JP5632668B2 - 微生物の回収方法、及び微生物由来dnaの精製方法 - Google Patents
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Description
(1) (a)被検液体試料中の微生物を、セルロース膜に捕集する工程と、
(b)前記工程(a)の後、前記セルロース膜にアセトンを添加して、当該セルロース膜を溶解させる工程と、
(c)前記工程(b)の後、得られたセルロース膜溶解物に、セルロース膜に添加したアセトンの1〜10倍量の水又は緩衝液を添加してセルロース繊維を析出させる工程と、
(d)前記工程(c)の後、セルロース繊維が析出された水溶液から、アセトンを揮発除去する工程と、
を有することを特徴とする、微生物の回収方法、
(2) 前記工程(c)の後前記工程(d)の前、又は前記工程(d)の後に、前記水溶液に、1種又は2種以上のセルロースに対するブロッキング剤を添加することを特徴とする前記(1)に記載の微生物の回収方法、
(3) 前記ブロッキング剤が、スキムミルク、λ−DNA、酵母tRNA、アルブミン、カゼイン、及び動物由来のDNAからなる群より選択される1種以上であることを特徴とする前記(2)に記載の微生物の回収方法、
(4) (a)被検液体試料中の微生物を、セルロース膜に捕集する工程と、
(b)前記工程(a)の後、前記セルロース膜にアセトンを添加して、当該セルロース膜を溶解させる工程と、
(c)前記工程(b)の後、得られたセルロース膜溶解物に、セルロース膜に添加したアセトンの1〜10倍量の水又は緩衝液を添加してセルロース繊維を析出させる工程と、
(d)前記工程(c)の後、セルロース繊維が析出された水溶液から、アセトンを揮発除去する工程と、
(e)前記工程(d)の後、得られた水溶液中で、細胞壁分解酵素及びタンパク質分解酵素からなる群より選択される1種以上による分解反応を行うことにより、当該水溶液中に含まれている微生物からDNAを抽出する工程と、
(f)前記工程(e)の後、前記水溶液中に、CTABを添加し、溶解していたセルロースを不溶化する工程と、
(g)前記工程(f)の後、前記水溶液からDNAを精製する工程と、
を有することを特徴とする、微生物由来DNAの精製方法、
(5) 前記工程(c)の後前記工程(f)の前に、前記水溶液に、1種又は2種以上のセルロースに対するブロッキング剤を添加することを特徴とする前記(4)に記載の微生物由来DNAの精製方法、
(6) 前記ブロッキング剤が、スキムミルク、λ−DNA、酵母tRNA、アルブミン、カゼイン、及び動物由来のDNAからなる群より選択される1種以上であることを特徴とする前記(5)に記載の微生物由来DNAの精製方法、
(7) 前記工程(c)の後前記工程(d)の前に、前記水溶液にλ−DNA及び/又は動物由来のDNAを添加し、
前記工程(e)の後前記工程(f)の前に、前記水溶液にスキムミルク及び/又はアルブミンを添加することを特徴とする前記(6)に記載の微生物由来DNAの精製方法、
(8) 前記被検液体試料が、ビール又はビール様発泡性飲料であることを特徴とする前記(4)〜(7)のいずれか一つに記載の微生物由来DNAの精製方法、
を提供するものである。
また、本発明の微生物由来DNAの精製方法は、本発明の微生物の回収方法により回収された微生物からDNAを抽出・精製する方法であり、被検液体試料中の微生物由来DNAを、効率よく精製することができる。
本発明の微生物の回収方法は、下記工程(a)〜(d)を有することを特徴とする。
(a)被検液体試料中の微生物を、セルロース膜に捕集する工程と、
(b)前記工程(a)の後、前記セルロース膜にアセトンを添加して、当該セルロース膜を溶解させる工程と、
(c)前記工程(b)の後、得られたセルロース膜溶解物に、セルロース膜に添加したアセトンの1〜10倍量の水又は緩衝液を添加してセルロース繊維を析出させる工程と、
(d)前記工程(c)の後、セルロース繊維が析出された水溶液から、アセトンを揮発除去する工程。
本発明の微生物由来DNAの精製方法は、本発明の微生物の回収方法により回収された被検液体試料中の微生物から、DNAを抽出し精製する方法である。具体的には、前記工程(a)〜(d)に加えて、下記工程(e)〜(g)を有することを特徴とする。
(e)前記工程(d)の後、得られた水溶液中で、細胞壁分解酵素及びタンパク質分解酵素からなる群より選択される1種以上による分解反応を行うことにより、当該水溶液中に含まれている微生物からDNAを抽出する工程と、
(f)前記工程(e)の後、前記水溶液中に、CTAB(臭化セチルトリメチルアンモニウム)を添加し、溶解していたセルロースを不溶化する工程と、
(g)前記工程(f)の後、前記水溶液からDNAを精製する工程。
107CFUのLactobacillus brevisを含む300mLのビールを5本、それぞれセルロース膜(Millipore社製、製品番号:HAWG 025 00)で濾過し、当該ビール中の微生物をセルロース膜に捕集した。当該セルロース膜を完全に乾燥させた後、アセトンを添加し、3分間以上ボルテックスにて完全に溶解させた。続いて、このセルロース膜溶解物に、緩衝液〔50mM Tris/Cl(pH8.0),50mM EDTA(pH8.0),0.5% Tween−20,0.5% Triton X−100〕と10μLのλ−DNA(TOYOBO社製、コード番号:DNA−001)とを添加し、3分間以上ボルテックスにて混和させた。アセトンと緩衝液の添加の比率は、以下の表に準じた。表1中、「緩衝液/アセトン」は、緩衝液の添加量をアセトンの添加量で除した値である。
その結果、表2に示すように、アセトンの1〜9倍量の緩衝液を添加した試験区3及び4のみ、核酸の増幅が確認された。
スキムミルク及びλ−DNAの添加の有無による影響を測定した。各試験区のスキムミルク及びλ−DNAの添加の有無は、表3の通りである。
続いて、試験区3及び4の水溶液に対して、実施例1と同様にしてDNA溶液を調製した。一方で、試験区1及び2の水溶液に対しては、スキムミルクを含有しない2×CTAB緩衝液を添加した以外は、実施例1と同様にしてDNA溶液を調製した。
Claims (8)
- (a)被検液体試料中の微生物を、セルロース膜に捕集する工程と、
(b)前記工程(a)の後、前記セルロース膜にアセトンを添加して、当該セルロース膜を溶解させる工程と、
(c)前記工程(b)の後、得られたセルロース膜溶解物に、セルロース膜に添加したアセトンの1〜10倍量の水又は緩衝液を添加してセルロース繊維を析出させる工程と、
(d)前記工程(c)の後、セルロース繊維が析出された水溶液から、アセトンを揮発除去する工程と、
を有することを特徴とする、微生物の回収方法。 - 前記工程(c)の後前記工程(d)の前、又は前記工程(d)の後に、前記水溶液に、1種又は2種以上のセルロースに対するブロッキング剤を添加することを特徴とする請求項1に記載の微生物の回収方法。
- 前記ブロッキング剤が、スキムミルク、λ−DNA、酵母tRNA、アルブミン、カゼイン、及び動物由来のDNAからなる群より選択される1種以上であることを特徴とする請求項2に記載の微生物の回収方法。
- (a)被検液体試料中の微生物を、セルロース膜に捕集する工程と、
(b)前記工程(a)の後、前記セルロース膜にアセトンを添加して、当該セルロース膜を溶解させる工程と、
(c)前記工程(b)の後、得られたセルロース膜溶解物に、セルロース膜に添加したアセトンの1〜10倍量の水又は緩衝液を添加してセルロース繊維を析出させる工程と、
(d)前記工程(c)の後、セルロース繊維が析出された水溶液から、アセトンを揮発除去する工程と、
(e)前記工程(d)の後、得られた水溶液中で、細胞壁分解酵素及びタンパク質分解酵素からなる群より選択される1種以上による分解反応を行うことにより、当該水溶液中に含まれている微生物からDNAを抽出する工程と、
(f)前記工程(e)の後、前記水溶液中に、CTABを添加し、溶解していたセルロースを不溶化する工程と、
(g)前記工程(f)の後、前記水溶液からDNAを精製する工程と、
を有することを特徴とする、微生物由来DNAの精製方法。 - 前記工程(c)の後前記工程(f)の前に、前記水溶液に、1種又は2種以上のセルロースに対するブロッキング剤を添加することを特徴とする請求項4に記載の微生物由来DNAの精製方法。
- 前記ブロッキング剤が、スキムミルク、λ−DNA、酵母tRNA、アルブミン、カゼイン、及び動物由来のDNAからなる群より選択される1種以上であることを特徴とする請求項5に記載の微生物由来DNAの精製方法。
- 前記工程(c)の後前記工程(d)の前に、前記水溶液に、λ−DNA、酵母tRNA、及び動物由来のDNAからなる群より選択される一種以上を添加し、
前記工程(e)の後前記工程(f)の前に、前記水溶液に、スキムミルク、アルブミン、及びカゼインからなる群より選択される一種以上を添加することを特徴とする請求項6に記載の微生物由来DNAの精製方法。 - 前記被検液体試料が、ビール又はビール様発泡性飲料であることを特徴とする請求項4〜7のいずれか一項に記載の微生物由来DNAの精製方法。
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