JP2005176678A - 核酸の分離精製方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 (1)核酸を含む試料溶液を核酸吸着性多孔性膜に通過させて、多孔性膜内に核酸を吸着させる工程、(2)核酸が吸着した状態で、多孔性膜を洗浄する工程、及び(3)回収液を、多孔性膜に通過させて、多孔性膜内から核酸を脱着させる工程を含有する核酸の分離精製方法において、該核酸吸着性多孔性膜がイオン結合が実質的に関与しない相互作用で核酸が吸着する多孔性膜であり、且つ、該洗浄液の表面張力が35mPa・m未満であることを特徴とする核酸の分離精製方法。
【選択図】 なし
Description
本発明は、このような背景から行われたものであって、その目的は、検体中の核酸を核酸吸着性の多孔膜に吸着させた後、洗浄等を経て脱着させて核酸を分離精製する方法において、分離性能に優れ、洗浄効率が良く、簡便で、迅速で、自動化および小型化適性に優れ、実質的に同一の分離性能を有するものを大量に生産可能である多孔膜を使用した核酸の分離精製方法を提供することである。
とりわけ、上記多孔膜を使用した核酸の分離精製に適用される、残液量の低減と、核酸の分離性能の確保が両立する多孔性膜を収容したカートリッジの洗浄液を提供することである。
本発明の核酸の分離精製方法では、上記(1)、(2)及び(3)の各工程において、核酸を含む試料溶液、洗浄液又は回収液を、加圧状態で核酸吸着性多孔性膜に通過させることが好ましい。
また、上記各工程において、少なくとも二個の開口を有する容器内に該核酸吸着性多孔性膜を収容した核酸分離精製カートリッジの一の開口に、核酸を含む試料溶液、洗浄液又は回収液を注入し、カートリッジの上記一の開口に結合された圧力差発生装置を用いてカートリッジ内を加圧状態にして、該注入した各液を通過させ、他の開口より排出させることが好ましい。
したがって、本発明では、カオトロピック物質を含ませないか、又はその含有量を有機溶剤含有量と共に表面張力が少なくとも35mPa・m未満となる量に調整することによって、洗浄性を高めて、迅速洗浄と核酸試料からの不純物分離性との両立を可能にして発明の目的を達することができたものである。好ましい表面張力は、1〜30mPa・mであり、5〜25mPa・mがより好ましい。
この表面張力範囲であれば、洗浄効率が高くなるので、洗浄操作を1回ですませることが可能であり、この点でも核酸の分離精製操作を迅速化できる。また、洗浄工程と回収工程の間に乾燥工程を設ける必要もないので、この点からも簡易化と迅速化を促進させることができる。
一方、水溶性塩のカチオン成分として好ましいのは、一価または二価のカチオンであり、特にカリウム塩又はナトリウム塩が好ましく、中でもナトリウム塩が適している。
塩の濃度は10mmol/L以上含まれているのが好ましい。特に塩化ナトリウムが20mmol/L以上含まれていることが目的の効果を発揮するのに好ましい。
好ましくは、上記(1)、(2)及び(3)の各工程において、核酸を含む試料溶液、洗浄液又は回収液を、加圧状態で核酸吸着性多孔性膜に通過させるものであり、より好ましくは、上記(1)、(2)及び(3)の各工程において、少なくとも二個の開口を有する容器内に該核酸吸着性多孔性膜を収容した核酸分離精製カートリッジの一の開口に、核酸を含む試料溶液、洗浄液又は回収液を注入し、カートリッジの上記一の開口に結合された圧力差発生装置を用いてカートリッジ内を加圧状態にして、該注入した各液を通過させ、他の開口より排出させるものである。核酸を含む試料溶液、洗浄液又は回収液を加圧状態で上記多孔性膜に通過させることにより、装置をコンパクトに自動化することができ、好ましい。加圧は、好ましくは10〜200kpa、より好ましくは40〜100kpaの程度で行われる。
セリンプロテアーゼとしては、特に限定されず、例えばプロテアーゼKなどを好ましく用いることができる。
システインプロテアーゼとしては、特に限定されず、例えばパパイン、カテプシン類などを好ましく用いることができる。
金属プロテアーゼとしては、特に限定されず、例えばカルボキシペプチターゼ等を好ましく用いることができる。
タンパク質分解酵素は、添加時の反応系全容積1mlあたり好ましくは0.001IU〜10IU、より好ましくは0.01IU〜1IUの濃度で用いることができる。
また、タンパク質分解酵素は、カオトロピック塩、界面活性剤等のその他の試薬とは個別の2つ以上の試薬として供されても良い。後者の場合、タンパク質分解酵素を含む試薬を先に検体と混合した後に、カオトロピック塩、界面活性剤を含む試薬と混合される。また、カオトロピック塩、界面活性剤を含む試薬を先に混合した後に、タンパク分解酵素を混合してもよい。
また、タンパク質分解酵素を検体または、検体とカオトロピック塩、界面活性剤を含む試薬との混合液に、タンパク質分解酵素保存容器から直接目薬状に滴下させることもできる。この場合、操作を簡便にすることができる。
上記の方法で核酸を含む試料溶液を得る場合、核酸可溶化試薬およびタンパク質分解酵素の保存安定性が良く、核酸収量を変えずに操作を簡便にすることができる。
混合する際、攪拌装置により30から3000rpmで1秒から3分間混合することが好ましい。これにより、分離精製される核酸収量を増加させることができる。または、転倒混和を5から30回行うことで混合することも好ましい。また、ピペッティング操作を、10から50回行うことによっても混合することができる、この場合、簡便な操作で分離精製される核酸収量を増加させることができる。
本発明においてはノニオン界面活性剤をこのましく用いることができる。ノニオン界面活性剤は、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル系界面活性剤、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系界面活性剤、脂肪酸アルカノールアミドを用いることができるが、好ましくは、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系界面活性剤を用いることができる、さらに好ましくは、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系界面活性剤は、POEデシルエ−テル、POEラウリルエ−テル、POEトリデシルエ−テル、POEアルキレンデシルエ−テル、POEソルビタンモノラウレ−ト、POEソルビタンモノオレエ−ト、POEソルビタンモノステアレ−ト、テトラオレイン酸ポリオキシエチレンソルビット、POEアルキルアミン、POEアセチレングリコ−ルから選択されるポリオキシエチレンアルキルエーテル系界面活性剤である。
これら界面活性剤の核酸可溶化試薬溶液における濃度は0.1〜20質量%であることが好ましい。
一方、RNAなどDNA以外の核酸を回収する場合、核酸可溶化試薬溶液にDNA分解酵素を加えることが好ましい。この場合、回収された核酸に共存するDNAによる干渉を軽減することができる。また、RNA分解酵素阻害剤を加えることも好ましい。RNA分解酵素阻害剤としては、RNA分解酵素を特異的に阻害するものが好ましい。
RNA分解酵素は特に限定されず、例えば、リボヌクレアーゼ H(RNase H)等のRNA特異的分解酵素を好ましく用いることができる。
DNA分解酵素は特に限定されず、例えば、DNase I等のDNA特異的分解酵素を好ましく用いることができる。
この鹸化処理の程度(鹸化度)と多孔性膜の孔径との組合せによりにより空間的な水酸基の量(密度)をコントロールすることができる。この場合、多孔性膜は、表裏対称性の多孔性膜であってもよいが、裏非対称性の多孔性膜を好ましく使用することができる。
トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースの混合比(モル比)は、99:1〜1:99であることが好ましい。さらには、トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースの混合比は、90:10〜50:50であることが好ましい。
トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースの混合比は、99:1〜1:99である事が好ましい。さらには、トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースの混合比は、90:10〜50:50であることが好ましい。
核酸の分離効率を上げるためには、導入される水酸基の数が多い方が好ましい。例えば、鹸化率が約5%以上であることが好ましい。さらには、鹸化率が約10%以上であることが好ましい。
鹸化率を変えるには、水酸化ナトリウムの濃度を変えて鹸化処理を行えば良い。表面鹸化率は、NMRまたはIRにより、定めることができる。
有機材料の多孔性膜にグラフトポリマー鎖を結合する方法としては、多孔性膜とグラフトポリマー鎖とを化学結合させる方法と、多孔性膜を起点として重合可能な二重結合を有する化合物を重合させグラフトポリマー鎖とする2つの方法がある。
基材に結合しているグラフトポリマー鎖を形成するのに有用な化合物は、重合可能な二重結合を有しており、核酸の吸着に関与する親水基を有するという、2つの特性を兼ね備えていることが必要である。これらの化合物としては、分子内に二重結合を有していれば、親水基を有するポリマー、オリゴマー、モノマーのいずれの化合物をも用いることができる。特に有用な化合物は親水基を有するモノマーである。
多孔性膜とグラフトポリマー鎖とを化学結合にて付着させる場合は、グラフトポリマー鎖の末端の官能基と反応する官能基を無機材料に導入し、そこにグラフトポリマーを化学結合させる。また、分子内に二重結合を有している親水基を有するモノマーを使用して、多孔性膜を起点として、グラフトポリマー鎖を重合する場合は、二重結合を有する化合物を重合する際の起点となる官能基を無機材料に導入する。
親水性基を持つグラフトポリマー、および分子内に二重結合を有している親水基を有するモノマーとしては、上記、親水基を持たない有機材料の多孔性膜とグラフトポリマー鎖とを化学結合させる方法において、記載した親水性基を持つグラフトポリマー、および分子内に二重結合を有している親水基を有するモノマーを好ましく使用することができる。
特に好ましい態様は、試料溶液を注入した一の開口から洗浄液も供給し、核酸吸着性多孔性膜を通過させ、一の開口と異なる開口より排出さる方法と、試料溶液を注入した一の開口と異なる開口から洗浄液を供給し、核酸吸着性多孔性膜を通過させ、一の開口より排出さる方法である。
洗浄工程における洗浄液の液量は、2μl/mm2以上が好ましい。洗浄液量が多量であれば洗浄効果は向上するが、操作性を保ち、試料の流出を抑止するためには、200μl/mm2以下が好ましい。
また洗浄工程において、その核酸分離精製カートリッジを機械的な振動や超音波による攪拌を与えながら、または遠心分離により洗浄することもできる。
洗浄液は通常検体試料に由来する細胞膜、細胞質などの分解物と核酸との分離性を良くするためにカオトロピック物質などを含有させることもあるが、その場合は、逆にそれらが多孔性膜の保湿性を高めて、洗浄液の濡れ性がよくなって多孔性膜やカートリッジ器壁への残液が増大させることもある。また、洗浄液は、分離性を高くするために水、有機溶剤以外の成分濃度を低濃度にすることが好ましいが、それが却って多孔性膜の膨潤度を高めることになりがちである。残液量が増大すると洗浄工程に続く回収工程への洗浄液の混入量が増加して核酸の純度の低下どを引起す原因となっている。したがって、洗浄液が、次の工程に影響を及ぼさないように、カートリッジ内に洗浄残液を残留させないことは重要である。
好ましい表面張力は、1〜30mPa・mであり、5〜30mPa・mがより好ましい。
表面張力の調整によって洗浄効率が高くなるので、洗浄工程を1回ですませることが可能であり、この点でも核酸の分離精製操作を迅速化できる。また、洗浄工程と回収工程の間に乾燥工程を設ける必要もないので、この点からも簡易化と迅速化を促進させることができる。
イオン強度の調整は、洗浄液中の塩類やイオン性界面活性剤の種類と濃度などの調節によって行うことができる。
一方、水溶性塩のカチオン成分として好ましいのは、一価または二価のカチオンであり、特にカリウム塩又はナトリウム塩が好ましく、中でもナトリウム塩が適している。また、少量でイオン強度を高めるためにはマグネシウム塩を用いてもよい。
塩の濃度は10mmol/L以上含まれているのが好ましい。特に塩化ナトリウムが20mmol/L以上含まれていることが目的の効果を発揮するのに好ましいが、500mmol/L以上を加えても効果の更なる増大は起こらない。
これらの水溶性塩やイオン強度増大性化合物は、洗浄液の表面張力を多少増大させる傾向を有している。
(1)核酸精製カートリッジの作製
内径7mm、核酸吸着性多孔膜を収容する部分を持つ核酸分離精製カートリッジ用容器をハイインパクトポリスチレンで作製した。
(2)核酸吸着性多孔膜として、トリアセチルセルロ−スの多孔膜(膜厚=70μm、平均孔径=1.2μm)を鹸化処理した多孔膜(鹸化率20%)を使用し、これを上記核酸分離精製カートリッジ用容器の核酸吸着性多孔膜を収容する部分に収容した。
表1に示す処方のRNA可溶化試薬溶液及び洗浄液を調製した。洗浄液の表面張力は25℃において24mPa・mであった。
ガン化人骨髄細胞(HL60)培養液から細胞中の核酸の分離精製操作を下記の手順で行なった。すなわち、この培養液200μlに核酸可溶化試薬溶液200μlとプロテアーゼK(SIGMA製)溶液20μlを添加して60℃で10分間インキュベートした。インキュベートしたのち、エタノ−ル200μlを添加して攪拌し、攪拌後、この細胞培養試料を上記核酸吸着性多孔膜を備えた核酸分離精製カートリッジの一の開口に注入し、続いて上記一の開口に圧力発生装置(パワーピペット)を結合し、核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にし、注入した核酸を含む試料溶液を、上記核酸吸着性多孔膜に通過させることにより、上記核酸吸着性多孔膜に接触させ、核酸分離精製カートリッジの他の開口より排出する。続いて、上記核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に洗浄液を500μL注入し、上記核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に圧力発生装置を結合し、核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にし、注入した洗浄液を、上記核酸吸着性多孔膜に通過させ、他の開口より排出した。続いて、上記核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に回収液として水を200μL注入し、上記核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に圧力発生装置を結合して、核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にし、注入した回収液を、上記核酸吸着性多孔膜に通過させ、他の開口より排出し、この液を回収した。
洗浄液として表2に示した組成のものを使用した以外は、実施例1と同じ条件及び操作により、分離した核酸を含有する液を回収した。なお、洗浄液の表面張力は25℃において42mPa・mであった。
図1は、本実施例で回収された核酸試料とサイズマーカーλHINDIIIを電気泳動して得られた図である(条件:ライフテクノロジー製、1質量%アガロース、100V,30分)。図1の結果から判るように、本発明の方法によって核酸含有検体試料から核酸を回収効率よく分離精製できる。
この核酸の分離精製は、約5分の短時間で簡易な操作と装置とによって行うことができた。
Claims (15)
- (1)核酸を含む試料溶液を核酸吸着性多孔性膜に通過させて、該多孔性膜内に核酸を吸着させる工程、
(2) 洗浄液を該核酸吸着性多孔性膜に通過させて、核酸が吸着した状態で該核酸吸着性多孔性膜を洗浄する工程、及び
(3)回収液を、該核酸吸着性多孔性膜に通過させて、該多孔性膜内から核酸を脱着させる工程
を含む核酸の分離精製方法において、該核酸吸着性多孔性膜がイオン結合が実質的に関与しない相互作用で核酸が吸着する多孔性膜であり、且つ、該洗浄液の表面張力が35mPa・m未満であることを特徴とする核酸の分離精製方法。 - 上記(1)、(2)及び(3)の各工程において、核酸を含む試料溶液、洗浄液又は回収液を、加圧状態で核酸吸着性多孔性膜に通過させることを特徴とする請求項1記載の核酸の分離精製方法。
- 上記(1)、(2)及び(3)の各工程において、少なくとも二個の開口を有する容器内に該核酸吸着性多孔性膜を収容した核酸分離精製カートリッジの一の開口に、核酸を含む試料溶液、洗浄液又は回収液を注入し、カートリッジの上記一の開口に結合された圧力差発生装置を用いてカートリッジ内を加圧状態にして、該注入した各液を通過させ、他の開口より排出させることを特徴とする請求項1記載の核酸の分離精製方法。
- 洗浄液が、メタノール、エタノール、イソプロパノール又はn−プロパノール又はそれらの混合物を20〜100質量%含有する水溶液であることを特徴とする請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
- 洗浄液が、1価又は2価金属の水溶性塩を5〜1000mmol/L含む溶液であることを特徴とする請求項1〜4のいずれかに記載の方法。
- 核酸が吸着した核酸吸着性多孔性膜に洗浄液を通過させて、該核酸吸着性多孔性膜を洗浄する回数が1回であることを特徴とする請求項1〜〜5のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
- 該洗浄工程と回収工程の間に、核酸を吸着した多孔性膜を乾燥させる工程を含まないことを特徴とする請求項1〜6のいずれかに記載の核酸の分離精製方法
- 核酸吸着性多孔性膜が、水酸基を有する有機高分子材料の多孔性膜であることを特徴とする請求項1〜7のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
- 核酸吸着性多孔性膜が、多糖構造を有する多孔性膜であることを特徴とする請求項8に記載の核酸の分離精製方法。
- 核酸吸着性多孔性膜が、再生セルロースの多孔性膜であることを特徴とする請求項8又は9に記載の核酸の分離精製方法。
- 核酸を含む試料溶液が、核酸の水溶液または核酸のバッファ溶液に水溶性有機溶媒を添加した溶液であることを特徴とする請求項1〜3のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
- 核酸を含む試料溶液が、細胞又はウイルスを含む検体を核酸可溶化試薬で処理して得られた溶液に水溶性有機溶媒を添加した溶液であることを特徴とする請求項1〜3及び11のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
- 水溶性有機溶媒が、メタノール、エタノール、イソプロパノール、n−プロパノール又はそれらの混合物であることを特徴とする請求項11又は12に記載の核酸の分離精製方法。
- 核酸可溶化試薬が、カオトロピック塩、界面活性剤およびタンパク質分解酵素を含む溶液であることを特徴とする請求項12に記載の核酸の分離精製方法。
- 回収液が、塩濃度が0.5mmol/L以下の溶液であることを特徴とする請求項1〜3のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
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