'anions ou de cations pourront être fixes ou mobiles, disposées au sein d'un dispositif d'extraction et de purification d'acides nucléiques de micro-organismes, elles sont choisies parmi les polymères chargés dont la ramification avec une chaîne carbonée permet le renforcement de la charge ; en particulier, elles sont sélectionnées dans le groupe constitué par les résines présentant des groupements choisis parmi les groupements aminés quaternaires, les groupements aminés tertiaires, les groupements aminés secondaires, les groupements aminés primaires, les groupements sulfoniques, les groupements phosphores, les groupements carboxyméthyle ou carboxylique ; ou encore les résines hydroxylapatite, Di-Ethyl-Amino-Ethyl (DEAE), poly-Lysine et Poly-Ethylène Imine (PEI). Lesdites surfaces échangeuses d'ions, en particulier d'anions, décrites ci-dessus permettent l'adsorption générique des micro-organismes, et peuvent s'adapter à un très large spectre d'applications. En outre, l'élimination du milieu liquide contenant initialement les micro-organismes à rechercher peut être réalisée facilement sans pour autant risquer de décrocher les micro-organismes de la surface. L'élimination du milieu liquide permet la concentration des microorganismes

8 capturés avant leur lyse. En particulier, le volume de l'échantillon peut être réduit à un volume compris entre 1 à 10 l. En plus de permettre la capture des micro-organismes, les surfaces échangeuses d'ions utiles pour la mise en oeuvre du procédé de l'invention résistent aux procédés physiques, chimiques ou enzymatiques d'ouverture des micro-organismes pour libérer leurs acides nucléiques. Préférentiellement, ces surfaces permettent également la purification et la concentration des acides nucléiques dans un solvant compatible avec les réactions biologiques, dans des volumes très faibles, de1à10pl.

Les surfaces échangeuses d'anions ou de cations reposent avantageusement sur un matériau support permettant la réception des groupements actifs vis-à-vis du procédé décrit, et dont l'intégrité n'est pas ou très peu altérée par les traitements d'ouverture des micro-organismes. A titre d'exemple et de façon non limitative, on peut citer la silice et le polycarbonate.

Les surfaces et leur support peuvent être soit mobiles, comme dans le cas de billes magnétiques par exemple, soit fixes, comme dans le cas d'un laboratoire sur puce. Par laboratoire sur puce , on entend tous dispositifs fluidiques et/ou m crofluidiques comprenant des zones de passages de l'échantillon adéquatement dimensionnées, structurées et fonctionnalisées (par modification de surface ou remplissage de réactifs fonctionnels) de façon complètement ou partiellement automatisée ou non automatisée. Lorsque la surface active et son support sont mobiles sous forme de billes ces dernières sont ajoutées à l'ensemble de l'échantillon liquide et se distribuent de telle sorte qu'elles se comportent comme un filet, avec pour dimension de maille la plus petite distance entre les billes. Le dispositif doit alors être capable de collecter les billes pour retenir les éléments capturés (micro-organismes, acides nucléiques) et concentrer l'échantillon. Lorsque le support est fixe, il n'y a pas de risque d'agrégation. Le dispositif doit cependant être dimensionné et conçu pour permettre une capture efficace des micro-organismes par exemple en favorisant les probabilités de rencontre surface active û échantillon. Enfin, l'échantillon est mis en contact avec les surfaces actives par fractions, à des vitesses dépendant du débit appliqué au dispositif.

Selon un mode particulier de mise en oeuvre du procédé selon l'invention, l'étape (A) de capture des micro-organismes contenus dans un échantillon liquide est réalisée sur une surface active, soit échangeuse d'anions lorsqu'il s'agit de capturer des micro-organismes dont la charge nette de surface est négative, soit échangeuse de cations lorsqu'il s'agit de capturer des micro-organismes de charge nette de surface positive. L'étape (A) peut être réalisée avec une surface échangeuse d'ions telle que : - la surface active par unité de volume est comprise entre 1 et 10 200 m2/1 d'échantillon, de préférence entre 9 et 100 m2/1 ; - la distance entre la surface active et les éléments à capturer est de l'ordre de 10 à 100 micromètres, préférentiellement 10 micromètres ; - le temps de mise en contact de l'échantillon liquide avec la surface active est de l'ordre de 30 secondes à 10 minutes, préférentiellement 10 minutes ; 15 - la température de mise en contact est comprise entre 4°C et 40°C, préférentiellement 25°C 5°C. Une agitation régulière de l'échantillon, par exemple à l'aide d'un vortex, peut être réalisée. Cette agitation s'avère avantageuse lorsque des billes sont utilisées comme support de la surface active. 20 Suite à la capture, une étape de concentration (A') est avantageusement réalisée par la séparation physique de la surface de capture (support fixe ou support mobile) et du solvant liquide. Dans le cas où la surface active est mobile portée par des billes magnétiques, une attraction magnétique des billes pendant :30 secondes à 2 minutes, ou jusqu'à clarification de l'échantillon, est 25 recommandée. L'étape (B) d'ouverture (lyse) des micro-organismes permettant la libération des acides nucléiques est réalisée directement sur les micro-organismes retenus sur la surface active ; elle peut être réalisée par toute méthode connue de l'homme du métier, notamment par sonication, abrasion par des billes de verre, 30 digestion enzymatique, choc thermique, choc osmotique, irradiation lumineuse, électroporation, action de micro-ondes, etc. selon l'échantillon considéré et l'application envisagée à la suite de cette étape. Un avantage de ce procédé est de réaliser la lyse in situ, c'est à dire pendant que les micro-organismes sont adsorbés sur la surface active.

10 Faire l'économie d'une étape d'élution des micro-organismes est avantageux ; en effet, moins le procédé comporte d'étapes, plus les transferts de liquides, potentiellement facteurs de contamination et de perte de matériel sont évités ; en outre, cela rend le procédé plus facilement automatisable.

Concrètement, l'étape (B) de lyse des micro-organismes directement en présence de la surface active peut être réalisée par différentes méthodes chimiques et/ou physiques et/ou biologiques et n'altérant pas, ou très peu, les propriétés structurelles et fonctionnelles des surfaces actives et/ou de leurs supports. A titre d'exemple, la lyse peut être effectuée par une digestion enzymatique par le lysozyme seul ou par le lysozyme puis la protéinase K. On procédera préférentiellement à une digestion successive par le lysozyme puis par la protéinase K dans les conditions de lyse respectives dans un milieu de composition : Tris-HCI à 50 mM, NaCl à 50 mM, EDTA à 5 mM, pH 7,5, pendant 10 minutes à température ambiante, puis dans un milieu de composition : Tris-HCI à 10 mM, EDTA à 2 mM, pH 8,0 ou NaCl à 4 M, Tris-HCI à 10 mM, EDTA à 2 mM, sarcosyl à 0,1 %, pH 9,0, pendant 15 minutes à 70°C. Selon une variante, l'étape (B) est réalisée par une ultrasonication de l'échantillon dans des conditions optimales en fonction de la géométrie de la chambre contenant l'échantillon et selon que le support de la surface active est fixe ou bien mobile. Selon une autre variante de l'invention, le présent procédé peut comprendre une étape supplémentaire (Al), qui s'intercale entre l'étape (A) et l'étape (B), de purification des micro-organismes. Cette étape de purification (Al) correspond à un lavage de la surface sur laquelle sont fixés les micro-organismes à l'aide d'une solution choisie pour ne pas perturber l'accrochage des micro-organismes à la surface échangeuse. A titre d'exemple, une solution à base de sels peut être employée, dont les caractéristiques sont dépendantes de la surface active employée. Par purification , on entend généralement l'élimination des composés inutiles ou gênants qui se sont fixés aux surfaces actives dans les mêmes conditions que les micro-organismes ou les acides nucléiques d'intérêts libérés au cours de l'étape (B), mais dont l'élution peut être réalisée par des solutions adaptées, sans risque d'éluer, ou du moins très partiellement, lesdits micro-organismes et acides nucléiques qui restent adsorbés à la surface active.

11 L'éventuelle étape (Al) de purification peut être réalisée par incubation de la surface active avec une solution lavante à base de sels, préférentiellement ayant la composition suivante : NaCl à 0,8 M, Tris-HCI à 10 mM, éthanol à 15% (v/v), pH 8.

Après l'ouverture ou lyse des micro-organismes, les acides nucléiques libérés sont soit immédiatement adsorbés sur la première surface active qui a permis la capture des micro-organismes, soit adsorbés à une autre surface échangeuse d'anions de force électrostatique similaire à celle de l'étape (A). Ceci permet de ségréguer et concentrer rapidement le matériel d'intérêt, ici les acides nucléiques. Une éventuelle étape (A2) d'élution des micro-organismes de la première surface active peut être réalisée, à la suite de l'étape (A) ou de l'étape (Al) et précédant l'étape (B), avec une solution qui favorise la séparation des micro-organismes de la première surface active par compétition avec un ion de même charge, ou par modification chimique de la densité de charge surfacique des billes et/ou des micro-organismes. L'étape (A2) peut être réalisée par l'incubation de la surface active avec une solution d'hydroxyde de sodium 100 mM, contenant ou non des détergents, éventuellement complétée par des méthodes physiques tels que le chauffage, l'agitation par un vortex ou par des ultrasons. Dans ce cas, les microorganismes contenus dans l'éluat pourront être isolés de la première surface active afin de subir la lyse prévue à l'étape (B) ou bien subir la lyse en présence de la première surface active mais sans être adsorbés. Une éventuelle étape (A3), suivant l'étape (A2), de régénération de la première surface active peut également être réalisée par une solution d'hydroxyde de sodium (NaOH) de façon à poursuivre par un autre cycle de capture conformément à l'étape (A) pour un nombre déterminé de cycles. La régénération de la surface active de capture des micro-organismes peut être réalisée dans les conditions suivantes : l'incubation de la surface active avec une solution de chlorure de sodiurn, préférentiellement de 100 mM, puis son élimination ou encore l'incubation de la surface active avec de l'eau déionisée, puis son élimination. Selon un autre objet de la présente invention, le procédé comprend en outre une étape (C), suivant l'étape (B), d'adsorption des acides nucléiques libérés par la lyse desdits micro-organismes.

Selon une variante telle que la première surface active est une surface échangeuse d'anions, cette adsorption est réalisée sur la même surface échangeuse d'ions que celle utilisée à l'étape (A). Selon une autre variante de l'étape (C) du procédé, l'adsorption est réalisée sur une seconde surface active, correspondant à une surface échangeuse d'anions utile pour cette étape (C) d'adsorption des acides nucléiques, prélude à la purification et à la concentration d'acides nucléiques. Cette seconde surface active anionique peut contenir des groupements porteurs de chaînes carbonées de différentes longueurs, de C, à C,$ par exemple, mais aussi de la silice, de l'ADN, de l'ARN et analogue synthétique des acides nucléiques tels que PNA et LNA. Là encore, la seconde surface utilisée peut reposer sur un support et ladite seconde surface active et son support peuvent être fixes ou mobiles. Le procédé peut comporter une étape optionnelle (Cl), suivant l'étape (C), de purification par lavage des acides nucléiques adsorbés.

Cette étape (Cl) est réalisée par l'ajout d'une solution à base de sels avec préférentiellement, mais pas obligatoirement, de l'alcool dans des concentra:ions biens définies, dépendant de la surface active ; elle permet l'élimination de bon nombre de contaminants chimiques et biologiques, tels que des sucres, des protéines, des lipides, les petits ARN, de telle sorte qu'il ne reste que les ADN et la plus grande partie des ARN de l'échantillon. Enfin, le procédé selon l'invention peut également comprendre une étape (C2) d'élution des acides nucléiques qui suit l'étape (C) ou l'étape (Cl). Selon les conditions expérimentales, cette étape (C2) peut permettre la séparation des ADN et des ARN. L'ARN retenu pouvant être sélectivement élué grâce à une solution saline de concentration inférieure à celle requise pour l'ADN. Après une série de lavages à base de sels et éventuellement d'alcool, l'élution est réalisée par une modification de la charge de surface des surfaces actives, soit en jouant sur le pH et/ou en jouant sur la concentration en ions dans des gammes de concentrations compatibles avec les réactions biochimiques et biologiques, selon des méthodes connues de l'homme du métier. Le procédé global de préparation d'acides nucléiques sur surfaces actives échangeuses d'anions est particulièrement bien adapté aux dispositifs du type laboratoire sur puce. En effet, la capture sur surface permet d'envisager une réduction d'échelle très importante dès les premières étapes du traitement de l'échantillon. Selon que la surface active est portée par des billes ou qu'elle revêt un support fixe, l'échantillon d'intérêt sera au final circonscrit à la surface de capture, globalement les microorganismes et/ou ADN et/ou ARN seront finalement stockés dans une structure bidimensionnelle, c'est-à-dire surfacique, au lieu d'être stockés en solution dans un réservoir tridimensionnel. L'invention peut être déclinée selon plusieurs variantes, en particulier, des étapes ultérieures de traitement de l'échantillon peuvent être ajoutées. Une fois les acides nucléiques collectés soit sur surface active soit en solution, il est possible de les purifier et de les collecter selon un procédé similaire consistant en l'adsorption des acides nucléiques sur une surface active de type PEI ou Silanol selon l'étape (D). L'étape (D) de capture des acides nucléiques sur une surface active, similaire cu différente de la première surface active de capture des micro-organismes, peut être réalisée dans des conditions physico-chimiques adaptées au type de surfaces actives. Pour ce faire, on incube la surface active avec une solution de concentration saline inférieure à 0,8 M de NaCl, préférentiellement inférieure à 200 mM, dépourvue de détergent, et de pH inférieur au pKa du groupement impliqué dans l'adsorption, préférentiellement autour de la neutralité, dans le cas d'une surface active similaire au PEI.

L'incubation de la surface active avec une solution de guanidine HCI de concentration supérieure à 3 M, Tris-HCI à 10 mM, éthanol à 80% (v/v), pH 4,5, dans le cas d'une surface active Silanol est préférée. Le procédé selon l'invention peut encore être complété d'une étape (E) de purification desdits acides nucléiques.

Cette étape (E) de purification des acides nucléiques est réalisée par passage d'une solution lavante via l'incubation de la surface active avec une solution à base de sels, préférentiellement de composition : NaCI à 0,5 M, Tris-HCI à 10 mM, éthanol à 15% (v/v), pH 8 pour une surface de type PEI ou via l'incubation de la surface active avec une solution à base de sels, préférentiellement de composition : NaCl à 2 mM, EDTA à 5 mM, éthanol à 80% (v/v), pH 7,0. Enfin, le procédé peut encore comporter une étape (F) de concentration finale via une étape de séchage consistant en l'élimination des liquides résiduels suivie d'une élution en un petit volume de liquide. A l'étape (F), l'élution des acides nucléiques en petit volume est 35 réalisée par une solution favorisant la séparation des acides nucléiques de la surface

14 active, selon les mêmes principes que ceux décrit en (A2) ; avec, de façon préférentielle, l'incubation de la surface active avec une solution de NaOH n'excédant pas 100 mM, préférentiellement 50 mM, pendant 20 secondes à température ambiante, pour une surface active de type PEI, ou l'incubation de la surface active avec une solution à de Tris-HCI 10 mM, à 60°C pendant 2 minutes pour une surface de type silanol. Selon un autre de ses aspects, l'invention se rapporte à un dispositif de traitement d'échantillon liquide susceptible de contenir des microorganismes, caractérisé en ce qu'il contient au moins une surface échangeuse d'ions telle que définie ci-dessus disposée dans une chambre telle que la surface par unité de volume est comprise entre 1 et 200 m2/I, de préférence entre 9 et 100 m2/l. Selon un mode particulier dudit dispositif, il comprend un laboratoire sur puce constitué de billes mobiles supportant les surfaces actives. Dans ce cas de figure, la distance optimale inter-billes pour l'étape de capture des micro-organismes est de 1C pm environ. Cette distance est également optimale pour la capture des acides nucléiques. De plus, les surfaces développées données par unité de volume sur la base d'études cinétiques de capture des micro-organismes (voir le modèle théorique de Deponte et al.) correspondent bien aux données expérimentales obtenues, L'homme du métier peut alors dimensionner un laboratoire sur puce en se basant sur les données de l'art antérieur (par exemple, Microfabricated reaction and separation systems. de Madhavi Krishnan et al. Dans Analytical Biotechnology ; éd. Elsiever Science). En premier lieu, il convient de définir ces trois données : ^ Le rapport Surface/Volume (S/V) de la chambre au travers de laquelle passera l'échantillon ; • Le volume d'échantillon qui peut être contenu dans la chambre de capture ; et • Le débit de l'échantillon.

Chaque donnée d'entrée influence les deux autres. A titre d'exemple, lorsqu'on utilise une chambre de dimension 20 mm x 5 mm x 0.01 mm ; le volume de ladite chambre est de 1 pl, la surface des deux rectangles (20 mm x 5 mm) = 200.10-6 m2, alors, le rapport SN vaut 200 m2/I, ce qui est en l'état très supérieur à la surface active développée par les billes de

15 1 pm utilisées dans la description du procédé qui suit et peut donc apporter encore plus d'efficacité au procédé. La surface active peut encore être augmentée en ajoutant une structuration de la chambre, par exemple par des piliers, ou bien une parallélisation des circuits fluidiques. Selon le modèle cinétique de Delponte et al. (voir supra), les vitesses d'adsorption devraient être très rapides et donc permettre des débits importants. Un dimensionnement et une structuration adaptés des chambres contenant la surface active en contact avec l'échantillon liquide doivent donc permettre de traiter des volumes d'échantillons avec, au minimum, les mêmes performances que celles décrites dans les exemples présentés ci-après. Conformément à la Figure 1, est décrit un procédé de préparation d'acides nucléiques selon l'invention pour les micro-organismes présents dans des échantillons liquides. Dans cette Figure 1, les flèches en pointillés représentent des étapes éventuelles, ou bien des possibilités alternatives de traitement de l'échantillon, le terme AN signifie acides nucléiques. Les combinaisons de cheminements représentés par la figure sont autant de variantes de préparations d'échantillon possibles. Cette invention trouve application dans des domaines très variés - toutes les analyses biologiques où les éléments recherchés sont très dilués et où la totalité de l'échantillon doit être analysée ; - dans les microsystèmes fluidiques (Laboratoire sur Puce (LOC pour Laboratory On Chip) ou Microsystème d'Analyse Totale (pTAS)), dans lesquels l'intégration de surfaces modifiées (fixes ou mobiles type billes magnétiques) est maîtrisée, et - dans tous les systèmes intégrés nécessitant une préparation d'échantillon, type extraction û purification d'acides nucléiques. Ce procédé de préparation d'échantillon décrit dans la présente invention offre plusieurs avantages : • la capture simple et générique de micro-organismes sans distinction de tailles ; • la capture de micro-organismes et de leurs constituants même à de très faibles concentrations ; • la capture de micro-organismes et de leur constituant même très concentrés ; • la capture de micro-organismes faiblement concentrés et compris dans une forte concentration de biomasse totale ; • la préparation d'un échantillon liquide avec une forte concentration des micro-organismes rendant le procédé incorporable dans des dispositifs types laboratoires sur puce ; • la capture et la concentration en continu de l'échantillon liquide, qui peut être l'échantillon entier ou bien une fraction modifiée ou non de l'échantillon entier ; • la possibilité de purifier les micro-organismes capturés ; • la possibilité d'éluer et de régénérer les surfaces actives permettant de traiter de grands volumes d'échantillons (par fractions modifiées ou non) ; • la possibilité de lyser les micro-organismes en présence de la surface active ; l0 • la capture et la purification des acides nucléiques ; • la possibilité d'élution différentielle de l'ADN et de l'ARN ; • la forte concentration des acides nucléiques ; • la mise en oeuvre du procédé en un temps court, de l'ordre de 15 à 20 minutes. L'invention est maintenant décrite plus en détail en lien avec les 15 figures suivantes : La figure 1 présente un organigramme général détaillant les différentes étapes du procédé selon la présente invention, il s'agit du procédé mis en oeuvre dans l'exemple 1. La figure 2 détaille les performances de capture et de régénération 20 des surfaces actives selon l'invention. La figure 3 montre la capacité en terme de rendement de purification des échantillons d'ADN ou d'ARN selon la nature des surfaces utilisées, référence faite à un procédé commercial. La figure 4 montre la détection des micro-organismes modèles 25 utilisés après capture. Exemple 1 û Procédé de préparation d'acides nucléiques 1. Matériels et méthodes Le procédé selon l'invention a été testé lors de la préparation d'acides nucléiques à partir de micro-organismes modèles, ici Escherischia col/ et 30 Bacillus subtilis pour les formes bactériennes végétatives, Bacillus subtilis pour les formes bactériennes sporulées, Adénovirus humain de type 2 (groupe C) pour les virus, Cryptosporidium parvum pour les protozoaires, et à l'aide de surface active revêtue de polyéthylène imine (PEI) pour la capture û concentration et purification des micro-organismes, et possiblement des acides nucléiques, et de silanol pour les 35 acides nucléiques.

Le protocole expérimental est décrit de façon générique pour l'ensemble des microorganismes testés. 1-A. Protocole de l'étape (A) Un échantillon liquide de 10 millilitres est préalablement collecté, il peut être l'échantillon entier, modifié, par exemple par un traitement tel qu'une ultrafiltration ou non, ou bien une fraction de l'échantillon total, modifié par exemple par un traitement tel qu'une ultrafiltration ou non. Cet échantillon est mis en contact avec une surface active de polyéthylène imine (PEI), ici 9,2 m2/litre d'échantillon, et supportée par des billes super paramagnétiques d'un micromètre de diamètre (Chemicell). La mise en contact est réalisée pendant 10 minutes sous agitation à l'aide d'un vortex, afin de maintenir les billes bien dispersées, et à température ambiante. Les billes sont collectées à l'aide d'un aimant jusqu'à clarification de l'échantillon puis la phase liquide est éliminée. 1-B. Protocole de l'étape (B) Selon l'étape (B), les billes, contenant à leur surface les micro-organismes, sont soumises à une étape de lyse pour permettre l'ouverture desdits micro-organismes et la libération des acides nucléiques. Selon une variante, les micro-organismes adsorbés aux billes sont 20 purifiés par 500p1 d'une solution de NaCI à 0,5M, de Tris-HCI à 10 mM, d'éthanol à 15% (v/v), pH 8,0, avant d'être lysé (Al). Selon une variante, les micro-organismes purifiés sont élués par une solution de NaOH à 100 mM à température ambiante pendant 2 minutes, puis séparés de la surface active (ici supportée par les billes) pour être conservés (A2). 25 Enfin, selon une variante, après élution des micro-organismes, la surface active peut-être régénérée par addition de NaOH à 100 mM puis d'eau déionisée, et retourner vers l'étape de capture initiale (A3). 1-B.1. Lyse en conditions low sait La lyse des micro-organismes est réalisée en présence de la surface 30 active supportée par les billes, contenue dans 200 pl d'une solution de Tris-HCI à 50 mM, de NaCI à 50 mM, d'EDTA à 5 mM M, pH 7,5 dite low sait . 1-B.2. Lyse en conditions high sait Selon une variante, les billes peuvent être contenues dans 200 pl d'une solution de NaCI 4M, de Tris-HCI à 50 mM, d'EDTA à 5 mM, de sarcosyl à 35 0,1%, pH 8,5 dite high sait . La lyse est réalisée par ultrasonication.

Selon une autre variante, la lyse est réalisée par deux digestions enzymatiques successives (avec le lysozyme et la protéinase K), telles que décrites ci-dessus. 1-C. Protocole de l'étape (C) 1-C.1. Conditions low sait Dans le cas d'une lyse réalisée dans des conditions low sait , les billes qui ont adsorbé les acides nucléiques sont collectées et la phase aqueuse éliminée. Les acides nucléiques adsorbés au PEI sont purifiés par une solution de NaCl à 0,5M, de Tris-HCI à 10 mM, d'éthanol à 15% (v/v), pH 8,0 selon l'étape (Cl).

Les billes sont collectées et la solution de purification évacuée. Les acides nucléiques sont alors élués en incubant les billes PEI dans 100p1 d'une solution de NaOH 100 mM à température ambiante pendant 10 secondes. Les billes sont collectées, les acides nucléiques récupérés et la solution de NaOH à 100 mM neutralisée par ajout de 100 pl d'une solution de HCI à 100 mM selon l'étape (C2).

Les acides nucléiques en solution sont alors mis en contact avec la surface active, ici 1,18 m2/1 d'échantillon, pendant 30 secondes sous agitation à température ambiante, selon (D). Les billes sont collectées et la phase aqueuse éliminée. Une étape de purification selon (E) est réalisée par incubation des billes dans une solution de NaCI 0,5M, de Tris-HCI à 10 mM, d'éthanol à 15% (v/v), pH 8,0. Enfin une étape d'élution est réalisée avec 2 à 10 pl d'une solution de NaOH à 100 mM à température ambiante pendant 10 secondes. Les billes sont collectées, le surnageant récupéré et neutralisé par ajout du même volume de HCI à 100 mM, selon l'étape (F) Selon une variante, les acides nucléiques élués des billes PEI à l'issue de l'étape de lyse et neutralisé peuvent être mélangé à 5 volumes de solution de Guanidine HCI à 3M, de Tris-HCI à 20 mM, d'éthanol à 80% (v/v) pH 4,5. Des billes d'un micromètre de diamètre développant une surface active de silanol de 9,2 m2/1 d'échantillon sont alors ajoutées selon (D). Les billes sont collectées, la phase aqueuse éliminée. Les acides nucléiques adsorbés sont purifiés deux fois par ajout de 500 pl d'une solution de NaCl à 2 mM, de Tris-HCI à 10 mM, d'éthanol à 75% (v/v), selon (E). Les billes sont collectées, la phase aqueuse éliminée. Les acides nucléiques sont alors élués dans 5 à 10 pl de Tris-HCI à 10 mM, pH 8,0 sous agitation et à 60°C, conformément à l'étape (F). 1-C.2. Conditions high sait Dans le cas d'une lyse réalisée dans des conditions high sait , l'expérimentateur collecte les billes qui ont adsorbé les acides nucléiques et récupère la phase aqueuse qu'il mélange à 5 volumes de solution de Guanidine HCI à 3M, de Tris-HCI à 20 mM, d'éthanol à 80% (v/v) pH 4,5. Des billes d'un micromètre de diamètre développant une surface active de silanol de 0,92 m2/1 d'échantillon sont alors ajoutées selon (D). Les billes sont collectées, la phase aqueuse éliminée. Les acides nucléiques adsorbés sont purifiés deux fois par ajout de 500 pl d'une solution de NaCI à 2 mM, de Tris-HCI à 10 mM, d'éthanol à 75% (v/v), conformément à l'étape (E). Les billes sont collectées, la phase aqueuse éliminée. Les acides nucléiques sont alors élués dans 5 à 10 pl de Tris-HCI à 10 mM, pH 8,0 sous agitation et à 60°C, conformément au principe de concentration dans un tout petit volume de l'étape (F). 2. Résultats Les variantes décrites ci-dessus ont chacune été validées indépendamment. 2-A. Capture et l'élution des micro-organismes modèles Le Tableau III regroupe les résultats d'élution des micro-organismes modèles (B. s pour Bacillus subtilis, E. c pour Escherichia coli, Cp pour Cryptosporidium parvum et Ad2 pour Adenovirus humain de type 2). Solutions utilisées Log10 reduction (Conditions) B. s E. c Cp Ad2 PBS < 0,05 < 0,05 < 0,05 H2O (di) < 0,05 0,18 < 0,05 PBS, SDS 0,1 % PBS, SDS 0,5 % < 0,05 0,27 < 0,05 PBS, SDS 1 % < 0,05 0,52 0,21 NaCl 1M, pH9 < 0,05 3,16 3 NaCl 2M, pH9 0,31 0,2 0,15 NaCI 3M, pH9 < 0,05 0,17 < 0,05 NaCl 4M, pH9 < 0,05 0,22 0,05 NaOH 50 mM > 2 1,04 0,84 NaOH 100 mM > 3 > 2 > 2 NaOH 200 mM > 3 > 2 >2 NaOH 100 mM, SDS 0,01% à 1% > 3 >2 >2 Tableau III Ce Tableau III montre que les conditions PBS et H2O ne permettent 20 pas l'élution des espèces préalablement adsorbées à la surface active.

La condition la plus favorable à l'élution est une incubation dans une solution de NaOH à 100 mM, réalisée ici par incubation des surfaces actives pendant 2 minutes à température ambiante (25°C) et sous agitation (650 rpm). 2-B. Réutilisation des billes La capacité de capture après purification, élution des micro-organismes et régénération de la surface active (polyéthylène imine (PEI) à 9,2 m2/litre d'échantillon, supportée par des billes super paramagnétiques de 1 m de diamètre (Chemicell)) a été évaluée après 10 cycles du procédé comprenant les étapes purification / élution / régénération, le graphe de cette expérience est représenté à la Figure 2. Ce graphe montre, sur 3 échantillons distincts, que la capture de N éléments microbiens est parfaitement possible par la capture de N/10 éléments microbiens répétée 10 fois. Cet essai confirme qu'un dispositif adapté à la mise en oeuvre du procédé selon l'invention peut être réutilisé après régénération de la surface active. 2-C. Lyse enzymatique et physique en présence des surfaces actives Les essais mis en oeuvre montrent également que la lyse des microorganismes n'affecte pas la fonctionnalité des surfaces actives. 2-D. Adsorption d'ADN et d'ARN Le résultat obtenu au point suivant démontre implicitement la capacité cle la surface active à capturer convenablement l'ADN et l'ARN. 2-E. Purification et l'élution d'ADN et d'ARN sur surface active (Silanol ou PEI) Les acides nucléiques (AN) ont été préparés selon deux variantes de préparation d'échantillon : en utilisant le PEI seulement ou le PEI + silanol. Les AN élués à l'issu de chacune des deux variantes ont été purifiés une nouvelle fois sur colonne Qiagen () dédiée soit à la purification d'ADN, soit d'ARN sur colonne de silice. La quantité d'ARN ou d'ADN a été mesurée par spectrophotométrie et le rendemert calculé par rapport à la référence. Le graphe de la Figure 3 montre que la méthode de préparation d'échantillon décrite ici permet une bonne purification des AN. 2-F. Evaluation du procédé complet Enfin le procédé complet a été validé en conditions artificielles et réelles par la détection des micro-organismes modèles dans différents échantillons réels. Le graphe de la Figure 4 montre la détection des acides nucléiques des microorganismes modèles par PCR. A chaque cycle d'amplification, le nombre de copie initial est doublé. L'augmentation du nombre de copies est suivie en temps réel par la mesure de l'augmentation spécifique de fluorescence libérée au cours de la réaction. Le Ct est directement proportionnel à la concentration de cibles dans le milieu réactionnel d'amplification et correspond au premier cycle de la phase linéaire de l'amplification. Il est déterminé automatiquement par le logiciel associé au thermocycleur (Stratagene).

Exemple 2 - Dispositif mettant en oeuvre le procédé décrit Principe de l'essai Le procédé décrit a été optimisé avec des billes magnétiques comme support des surfaces actives dédiées à la capture des micro-organismes puis des acides nucléiques. Il a été validé sur des micro-organismes modèles reconnus : bactéries gram négatif et gram positif, bactéries sporulées, virus et protozoaires. Il a été validé sur différents types d'échantillons liquides : eaux industrielles, prélèvements aériens (4 m3) contenant différents polluants types poussière, cheveux, et des prélèvements cervicaux humains, auxquels une forte contamination bactérienne réalisée artificiellement.

Dispositif Le dispositif comprend : - une pompe péristaltique pour permettre le déplacement de l'échantillon et de l'ensemble des réactifs liquides ; - un aimant, qui permet la collecte des billes magnétiques ; - un dispositif à ultrasons chauffant, qui permet la remise en suspension des billes collectées par l'aimant et l'ouverture des micro-organismes ; - des zones de traitements de ségrégation des billes ; - un ordinateur, qui permet le pilotage des étapes.

Protocole Le procédé a été réalisé conformément au procédé décrit dans l'exemple 1 selon l'ensemble des variantes qui y sont explicitées.5

Claims

REVENDICATIONS1. Procédé de traitement d'un échantillon liquide en vue d'une analyse des acides nucléiques des micro-organismes susceptibles d'être contenus dans ledit échantillon, caractérisé en ce qu'il comprend au moins les étapes suivantes (A) la capture des microorganismes contenus dans ledit échantillon liquide par adsorption desdits micro-organismes sur une première surface active échangeuse d'anions et/ou de cations ; et (B) la lyse desdits microorganismes in situ.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite première surface active est choisie parmi le groupe constitué par les résines présentant des groupements choisis parmi les groupements aminés quaternaires, les groupements aminés tertiaires, les groupements aminés secondaires, les groupements aminés primaires, les groupements sulfoniques, les groupements phosphores, les groupements carboxyméthyle ou carboxylique ; et les résines hydroxylapatite, Di-Ethyl-Amino-Ethyl (DEAE), poly-Lysine et Poly-Ethylène Imine (PEI).
3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que ladite première surface est sur un support choisi parmi la silice et le polycarbonate.
4. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la lyse de l'étape (B) est réalisée par sonication, abrasion par des billes de verre, digestion enzymatique, choc thermique, choc osmotique, irradiation lumineuse, électroporation et/ou action de micro-ondes.
5. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend en outre une étape (Al) de purification des microorganismes par un lavage de ladite première surface mise en oeuvre préalablement à l'étape (B).
6. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend, préalablement à l'étape (B), une étape (A2) 30 d'élution desdits microorganismes.
7. Procédé selon la revendication précédente, caractérisé en ce qu'il comprend après l'étape (A2) une étape (A3) de régénération de ladite première surface active.
8. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend après l'étape (B) une étape (C), d'adsorption desdits acides nucléiques sur une seconde surface active anionique.
9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que ladite 5 seconde surface active est la même que celle utilisée à l'étape (A).
10. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que ladite seconde surface est différente de celle utilisée à l'étape (A) et est choisie parmi les surfaces échangeuses d'anions fortes contenant des chaînes carbonées de C, à ois, de la silice. 10
11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 8 à 10, caractérisé en ce qu'il comporte, après l'étape (C), une étape (Cl) de purification des acides nucléiques adsorbés par lavage avec une solution à base de sels.
12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 8 à 11, caractérisé en ce qu'il comprend, après les étapes (C) ou (Cl), une étape (C2) 15 d'élution clesdits acides nucléiques par modification de la charge de ladite seconde surface active.
13. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce qu'il comprend, à la suite de l'étape (C2), les étapes additionnelles suivantes : l'étape (D) de capture des acides nucléiques sur une surface choisie parmi la PEI ou le silanol et 20 l'étape (E) de purification desdits acides nucléiques et l'étape (F) de concentration desdits acides nucléiques par élimination des liquides et élution desdits acides nucléiques.
14. Dispositif intégré de traitement d'échantillon liquide susceptible de contenir des microorganismes, caractérisé en ce qu'il contient au moins une 25 surface échangeuse d'ions choisie dans le groupe constitué par les résines présentant des groupements choisis parmi les groupements aminés quaternaires, les groupements aminés tertiaires, les groupements aminés secondaires, les groupements aminés primaires, les groupements sulfoniques, les groupements phosphores, les groupements carboxyméthyle ou carboxylique ; et les résines 30 hydroxylapatite, Di-Ethyl-Amino-Ethyl (DEAE), poly-Lysine et Poly-Ethyléne Imine (PEI) ;.disposée dans une chambre telle que la surface par unité de volume est comprise entre 1 et 200 m2/l.