CN103702736A - 包含粘土矿物的过滤装置 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含粘土矿物以过滤用于生物化学和分子生物学应用的水性溶液的过滤装置。本发明具体涉及通过包含粘土矿物的滤器经过滤从水性溶液去除不需要的蛋白质。

Description

包含粘土矿物的过滤装置
技术领域
本发明涉及用于分子生物学和生物化学应用的过滤装置和过滤溶液的方法。具体地，本发明涉及从溶液去除不需要的蛋白质，更具体地涉及从溶液去除核酸酶和蛋白酶。
发明背景
在生物化学和分子生物学技术中，生物分子(如蛋白质和核酸)的品质大幅影响实验结果，如结果的准确性和显著性。由核酸酶和蛋白酶分别降解核酸和蛋白质是引起试验中信号损失或反应产率不尽如人意的主要原因。就许多应用而言，降解酶(如蛋白酶和核酸酶，特别是核糖核酸酶(RNA酶)和脱氧核糖核酸酶(DNA酶))需经灭活或者从任何所用缓冲液或实验室器具(如玻璃器皿)中去除。
水性溶液(如缓冲液)常包含RNA酶和/或DNA酶的污染物，需要去除所述RNA酶和/或DNA酶以进一步用于分子生物学或生物化学应用。尤其是处理RNA时，必须确保反应缓冲液中不存在RNA酶污染。
与DNA相比，RNA更易受损且易于降解。其在极端pH条件下或存在金属离子和高温时易分解。但RNA降解的主要原因是RNA酶。因此，在RNA处理期间针对核酸酶采取适当保护很重要。RNA酶通过细胞和组织样品以及皮肤分泌物和空气中的微生物引入系统。必须遵循适当的预防措施以获得RNA处理期间的无RNA酶的环境，如Blumberg 1987(MethodsEnzymol.,152:20-24)中所概括。有数种灭活RNA酶的方法，但其通常存在不足。加热是一种可行方式，因为一些RNA酶在高温下显示低活性。不幸的是，温度下降常导致活性完全恢复。一些RNA酶甚至可承受高压灭菌、极端pH值和尿素、EDTA或SDS。因此，看来RNA酶灭活是一个复杂体系。
为去除RNA酶，可使玻璃器具在180℃烘烤8小时或更久。塑料制品可用氯仿冲洗。另一个方法是使玻璃器具或塑料制品在DEPC溶液(0.1%)中于37℃孵育两小时，之后用DEPC处理的水冲洗数次，并对其高压灭菌15分钟(Blumberg 1987)。
处理中不建议采用DEPC，因为其昂贵且可能致癌。此外，烘烤实验室器具或用DEPC处理所述器具是耗时的。不能被高压灭菌的实验室器具通过在3%H2O2溶液中孵育10分钟之后用DEPC处理的水冲洗来清洁。
此外，无RNA酶的缓冲溶液可通过DEPC处理随后对该缓冲溶液高压灭菌来获得。在DEPC处理后对该缓冲溶液高压灭菌是必需的，以破坏所述溶液中的DEPC。然而，对含氨基基团的缓冲液不能采用此方法。此外，许多缓冲液不能进行高压灭菌。单是高压灭菌不足以破坏缓冲溶液中的RNA酶。
因此，目前就去除或破坏许多常见缓冲溶液中的RNA酶而言没有适当的方法。
用于RNA酶敏感性工作区的洗涤液市售可得。示例有RNaseZap(安碧公司(Ambion))、RNase Away(分子生物产品公司(Molecular BioProducts))、Exitus Plus(应用化学公司(AppliChem))和License to kill(生物三角洲公司(BioDelta))。此类市售可得的溶液通常利用极端pH的变性效果。如果恢复pH，所述蛋白质可能会再重叠，因此抑制效果不持久。在一个不同的方法中，使用变性剂和抑制剂的组合，如EDTA、SDS和蛋白质RNA酶抑制剂。所述抑制效果不会导致RNA酶的不可逆破坏。使用RNA酶抑制剂是有效的，但是昂贵。
WO 2005/083081公开了通过使用核酸酶抑制剂来抑制和/或灭活核酸酶的方法和组合物。这些核酸酶抑制剂包括抗核酸酶抗体和非抗体核酸酶抑制剂。
其它方法中，矿物粘土膨润土被用于从裂解物中去除核酶(Kaiser等.1971,Biochim Biophys Acta.232(2):388-402)或在RNA分离过程中抑制RNA酶活性(Blackburn等.1967 Biochem.J.102,168)。
发明内容
本发明涉及包括上部容器和滤器的过滤装置，所述滤器包含粘土矿物。所述粘土矿物优选是蒙脱石粘土。更优选所述蒙脱石粘土选自下组：膨润土、有机粘土和硅藻土或其组合、衍生物或类似物。
所述粘土矿物优选被固定在膜上或限于膜之间或在过滤器外壳内。
本发明还涉及本发明所述的过滤装置或本发明所述的方法用于从水性溶液中去除不需要的蛋白质(如蛋白酶和核酸酶，特别是RNA酶和DNA酶)的应用。
包含本发明所述的过滤装置的试剂盒也在本发明的范围内。
附图说明
图1示意性地说明用于真空过滤的本发明的过滤装置。1：过滤前的水性溶液；2：用于去除RNA酶或其它蛋白质的粘土滤器；3：用于去除例如微生物的无菌滤器；4：真空泵入口；5：滤液保持器。
图2示意性地说明用于离心过滤的本发明的过滤装置。1：过滤前的水性溶液；2：用于去除RNA酶或其它蛋白质的粘土滤器；3：用于去除例如微生物的无菌滤器；5：滤液保持器。
图3描述不同pH条件对过滤结果的影响。上排(A)：对柱应用膨润土溶液，下排(B)：没有应用膨润土。从左到右：pH 3、pH 5、pH 7、pH 10，对于各pH条件(从左到右)：对照(无RNA酶添加)，RNA酶浓度分别为1μg/ml、10μg/ml、100μg/ml和1mg/ml。
图4描述对柱应用干燥膨润土(A)和预溶胀膨润土(B)的效果。
发明详述
本发明涉及包括上部容器和滤器的过滤装置，所述滤器包含粘土矿物。所述粘土矿物优选是蒙脱石粘土。更优选所述蒙脱石粘土选自下组：膨润土、有机粘土和硅藻土或其组合、衍生物或类似物。最优选所述粘土矿物是膨润土。
粘土是主要由细粒矿物组成的天然产生的材料。粘土矿床通常由粘土矿物(页硅酸盐矿物)组成。
蒙脱石是硅酸盐矿物，特别是页硅酸盐类型的页状矿物。其优选为式(Na,K,Ca)0.33(Al,Mg)2(Si4O10)(OH)2·nH2O等。膨润土是铝蒙脱石，而硅藻土是镁蒙脱石。有机粘土是有机改性的页硅酸盐，衍生自天然产生的粘土矿物。通过修饰例如膨润土来生产有机粘土。例如，原层间阳离子可与有机阳离子(如季胺)交换。从而产生亲有机质表面，其包括共价连接的有机部分。所述胺的链长度优选为12-18个碳原子。
所述粘土矿物优选被固定于膜上或限于膜之间或在过滤器外壳内。可使用任何类型的膜，只要孔尺寸足以阻止粘土矿物。这包括无机膜如二氧化硅或玻璃纤维，或有机膜如聚醚砜、尼龙、铁氟龙、纤维素和纤维素衍生物(例如乙酸纤维素、硝化纤维素)。其它材料对本领域技术人员而言是显而易见的。
例如，其它合适的膜材料包括但不限于混合纤维素醚和酯、聚碳酸酯(PC)、聚砜(PS)、聚丙烯腈(PAN)、聚酰胺(PA)、聚酰亚胺(PI)、聚酰胺-酰亚胺(PAI)、聚酯、聚乙烯亚胺(PEI)、聚乙烯(PE)、聚丙烯(PP)、聚四氟乙烯(PTFE)、聚偏二氟乙烯(PVDF)、聚氯乙烯(PVC)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙烯醇(PVOH)、聚二甲硅氧烷(PDMS)，其混合物和/或掺合物，或其共聚物。
所述膜可具有均一或不均一的结构，包括多层复合膜。如果本发明的过滤装置包括多于一个膜/装置，所述膜可相同或不同。还可将多个过滤装置合并至板(如在多孔板中)，并且同时或依次使用。
根据本发明，所述膜优选可代表多孔膜。孔尺寸范围优选为约0.005μm-约100μm，更优选约0.01-约10μm，包括约0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8和9μm，以及这些值中任意二者之间的范围，最优选约0.1-约1μm。
所述膜的厚度不重要，只要所选的膜提供充足机械稳定性供于预期用途(如真空过滤或通过在离心机中旋转过滤装置来过滤)即可。厚度范围可取决于例如所用的一种或多种膜材料，并且能由本领域技术人员方便地确定。优选使用厚度范围为数纳米到多至数厘米的膜，例如约20nm-约5cm，优选约100nm-约1cm，更优选约1μm-约1mm，包括约2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800和900μm，以及这些值中任意二者之间的范围。
粘土矿物可通过例如移液到过滤膜来添加。其能作为溶液或者干燥或预溶胀粘土添加，但优选在所述装置接触待过滤悬液、液体和/或溶液前添加至该装置。
所述过滤装置可另包含一个或多个附加过滤和/或分离介质。合适的附加过滤介质可以是无菌过滤膜，即用于从待过滤溶液去除微生物的过滤膜。无菌滤器可特定具有约0.2-0.45μm的孔尺寸。无菌膜可用于通过过滤从待过滤液体去除细胞(如微生物)。合适的分离介质可以是凝胶(渗透)色谱介质，其能用于例如另外去除盐或其它污染物。合适的凝胶(渗透)色谱介质是具有亲水和多孔性质的高度交联颗粒。合适的凝胶(渗透)色谱介质的示例有经修饰的多糖，如Sephadex或琼脂糖(Sepharose)、交联聚丙烯酰胺、琼脂糖凝胶、玻璃、右旋糖苷或硅胶。
在一个或多个单个滤器和/或一种或多种分离介质的组合情况中，其可直接互相接触或由适当分隔介质(如玻料或膜)分离，其应能透过不被置于所述分隔介质上的过滤介质或分离介质保留的所有物质。
所述过滤装置优选另包括滤液保持器。
本发明所述的过滤装置可根据待过滤的体积而具有不同尺寸。具体地就较大待过滤体积而言，本发明过滤装置的上部容器的体积(以及因此的保持器(如存在))优选在约50μl-100l范围内，更优选在约0.1ml-50l范围内，甚至更优选约0.5ml-1l。
优选地，离心过滤装置优选具有适合与标准反应管或者标准圆锥管或圆底管联用的尺寸，所述标准反应管例如由玻璃或塑料制成，如体积为0.5ml、1.5ml和2ml的微量离心管，所述标准圆锥管或圆底管例如体积为15ml或50ml的聚丙烯或聚苯乙烯管。还可优选具有适合与标准烧瓶联用的尺寸的真空过滤装置，如500ml或1l体积。优选地，较大体积(如50ml以上的体积特别是大于100ml到多至数百毫升或数升的体积)通过真空过滤来过滤，并且用于较大体积的过滤装置是真空过滤装置。较小体积(如约μl-50ml范围的体积)优选采用离心过滤装置通过离心来过滤。因此，在一个实施方式中，所述过滤装置可以是离心过滤装置，或在另一个实施方式中，所述过滤装置可以是真空过滤装置，或在另外一个实施方式中，所述过滤装置可与重力流协作。真空过滤装置可优选包括真空泵入口。
本发明还涉及从溶液特别是水性溶液中去除蛋白质特别是不需要的蛋白质的方法，所述方法包括通过包含粘土矿物的过滤系统，优选如上详述的本发明的过滤装置过滤(水)溶液。在使用本发明过滤装置(所述装置在接触溶液优选待过滤水性溶液之前已包含蒙脱石粘土)时，在过滤之前无需向所述溶液添加所述粘土的附加步骤。由于蒙脱石粘土可被固定在所述过滤装置中(如通过将其固定于膜上或使其限于膜之间)，甚至可使用蒙脱石粘土粉，而这种蒙脱石粘土粉在其它情况下会阻塞小孔尺寸(如约0.2-0.45μm)的滤器，和/或通过较大孔尺寸(如约>1μm-100μm)的滤器。
不需要的蛋白质可选自蛋白酶和核酸酶。所述核酸酶可以是例如核糖核酸酶(RNA酶)或脱氧核糖核酸酶(DNA酶)。例如，处理RNA时去除RNA酶是需要且重要的。
优选地，本发明方法中所用的粘土矿物可以是蒙脱石粘土，更优选选自下组：膨润土、有机粘土和硅藻土或可以是其组合、衍生物或类似物。最优选所述粘土矿物是膨润土。
待从中去除不需要的蛋白质的溶液特别是水性溶液优选是液体(优选水性)、组合物或缓冲液，其可用于裂解含核酸的细胞，和/或纯化、匀化、表征、修饰、检测和/或制备生物分子(如核酸)。待过滤溶液的示例有：裂解液、包括纯水在内的洗液、洗脱液、结合液、样品稳定溶液、提取液、沉淀液、凝胶加样溶液或用于扩增反应、甲基化反应和/或标记反应的溶液和/或应该用于分子生物学应用的任何其它液体。优选地，待过滤溶液不是饮料，优选不是酒精饮料，最优选不含酒。
所述粘土矿物优选可被固定在过滤膜上或限于膜之间或在过滤器外壳内。在所述方法的另一个优选实施方式中，在过滤之前通过例如移液向过滤膜添加所述粘土矿物。
从水性溶液去除不需要的蛋白质的方法可另包括通过无菌滤器过滤水性溶液。这特别是从所述溶液去除微生物，例如细菌或真菌。
可优选使待过滤的水性溶液于过滤之前在所述粘土上孵育，例如在施加离心力或真空之前。所述孵育时间优选在1-30分钟范围内，如1分钟、2分钟、5分钟、10分钟或15分钟。
在本发明的一些实施方式中，使用干燥粘土矿物。
在本发明方法的其它实施方式中，所述粘土矿物经预溶胀，如在水或缓冲液中预溶胀。在一个特定实施方式中，使所述预溶胀的粘土矿物于过滤之前在膜上干燥。
本发明方法和如本发明所述的过滤装置的应用不限于过滤特定缓冲液或溶液。常用缓冲液及其优选pH范围为技术人员已知。此类缓冲液可选自下组：MES、Bis-Tris、ADA、aces、PIPES、MOPSO、Bis-Tris丙烷、BES、MOPS、TES、HEPES、DIPSO、MOBS、TAPSO、Trizma、HEPPSO、POPSO、TEA、EPPS、三(羟甲基)甲基甘氨酸(Tricine)、Gly-Gly、N,N-二(2-羟乙基)甘氨酸(Bicine)、HEPBS、TAPS、AMPD、TABS、AMPSO、CHES、CAPSO、AMP、CAPS、CABS、邻苯二甲酸盐、乙酸盐、Tris、磷酸盐和柠檬酸盐缓冲液及其混合物。在一个实施方式中，所述缓冲液或水性溶液不含大于10体积%，优选不大于5体积%，更优选不大于1体积%，甚至更优选不大于0.1体积%的甲醇、乙醇和/或异丙醇，且最优选不含甲醇、乙醇和/或异丙醇。
用于预溶胀的缓冲液的pH优选在约pH 2-pH 11的范围内，更优选在约pH 3-pH 10的范围内。甚至可更优选在约pH 3-<pH 7或约>pH 7-pH11的范围内，甚至更加优选约pH 4-pH 6的范围内，如pH 4.5-pH 5.5，或约pH 8-pH 10.5。特别优选所述缓冲液的pH约为10。
待过滤的缓冲液的pH优选在约pH 2-pH 11的范围内，更优选在约pH3-pH 10的范围内。甚至可更优选在约pH 3-<pH 7或约>pH 7-pH 11的范围内，甚至更加优选在约pH 4-pH 6的范围内，如pH 4.5-pH 5.5，或约pH 8-pH 10.5。特别优选所述缓冲液的pH约为10。
说明性实施方式中的缓冲液可以是基于2-氨基-2-羟甲基-丙烷-1,3-二醇的缓冲液(三羟甲基氨基甲烷，Tris)，优选pH约为10的Tris缓冲液。
所述溶液和/或缓冲液可包含一种或多种其它组分，所述组分独立地选自例如下组：盐(包括无机盐和有机盐)、络合剂、表面活性剂、去垢剂、离液剂、有机溶剂(如醇或酸)、着色剂、引物或核苷酸。
所述粘土矿物优选在过滤过程中不通过过滤膜，即优选滤液中没有粘土矿物。然而，在一些实施方式中，可通过附加离心或过滤步骤从滤液中去除残余的粘土矿物。
在本发明的一些实施方式中，可能还需要预处理所用的玻璃器具或塑料制品以去除不需要的蛋白质，例如通过高压灭菌、预烘烤和/或用DEPC冲洗。特别地，保持和/或保存滤液的保持器需要是无菌的且没有不需要的蛋白质。
用于去除不需要的蛋白质的方法中的过滤优选采用真空过滤装置或离心过滤装置(如离心柱)或通过重力流来进行。
本发明还涉及如本发明所述的过滤装置的应用或如本发明所述的用于(尤其在预期用于核酸处理过程如分离或纯化时)从溶液去除不需要的蛋白质的方法，所述溶液优选水性溶液，特别是上文已详述的液体组合物或缓冲液，所述不需要的蛋白质例如蛋白酶和核酸酶，特别是RNA酶和DNA酶。
包含上述过滤装置的试剂盒也在本发明的范围内。在一些实施方式中，所述试剂盒可用于从水性溶液去除不需要的蛋白质，如蛋白酶和核酸酶，特别是RNA酶和DNA酶。此外，所述试剂盒可包含水性溶液和/或非水性溶液(特别是上述液体组合物和/或缓冲液)、一种或多种相同或不同塑料耗材如管或柱、一种或多种酶如DNA酶或RNA酶(优选通过过滤装置在酶处理后去除)，和/或使用该试剂盒的说明书。
本发明装置和方法的优势是从水性溶液去除不需要的蛋白质，优选核酸酶，最优选RNA酶，而不是仅仅抑制这些蛋白质。
实施例
实施例1：确定通过离心柱上膨润土过滤来去除和/或抑制RNA酶的最优条件
向RNeasy旋转柱(恰根公司(Qiagen))各加载100μl膨润土水性溶液(在水和下列缓冲液中：氢酞酸钾pH 3；乙酸钠pH 5；MOPS pH 7；Tris pH 10；膨润土浓度：100mg/ml)(对照：无膨润土的溶液)。所述液体通过离心去除(3分钟,14000g)。通过移液向膨润土处理柱添加100μl RNA酶溶液(RNA酶浓度分别为1mg/ml、100μg/ml、10μg/ml和1μg/ml；对照：无RNA酶；储液：100mg/ml RNA酶)，并孵育15分钟。随后使所述柱以14000g离心3分钟。之后，向各2μl的流通液添加在不同pH缓冲(氢酞酸钾pH 3；乙酸钠pH 5；MOPS pH 7；Tris pH 10)的8μl的含RNA溶液(对应于约4μgRNA)并允许室温孵育15分钟。添加RNA标记物后，通过甲醛琼脂糖凝胶分离溶液。所述凝胶电泳结果示于附图3。
图3中经染色凝胶的图像显示，就所有pH值而言，在最高浓度RNA酶(图3中RNA酶浓度从左到右为：第一泳道：对照(未添加RNA酶)，然后施加1μg/ml、10μg/ml、100μg/ml、1mg/ml RNA酶)观察到完全RNA降解。就其它RNA酶浓度而言，在pH 5没有观察到降解，在pH 10观察到轻微降解，在pH 3观察到中等降解且在pH 7观察到强降解。在没有膨润土的对照实验中，除不添加RNA酶的情况(对照)以外总是观察到降解。因此，用膨润土过滤的最优pH条件为微酸性pH，如约5pH和约pH 10。
然而，使用本发明方法，能在任何测试pH观察到RNA降解的减少。
另外，测定预溶胀效果。图4显示用干燥膨润土(图4中的A)替代膨润土溶液(图4中的B)时未能观察到任何差异。

Claims (15)

1.包括上部容器和滤器的过滤装置，所述滤器包含蒙脱石粘土矿物，所述蒙脱石粘土矿物选自下组：膨润土、有机粘土和硅藻土或其组合、衍生物或类似物。
2.如权利要求1所述的过滤装置，其特征在于，所述粘土矿物被固定在膜上或限于膜之间或在滤器外壳内，其中所述一个或多个膜优选选自二氧化硅、玻璃纤维或有机膜。
3.如权利要求1-2中任一项所述的过滤装置，其特征在于，所述过滤装置还包括无菌过滤膜。
4.如权利要求1-3中任一项所述的过滤装置，其特征在于，所述过滤装置还包括滤液保持器。
5.如权利要求1-4中任一项所述的过滤装置，其特征在于，所述过滤装置是离心过滤装置或真空过滤装置或利用重力流工作的过滤装置。
6.从水性溶液去除蛋白质的方法，所述方法包括通过包含粘土矿物的过滤系统过滤所述水性溶液。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述蛋白质选自蛋白酶和核酸酶。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述粘土矿物是蒙脱石粘土，所述蒙脱石粘土选自下组：膨润土、有机粘土和硅藻土或其组合、衍生物或类似物。
9.如权利要求6、7或8中任一项所述的方法，其特征在于，所述水性溶液是用于细胞裂解或核酸纯化、表征和/或制备的缓冲液。
10.如权利要求6-9中任一项所述的方法，其特征在于，所述粘土矿物被固定在过滤膜上或限于膜之间或在滤器外壳内。
11.如权利要求6-10中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括通过无菌滤器过滤所述水性溶液。
12.如权利要求6-11中任一项所述的方法，其特征在于，所述粘土矿物是预溶胀的或其中所述粘土是干燥的。
13.如权利要求6-12中任一项所述的方法，其特征在于，所述过滤采用真空过滤装置或离心过滤装置或通过重力流来实行。
14.如权利要求1-5中任一项所述的过滤装置或如权利要求6-13中任一项所述的方法在从水性溶液去除不需要的蛋白质中的应用。
15.包含如权利要求1-5中任一项所述的过滤装置的试剂盒。
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