CN111304289B - 一种dna模板制备液及dna模板制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种DNA模板制备液，包括以下成分：单价阳离子盐、乙醇，溶剂为水；其中所述单价阳离子的终浓度为0.1‑0.8M，所述乙醇的终浓度为0.5‑30％；还公开了一种DNA模板的制备方法，包括以下步骤：(1)将抗凝血液和DNA模板制备液以体积比1:1‑200混合；(2)将步骤(1)得到的混合液直接离心或静置5min后离心，上清液即为DNA模板。本发明即用型的DNA模板制备液，制备液中无需蛋白酶或其他的高价盐离子，且获取过程简单，无需加热处理、时间短；本发明的DNA模板制备液与血液的比例要求不严格，在宽的范围内制备DNA模板均可很好地用于PCR扩增。
Description
技术领域
本发明涉及DNA提取，具体涉及一种DNA模板制备液及DNA模板制备方法。
背景技术
利用血细胞DNA进行PCR检测有十分广泛的应用前景，如进行性别鉴定、遗传疾病诊断、遗传多态性分析等。目前获取适于PCR扩增的血液基因组DNA模板的方法大致有以下三类：第一类是提取纯品基因组DNA，具体获取方法包括经典的酚氯仿抽提法、离心柱法等，操作过程繁琐，即使使用改进后的离心柱法，在面对大样本量时，消化、过柱、洗涤、离心，整套程序走下来也要耗费大量的人力物力财力；第二类是相对简省的方法，即利用血细胞DNA粗提液作为PCR扩增的模板，目前很多试剂公司开发的PCR裂解液、预处理液多属此种类型，其原理大多是通过添加蛋白酶K或一定浓度温和去污剂，裂解细胞并释放基因组DNA，这种方法大多要求一定时长的热处理以满足酶活要求，同时为避免血液中PCR抑制成份对PCR扩增的影响，一般对样品处理量有严格要求；第三类是血液、血细胞直接作为粗制模板进行PCR，为防止抑制成份的影响又分两种不同思路，一是大量稀释血液以减少干扰，二是通过添加PCR增强剂减少干扰。稀释血液的方法看似简单直接，但由于稀释比例要求及操作问题实际应用价值不大，大部分试剂公司开发的血液直接PCR试剂盒均采用添加PCR增强剂的方法，如添加一定浓度BSA、明胶或gp32等，可一定程度起到缓解血红素抑制的效果，但这种方法成本高添加血液量也有要求。
发明内容
发明目的：为了解决现有的DNA模板制备液成分复杂、提取程序繁琐或提取要求高的问题，本发明第一方面提供了一种DNA模板制备液，本发明第二方面提供了一种DNA模板的制备方法；本发明的制备液尤其适用于动物血液，如各种禽类及哺乳动物的肝素钠抗凝血液。
技术方案：本发明第一方面提供一种DNA模板制备液，包括以下成分：单价阳离子盐、乙醇，溶剂为水；其中所述单价阳离子的终浓度为0.1-0.8M，所述乙醇的体积浓度浓度为0.5-30％。
其中，单价阳离子盐作为DNA和蛋白解离剂，用于使细胞核内DNA与核蛋白分离；乙醇作为细胞破膜试剂，用于溶解细胞膜脂质双分子层使核内物质从核膜及细胞膜内施放出来，同时乙醇又是蛋白沉淀剂，可使血红素等PCR抑制成分大部分沉淀下去，减少对PCR的影响。
优选地，所述单价阳离子的终浓度为0.2-0.6M，所述乙醇的体积浓度为10-20％。
最优选地，所述单价阳离子的浓度为0.5M，所述乙醇的体积浓度为15％。
优选地，所述单价阳离子盐为钠盐、钾盐和铵盐中的任意一种或几种的组合。更优选地，所述单价阳离子盐为钠盐。
优选地，所述DNA模板制备液还包括聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、曲拉通(Triton X-100)、吐温和乙基苯基聚乙二醇(NP-40)中的任意一种或几种。上述非离子去污剂在本专利中所起的作用相似，因其同时具有亲水和疏水基团，可与油脂或蛋白结合在水中形成微囊而被洗脱。所述聚乙烯吡咯烷酮的终浓度为0.5-20g/L，所述曲拉通的体积浓度为0.1-2％，所述吐温的体积浓度为0.1-2％，所述乙基苯基聚乙二醇的体积浓度为0.1-2％。
更优选地，所述DNA模板制备液包括以下成分：NaCl、乙醇、聚乙烯吡咯烷酮，溶剂为水；其中所述NaCl的终浓度为0.4-0.6M，所述乙醇的体积浓度为10-20％，所述聚乙烯吡咯烷酮的终浓度为5-10g/L。
最优选地，所述DNA模板制备液包括以下成分：NaCl、乙醇、聚乙烯吡咯烷酮，溶剂为水；其中所述NaCl的终浓度为0.5M，所述乙醇的体积浓度为15％，所述聚乙烯吡咯烷酮的终浓度为5g/L。
本发明第二方面提供一种DNA模板的制备方法，包括以下步骤：
(1)将抗凝血液和上述的DNA模板制备液以体积比1:1-200混合；
(2)将步骤(1)得到的混合液直接离心或静置3-5min后离心，上清液即为DNA模板。
步骤(1)中，所述抗凝血液为禽类动物的抗凝血液或哺乳动物的抗凝血液。优选地，所述禽类动物的抗凝血液为鸽或鸡的抗凝血液，所述哺乳动物的抗凝血液为猪或牛的抗凝血液。优选抗凝血液和DNA模板制备液的体积比为1:1-100，所述抗凝血液为肝素钠抗凝血液。
当步骤(1)中所述抗凝血液为禽类动物的抗凝血液时，步骤(2)中将混合液室温下直接离心1min，得到DNA模板；当步骤(1)中所述抗凝血液为哺乳动物的抗凝血液时，步骤(2)中将混合液静置3-5min，然后离心1min。
优选地，使用的离心机为迷你型桌面离心机(LX-900迷你离心机)。
有益效果：(1)本发明开发了一种即用型的DNA模板制备液，制备液中无需蛋白酶或其他的高价盐离子，仅需一定浓度的乙醇和单价阳离子可即时获取PCR用的DNA模板，且获取过程简单，无需加热处理、时间短；(2)本发明的DNA模板制备液与血液的比例要求不严格，在宽的范围内(肝素钠抗凝血液：DNA模板制备液为1:1-100)制备DNA模板均可很好地用于PCR扩增，达到均质化模板效果；(3)本发明的DNA模板制备液适用于和各种禽类动物或哺乳动物的抗凝血液混合提取DNA模板。
附图说明
图1为不同PVP浓度对PCR模板生成质量的影响；
图2为鸽性别鉴定结果；
图3为猪氟烷基因扩增；
图4为哺乳动物通用引物扩增牛血样本；
图5为鸡性别鉴定；
图6为即用型模板制备液不同贮存时间对PCR结果的影响。
具体实施方式
实施例1
设6管PCR反应管，每管取100μL即用型模板制备液，6管即用型模板制备液的区别是，1号管即用型模板制备液只含0.5M NaCl和15％(v/v)乙醇，溶剂为水；2-6号管即用型模板制备液除含0.5M NaCl和15％(v/v)乙醇外，还分别含有1-5g/L的PVP，溶剂为水。每管中均添加10μL公鸡肝素钠抗凝血，用移液枪吹吸一次后，LX-900迷你离心机离心1min，上清即可作为PCR扩增DNA模板。PCR反应体系(50μL)见表1，引物CHDF的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，引物CHDR的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
表1 PCR反应体系
PCR反应条件如下：①94℃、5min；②94℃、30s；50℃、30s，72℃、30s，35个循环；③72℃、5min。PCR产物1％琼脂糖电泳，EB染色，凝胶成像系统条带分型，见图1。M为DNA分子量标准DL2000，1-6分别表示利用1-6号管模板PCR后的结果。试验结果表明，当1号管的模板制备液仅含有0.5M NaCl和15％(v/v)乙醇时，可以生成清晰的PCR模板，在5g/LPVP浓度下，PCR模板生成质量最佳。
实施例2制备DNA模板制备液
配制DNA模板制备液，包括以下组分：NaCl、乙醇、PVP，溶剂为水；其中NaCl终浓度为0.5M，乙醇体积浓度为15％，PVP终浓度为5g/L。
实施例3即用型模板制备液用于鸽快速性别鉴定
每羽鸽取10μL肝素钠抗凝血，分别混入实施例2制备得到的100μL即用型模板制备液中，用移液枪吹吸一次后，LX-900迷你离心机离心1min，上清即可作为PCR扩增DNA模板。PCR反应体系(50μL)见表2，引物1的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，引物2的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
表2 PCR反应体系
PCR反应条件如下：①94℃、5min；②94℃、30s；50℃、30s，72℃、30s，35个循环；③72℃、5min。PCR产物经1％琼脂糖电泳，EB染色，凝胶成像系统条带分型，见图2。M为DNA分子量标准DL2000，-为阴性对照，雌性为两条带(1、3、4、5号鸽)，雄性为一条带(2号鸽)。
实施例4即用型模板制备液用于猪氟烷基因扩增
每管取10μL肝素钠抗凝猪血，分别混入实施例2制备得到的100μL即用型模板制备液中，用移液枪吹吸一次混匀后，静置5min，LX-900迷你离心机离心1min，上清即可作为PCR扩增DNA模板。PCR反应体系(50μL)见表3，引物3的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，引物4的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。
表3 PCR反应体系
PCR反应条件如下：①94℃、5min；②94℃、30s；50℃、30s，72℃、30s，35个循环；③72℃、5min。PCR产物经1％琼脂糖电泳，EB染色，凝胶成像系统条带分型，见图3。M为DNA分子量标准DL2000，平行样本(1-5)均扩增出一条452bp的条带，与设计预期一致。
实施例5即用型模板制备液用于牛哺乳动物通用引物扩增
每管取10μL肝素钠抗凝牛血，分别混入实施例2制备得到的100μL即用型模板制备液中，用移液枪吹吸一次混匀后，静置5min，LX-900迷你离心机离心1min，上清即可作为PCR扩增DNA模板。PCR反应体系(50μL)见表4，引物L14724的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示，引物H15149的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示。
表4 PCR反应体系
PCR反应条件如下：①94℃、5min；②94℃、30s；50℃、30s，72℃、30s，35个循环；③72℃、5min。PCR产物1％琼脂糖电泳，EB染色，凝胶成像系统条带分型，见图4。M为DNA分子量标准DL2000，平行样本(1-5)均扩增出一条清晰条带，与设计预期一致。
实施例6即用型模板制备液用于鸡快速性别鉴定
每只鸡取10μL肝素钠抗凝血，分别混入实施例2制备得到的100μL即用型模板制备液中，用移液枪吹吸一次后，LX-900迷你离心机离心1min，上清即可作为PCR扩增DNA模板。PCR反应体系(50μL)见表5，引物CHDF的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，引物CHDR的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
表5 PCR反应体系
PCR反应条件如下：①94℃、5min；②94℃、30s；50℃、30s，72℃、30s，35个循环；③72℃、5min。PCR产物1％琼脂糖电泳，EB染色，凝胶成像系统条带分型，见图5。M为DNA分子量标准DL2000，雌性为两条带(1-6号样)，雄性为一条带(7号样)。
实施例7即用型模板制备液不同贮存时间对PCR结果的影响
取10μL母鸡肝素钠抗凝血，混入实施例2制备得到的100μL即用型模板制备液，用移液枪吹吸一次后，LX-900迷你离心机离心1min，上清即可作为PCR扩增DNA模板，置4℃冰箱保存备用(0天)。于1天、3天、5天、7天时，分别取上清PCR扩增DNA模板1μL进行PCR扩增。PCR反应体系(50μL)见表5，反应条件如下：①94℃、5min；②94℃、30s；50℃、30s，72℃、30s，35个循环；③72℃、5min。PCR产物分别进行1％琼脂糖电泳，EB染色，凝胶成像系统条带分型，见图6。M为DNA分子量标准DL2000，泳道1为母鸡样，day1-7代表即用型模板分别4℃贮存1-7天后PCR的结果，说明即用型模板至少4℃贮存一周，没有出现明显降解以影响PCR结果。
实施例8
配制DNA模板制备液，包括以下组分：NaCl、乙醇、曲拉通，溶剂为水；其中NaCl终浓度为0.5M，乙醇体积浓度为15％，曲拉通体积浓度为1％，然后将配制的DNA模板制备液用于鸽快速性别测定。
实施例9
配制DNA模板制备液，包括以下组分：NaCl、乙醇、吐温，溶剂为水；其中NaCl终浓度为0.5M，乙醇体积浓度为15％，吐温体积浓度为1％，然后将配制的DNA模板制备液用于鸽快速性别测定。
实施例10
配制DNA模板制备液，包括以下组分：NaCl、乙醇、NP-40，溶剂为水；其中NaCl终浓度为0.5M，乙醇体积浓度为15％，NP-40体积浓度为1％，然后将配制的DNA模板制备液用于鸽快速性别测定。
实施例11
配制DNA模板制备液，包括以下组分：NaCl、乙醇、PVP，溶剂为水；其中NaCl终浓度为0.5M，乙醇体积浓度为15％，PVP终浓度为5g/L，将配制的DNA模板制备液用于鸽快速性别鉴定，其中模板制备液为100μL，鸽的肝素钠抗凝血100μL。
实施例12
配制DNA模板制备液，包括以下组分：NaCl、乙醇、PVP，溶剂为水；其中NaCl终浓度为0.5M，乙醇体积浓度为15％，PVP终浓度为5g/L，将配制的DNA模板制备液用于鸽快速性别鉴定，其中模板制备液为1000μL，鸽的肝素钠抗凝血10μL。
序列表
<110> 金陵科技学院
<120> 一种DNA模板制备液及DNA模板制备方法
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tgcagaagca atattacaag t 21
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aattcattat catctggtgg 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
agaacgtggc aacagagtac 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ctcagaatga tatttgtcct ca 22
Claims (3)
1.一种DNA模板制备液，其特征在于，由以下成分组成：单价阳离子盐、乙醇、聚乙烯吡咯烷酮和水；其中，所述单价阳离子盐为NaCl，所述单价阳离子的终浓度为0.5 M，所述乙醇的体积浓度为15%，所述聚乙烯吡咯烷酮的终浓度为5 g/L。
2.一种DNA模板的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将抗凝血液和权利要求1所述的DNA模板制备液以体积比1:10-200混合；
（2）将步骤（1）得到的混合液直接离心或静置3-5 min后离心，上清液即为DNA模板；
步骤（1）中所述抗凝血液为禽类动物的抗凝血液或哺乳动物的抗凝血液；
当步骤（1）中所述抗凝血液为禽类动物的抗凝血液时，步骤（2）中将混合液直接离心，得到DNA模板；当步骤（1）中所述抗凝血液为哺乳动物的抗凝血液时，步骤（2）中将混合液静置3-5 min后离心。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述禽类动物的抗凝血液为鸽或鸡的抗凝血液，所述哺乳动物的抗凝血液为猪或牛的抗凝血液。
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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