EP2318539A2 - Procede de purification des acides nucleiques de microorganismes presents dans des echantillons liquides - Google Patents

Procede de purification des acides nucleiques de microorganismes presents dans des echantillons liquides

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Publication number
EP2318539A2
EP2318539A2 EP09784273A EP09784273A EP2318539A2 EP 2318539 A2 EP2318539 A2 EP 2318539A2 EP 09784273 A EP09784273 A EP 09784273A EP 09784273 A EP09784273 A EP 09784273A EP 2318539 A2 EP2318539 A2 EP 2318539A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
microorganisms
nucleic acids
active surface
sample
capture
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP09784273A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Stéphane COUPE
Dorothée JARY
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA
Original Assignee
Commissariat a lEnergie Atomique CEA
Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Commissariat a lEnergie Atomique CEA, Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA filed Critical Commissariat a lEnergie Atomique CEA
Publication of EP2318539A2 publication Critical patent/EP2318539A2/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor

Definitions

  • the invention relates to the field of global detection of pathogenic microorganisms possibly poorly represented in the samples to be analyzed and whose impact on public health, whether human or animal, can be considerable.
  • the present invention more specifically relates to a method of treating liquid samples for the detection of possible pathogenic microorganisms in very small quantities. More specifically, this process consists of a generic step of capture and concentration of microorganisms, followed by in situ lysis of microorganisms and capture of the nucleic acids released during lysis. The implementation of this method makes it possible to obtain an extremely concentrated and purified nucleic acid solution. This method is further adapted for continuous processing of liquid samples.
  • the samples to be treated may be of complex biological and physicochemical composition.
  • the characteristics that make the analysis of the sample difficult lie mainly in the variability of total biomass, ionic strength, pH, the presence of colloids, small molecules of decomposition of organic matter, or artificial chemical substances. in said sample.
  • the samples to be analyzed contain a ubiquitous microbiological flora more or less concentrated, with no real impact on public health or the scientific studies carried out. This is for example the case of water samples (industrial, environmental) and conforms they may contain, these bacteria being pathogenic only at high concentrations; this is also valid for samples obtained from air, sludge or stool.
  • the search for microorganisms with little or no concentration in a sample may be necessary, for example in the case of the detection of pathogens likely to colonize drinking water circuits, industrial or environmental waters or air. This is most often viruses, bacteria, protozoa, amoebae, fungi, yeasts, algae, worms ... This detection is essential since these pathogens can then be responsible for serious diseases including cholera, legionella, typhoid , in which one can observe the following symptoms: diarrhea, dysentery, gastroenteritis.
  • microbiological monitoring makes it possible to initiate disinfection or treatment of water or industrial installations before discharge into the environment, and thus to comply with the regulatory microbiological standards.
  • the reference technique is based on identification and enumeration of microorganisms by culture on different selective media. This is a technique that takes a long time to implement, often hours and which can be biased by both commensal flora but also by the presence of microorganisms stunted or even viable but not culturable and yet pathogenic. In addition, this method may not take into account slow growing microorganisms.
  • Another technique allows rapid quantification of the total microbial population by measurement of enzymatic activity. This technique has the advantage of taking into account viable but non-culturable bacteria. On the other hand, it does not allow the specific identification of microorganisms.
  • the filters or pellets generated are respectively often saturated or compact, contain many molecules and particles that are difficult to characterize, and which are known to interfere strongly with biological methods of analysis, such as antigen-antibody interactions or gene amplifications. It is therefore often necessary to dilute the samples very strongly to avoid inhibitions of the detection reactions, and to avoid false negative results.
  • results obtained therefore correspond to instantaneous images of a state of contamination of a particular environment. They can not take into account the variability of contamination related to the environment.
  • Liu et al. describe a biochip for the detection of bacteria in which the following steps are performed: the immunomagnetic capture of the target bacteria; pre-concentration of bacteria and their purification; lysis of bacteria; PCR amplification of the nucleic acids obtained and detection based on electrochemical DNA chips (Liu et al Anal Chem (2004) 76, 1824-1831).
  • this device allows only a specific detection, targeting a particular bacterium.
  • Cheng et al. disclose a biochip for the detection of bacteria in blood samples having a fluid chamber in which a dielectrophoretic separation of bacterial cells and blood cells is performed; electronic lysis (by application of a series of electrical pulses) of the captured bacteria; digestion of proteins with proteinase K; and an analysis of RNA and DNA released with DNA chips.
  • the dielectrophoretic separation step allows the capture of only a small fraction of the bacteria thus limiting the applications of this device; in particular, it is not suitable for processing samples that may contain small amounts of microorganisms (Cheng et al., Nature Biotechnology (1998) 16, 541-546).
  • PEI polyethyleneimine
  • nucleic acid DNA and RNA
  • the advantages of the described method and device are: generic capture; a high degree of concentration of microorganisms and possibly nucleic acids; a high degree of purification of microorganisms and possibly nucleic acids; simple integration into automated systems. More specifically, the present invention relates to a method for treating a liquid sample for analysis of the nucleic acids of the microorganisms likely to be contained in said sample consisting of:
  • step (C) adsorbing the nucleic acids released in step (B) onto a second anion exchange active surface.
  • the lysis step (B) is carried out in situ while said microorganisms are adsorbed on said first active surface and / or said first active surface is anion exchange surface and said second active surface is the same as said first active surface.
  • 'Liquid sample means an industrial water withdrawal (eg from the cooling circuit), environmental water, or drinking water intended for human or animal consumption and, by extension, any sample in which the element or elements to be detected are in solution or in suspension.
  • This sample may itself have been obtained from a sample or other sample containing the elements of interest, for example a body fluid, a sample of air, obtained by physical and / or chemical treatment, and / or biological according to any method adaptable by the skilled person.
  • these are aqueous or high aqueous component samples.
  • the samples are preferably made under conditions of great cleanliness with sterile material.
  • the liquid samples are prepared according to techniques known to those skilled in the art (see in particular the publication of Stachowiak JC, Shugard EE, BP Mosier, Renzi RF, Caton PF Ferko SM, Van de Vreugde JL, Yee DD, Haroldsen BL, VanderBoot VA Autonomous microfluidic sample preparation system for protein profile-based detection of aerosolized bacterial cells and spores Anal Chem 2007 Aug. 1; 79 (15): 5763 -70).
  • the volume of the liquid samples is between 1 and 100 ml, preferably it is 10 ml.
  • the liquid sample is such:
  • Micro-organisms means enveloped or non-enveloped viruses, Gram-positive and negative vegetative bacteria, spore-forming bacteria, protozoa, microscopic fungi and yeasts, microplankton, pollens, animal cells and the plant cells that we want to capture, and / or concentrate, and / or purify, and / or detect.
  • active ion exchange surface is meant any ion exchange surfaces (anions or cations), more or less strong, allowing adsorption of microorganisms, or their constituents up to the molecular level.
  • the active surface is selected from strong ion exchange resins.
  • the active surface will be an anion exchange surface or anionic resin.
  • anion exchange surface or anionic resin is meant a surface carrying charged chemical functions whatever the pH conditions. This is for example the case of quaternary amines, all of whose bonds are engaged with radicals other than protons.
  • PEI polyethyleneimine
  • DEAE diethylaminoethyl
  • a strong anion exchange surface is all the stronger as the proportion of quaternary amine is important.
  • the anionic resins (anion exchange) can be classified according to Table I below.
  • Cationic resins (cation exchange) can be classified according to Table II below.
  • the anion or cation exchange surfaces may be fixed or mobile, arranged within a device for extraction and purification of nucleic acids of microorganisms, they are chosen from charged polymers whose branching with a carbon chain allows the reinforcement of the load; in particular, they are selected from the group consisting of resins having groups selected from quaternary amino groups, tertiary amine groups, secondary amine groups, primary amino groups, sulphonic groups, phosphorus groups, carboxymethyl groups or carboxylic acid; or the hydroxylapatite, Di-ethyl-amino-ethyl (DEAE), poly-lysine and poly-ethylene-lmine (PEI) resins.
  • DEAE Di-ethyl-amino-ethyl
  • PEI poly-ethylene-lmine
  • ion exchange surfaces in particular anions, described above allow the generic adsorption of microorganisms, and can be adapted to a very broad spectrum of applications.
  • the elimination of the liquid medium initially containing the microorganisms to be sought can be easily achieved without risking picking up microorganisms from the surface.
  • the elimination of the liquid medium allows the concentration of the microorganisms captured before lysis.
  • the volume of the sample can be reduced to a volume of between 1 and 10 ⁇ l.
  • ion exchange surfaces useful for carrying out the method of the invention resist the physical, chemical or enzymatic processes of opening microorganisms to release their nucleic acids.
  • these surfaces also allow the purification and concentration of the nucleic acids in a solvent compatible with the biological reactions, in very low volumes, from 1 to 10 ⁇ l.
  • anion or cation exchange surfaces advantageously rest on a support material enabling the active groups to be received vis-à-vis the process described, and whose integrity is not or very little altered by the opening treatments of the microorganisms.
  • a support material enabling the active groups to be received vis-à-vis the process described, and whose integrity is not or very little altered by the opening treatments of the microorganisms.
  • silica and polycarbonate By way of example and without limitation, mention may be made of silica and polycarbonate.
  • the surfaces and their support can be either mobile, as in the case of magnetic beads for example, or fixed, as in the case of a lab on a chip.
  • Lab-on-a-chip means any fluidic and / or microfluidic device comprising adequately sized, structured and functionalised sample passage zones (by surface modification or filling of functional reagents) completely or partially automated or not automated.
  • the active surface and its support are movable in the form of balls, they are added to the whole of the liquid sample and are distributed in such a way that they behave like a net, with the smallest mesh size distance between the balls.
  • the device must then be able to collect the beads to retain the captured elements (microorganisms, nucleic acids) and concentrate the sample.
  • the device When the medium is fixed, there is no risk of aggregation.
  • the device must, however, be sized and designed to allow effective capture of microorganisms for example by promoting the probabilities of meeting active surface - sample.
  • the sample is brought into contact with the active surfaces in fractions, at speeds depending on the flow rate applied to the device.
  • step (A) of capture of the microorganisms contained in a liquid sample is carried out on an active surface, ie anion exchange.
  • the active surface is an anion exchange surface selected from quaternary amino groups, tertiary amine groups, secondary amino groups, primary amino groups; or the resins hydroxylapatite, Di-Ethyl-Amino-Ethyl (DEAE), poly-Lysine and Poly-Ethylene Imine (PEI).
  • Step (A) can be carried out with an ion exchange surface such that:
  • the active surface per unit volume of liquid sample that may be contained in the chamber in which the capture of the microorganisms is carried out is between 1 and 200 m 2 / l of sample, preferably between 9 and 100 m 2 / l ; the distance between the active surface and the elements to be captured is of the order of 10 to 100 micrometers, preferably 10 micrometers;
  • the time for contacting the liquid sample with the active surface is of the order of 30 seconds to 10 minutes, preferably 10 minutes;
  • the contacting temperature is between 4 ° C. and 40 ° C., preferably 25 ° C. ⁇ 5 ° C.
  • an optional concentration step (A ') is advantageously carried out by the physical separation of the capture surface (fixed support or mobile support) and the liquid solvent.
  • the active surface is mobile carried by magnetic beads
  • the opening step (B) (lysis) of the microorganisms allowing the release of the nucleic acids is carried out directly on the microorganisms retained on the active surface; it can be carried out by any method known to those skilled in the art, in particular by sonication, abrasion by glass beads, enzymatic digestion, thermal shock, osmotic shock, light irradiation, electroporation, microwave action, etc. depending on the sample considered and the intended application following this step.
  • An advantage of this method is to perform the lysis in situ, ie while the microorganisms are adsorbed on the active surface. To omit a stage of elution of microorganisms is advantageous; in fact, the fewer stages of the process, the more fluid transfers, potential contamination factors and loss of material are avoided; in addition, this makes the process more easily automatable.
  • the step (B) of lyse microorganisms directly in the presence of the active surface can be achieved by different chemical and / or physical and / or biological and not altering, or very little, the structural properties and functional surfaces and / or their supports.
  • the lysis can be carried out by enzymatic digestion with lysozyme alone or with lysozyme and then proteinase K.
  • Preferential digestion with lysozyme followed by proteinase K will be preferable under the respective lysis conditions in a medium of composition: Tris-HCl at 50 mM, NaCl at 50 mM, EDTA at 5 mM, pH 7.5, for 10 minutes at room temperature, then in a medium of composition: Tris-HCl 10 mM, EDTA at 2 mM, pH 8.0 or 4M NaCl, 10 mM Tris-HCl, 2 mM EDTA, 0.1% sarcosyl, pH 9.0, for 15 minutes at 70 ° C.
  • step (B) is carried out by ultrasonication of the sample under optimum conditions as a function of the geometry of the chamber containing the sample and whether the support of the active surface is fixed or mobile.
  • the present process may comprise an additional step (A1), which is intercalated between step (A) and step (B), for purification of the microorganisms.
  • This purification step (A1) corresponds to a washing of the surface on which the microorganisms are fixed with a solution chosen so as not to disturb the attachment of the microorganisms to the exchange surface.
  • a salt solution may be employed, the characteristics of which are dependent on the active surface employed.
  • purification is generally meant the elimination of unnecessary or troublesome compounds which have attached to the active surfaces under the same conditions as the microorganisms or nucleic acids of interest released at course of step (B), but whose elution can be achieved by suitable solutions, without the risk of eluting, or at least very partially, said microorganisms and nucleic acids which remain adsorbed on the active surface.
  • the optional purification step (A1) may be carried out by incubating the active surface with a washing solution based on salts, preferably having the following composition: 0.8M NaCl, 10 mM Tris-HCl, 15% ethanol % (v / v), pH 8.
  • the process according to the invention also comprises a step (C), following step (B), of adsorption of the nucleic acids released by the lysis of said microorganisms.
  • the nucleic acids released are, during step (C), either immediately adsorbed on the first active surface that has allowed the capture of microorganisms, or adsorbed on a second electrostatic force anion exchange surface similar to that of step (A).
  • a second electrostatic force anion exchange surface similar to that of step (A).
  • the same first anion exchange surface is used as the first and second active surfaces.
  • a possible step (A2) of elution of the microorganisms of the first active surface can be carried out, following step (A) or step (A1) and preceding step (B), with a solution which promotes the separation of the microorganisms of the first active surface by competition with an ion of the same charge, or by chemical modification of the surface charge density of the balls and / or microorganisms.
  • Step (A2) can be carried out by incubating the active surface with a solution of 100 mM sodium hydroxide, containing or not detergents, optionally supplemented by physical methods such as heating, stirring with a vortex or ultrasound.
  • the microorganisms contained in the eluate may be isolated from the first active surface to undergo the lysis provided in step (B) or undergo lysis in the presence of the first active surface but without being adsorbed.
  • a possible step (A3), following step (A2), of regeneration of the first active surface can also be carried out with a solution of sodium hydroxide (NaOH) so as to continue with another capture cycle in accordance with step (A) for a predetermined number of cycles.
  • Regeneration of the active capture surface of the microorganisms can be carried out in the following conditions: incubation of the active surface with a solution of sodium chloride, preferably 100 mM, then its removal or incubation of the active surface with deionized water, and its removal.
  • step (C) of the process the adsorption of the nucleic acids is carried out on the same ion exchange surface as that used in step (A) (first active surface), which is a surface exchange surface. anion.
  • the adsorption is carried out on a second active surface, corresponding to an anion exchange surface useful for this nucleic acid adsorption step (C), a prelude to the purification and concentration of nucleic acids.
  • This second anionic active surface can contain groups bearing different lengths of carbon chains, C 1 -C 18 for example, but also of silica, DNA, RNA I 1 and synthetic analogue of nucleic acids such as PNA and LNA.
  • the second active surface is the same anion exchange surface as used in step (A).
  • the second surface used may rest on a support and said second active surface and its support may be fixed or movable.
  • the method may comprise an optional step (C1), following step (C), of washing purification of the adsorbed nucleic acids.
  • This step (C1) is carried out by adding a salt-based solution with preferably, but not necessarily, alcohol in well-defined concentrations, depending on the active surface; it allows the elimination of many chemical and biological contaminants, such as sugars, proteins, lipids, small RNAs, so that only the DNAs and most of the RNAs remain. sample.
  • a salt-based solution with preferably, but not necessarily, alcohol in well-defined concentrations, depending on the active surface; it allows the elimination of many chemical and biological contaminants, such as sugars, proteins, lipids, small RNAs, so that only the DNAs and most of the RNAs remain. sample.
  • the method according to the invention may also comprise a nucleic acid elution step (C2) following step (C) or step (C1).
  • this step (C2) can allow the separation of DNAs and RNAs.
  • the retained RNA can be selectively eluted with a saline solution of lower concentration than that required for DNA.
  • the elution is carried out by modifying the surface charge of the active surfaces, either by varying the pH and / or by varying the ion concentration. in ranges of concentrations compatible with biochemical and biological reactions, according to methods known to those skilled in the art.
  • the overall process for preparing nucleic acids on active anion exchange surfaces is particularly well suited to devices of the laboratory-on-a-chip type.
  • the surface capture makes it possible to envisage a very significant downscaling as soon as the first steps of the sample processing are carried out.
  • the sample of interest will ultimately be circumscribed to the capture surface, overall the microorganisms and / or DNA and / or RNA will ultimately be stored in a two-dimensional structure, that is to say surface, instead of being stored in solution in a three-dimensional reservoir.
  • the invention can be declined in several variants, in particular, subsequent steps of sample processing can be added.
  • the step (D) of capturing the nucleic acids on an active surface can be carried out under physicochemical conditions adapted to the type of active surfaces.
  • the active surface is incubated with a saline concentration solution of less than 0.8 M NaCl, preferentially less than
  • the method according to the invention can be further completed by a step (E) of purification of said nucleic acids.
  • This step (E) of purifying the nucleic acids is carried out by passing a washing solution via the incubation of the active surface with a solution based on salts, preferably of composition: 0.5M NaCl, tris-HCl 10 mM, 15% (v / v) ethanol, pH 8 for a PEI type surface or via incubation of the active surface with a salt-based solution, preferably of composition: 2 mM NaCl, 5 mM EDTA, 80% ethanol (y N), pH 7.0.
  • a washing solution via the incubation of the active surface with a solution based on salts, preferably of composition: 0.5M NaCl, tris-HCl 10 mM, 15% (v / v) ethanol, pH 8 for a PEI type surface or via incubation of the active surface with a salt-based solution, preferably of composition: 2 mM NaCl, 5 mM EDTA, 80% ethanol (y N), pH 7.0.
  • the method may further include a final concentration step (F) via a drying step of removing residual liquids followed by elution to a small volume of liquid.
  • step (F) elution of nucleic acids in small volume is carried out by a solution promoting the separation of nucleic acids from the active surface, according to the same principles as those described in (A2); with, preferably, the incubation of the active surface with a NaOH solution not exceeding 100 mM, preferably 50 mM, for 20 seconds at room temperature, for an active surface of the PEI type, or the incubation of the active surface with a 10 mM Tris-HCl solution at 60 ° C. for 2 minutes for a silanol surface.
  • the invention relates to a liquid sample treatment device capable of containing microorganisms, characterized in that it contains at least one ion exchange surface, preferably anion, such as as defined above arranged in a chamber such that the ratio of said active surface per unit volume of sample that can be contained in said chamber is between 1 and 200 m 2 / l, preferably between 9 and 100 m 2 / l.
  • the device comprises a laboratory on a chip consisting of moving balls supporting the active surfaces.
  • the optimal inter-ball distance for the microorganism capture step is about 10 ⁇ m. This distance is also optimal for the capture of nucleic acids.
  • the developed surfaces given per unit volume based on kinetic studies of capture of microorganisms Correspond well to the experimental data obtained.
  • the surface area per unit volume (S / V) ratio of the chamber through which the sample will pass is calculated with the value of the active area ion exchange present in the chamber and the value of the sample volume that may be contained in the chamber;
  • the volume of sample that may be contained in the capture chamber and - the flow rate of the sample.
  • Each input data influences the other two.
  • the volume of said chamber is 1 .mu.l
  • the surface of the two rectangles (20 mm x 5 mm) 200.10 "6 m 2
  • the SA / ratio is 200 m 2 / l, which is in the state very greater than the active surface developed by the 1 ⁇ m beads used in the description of the process which follows and can therefore bring even more efficiency to the process.
  • the active surface can be further increased by adding a structuring of the chamber, for example by pillars, or a parallelization of the fluidic circuits.
  • the adsorption rates should be very fast and therefore allow high flow rates.
  • Suitable dimensioning and structuring of the chambers containing the active surface in contact with the liquid sample must therefore make it possible to treat sample volumes with, at least, the same performances as those described in the examples presented below.
  • Figure 1 there is described a method of preparing nucleic acids according to the invention for microorganisms present in liquid samples.
  • the dashed arrows represent possible steps, or alternative possibilities of sample processing, the term "AN" means nucleic acids.
  • the path combinations shown in the figure are as many variants of possible sample preparations.
  • This invention finds application in very varied fields: - all the biological analyzes where the elements sought are very diluted and where the whole of the sample must be analyzed;
  • This sample preparation method described in the present invention offers several advantages: the simple and generic capture of microorganisms without distinction of sizes; capture of microorganisms and their constituents even at very low concentrations; the capture of microorganisms and their constituent even very concentrated; capture of poorly concentrated microorganisms in a high concentration of total biomass; the preparation of a liquid sample with a high concentration of microorganisms making the process incorporable in standard devices lab-on-a-chip; capturing and continuously concentrating the liquid sample, which may be the whole sample or a modified or unmodified fraction of the whole sample; the possibility of purifying captured microorganisms; the ability to elute and regenerate active surfaces to process large volumes of samples (modified fractions or not); • the possibility of lysing microorganisms in the presence of the active surface; "Capture and purification of nucleic acids;
  • FIG. 1 presents a general flowchart detailing the different steps of the method according to the present invention, it is the method implemented in example 1.
  • Figure 2 details the capture and regeneration performance of the active surfaces according to the invention.
  • Figure 3 shows the capacity in terms of purification yield of DNA or RNA samples according to the nature of the surfaces used, reference to a commercial process.
  • Figure 4 shows the detection of model microorganisms used after capture.
  • Example 1 Process for preparing nucleic acids 1. Materials and methods
  • the method according to the invention was tested during the preparation of nucleic acids from model microorganisms, here Escherischia coli and Bacillus subtilis for vegetative bacterial forms, Bacillus subtilis for sporulated bacterial forms, human adenovirus type 2 (group C) for viruses, Cryptospomoidium parvum for protozoa, and using polyethyleneimine coated (PEI) coated active surface for capture - concentration and purification of microorganisms, and possibly nucleic acids, and silanol for nucleic acids.
  • model microorganisms here Escherischia coli and Bacillus subtilis for vegetative bacterial forms
  • Bacillus subtilis for sporulated bacterial forms
  • human adenovirus type 2 (group C) for viruses
  • Cryptospomoidium parvum for protozoa
  • PEI polyethyleneimine coated
  • the experimental protocol is generically described for all the microorganisms tested.
  • a liquid sample of 10 milliliters is previously collected, it may be the whole sample, modified, for example by a treatment such as an ultrafiltration or not, or a fraction of the total sample, modified for example by a treatment such as whether ultrafiltration or not.
  • This sample is contacted with an active surface of polyethylene imine (PEI), here 9.2 rVVIitre sample, and supported by super paramagnetic beads of a micrometer diameter (Chemicell).
  • PEI polyethylene imine
  • the contacting is carried out for 10 minutes with stirring using a vortex, in order to keep the beads well dispersed, and at room temperature.
  • the beads are collected using a magnet until clarification of the sample and the liquid phase is eliminated.
  • step (B) the beads, containing on their surface the microorganisms, are subjected to a lysis step to allow the opening of said microorganisms and the release of nucleic acids.
  • microorganisms adsorbed to the beads are purified by 500 ⁇ l of a solution of NaCl 0.5M, Tris-HCl 10 m M 1 15% ethanol (v / v), pH 8, 0, before being lysed (A1).
  • the purified microorganisms are eluted with a solution of 100 mM NaOH at ambient temperature for 2 minutes and then separated from the active surface (here supported by the beads) to be stored (A2).
  • the active surface can be regenerated by addition of NaOH to 100 mM and then deionized water, and return to the initial capture step (A3).
  • Lyse under "low knows” conditions The lysis of the microorganisms is carried out in the presence of the active surface supported by the beads, contained in 200 ⁇ l of a solution of 50 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, EDTA at 5 mM M, pH 7.5 called "low knows”.
  • the beads may be contained in 200 ⁇ l of a solution of 4M NaCl, 50 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA, 0.1% sarcosyl, pH 8.5 called "high know. Lysis is performed by ultrasonication.
  • the lysis is performed by two successive enzymatic digestions (with lysozyme and proteinase K), as described above. 1 C. Protocol of step (C)
  • the beads that adsorbed the nucleic acids are collected and the aqueous phase removed.
  • the PEI-adsorbed nucleic acids are purified with 0.5M 1 NaCl solution of 10 mM Tris-HCl, 15% ethanol (v / v), pH 8.0 according to step (C1).
  • the beads are collected and the purification solution evacuated.
  • the nucleic acids are then eluted by incubating the PEI beads in 100 ⁇ l of a 100 mM NaOH solution at room temperature for 10 seconds.
  • the beads are collected, the nucleic acids recovered and the 100 mM NaOH solution neutralized by adding 100 ⁇ l of a 100 mM HCl solution according to step (C2).
  • the nucleic acids in solution are then brought into contact with the active surface, here 1, 18 m 2 / l of sample, for 30 seconds with stirring at room temperature, according to (D).
  • the beads are collected and the aqueous phase removed.
  • a purification step according to (E) is performed by incubation of the beads in a solution of 0.5M NaCl 1 Tris-HCl 10 mM, ethanol 15% (v / v), pH 8.0. Finally, an elution step is carried out with 2 to 10 ⁇ l of a solution of 100 mM NaOH at room temperature for 10 seconds.
  • the beads are collected, the supernatant recovered and neutralized by adding the same volume of HCl to 100 mM, according to step (F)
  • the nucleic acids eluted from the PEI beads at the end of the lysis stage and neutralized can be mixed with 5 volumes of solution.
  • Balls of one micrometer in diameter developing a silanol active surface area of 9.2 m 2 / l of sample are then added according to (D).
  • the beads are collected, the aqueous phase removed.
  • the adsorbed nucleic acids are purified twice by adding 500 ⁇ l of a 2 mM NaCl solution, 10 mM Tris-HCl, 75% (v / v) ethanol, according to (E).
  • the beads are collected, the aqueous phase removed.
  • the nucleic acids are then eluted in 5 to 10 ⁇ l of Tris-HCl at 10 mM, pH 8.0 with stirring and at 60 ° C., according to step (F).
  • 1-C.2. "High knows” conditions In the case of a lysis performed under "high knows” conditions, the experimenter collects the beads that adsorbed the nucleic acids and recovers the aqueous phase that he mixes with 5 volumes of Guanidine HCl solution. 3M, 20 mM Tris-HCl, 80% (v / v) ethanol pH 4.5. Balls of one micrometer in diameter developing a silanol active surface of 0.92 m 2 / l of sample are then added according to (D).
  • the beads are collected, the aqueous phase removed.
  • the adsorbed nucleic acids are purified twice by adding 500 ⁇ l of a 2 mM NaCl solution, 10 mM Tris-HCl, 75% (v / v) ethanol, according to step (E). ).
  • the beads are collected, the aqueous phase removed.
  • the nucleic acids are then eluted in 5 to 10 .mu.l of 10 mM Tris-HCl, pH 8.0 with stirring and at 60.degree. C., according to the principle of concentration in a very small volume of step (F).
  • Table III summarizes the elution results of model microorganisms ( ⁇ for Bacillus subtilis, E. c for Escherichia coli, Cp for Cryptospomoidium parvum and Ad2 for human Adenovirus type 2). Solutions used L-Og 10 reduction
  • the most favorable condition for elution is an incubation in a solution of 100 mM NaOH, performed here by incubating the active surfaces for 2 minutes at room temperature (25 ° C.) and with stirring (650 rpm).
  • This graph shows, on 3 separate samples, that the capture of N microbial elements is perfectly possible by the capture of N / 10 microbial elements repeated 10 times.
  • NAs Nucleic acids
  • the ANs eluted at the end of each of the two variants were purified once again on a Qiagen column dedicated to either the purification of DNA or of RNA on a silica column.
  • the amount of RNA or DNA was measured spectrophotometrically and the yield calculated relative to the reference.
  • the graph of Figure 3 shows that the sample preparation method described herein allows for good purification of nucleic acids (NAs), in particular by using the same ion exchange surface to capture both microorganisms and viruses. nucleic acids.
  • the graph of Figure 4 shows the detection of nucleic acids of model microorganisms by PCR.
  • the initial copy number is doubled.
  • the increase in the number of copies is monitored in real time by measuring the specific increase in fluorescence released during the reaction.
  • the Ct is directly proportional to the concentration of targets in the amplification reaction medium and corresponds to the first cycle of the linear phase of the amplification.
  • the method described has been optimized with magnetic beads as support for active surfaces dedicated to the capture of microorganisms and nucleic acids. It has been validated on recognized model microorganisms: gram-negative and gram-positive bacteria, sporulated bacteria, viruses and protozoa.
  • the device comprises:
  • a peristaltic pump to allow the displacement of the sample and of all the liquid reagents;
  • - a magnet, which allows the collection of magnetic beads;
  • a heating ultrasound device which allows the resuspension of the beads collected by the magnet and the opening of the microorganisms;

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Abstract

La présente invention concerne un procédé de traitement d'échantillons liquides en vue de la détection d'éventuels micro-organismes pathogènes en très petite quantité. Plus précisément, ce procédé consiste en une étape générique de capture et de concentration de micro-organismes sur une surface échangeuse d'ions, suivie d'un traitement de lyse in situ des microorganismes et d'une capture des acides nucléiques libérés lors de la lyse. La mise en oeuvre de ce procédé permet l'obtention d'une solution d'acides nucléiques extrêmement concentrée et purifiée. Ce procédé est adapté à un traitement en continu d'échantillons liquides. L'invention se rapporte également à un dispositif d'analyse d'échantillons liquides pour la biologie, la santé ou l'environnement adapté à la mise en oeuvre du procédé selon l'invention.

Description

Procédé de purification des acides nucléiques de microorganismes présents dans des échantillons liquides
L'invention concerne le domaine de la détection globale de micro- organismes pathogènes éventuellement faiblement représentés dans les prélèvements à analyser et dont l'incidence en santé publique, que ce soit humaine ou animale, peut être considérable.
La présente invention concerne plus précisément un procédé de traitement d'échantillons liquides en vue de la détection d'éventuels microorganismes pathogènes en très petites quantités. Plus précisément, ce procédé consiste en une étape générique de capture et de concentration de microorganismes, suivie d'un traitement de lyse in situ des microorganismes et d'une capture des acides nucléiques libérés lors de la lyse. La mise en œuvre de ce procédé permet l'obtention d'une solution d'acides nucléiques extrêmement concentrée et purifiée. Ce procédé est en outre adapté à un traitement en continu d'échantillons liquides.
Elle concerne aussi des dispositifs d'analyse d'échantillons liquides pour la biologie, la santé ou l'environnement ; notamment de dispositifs collecteur- concentrateur cellulaires et moléculaires, et, plus généralement, de dispositifs intégrés de traitement des échantillons. Problème de la qualité des échantillons
Les échantillons à traiter peuvent être de composition biologique et physico-chimique complexe. Les caractéristiques rendant l'analyse de l'échantillon difficile résident essentiellement dans la variabilité de la biomasse totale, de la force ionique, du pH, de la présence de colloïdes, de petites molécules de décomposition de matières organiques, ou encore de substances chimiques artificielles dans ledit échantillon.
Ainsi il est fréquent que les échantillons à analyser contiennent une flore microbiologique ubiquitaire plus ou moins concentrée, sans réelle incidence sur la santé publique ou les études scientifiques réalisées. C'est par exemple le cas des échantillons d'eaux (industrielles, environnementales) et des conformes qu'ils peuvent contenir, ces bactéries n'étant pathogènes qu'à des fortes concentrations ; cela est aussi valable pour les échantillons obtenus à partir d'air, de boues ou bien encore de selles.
Dans de nombreux cas, la recherche de micro-organismes peu concentrés ou faiblement représentés dans un échantillon peut s'avérer nécessaire, par exemple dans le cas de la détection de pathogènes susceptibles de coloniser les circuits d'eaux de boissons, les eaux industrielles ou environnementales ou l'air. Il s'agit le plus souvent de virus, bactéries, protozoaires, amibes, champignons, levures, algues, vers... Cette détection est essentielle puisque ces pathogènes peuvent alors être responsables de maladies graves parmi lesquelles le choléra, la légionellose, la typhoïde, dans lesquelles on peut observer les symptômes suivants : diarrhée, dysenterie, gastroentérite.
Dans le cas d'un échantillon complexe en raison, par exemple, d'une très forte charge microbienne totale, ou encore d'un échantillon riche en colloïdes, etc. la détection d'un micro-organisme très dilué est rendue difficile.
Nécessité d'une surveillance microbiologique Etant données les contaminations possibles des eaux par des agents infectieux, il est nécessaire de pouvoir surveiller avec une fréquence suffisante la charge des micro-organismes pathogènes. Dans le cas des eaux environnementales, les contrôles permettent d'engager si besoin des mesures de prévention en terme de fréquentation humaine ou animale, en limitant l'accès aux sites par exemple, et en terme de prélèvement à destination de traitement pour les réseaux d'eau potable, entre autres.
Dans le cas des réseaux d'eaux industrielles, le suivi microbiologique permet d'engager des actions de désinfection ou de traitement de l'eau ou des installations industrielles avant rejet dans l'environnement, et ainsi de respecter les normes microbiologiques réglementaires.
Une surveillance de la qualité microbiologique de l'air est soumise aux mêmes problématiques avec les mêmes conséquences sanitaires que celles définies pour les eaux.
Optimisation des méthodes de traitement de l'échantillon La plupart des techniques conventionnelles utilisées pour le traitement des échantillons liquides de grands volumes présentent plusieurs inconvénients. Elles traitent des échantillons ponctuels, sont peu sensibles en raison des faibles rendements de purifications et des fortes dilutions nécessaires avant les analyses biologiques. Enfin, elles sont longues, nécessitent de lourds équipements et reviennent chères en moyens humains et matériels.
La technique de référence repose sur une identification et un dénombrement des micro-organismes par culture sur différents milieux sélectifs. C'est une technique dont la mise en œuvre est longue, souvent supérieure à 24 heures et qui peut être biaisée à la fois par la flore commensale mais aussi par la présence de micro-organismes en retard de croissance ou même viables mais non cultivables et pourtant pathogènes. De plus, cette méthode peut ne pas prendre en compte les micro-organismes à croissance lente. Une autre technique permet une quantification rapide de la population microbienne totale par mesure d'activité enzymatique. Cette technique présente l'intérêt de prendre en compte les bactéries viables mais non cultivables. En revanche, elle ne permet pas l'identification spécifique des micro-organismes.
Enfin d'autres techniques permettent des réponses plus spécifiques. C'est le cas des captures microbiennes à l'aide d'anticorps spécifiques. Toutefois, le temps de réponse est encore souvent long et la technique peut présenter des défauts de sensibilité et de spécificité en raison de réactions croisées. De la même façon, l'utilisation de sondes nucléiques marquées permet une détection très spécifique après hybridation avec leurs cibles. L'inconvénient réside ici dans le faible nombre de cibles par cellules qui rend cette technique peu sensible et mal adaptée à la détection de micro-organismes peu concentrés. Depuis quelques années, cet inconvénient a été surmonté par l'utilisation des techniques d'amplification génique en temps réel, par exemple par PCR ou NASBA.
Toutefois la plupart des techniques nécessitent d'abord un traitement lourd par filtration, centrifugation ou par précipitation. Or, les filtres ou culots générés sont respectivement souvent saturés ou compacts, contiennent de nombreuses molécules et particules difficilement caractérisables, dont on sait qu'elles interfèrent fortement avec les procédés biologiques d'analyses, type interactions antigène - anticorps ou amplifications géniques. Il est donc souvent nécessaire de diluer très fortement les échantillons pour éviter les inhibitions des réactions de détection, et éviter les résultats faux négatifs.
Enfin, les prélèvements sont réalisés ponctuellement au cours du temps avec des fréquences pouvant être variables. Les résultats obtenus correspondent donc à des images instantanées d'un état de contamination d'un environnement particulier. Ils ne peuvent pas prendre en compte les variabilités de contaminations liées à l'environnement.
L'analyse des travaux de développement de systèmes intégrés miniaturisés jusqu'à l'échelle micrométrique montre que l'étape de préparation des échantillons est cruciale et très difficile à intégrer, et ce d'autant plus lorsque l'ensemble des étapes préparatives est prise en charge par le même microsystème, de la capture des éléments à rechercher jusqu'à l'obtention des molécules pures et ultra concentrées.
Il apparaît donc qu'un système capable de capturer et concentrer les micro-organismes en continu sur un temps relativement long serait plus informatif de l'état de contamination d'un environnement qu'un prélèvement ponctuel, et permettrait à la fois une meilleure concentration et une meilleure purification. Globalement cela permettrait de pouvoir travailler avec des systèmes types laboratoire sur puce et d'éviter par exemple les dilutions nécessaires avant les amplifications géniques telles qu'elles sont pratiquées aujourd'hui. Par conséquent, il est utile de développer un système intégré répondant aux critères suivants :
1. une large plage d'utilisation permettant des stratégies simples et génériques de traitements d'échantillons,
2. un changement d'échelle important de l'échantillon à traiter et pouvant être intégré aux microsystèmes,
3. une forte capacité de purification et de concentration pour permettre l'analyse de tout l'échantillon et permettre la détection des microorganismes traces (dont le nombre peut être inférieur à 10 dans 100 ml),
4. un temps de préparation rapide, inférieur à 20 minutes. C'est à ces différentes exigences que répond le procédé selon l'invention.
Des dispositifs miniaturisés (biopuces) de détection de microorganismes ont été mis au point. Liu et al. décrivent une biopuce pour la détection de bactéries au sein de laquelle sont effectuées les étapes suivantes : la capture immuno-magnétique des bactéries cibles ; la pré-concentration des bactéries et leur purification ; la lyse des bactéries ; l'amplification par PCR des acides nucléiques obtenus et la détection basée sur des puces à ADN électrochimiques (Liu et al. Anal. Chem. (2004) 76, 1824-1831). De par la capture immunomagnétique des bactéries cibles, ce dispositif ne permet qu'une détection spécifique, visant une bactérie particulière.
Cheng et al. décrivent une biopuce pour la détection de bactéries dans des échantillons de sang comportant une chambre fluidique dans laquelle sont réalisées une séparation diélectrophorétique des cellules bactériennes et des cellules sanguines ; une lyse électronique (par application d'une série d'impulsions électriques) des bactéries capturées ; une digestion des protéines avec la protéinase K ; et une analyse des ARN et ADN libérés avec des puces à ADN. L'étape de séparation diélectrophorétique ne permet la capture que d'une faible fraction des bactéries limitant ainsi les applications de ce dispositif ; il n'est en particulier pas adapté au traitement d'échantillons susceptibles de contenir de faibles quantités de micro-organismes (Cheng et al. Nature Biotechnology (1998) 16, 541-546).
Il a été montré que certains polymères échangeurs d'ions, comme la polyéthylèneimine (PEI), peuvent adsorber des bactéries ou des virus (Deponte et al.
Anal Bioanal Chem. 2004; 379(3):419-26 ; Yamaguchi et al. J Virol Methods. 2003
Dec; 114(1):11-9.) ; des matrices de cellulose porteuses de fonctions esters de sulfate ont également été décrites pour la capture de virus ou de particules virales
(EP 1 808 607). De tels polymères échangeurs d'ions permettent également la capture de molécules chimiques (Boom et al. J Clin Microbiol. 1990 Mar; 28(3):495-
503 ; United States Patent US 5,342,931 "Process for purifying DNA on hydrated silica" ; United States Patent US 5,503,816 "Silicate compounds for DNA purification") avec de bonnes performances en terme de cinétique, de purification et de saturation.
Certains systèmes ont été développés pour l'extraction d'ADN à partir d'échantillons de sang, d'un volume de quelques millilitres. UADN extrait est purifié et ensuite élue dans 100 μl au moins (King Fisher, Easy Mag).
Cependant, aucun de ces dispositifs ou méthodes ne permet à la fois une capture des micro-organismes qui revêt un caractère générique, la possibilité de réaliser une lyse des microorganismes in situ ainsi qu'une capture des acides nucléiques libérés lors de ladite lyse.
La Demanderesse a maintenant mis en évidence la possibilité d'appliquer un prétraitement à des échantillons liquides susceptibles de contenir des microorganismes en vue d'une analyse ultérieure des acides nucléiques desdits échantillons liquides.
Le procédé mis en œuvre dans cette invention repose sur l'utilisation de surfaces échangeuses d'ions pour réaliser l'ensemble des étapes de préparation d'acides nucléiques, de la capture des micro-organismes jusqu'à la purification et la concentration des acides nucléiques (ADN et ARN).
Pour résumer, les avantages du procédé et du dispositif décrits sont : une capture générique ; un fort degré de concentration des microorganismes et, éventuellement, des acides nucléiques ; un fort degré de purification des microorganismes et, éventuellement, des acides nucléiques ; une intégration simple dans les systèmes automatisés. Plus spécifiquement, la présente invention se rapporte à un procédé de traitement d'un échantillon liquide en vue d'une analyse des acides nucléiques des micro-organismes susceptibles d'être contenus dans ledit échantillon consistant en :
(A) la capture des microorganismes contenus dans ledit échantillon liquide par adsorption desdits micro-organismes sur une première surface active échangeuse d'ions, anions et/ou cations ;
(B) la lyse desdits microorganismes en présence de ladite première surface active sur laquelle lesdits micro-organismes sont adsorbés ou non :
(C) l'adsorption des acides nucléiques libérés au cours de l'étape (B) sur une seconde surface active échangeuse d'anions. De préférence, l'étape (B) de lyse est réalisée in situ pendant que lesdits micro-organismes sont adsorbés sur ladite première surface active et/ou ladite première surface active est surface échangeuse d'anions et ladite seconde surface active est la même que ladite première surface active.
Le caractère générique du procédé provient de sa capacité à pouvoir être mis en œuvre pour l'ensemble des micro-organismes définis ci-dessous et des acides nucléiques sans distinction de spécificité particulière pouvant a priori les différencier les uns des autres.
Par « échantillon liquide », on entend un prélèvement d'eau industrielle (par exemple, provenant de circuit de refroidissement), d'eau environnementale, ou encore d'eau potable destinée à la consommation humaine ou animale et par extension tout échantillon dans lequel le ou les éléments à détecter sont en solution ou en suspension. Cet échantillon peut lui-même avoir été obtenu à partir d'un prélèvement ou autre échantillon contenant les éléments d'intérêts, par exemple un fluide corporel, un prélèvement d'air, obtenu par traitement physique et/ou chimique, et/ou biologique selon toute méthode adaptable par l'homme du métier. De préférence, il s'agit d'échantillons aqueux ou à forte composante aqueuse.
De façon à éviter toute contamination exogène, les prélèvements sont préférentiellement réalisés dans des conditions de grande propreté avec du matériel stérile. Dans le cas d'analyse de la qualité microbiologique de l'air, les échantillons liquides sont préparés selon des techniques connues de l'homme du métier (voir notamment la publication de Stachowiak JC, Shugard EE, Mosier BP, Renzi RF, Caton PF, Ferko SM, Van de Vreugde JL, Yee DD, Haroldsen BL, VanderBoot VA. Autonomous microfluidic sample préparation system for protein profile-based détection of aerosolized bacterial cells and spores. Anal Chem. 2007 Aug. 1 ;79(15):5763-70).
Le volume des échantillons liquides est compris entre 1 et 100 ml, de préférence, il est de 10 ml. De préférence, l'échantillon liquide est tel :
- qu'il ne contient pas, ou une quantité négligeable, c'est-à-dire inférieure à 5 % en poids par rapport au poids total de l'échantillon, de détergents ioniques ;
- que sa concentration saline n'excède pas 2 M et est préférentiellement inférieure à 200 mM ;
- que son pH n'excède pas 10, de préférence, son pH est proche de la neutralité.
Par « micro-organismes », on entend les virus enveloppés ou non enveloppés, les bactéries végétatives à Gram positif et négatif, les bactéries sous forme sporulée, les protozoaires, les champignons microscopiques et levures, le microplancton, les pollens, les cellules animales et les cellules végétales que l'on veut capturer, et/ou concentrer, et/ou purifier, et/ou détecter.
Par « surface active échangeuse d'ions », on entend toutes surfaces échangeuses d'ions (anions ou cations), plus ou moins fortes, permettant l'adsorption des micro-organismes, ou de leurs constituants jusqu'au niveau moléculaire. De préférence, la surface active est choisie parmi les résines échangeuses d'ions fortes. De manière préférentielle, la surface active sera une surface échangeuse d'anions ou résine anionique.
Par « surface échangeuse d'anions ou résine anionique », on entend une surface portant des fonctions chimiques chargées quelles que soient les conditions de pH. C'est par exemple le cas des aminés quaternaires, dont toutes les liaisons sont engagées avec des radicaux autres que des protons. Ainsi par exemple, le polyéthylène imine (PEI) est un échangeur fort d'anions puisqu'une fraction des aminés est quaternaire alors que le diéthyl amino éthyle (DEAE) est un échangeur faible puisque aucune aminé n'est quaternaire. Ainsi, une surface échangeuse forte d'anions est d'autant plus forte que la proportion d'aminé quaternaire est importante.
On peut classer les résines anioniques (échange d'anions) selon le Tableau I ci-après.
Tableau I
On peut classer les résines cationiques (échange de cations) selon le Tableau II ci-après.
Tableau II Les surfaces échangeuses d'anions ou de cations pourront être fixes ou mobiles, disposées au sein d'un dispositif d'extraction et de purification d'acides nucléiques de micro-organismes, elles sont choisies parmi les polymères chargés dont la ramification avec une chaîne carbonée permet le renforcement de la charge ; en particulier, elles sont sélectionnées dans le groupe constitué par les résines présentant des groupements choisis parmi les groupements aminés quaternaires, les groupements aminés tertiaires, les groupements aminés secondaires, les groupements aminés primaires, les groupements sulfoniques, les groupements phosphores, les groupements carboxyméthyle ou carboxylique ; ou encore les résines hydroxylapatite, Di-Ethyl-Amino-Ethyl (DEAE), poly-Lysine et Poly-Ethylène lmine (PEI). Lesdites surfaces échangeuses d'ions, en particulier d'anions, décrites ci-dessus permettent l'adsorption générique des micro-organismes, et peuvent s'adapter à un très large spectre d'applications. En outre, l'élimination du milieu liquide contenant initialement les micro-organismes à rechercher peut être réalisée facilement sans pour autant risquer de décrocher les micro-organismes de la surface. L'élimination du milieu liquide permet la concentration des microorganismes capturés avant leur lyse. En particulier, le volume de l'échantillon peut être réduit à un volume compris entre 1 à 10 μl. En plus de permettre la capture des micro-organismes, les surfaces échangeuses d'ions utiles pour la mise en œuvre du procédé de l'invention résistent aux procédés physiques, chimiques ou enzymatiques d'ouverture des microorganismes pour libérer leurs acides nucléiques. Préférentiellement, ces surfaces permettent également la purification et la concentration des acides nucléiques dans un solvant compatible avec les réactions biologiques, dans des volumes très faibles, de 1 à 10 μl.
Les surfaces échangeuses d'anions ou de cations reposent avantageusement sur un matériau support permettant la réception des groupements actifs vis-à-vis du procédé décrit, et dont l'intégrité n'est pas ou très peu altérée par les traitements d'ouverture des micro-organismes. A titre d'exemple et de façon non limitative, on peut citer la silice et le polycarbonate.
Les surfaces et leur support peuvent être soit mobiles, comme dans le cas de billes magnétiques par exemple, soit fixes, comme dans le cas d'un laboratoire sur puce.
Par « laboratoire sur puce », on entend tous dispositifs fluidiques et/ou microfluidiques comprenant des zones de passages de l'échantillon adéquatement dimensionnées, structurées et fonctionnalisées (par modification de surface ou remplissage de réactifs fonctionnels) de façon complètement ou partiellement automatisée ou non automatisée.
Lorsque la surface active et son support sont mobiles sous forme de billes, ces dernières sont ajoutées à l'ensemble de l'échantillon liquide et se distribuent de telle sorte qu'elles se comportent comme un filet, avec pour dimension de maille la plus petite distance entre les billes. Le dispositif doit alors être capable de collecter les billes pour retenir les éléments capturés (micro-organismes, acides nucléiques) et concentrer l'échantillon.
Lorsque le support est fixe, il n'y a pas de risque d'agrégation. Le dispositif doit cependant être dimensionné et conçu pour permettre une capture efficace des micro-organismes par exemple en favorisant les probabilités de rencontre surface active - échantillon.
Enfin, l'échantillon est mis en contact avec les surfaces actives par fractions, à des vitesses dépendant du débit appliqué au dispositif.
Selon un mode particulier de mise en oeuvre du procédé selon l'invention, l'étape (A) de capture des micro-organismes contenus dans un échantillon liquide est réalisée sur une surface active, soit échangeuse d'anions lorsqu'il s'agit de capturer des micro-organismes dont la charge nette de surface est négative, soit échangeuse de cations lorsqu'il s'agit de capturer des microorganismes de charge nette de surface positive ; de préférence, la surface active est une surface échangeuse d'anions choisie parmi les groupements aminés quaternaires, les groupements aminés tertiaires, les groupements aminés secondaires, les groupements aminés primaires ; ou encore les résines hydroxylapatite, Di-Ethyl-Amino-Ethyl (DEAE), poly-Lysine et Poly-Ethylène Imine (PEI).
L'étape (A) peut être réalisée avec une surface échangeuse d'ions telle que :
- la surface active par unité de volume d'échantillon liquide pouvant être contenu dans la chambre dans laquelle est réalisée la capture des microorganismes est comprise entre 1 et 200 m2/l d'échantillon, de préférence entre 9 et 100 m2/l ; - la distance entre la surface active et les éléments à capturer est de l'ordre de 10 à 100 micromètres, préférentiellement 10 micromètres ;
- le temps de mise en contact de l'échantillon liquide avec la surface active est de l'ordre de 30 secondes à 10 minutes, préférentiellement 10 minutes ;
- la température de mise en contact est comprise entre 4°C et 40°C, préférentiellement 25°C ± 5°C.
Une agitation régulière de l'échantillon, par exemple à l'aide d'un vortex, peut être réalisée. Cette agitation s'avère avantageuse lorsque des billes sont utilisées comme support de la surface active.
Suite à la capture, une étape optionnelle de concentration (A') est avantageusement réalisée par la séparation physique de la surface de capture (support fixe ou support mobile) et du solvant liquide. Dans le cas où la surface active est mobile portée par des billes magnétiques, une attraction magnétique des billes pendant 30 secondes à 2 minutes, ou jusqu'à clarification de l'échantillon, est recommandée. L'étape (B) d'ouverture (lyse) des micro-organismes permettant la libération des acides nucléiques est réalisée directement sur les micro-organismes retenus sur la surface active ; elle peut être réalisée par toute méthode connue de l'homme du métier, notamment par sonication, abrasion par des billes de verre, digestion enzymatique, choc thermique, choc osmotique, irradiation lumineuse, électroporation, action de micro-ondes, etc. selon l'échantillon considéré et l'application envisagée à la suite de cette étape.
Un avantage de ce procédé est de réaliser la lyse in situ, c'est à dire pendant que les micro-organismes sont adsorbés sur la surface active. Faire l'économie d'une étape d'élution des micro-organismes est avantageux ; en effet, moins le procédé comporte d'étapes, plus les transferts de liquides, potentiellement facteurs de contamination et de perte de matériel sont évités ; en outre, cela rend le procédé plus facilement automatisable.
Concrètement, l'étape (B) de lyse des micro-organismes directement en présence de la surface active peut être réalisée par différentes méthodes chimiques et/ou physiques et/ou biologiques et n'altérant pas, ou très peu, les propriétés structurelles et fonctionnelles des surfaces actives et/ou de leurs supports.
A titre d'exemple, la lyse peut être effectuée par une digestion enzymatique par le lysozyme seul ou par le lysozyme puis la protéinase K. On procédera préférentiellement à une digestion successive par le lysozyme puis par la protéinase K dans les conditions de lyse respectives dans un milieu de composition : Tris-HCI à 5O mM, NaCI à 5O mM, EDTA à 5 m M, pH 7,5, pendant 10 minutes à température ambiante, puis dans un milieu de composition : Tris-HCI à 10 mM, EDTA à 2 mM, pH 8,0 ou NaCI à 4 M, Tris-HCI à 10 mM, EDTA à 2 mM, sarcosyl à 0,1%, pH 9,0, pendant 15 minutes à 700C.
Selon une variante, l'étape (B) est réalisée par une ultrasonication de l'échantillon dans des conditions optimales en fonction de la géométrie de la chambre contenant l'échantillon et selon que le support de la surface active est fixe ou bien mobile. Selon une autre variante de l'invention, le présent procédé peut comprendre une étape supplémentaire (A1), qui s'intercale entre l'étape (A) et l'étape (B), de purification des micro-organismes. Cette étape de purification (A1) correspond à un lavage de la surface sur laquelle sont fixés les micro-organismes à l'aide d'une solution choisie pour ne pas perturber l'accrochage des micro- organismes à la surface échangeuse. A titre d'exemple, une solution à base de sels peut être employée, dont les caractéristiques sont dépendantes de la surface active employée.
Par « purification », on entend généralement l'élimination des composés inutiles ou gênants qui se sont fixés aux surfaces actives dans les mêmes conditions que les micro-organismes ou les acides nucléiques d'intérêts libérés au cours de l'étape (B), mais dont l'élution peut être réalisée par des solutions adaptées, sans risque d'éluer, ou du moins très partiellement, lesdits micro-organismes et acides nucléiques qui restent adsorbés à la surface active.
L'éventuelle étape (A1) de purification peut être réalisée par incubation de la surface active avec une solution lavante à base de sels, préférentiellement ayant la composition suivante : NaCI à 0,8 M, Tris-HCI à 10 mM, éthanol à 15% (v/v), pH 8.
Le procédé selon l'invention comprend en outre une étape (C), suivant l'étape (B), d'adsorption des acides nucléiques libérés par la lyse desdits micro-organismes.
Ainsi, après l'ouverture ou lyse des micro-organismes, les acides nucléiques libérés sont, au cours de l'étape (C), soit immédiatement adsorbés sur la première surface active qui a permis la capture des micro-organismes, soit adsorbés sur une seconde surface échangeuse d'anions de force électrostatique similaire à celle de l'étape (A). Ceci permet de ségréguer et concentrer rapidement le matériel d'intérêt, ici les acides nucléiques. De préférence, on utilise comme première et seconde surface active la même surface échangeuse d'anions.
Une éventuelle étape (A2) d'élution des micro-organismes de la première surface active peut être réalisée, à la suite de l'étape (A) ou de l'étape (A1) et précédant l'étape (B), avec une solution qui favorise la séparation des microorganismes de la première surface active par compétition avec un ion de même charge, ou par modification chimique de la densité de charge surfacique des billes et/ou des micro-organismes.
L'étape (A2) peut être réalisée par l'incubation de la surface active avec une solution d'hydroxyde de sodium 100 mM, contenant ou non des détergents, éventuellement complétée par des méthodes physiques tels que le chauffage, l'agitation par un vortex ou par des ultrasons. Dans ce cas, les microorganismes contenus dans l'éluat pourront être isolés de la première surface active afin de subir la lyse prévue à l'étape (B) ou bien subir la lyse en présence de la première surface active mais sans être adsorbés.
Une éventuelle étape (A3), suivant l'étape (A2), de régénération de la première surface active peut également être réalisée par une solution d'hydroxyde de sodium (NaOH) de façon à poursuivre par un autre cycle de capture conformément à l'étape (A) pour un nombre déterminé de cycles. La régénération de la surface active de capture des micro-organismes peut être réalisée dans les conditions suivantes : l'incubation de la surface active avec une solution de chlorure de sodium, préférentiellement de 100 mM, puis son élimination ou encore l'incubation de la surface active avec de l'eau déionisée, puis son élimination.
Selon une variante de l'étape (C) du procédé, l'adsorption des acides nucléiques est réalisée sur la même surface échangeuse d'ions que celle utilisée à l'étape (A) (première surface active) qui est une surface échangeuse d'anions.
Selon une autre variante de l'étape (C) du procédé, l'adsorption est réalisée sur une seconde surface active, correspondant à une surface échangeuse d'anions utile pour cette étape (C) d'adsorption des acides nucléiques, prélude à la purification et à la concentration d'acides nucléiques. Cette seconde surface active anionique peut contenir des groupements porteurs de chaînes carbonées de différentes longueurs, de C1 à C18 par exemple, mais aussi de la silice, de l'ADN, de I1ARN et analogue synthétique des acides nucléiques tels que PNA et LNA. De préférence, la seconde surface active est la même surface échangeuse d'anions que celle utilisée dans l'étape (A).
Là encore, la seconde surface utilisée peut reposer sur un support et ladite seconde surface active et son support peuvent être fixes ou mobiles.
Le procédé peut comporter une étape optionnelle (C1), suivant l'étape (C), de purification par lavage des acides nucléiques adsorbés.
Cette étape (C1) est réalisée par l'ajout d'une solution à base de sels avec préférentiellement, mais pas obligatoirement, de l'alcool dans des concentrations biens définies, dépendant de la surface active ; elle permet l'élimination de bon nombre de contaminants chimiques et biologiques, tels que des sucres, des protéines, des lipides, les petits ARN, de telle sorte qu'il ne reste que les ADN et la plus grande partie des ARN de l'échantillon.
Enfin, le procédé selon l'invention peut également comprendre une étape (C2) d'élution des acides nucléiques qui suit l'étape (C) ou l'étape (C1).
Selon les conditions expérimentales, cette étape (C2) peut permettre la séparation des ADN et des ARN. L'ARN retenu pouvant être sélectivement élue grâce à une solution saline de concentration inférieure à celle requise pour l'ADN.
Après une série de lavages à base de sels et éventuellement d'alcool, l'élution est réalisée par une modification de la charge de surface des surfaces actives, soit en jouant sur le pH et/ou en jouant sur la concentration en ions dans des gammes de concentrations compatibles avec les réactions biochimiques et biologiques, selon des méthodes connues de l'homme du métier.
Le procédé global de préparation d'acides nucléiques sur surfaces actives échangeuses d'anions est particulièrement bien adapté aux dispositifs du type laboratoire sur puce. En effet, la capture sur surface permet d'envisager une réduction d'échelle très importante dès les premières étapes du traitement de l'échantillon. Selon que la surface active est portée par des billes ou qu'elle revêt un support fixe, l'échantillon d'intérêt sera au final circonscrit à la surface de capture, globalement les microorganismes et/ou ADN et/ou ARN seront finalement stockés dans une structure bidimensionnelle, c'est-à-dire surfacique, au lieu d'être stockés en solution dans un réservoir tridimensionnel.
L'invention peut être déclinée selon plusieurs variantes, en particulier, des étapes ultérieures de traitement de l'échantillon peuvent être ajoutées. Une fois les acides nucléiques collectés soit sur surface active soit en solution, il est possible de les purifier et de les collecter selon un procédé similaire consistant en l'adsorption des acides nucléiques sur une surface active de type PEl ou Silanol, selon l'étape (D).
L'étape (D) de capture des acides nucléiques sur une surface active, similaire ou différente de la première surface active de capture des micro- organismes, peut être réalisée dans des conditions physico-chimiques adaptées au type de surfaces actives. Pour ce faire, on incube la surface active avec une solution de concentration saline inférieure à 0,8 M de NaCI, préférentiellement inférieure à
200 mM, dépourvue de détergent, et de pH inférieur au pKa du groupement impliqué dans l'adsorption, préférentiellement autour de la neutralité, dans le cas d'une surface active similaire au PEI.
L'incubation de la surface active avec une solution de guanidine HCI de concentration supérieure à 3 M, Tris-HCI à 10 mM, éthanol à 80% (v/v), pH 4,5, dans le cas d'une surface active Silanol est préférée.
Le procédé selon l'invention peut encore être complété d'une étape (E) de purification desdits acides nucléiques.
Cette étape (E) de purification des acides nucléiques est réalisée par passage d'une solution lavante via l'incubation de la surface active avec une solution à base de sels, préférentiellement de composition : NaCI à 0,5 M, Tris-HCI à 10 mM, éthanol à 15% (v/v), pH 8 pour une surface de type PEI ou via l'incubation de la surface active avec une solution à base de sels, préférentiellement de composition : NaCI à 2 mM, EDTA à 5 mM, éthanol à 80% {y N), pH 7,0.
Enfin, le procédé peut encore comporter une étape (F) de concentration finale via une étape de séchage consistant en l'élimination des liquides résiduels suivie d'une élution en un petit volume de liquide.
A l'étape (F), Pélution des acides nucléiques en petit volume est réalisée par une solution favorisant la séparation des acides nucléiques de la surface active, selon les mêmes principes que ceux décrit en (A2) ; avec, de façon préférentielle, l'incubation de la surface active avec une solution de NaOH n'excédant pas 10O mM, préférentiellement 50 m M, pendant 20 secondes à température ambiante, pour une surface active de type PEI, ou l'incubation de la surface active avec une solution à de Tris-HCI 10 mM, à 600C pendant 2 minutes pour une surface de type silanol.
Selon un autre de ses aspects, l'invention se rapporte à un dispositif de traitement d'échantillon liquide susceptible de contenir des microorganismes, caractérisé en ce qu'il contient au moins une surface échangeuse d'ions, de préférence d'anions, telle que définie ci-dessus disposée dans une chambre telle que le rapport de ladite surface active par unité de volume d'échantillon qui peut être contenu dans ladite chambre est compris entre 1 et 200 m2/l, de préférence entre 9 et 100 m2/l.
Selon un mode particulier dudit dispositif, il comprend un laboratoire sur puce constitué de billes mobiles supportant les surfaces actives. Dans ce cas de figure, la distance optimale inter-billes pour l'étape de capture des micro-organismes est de 10 μm environ. Cette distance est également optimale pour la capture des acides nucléiques. De plus, les surfaces développées données par unité de volume sur la base d'études cinétiques de capture des micro-organismes (voir le modèle théorique de Deponte et al.) correspondent bien aux données expérimentales obtenues.
L'homme du métier peut alors dimensionner un laboratoire sur puce en se basant sur les données de l'art antérieur (par exemple, Microfabήcated reaction and séparation Systems, de Madhavi Krishnan et al. Dans « Analytical Biotechnology » ; éd. Elsiever Science).
En premier lieu, il convient de définir ces trois données :
Le rapport surface par unité de volume (S/V) de la chambre au travers de laquelle passera l'échantillon se calcule avec la valeur de la surface active échangeuse d'ions présente dans la chambre et la valeur du volume d'échantillon qui peut être contenu dans la chambre ;
Le volume d'échantillon qui peut être contenu dans la chambre de capture ; et - Le débit de l'échantillon.
Chaque donnée d'entrée influence les deux autres. A titre d'exemple, lorsqu'on utilise une chambre de dimension 20 mm x 5 mm x 0.01 mm ; le volume de ladite chambre est de 1 μl, la surface des deux rectangles (20 mm x 5 mm) = 200.10"6 m2, alors, le rapport SA/ vaut 200 m2/l, ce qui est en l'état très supérieur à la surface active développée par les billes de 1 μm utilisées dans la description du procédé qui suit et peut donc apporter encore plus d'efficacité au procédé.
La surface active peut encore être augmentée en ajoutant une structuration de la chambre, par exemple par des piliers, ou bien une parallélisation des circuits fluidiques.
Selon le modèle cinétique de Deponte et al. (voir supra), les vitesses d'adsorption devraient être très rapides et donc permettre des débits importants. Un dimensionnement et une structuration adaptés des chambres contenant la surface active en contact avec l'échantillon liquide doivent donc permettre de traiter des volumes d'échantillons avec, au minimum, les mêmes performances que celles décrites dans les exemples présentés ci-après.
Conformément à la Figure 1, est décrit un procédé de préparation d'acides nucléiques selon l'invention pour les micro-organismes présents dans des échantillons liquides. Dans cette Figure 1 , les flèches en pointillés représentent des étapes éventuelles, ou bien des possibilités alternatives de traitement de l'échantillon, le terme « AN » signifie acides nucléiques. Les combinaisons de cheminements représentés par la figure sont autant de variantes de préparations d'échantillon possibles.
Cette invention trouve application dans des domaines très variés : - toutes les analyses biologiques où les éléments recherchés sont très dilués et où la totalité de l'échantillon doit être analysée ;
- dans les microsystèmes fluidiques (Laboratoire sur Puce (LOC pour Laboratory On Chip) ou Microsystème d'Analyse Totale (μTAS)), dans lesquels l'intégration de surfaces modifiées (fixes ou mobiles type billes magnétiques) est maîtrisée, et 00872
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- dans tous les systèmes intégrés nécessitant une préparation d'échantillon, type extraction - purification d'acides nucléiques.
Ce procédé de préparation d'échantillon décrit dans la présente invention offre plusieurs avantages : - la capture simple et générique de micro-organismes sans distinction de tailles ; la capture de micro-organismes et de leurs constituants même à de très faibles concentrations ; la capture de micro-organismes et de leur constituant même très concentrés ; la capture de micro-organismes faiblement concentrés et compris dans une forte concentration de biomasse totale ; la préparation d'un échantillon liquide avec une forte concentration des microorganismes rendant le procédé incorporable dans des dispositifs types laboratoires sur puce ; la capture et la concentration en continu de l'échantillon liquide, qui peut être l'échantillon entier ou bien une fraction modifiée ou non de l'échantillon entier ; la possibilité de purifier les micro-organismes capturés ; la possibilité d'éluer et de régénérer les surfaces actives permettant de traiter de grands volumes d'échantillons (par fractions modifiées ou non) ; • la possibilité de lyser les micro-organismes en présence de la surface active ; « la capture et la purification des acides nucléiques ;
- la possibilité d'élution différentielle de I1ADN et de l'ARN ; la forte concentration des acides nucléiques ; la mise en oeuvre du procédé en un temps court, de l'ordre de 15 à 20 minutes.
L'invention est maintenant décrite plus en détail en lien avec les figures suivantes :
La figure 1 présente un organigramme général détaillant les différentes étapes du procédé selon la présente invention, il s'agit du procédé mis en œuvre dans l'exemple 1.
La figure 2 détaille les performances de capture et de régénération des surfaces actives selon l'invention.
La figure 3 montre la capacité en terme de rendement de purification des échantillons d'ADN ou d'ARN selon la nature des surfaces utilisées, référence faite à un procédé commercial.
La figure 4 montre la détection des micro-organismes modèles utilisés après capture. Exemple 1 - Procédé de préparation d'acides nucléiques 1. Matériels et méthodes
Le procédé selon l'invention a été testé lors de la préparation d'acides nucléiques à partir de micro-organismes modèles, ici Escherischia coli et Bacillus subtilis pour les formes bactériennes végétatives, Bacillus subtilis pour les formes bactériennes sporulées, Adénovirus humain de type 2 (groupe C) pour les virus, Cryptospoήdium parvum pour les protozoaires, et à l'aide de surface active revêtue de polyéthylène imine (PEI) pour la capture - concentration et purification des micro-organismes, et possiblement des acides nucléiques, et de silanol pour les acides nucléiques.
Le protocole expérimental est décrit de façon générique pour l'ensemble des microorganismes testés.
1-A. Protocole de l'étape (A)
Un échantillon liquide de 10 millilitres est préalablement collecté, il peut être l'échantillon entier, modifié, par exemple par un traitement tel qu'une ultrafiltration ou non, ou bien une fraction de l'échantillon total, modifié par exemple par un traitement tel qu'une ultrafiltration ou non.
Cet échantillon est mis en contact avec une surface active de polyéthylène imine (PEI), ici 9,2 rrvVIitre d'échantillon, et supportée par des billes super paramagnétiques d'un micromètre de diamètre (Chemicell). La mise en contact est réalisée pendant 10 minutes sous agitation à l'aide d'un vortex, afin de maintenir les billes bien dispersées, et à température ambiante. Les billes sont collectées à l'aide d'un aimant jusqu'à clarification de l'échantillon puis la phase liquide est éliminée. 1-B. Protocole de l'étape (B)
Selon l'étape (B), les billes, contenant à leur surface les microorganismes, sont soumises à une étape de lyse pour permettre l'ouverture desdits micro-organismes et la libération des acides nucléiques.
Selon une variante, les micro-organismes adsorbés aux billes sont purifiés par 500μl d'une solution de NaCI à 0,5M, de Tris-HCI à 10 m M1 d'éthanol à 15% (v/v), pH 8,0, avant d'être lysé (A1).
Selon une variante, les micro-organismes purifiés sont élues par une solution de NaOH à 100 mM à température ambiante pendant 2 minutes, puis séparés de la surface active (ici supportée par les billes) pour être conservés (A2). Enfin, selon une variante, après élution des micro-organismes, la surface active peut-être régénérée par addition de NaOH à 100 mM puis d'eau déionisée, et retourner vers l'étape de capture initiale (A3).
1-B.1. Lyse en conditions « low sait » La lyse des micro-organismes est réalisée en présence de la surface active supportée par les billes, contenue dans 200 μl d'une solution de Tris-HCI à 50 mM, de NaCI à 50 mM, d'EDTA à 5 mM M, pH 7,5 dite « low sait ».
1-B.2. Lyse en conditions « high sait »
Selon une variante, les billes peuvent être contenues dans 200 μl d'une solution de NaCI 4M, de Tris-HCI à 50 mM, d'EDTA à 5 mM, de sarcosyl à 0,1%, pH 8,5 dite « high sait ». La lyse est réalisée par ultrasonication.
Selon une autre variante, la lyse est réalisée par deux digestions enzymatiques successives (avec le lysozyme et la protéinase K), telles que décrites ci-dessus. 1-C. Protocole de l'étape (C)
1-C.1. Conditions « low sait »
Dans le cas d'une lyse réalisée dans des conditions « low sait », les billes qui ont adsorbé les acides nucléiques sont collectées et la phase aqueuse éliminée. Les acides nucléiques adsorbés au PEI sont purifiés par une solution de NaCI à 0,5M1 de Tris-HCI à 10 mM, d'éthanol à 15% (v/v), pH 8,0 selon l'étape (C1). Les billes sont collectées et la solution de purification évacuée. Les acides nucléiques sont alors élues en incubant les billes PEI dans 100μl d'une solution de NaOH 100 mM à température ambiante pendant 10 secondes. Les billes sont collectées, les acides nucléiques récupérés et la solution de NaOH à 100 mM neutralisée par ajout de 100 μl d'une solution de HCI à 100 mM selon l'étape (C2). Les acides nucléiques en solution sont alors mis en contact avec la surface active, ici 1 ,18 m2/l d'échantillon, pendant 30 secondes sous agitation à température ambiante, selon (D). Les billes sont collectées et la phase aqueuse éliminée. Une étape de purification selon (E) est réalisée par incubation des billes dans une solution de NaCI 0,5M1 de Tris-HCI à 10 mM, d'éthanol à 15% (v/v), pH 8,0. Enfin une étape d'élution est réalisée avec 2 à 10 μl d'une solution de NaOH à 100 mM à température ambiante pendant 10 secondes. Les billes sont collectées, le surnageant récupéré et neutralisé par ajout du même volume de HCI à 100 mM, selon l'étape (F)
Selon une variante, les acides nucléiques élues des billes PEI à l'issue de l'étape de lyse et neutralisé peuvent être mélangé à 5 volumes de solution de Guanidine HCI à 3M, de Tris-HCI à 20 mM, d'éthanol à 80% (v/v) pH 4,5. Des billes d'un micromètre de diamètre développant une surface active de silanol de 9,2 m2/l d'échantillon sont alors ajoutées selon (D). Les billes sont collectées, la phase aqueuse éliminée. Les acides nucléiques adsorbés sont purifiés deux fois par ajout de 500 μl d'une solution de NaCI à 2 mM, de Tris-HCI à 10 mM, d'éthanol à 75% (v/v), selon (E). Les billes sont collectées, la phase aqueuse éliminée. Les acides nucléiques sont alors élues dans 5 à 10 μl de Tris-HCI à 10 mM, pH 8,0 sous agitation et à 600C, conformément à l'étape (F). 1-C.2. Conditions « high sait » Dans le cas d'une lyse réalisée dans des conditions « high sait », l'expérimentateur collecte les billes qui ont adsorbé les acides nucléiques et récupère la phase aqueuse qu'il mélange à 5 volumes de solution de Guanidine HCI à 3M, de Tris-HCI à 20 mM, d'éthanol à 80% (v/v) pH 4,5. Des billes d'un micromètre de diamètre développant une surface active de silanol de 0,92 m2/l d'échantillon sont alors ajoutées selon (D). Les billes sont collectées, la phase aqueuse éliminée. Les acides nucléiques adsorbés sont purifiés deux fois par ajout de 500 μl d'une solution de NaCI à 2 mM, de Tris-HCI à 10 mM, d'éthanol à 75% (v/v), conformément à l'étape (E). Les billes sont collectées, la phase aqueuse éliminée. Les acides nucléiques sont alors élues dans 5 à 10 μl de Tris-HCI à 10 mM, pH 8,0 sous agitation et à 60°C, conformément au principe de concentration dans un tout petit volume de l'étape (F).
2. Résultats
Les variantes décrites ci-dessus ont chacune été validées indépendamment. 2-A. Capture et l'élution des micro-organismes modèles
Le Tableau III regroupe les résultats d'élution des micro-organismes modèles (β. s pour Bacillus subtilis, E. c pour Escherichia coli, Cp pour Cryptospoήdium parvum et Ad2 pour Adenovirus humain de type 2). Solutions utilisées L-Og10 réduction
(Conditions) β. s E. c Cp Ad2
PBS < 0,05 < 0,05 < 0,05 H2O (di)
PBS1 SDS 0,1 % < 0,05 0,18 < 0,05
PBS, SDS 0,5 % < 0,05 0,27 < 0,05 PBS, SDS 1 % < 0,05 0,52 0,21
NaCI 1 M, pH9 < 0,05 3,16 3
NaCI 2M, pH9 0,31 0,2 0,15
NaCI 3M1 pH9 < 0,05 0,17 < 0,05
NaCI 4M, pH9 < 0,05 0,22 0,05
NaOH 50 mM > 2 1 ,04 0,84
NaOH 10O mM > 3 > 2 > 2
NaOH 200 mM > 3 > 2 > 2
NaOH 100 mM, SDS 0,01 % à 1% > 3 > 2 > 2
Tableau III
Ce Tableau III montre que les conditions PBS et H2O ne permettent pas l'élution des espèces préalablement adsorbées à la surface active.
La condition la plus favorable à l'élution est une incubation dans une solution de NaOH à 100 mM, réalisée ici par incubation des surfaces actives pendant 2 minutes à température ambiante (25°C) et sous agitation (650 rpm). 2-B. Réutilisation des billes
La capacité de capture après purification, élution des microorganismes et régénération de la surface active (polyéthylène imine (PEI) à 9,2 m2/litre d'échantillon, supportée par des billes super paramagnétiques de 1 μm de diamètre (Chemicell)) a été évaluée après 10 cycles du procédé comprenant les étapes purification / élution / régénération, le graphe de cette expérience est représenté à la Figure 2.
Ce graphe montre, sur 3 échantillons distincts, que la capture de N éléments microbiens est parfaitement possible par la capture de N/10 éléments microbiens répétée 10 fois.
Cet essai confirme qu'un dispositif adapté à la mise en oeuvre du procédé selon l'invention peut être réutilisé après régénération de la surface active.
2-C. Lyse enzvmatique et physique en présence des surfaces actives
Les essais mis en œuvre montrent également que la lyse des microorganismes n'affecte pas la fonctionnalité des surfaces actives. 2-D. Adsorption d'ADN et d'ARN
Le résultat obtenu au point suivant démontre implicitement la capacité de la surface active à capturer convenablement l'ADN et I1ARN. 2-E. Purification et l'élution d'ADN et d'ARN sur surface active (Silanol ou PEH
Les acides nucléiques (AN) ont été préparés selon deux variantes de préparation d'échantillon : en utilisant le PEl seulement ou le PEI + silanol. Les AN élues à l'issu de chacune des deux variantes ont été purifiés une nouvelle fois sur colonne Qiagen dédiée soit à la purification d'ADN, soit d'ARN sur colonne de silice. La quantité d'ARN ou d'ADN a été mesurée par spectrophotométrie et le rendement calculé par rapport à la référence.
Le graphe de la Figure 3 montre que la méthode de préparation d'échantillon décrite ici permet une bonne purification des acides nucléiques (AN), en particulier en utilisant la même surface échangeuse d'ions pour capturer à la fois les micro-organismes et les acides nucléiques.
2-F. Evaluation du procédé complet
Enfin le procédé complet a été validé en conditions artificielles et réelles par la détection des micro-organismes modèles dans différents échantillons réels.
Le graphe de la Figure 4 montre la détection des acides nucléiques des microorganismes modèles par PCR.
A chaque cycle d'amplification, le nombre de copie initial est doublé. L'augmentation du nombre de copies est suivie en temps réel par la mesure de l'augmentation spécifique de fluorescence libérée au cours de la réaction. Le Ct est directement proportionnel à la concentration de cibles dans le milieu réactionnel d'amplification et correspond au premier cycle de la phase linéaire de l'amplification.
Il est déterminé automatiquement par le logiciel associé au thermocycleur (Stratagene).
Exemple 2 - Dispositif mettant en oeuyre le procédé décrit Principe de l'essai
Le procédé décrit a été optimisé avec des billes magnétiques comme support des surfaces actives dédiées à la capture des micro-organismes puis des acides nucléiques. Il a été validé sur des micro-organismes modèles reconnus : bactéries gram négatif et gram positif, bactéries sporulées, virus et protozoaires.
Il a été validé sur différents types d'échantillons liquides : eaux industrielles, prélèvements aériens (4 m3) contenant différents polluants types poussière, cheveux, et des prélèvements cervicaux humains, auxquels une forte contamination bactérienne réalisée artificiellement. Dispositif
Le dispositif comprend :
- une pompe péristaltique pour permettre le déplacement de l'échantillon et de l'ensemble des réactifs liquides ; - un aimant, qui permet la collecte des billes magnétiques ;
- un dispositif à ultrasons chauffant, qui permet la remise en suspension des billes collectées par l'aimant et l'ouverture des micro-organismes ;
- des zones de traitements de ségrégation des billes ;
- un ordinateur, qui permet le pilotage des étapes. Protocole
Le procédé a été réalisé conformément au procédé décrit dans l'exemple 1 selon l'ensemble des variantes qui y sont explicitées.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de traitement d'un échantillon liquide en vue d'une analyse des acides nucléiques des micro-organismes susceptibles d'être contenus dans ledit échantillon, caractérisé en ce qu'il comprend au moins les étapes suivantes :
(A) la capture des microorganismes contenus dans ledit échantillon liquide par adsorption desdits micro-organismes sur une première surface active échangeuse d'anions ;
(B) la lyse desdits microorganismes en présence de ladite première surface active sur laquelle lesdits micro-organismes sont adsorbés ou non ; et
(C) l'adsorption des acides nucléiques libérés au cours de l'étape (B) sur ladite première surface active échangeuse d'anions.
2. Procédé selon la revendication 1 , caractérisé en ce que l'étape (B) de lyse est réalisée in situ pendant que lesdits micro-organismes sont adsorbés sur ladite première surface active.
3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que ladite première surface active est choisie parmi le groupe constitué par les résines présentant des groupements choisis parmi les groupements aminés quaternaires, les groupements aminés tertiaires, les groupements aminés secondaires, les groupements aminés primaires ; et les résines hydroxylapatite, Di-Ethyl-Amino-Ethyl (DEAE), poly-Lysine et Poly-Ethylène lmine (PEI).
4. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ladite première surface est sur un support choisi parmi la silice et le polycarbonate.
5. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la lyse de l'étape (B) est réalisée par sonication, abrasion par des billes de verre, digestion enzymatique, choc thermique, choc osmotique, irradiation lumineuse, électroporation et/ou action de micro-ondes.
6. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend en outre une étape (A1) de purification des microorganismes par un lavage de ladite première surface mise en oeuvre préalablement à l'étape (B).
7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 et 3 à 6, caractérisé en ce qu'il comprend, préalablement à l'étape (B), une étape (A2) d'élution desdits microorganismes.
8. Procédé selon la revendication précédente, caractérisé en ce qu'il comprend après l'étape (A2) une étape (A3) de régénération de ladite première surface active.
9. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comporte, après l'étape (C), une étape (C1) de purification des acides nucléiques adsorbés par lavage avec une solution à base de sels.
10. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend, après les étapes (C) ou (C1), une étape (C2) d'élution desdits acides nucléiques par modification de la charge de ladite seconde surface active.
11. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'il comprend, à la suite de l'étape (C2), les étapes additionnelles suivantes : l'étape (D) de capture des acides nucléiques sur une surface choisie parmi la PEI ou le silanol et l'étape (E) de purification desdits acides nucléiques et l'étape (F) de concentration desdits acides nucléiques par élimination des liquides et élution desdits acides nucléiques.
12. Dispositif intégré de traitement d'échantillon liquide susceptible de contenir des microorganismes, caractérisé en ce qu'il contient au moins une surface active échangeuse d'anions choisie dans le groupe constitué par les résines présentant des groupements choisis parmi les groupements aminés quaternaires, les groupements aminés tertiaires, les groupements aminés secondaires, les groupements aminés primaires ; et les résines hydroxylapatite, Di-Ethyl-Amino-Ethyl (DEAE), poly-Lysine et Poly-Ethylène lmine (PEI) ; ladite surface active étant disposée dans une chambre telle que le rapport de ladite surface active par unité de volume d'échantillon qui peut être contenu dans ladite chambre est compris entre 1 et 200 nf7l.
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