JP2006217839A - 核酸の分離精製方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】 抗凝固剤を含む検体において使用する抗凝固剤の種類によらず、検体中の核酸を核酸吸着性の多孔性膜に吸着させた後、洗浄等を経て脱着させて核酸を効率よく分離精製する方法を提供すること。
【解決手段】 (1)核酸を含む試料溶液を核酸吸着性多孔性膜に通過させて、該多孔性膜内に核酸を吸着させる工程、(2)洗浄液により、核酸が吸着した状態で該多孔性膜を洗浄する工程、及び(3)回収液により、該多孔性膜内から核酸を脱着させる工程を含有する核酸の分離精製方法において、
該核酸吸着性多孔性膜がイオン結合が関与しない相互作用で核酸が吸着する多孔性膜であり、且つ、核酸を含む試料溶液を特定の試料溶液調製工程で得ることを特徴とする核酸の分離精製方法。
【選択図】 なし
【解決手段】 (1)核酸を含む試料溶液を核酸吸着性多孔性膜に通過させて、該多孔性膜内に核酸を吸着させる工程、(2)洗浄液により、核酸が吸着した状態で該多孔性膜を洗浄する工程、及び(3)回収液により、該多孔性膜内から核酸を脱着させる工程を含有する核酸の分離精製方法において、
該核酸吸着性多孔性膜がイオン結合が関与しない相互作用で核酸が吸着する多孔性膜であり、且つ、核酸を含む試料溶液を特定の試料溶液調製工程で得ることを特徴とする核酸の分離精製方法。
【選択図】 なし
Description
本発明は、核酸を分離精製する方法に関し、より詳細には、核酸を分離精製するために、検体から核酸を含む試料溶液を得る、試料溶液調製工程を含む、核酸分離精製方法に関する。
核酸は、様々な分野で種々の形態で使用されている。例えば、組換え核酸技術の領域においては、核酸をプローブ、ゲノム核酸、およびプラスミド核酸の形状で用いることを要求する。
診断分野においても、核酸は種々の方法で用いられている。例えば、核酸プローブは、ヒトの病原体の検出および診断に日常的に用いられている。同様に核酸は遺伝障害の検出に用いられている。核酸はまた食品汚染物質の検出にも用いられている。さらに、核酸は遺伝地図の作製からクローニングおよび組換え発現におよぶ種々の理由により、興味ある核酸の位置確認、同定および単離において日常的に用いられている。
多くの場合、核酸は極めて少量でしか入手できず、そして単離および精製操作が煩雑で時間を要する。このしばしば時間を消費する煩雑な操作は核酸の損失に結びつきやすい。 血清、尿およびバクテリアのカルチャーから得られた試料の核酸の精製においては、コンタミネーションおよび疑陽性の結果が生じるという危険性も加わる。
広く知られた分離精製方法の一つに、核酸を二酸化珪素、シリカポリマー、珪酸マグネシウム等の固相に吸着させ、引き続く洗浄、脱着等の操作によって分離精製する方法がある（例えば、特許文献１）。この方法は、分離性能としては優れているが、簡便性、迅速性、自動化および小型化適性においては十分でなく、同一性能の吸着媒体の工業的大量生産が困難であり、かつ取扱いが不便で、種々の形状に加工しがたい等の問題点がある。
また、簡便かつ効率よく核酸を分離精製する方法の一つとして、固相に核酸を吸着させる溶液及び固相から核酸を脱着させる溶液をそれぞれ用いて、表面に水酸基を有する有機高分子から成る固相に核酸を吸着及び脱着させることによって、核酸を分離精製する方法が記載されている（特許文献２）が、更なる改良が望まれる。
一方、従来の核酸分離精製法としては、遠心法によるもの、磁気ビーズを用いるもの、フィルターを用いるものなどがある。例えば、フィルターを用いた核酸分離性装置としては、フィルターを収容したフィルターチューブをラックに多数セットし、これに核酸を含む試料溶液を分注し、上記ラックの底部の周囲をシール材を介してエアチャンバーで密閉して内部を減圧し、全フィルターチューブを同時に排出側より吸引し試料液を通過させて核酸をフィルターに吸着し、その後、洗浄液および回収液を分注して、同様に減圧吸引して洗浄・脱着するようにした機構が提案されている（例えば、特許文献３参照）。
しかしながら、これらの自動装置は、装置が大型で多量の検体を分析するのには適するものの、検体数が少なく分析頻度の少ない場合には、高価で不向きであるとともに、処理効率が低くなる問題を有する。特に、採取全血のように各試料液の特性が異なる場合に、特許文献３のように全体を同時に吸引するものでは、一部のフィルターチューブの吸引が終了してその抵抗がなくなると、他のフィルターチューブに作用する減圧が小さくなって粘度の高い試料液の処理が終了しない場合が生じる。その減圧容量を増大することは装置の小型化を図る際の障害となり、減圧容積が大きいために減圧を作用させるまでの時間が
掛かり、また、液が全部排出されたことの検出が困難で、時間設定が長く、処理効率の向上の障害となる。さらにまた、粘度の低い試料液では、フィルターチューブより勢いよく液が排出されて、泡状の飛沫が隣接するフィルターチューブおよびラックに付着してコンタミネーションを生じ、精度低下を招く問題がある。
特公平７−５１０６５号公報
特開２００３−１２８６９１号公報
特許第２８３２５８６号公報
掛かり、また、液が全部排出されたことの検出が困難で、時間設定が長く、処理効率の向上の障害となる。さらにまた、粘度の低い試料液では、フィルターチューブより勢いよく液が排出されて、泡状の飛沫が隣接するフィルターチューブおよびラックに付着してコンタミネーションを生じ、精度低下を招く問題がある。
本発明の目的は、抗凝固剤を含む検体において使用する抗凝固剤の種類によらず、検体中の核酸を核酸吸着性の多孔性膜に吸着させた後、洗浄等を経て脱着させて核酸を効率よく分離精製する方法を提供することである。
本発明の別の目的は、分離性能に優れ、洗浄効率が良く、簡便で、迅速で、自動化および小型化適性に優れ、実質的に同一の分離性能を有するものを大量に生産可能である多孔性膜を使用した核酸の分離精製方法を提供することである。
本発明のさらに別の目的は、短時間で効率よくコンタミネーションが発生しないように処理でき、かつ、小型化が可能な、核酸分離精製装置を提供することである。
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、核酸を多孔性膜に吸着及び脱着させる過程を含む核酸の分離精製方法において、該多孔性膜としてイオン結合が関与しない相互作用で核酸が吸着する多孔性膜を用い、核酸を含む試料溶液を後述する工程により得ることによって、血液および白血球の少なくともいずれかを含み、かつ抗凝固剤を含む検体から核酸を効率よく、高純度で分離精製することができることを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。
＜１＞ （1）核酸を含む試料溶液を核酸吸着性多孔性膜に通過させて、該多孔性膜内に核酸を吸着させる工程、
（2）洗浄液を該核酸吸着性多孔性膜に通過させて、核酸が吸着した状態で該多孔性膜を洗浄する工程、及び
（3）回収液を該核酸吸着性多孔性膜に通過させて、該多孔性膜内から核酸を脱着させる工程を含有する核酸の分離精製方法において、
該核酸吸着性多孔性膜がイオン結合が関与しない相互作用で核酸が吸着する多孔性膜であり、且つ、
核酸を含む試料溶液が、
（I）血液および白血球の少なくともいずれかを含み、かつ抗凝固剤を含む検体を容器に注入する工程、
（II）上記容器に、カオトロピック塩、界面活性剤、バッファー、及びタンパク質分解酵素を添加し、検体と混合して混合液を得る工程、
（III）混合液をインキュベ−トし、インキュベ−トされた混合液を得る工程、及び
（IV）インキュベ−トされた混合液に水溶性有機溶媒を添加し、核酸を含む試料溶液を得る工程、
を含有する試料溶液調製工程で得られることを特徴とする核酸の分離精製方法。
（2）洗浄液を該核酸吸着性多孔性膜に通過させて、核酸が吸着した状態で該多孔性膜を洗浄する工程、及び
（3）回収液を該核酸吸着性多孔性膜に通過させて、該多孔性膜内から核酸を脱着させる工程を含有する核酸の分離精製方法において、
該核酸吸着性多孔性膜がイオン結合が関与しない相互作用で核酸が吸着する多孔性膜であり、且つ、
核酸を含む試料溶液が、
（I）血液および白血球の少なくともいずれかを含み、かつ抗凝固剤を含む検体を容器に注入する工程、
（II）上記容器に、カオトロピック塩、界面活性剤、バッファー、及びタンパク質分解酵素を添加し、検体と混合して混合液を得る工程、
（III）混合液をインキュベ−トし、インキュベ−トされた混合液を得る工程、及び
（IV）インキュベ−トされた混合液に水溶性有機溶媒を添加し、核酸を含む試料溶液を得る工程、
を含有する試料溶液調製工程で得られることを特徴とする核酸の分離精製方法。
＜２＞ 上記（II）の工程において、界面活性剤がノニオン系界面活性剤である、＜１＞に記載の核酸の分離精製方法。
＜３＞ ノニオン系界面活性剤がポリオキシエチレン系界面活性剤である、＜２＞に記載の核酸の分離精製方法。
＜４＞ ポリオキシエチレン系界面活性剤がポリオキシエチレンソルビタン系界面活性剤である、＜３＞に記載の核酸の分離精製方法。
＜５＞ 上記（II）の工程において、バッファーがＢｉｓＴｒｉｓ（Ｂｉｓ（２‐ｈｙｄｏｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｉｍｉｎｏｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｍｅｔｈａｎｅ）である、＜１＞〜＜４＞のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
＜６＞ 上記（II）の工程において、カオトロピック塩がグアニジウム塩である、＜１＞〜＜５＞のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
＜７＞ 上記（II）の工程において、さらに消泡剤が添加され、その含有量が０〜１０質量％である、＜１＞〜＜６＞のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
＜８＞ 上記（II）の工程において、さらに消泡剤が添加され、その含有量が０．０１〜５質量％である、＜１＞〜＜６＞のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
＜９＞ 上記（1）、（2）及び（3）の各工程において、核酸を含む試料溶液、洗浄液又は回収液を、加圧状態で核酸吸着性多孔性膜に通過させる、＜１＞〜＜８＞のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
＜８＞ 上記（II）の工程において、さらに消泡剤が添加され、その含有量が０．０１〜５質量％である、＜１＞〜＜６＞のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
＜９＞ 上記（1）、（2）及び（3）の各工程において、核酸を含む試料溶液、洗浄液又は回収液を、加圧状態で核酸吸着性多孔性膜に通過させる、＜１＞〜＜８＞のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
＜１０＞ 上記（IV）の工程において、水溶性有機溶媒が、メタノール、エタノール、プロパノールまたはその異性体、ブタノールまたはその異性体の少なくともいずれかである、＜１＞〜＜９＞のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
＜１１＞ ＜１＞〜＜１０＞のいずれかに記載の核酸分離精製方法を自動で行う装置。
＜１２＞ （ｉ）核酸分離精製カ−トリッジと、（ii）タンパク質分解酵素、（iii）カオトロピック塩、界面活性剤及びバッファー、（iv）洗浄液、および（v）回収液の試薬とを含む、＜１＞〜＜１０＞のいずれかに記載の核酸分離精製方法を行うためのキット。
＜１３＞ 上記（１）（２）（３）の工程が、
（a）核酸を含む試料溶液を、少なくとも二個の開口を有する容器内に、溶液が内部を通過可能な核酸吸着性多孔性膜を収容した核酸分離精製カ−トリッジの一の開口に注入する工程、
（b）核酸分離精製カ−トリッジの上記一の開口に結合された圧力差発生装置を用いて核酸分離精製カ−トリッジ内を加圧状態にし、注入した核酸を含む試料溶液を、核酸吸着性多孔性膜を通過させ、核酸分離精製カ−トリッジの他の開口より排出することによって、核酸吸着性多孔性膜内に核酸を吸着させる工程、
（c）核酸分離精製カ−トリッジの上記一の開口に洗浄液を注入する工程、
（d）核酸分離精製カ−トリッジの上記一の開口に結合された圧力差発生装置を用いて核酸分離精製カ−トリッジ内を加圧状態にし、注入した洗浄液を、核酸吸着性多孔性膜を通過させ、他の開口より排出することによって、核酸吸着性多孔性膜を、核酸が吸着した状態で、洗浄する工程、
（e）核酸分離精製カ−トリッジの上記一の開口に回収液を注入する工程、
（f）核酸分離精製カ−トリッジの上記一の開口に結合させて圧力差発生装置を用いて核酸分離精製カ−トリッジ内を加圧状態にし、注入した回収液を、核酸吸着性多孔性膜を通過させ、他の開口より排出することによって、核酸吸着性多孔性膜内から核酸を脱着させ、核酸分離精製カ−トリッジ容器外に排出する工程、を含む、＜１＞〜＜１０＞のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
（a）核酸を含む試料溶液を、少なくとも二個の開口を有する容器内に、溶液が内部を通過可能な核酸吸着性多孔性膜を収容した核酸分離精製カ−トリッジの一の開口に注入する工程、
（b）核酸分離精製カ−トリッジの上記一の開口に結合された圧力差発生装置を用いて核酸分離精製カ−トリッジ内を加圧状態にし、注入した核酸を含む試料溶液を、核酸吸着性多孔性膜を通過させ、核酸分離精製カ−トリッジの他の開口より排出することによって、核酸吸着性多孔性膜内に核酸を吸着させる工程、
（c）核酸分離精製カ−トリッジの上記一の開口に洗浄液を注入する工程、
（d）核酸分離精製カ−トリッジの上記一の開口に結合された圧力差発生装置を用いて核酸分離精製カ−トリッジ内を加圧状態にし、注入した洗浄液を、核酸吸着性多孔性膜を通過させ、他の開口より排出することによって、核酸吸着性多孔性膜を、核酸が吸着した状態で、洗浄する工程、
（e）核酸分離精製カ−トリッジの上記一の開口に回収液を注入する工程、
（f）核酸分離精製カ−トリッジの上記一の開口に結合させて圧力差発生装置を用いて核酸分離精製カ−トリッジ内を加圧状態にし、注入した回収液を、核酸吸着性多孔性膜を通過させ、他の開口より排出することによって、核酸吸着性多孔性膜内から核酸を脱着させ、核酸分離精製カ−トリッジ容器外に排出する工程、を含む、＜１＞〜＜１０＞のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
本発明によれば、血液および白血球の少なくともいずれかを含み、かつ抗凝固剤を含む検体から、抗凝固剤の種類によらず効率よく高純度の核酸、例えば核酸水溶液が得られる。
さらには、本発明の核酸の分離精製方法により、分離性能良く、簡便で、迅速に、自動化可能に、検体から核酸を分離精製することができる。
本発明の核酸分離精製方法は、
（1）核酸を含む試料溶液を核酸吸着性多孔性膜に通過させて、該多孔性膜内に核酸を吸着させる工程（以下、「吸着工程」とも言う。）、
（2）該核酸吸着性多孔性膜を、核酸が吸着した状態で、洗浄する工程（以下、「洗浄工程」とも言う。）、及び
（3）回収液を、該核酸吸着性多孔性膜に通過させて、該多孔性膜内から核酸を脱着させる工程（以下、「回収工程」とも言う。）
を少なくとも含むものである。
（1）核酸を含む試料溶液を核酸吸着性多孔性膜に通過させて、該多孔性膜内に核酸を吸着させる工程（以下、「吸着工程」とも言う。）、
（2）該核酸吸着性多孔性膜を、核酸が吸着した状態で、洗浄する工程（以下、「洗浄工程」とも言う。）、及び
（3）回収液を、該核酸吸着性多孔性膜に通過させて、該多孔性膜内から核酸を脱着させる工程（以下、「回収工程」とも言う。）
を少なくとも含むものである。
好ましくは、上記（1）、（2）及び（3）の各工程において、核酸を含む試料溶液、洗浄液又は回収液を、加圧状態で核酸吸着性多孔性膜に通過させるものであり、より好ましくは、上記（1）、（2）及び（3）の各工程において、少なくとも二個の開口を有する容器内に該核酸吸着性多孔性膜を収容した核酸分離精製カートリッジの一の開口に、核酸を含む試料溶液、洗浄液又は回収液を注入し、カートリッジの上記一の開口に結合された圧力差発生装置を用いてカートリッジ内を加圧状態にして、該注入した各液を通過させ、他の開口より排出させるものである。核酸を含む試料溶液、洗浄液又は回収液を加圧状態で上記多孔性膜に通過させることにより、装置をコンパクトに自動化することができ、好ましい。加圧は、好ましくは１０〜２００ｋｐａ、より好ましくは４０〜１００ｋｐａの程度で行われる。
上記（1）〜（3）の工程では、最初の核酸を含む試料溶液を注入から核酸分離精製カートリッジ外に核酸を得るまでの工程を１０分以内、好適な状況では２分以内で終了することが可能である。また、上記の核酸分精製の工程では核酸を検体中に含まれる全量に対して５０質量％以上、好適な状況では９０質量％以上の収率で得る事が可能である。
また、上記の核酸分精製方法では、１ｋｂｐから２００ｋｂｐ、特に２０ｋｂｐから１４０ｋｂｐと広範囲に及ぶ分子量の核酸を回収することができる。すなわち、従来行なわれているガラスフィルターを用いたスピンカラム法に比べて、長鎖の核酸を回収できる。
また、上記の核酸分精製方法では、紫外可視分光光度計での測定値（２６０ｎｍ／２８０ｎｍ）が、ＤＮＡの場合は１．６〜２．０、ＲＮＡの場合は１．８〜２．２となる純度を持つ核酸を回収することができ、不純物混入量の少ない高純度の核酸を定常的に得ることができる。さらには、紫外可視分光光度計での測定値（２６０ｎｍ／２８０ｎｍ）がＤＮＡの場合は１．８付近、ＲＮＡの場合は２．０付近となる純度を持つ核酸を回収することができる。
また、上記工程において、圧力差発生装置としては、注射器、ピペッタ、あるいはペリスタポンプのような加圧が可能なポンプ等、或いは、エバポレーター等の減圧可能なものが挙げられる。これらの内、手動操作には注射器が、自動操作にはポンプが適している。 また、ピペッタは片手操作が容易にできるという利点を有する。好ましくは、圧力差発生装置は、核酸分離精製カートリッジの一の開口に着脱可能に結合されている。
本発明は、少なくとも下記（Ｉ）〜（IV）の工程を含有する試料溶液調製工程で、核酸を含む試料溶液を得る。
（I）血液および白血球の少なくともいずれかを含み、かつ抗凝固剤を含む検体を容器に注入する工程、
（II）上記容器に、カオトロピック塩、界面活性剤、バッファーおよびタンパク質分解酵素を添加し、検体と混合して混合液を得る工程、
（III）混合液をインキュベ−トし、インキュベ−トされた混合液を得る工程、及び
（IV）インキュベ−トされた混合液に水溶性有機溶媒を添加し、核酸を含む試料溶液を得る工程。
（I）血液および白血球の少なくともいずれかを含み、かつ抗凝固剤を含む検体を容器に注入する工程、
（II）上記容器に、カオトロピック塩、界面活性剤、バッファーおよびタンパク質分解酵素を添加し、検体と混合して混合液を得る工程、
（III）混合液をインキュベ−トし、インキュベ−トされた混合液を得る工程、及び
（IV）インキュベ−トされた混合液に水溶性有機溶媒を添加し、核酸を含む試料溶液を得る工程。
以上の工程により、血液や白血球の細胞膜および核膜が溶解されて、核酸が水溶液内に分散し、核酸を含む試料溶液が得られる。
細胞膜および核膜を溶解して、核酸を可溶化するためには、A.赤血球の除去、B.各種タンパク質の除去、及びC.白血球の溶解及び核膜の溶解が必要となる。A.赤血球の除去およびB.各種タンパク質の除去は、膜への非特異吸着および多孔性膜の目詰まりを防ぐために、C.白血球の溶解及び核膜の溶解は、抽出の対象である核酸を可溶化させるためにそれぞれ必要となる。特に、本発明において、C.白血球の溶解及び核膜の溶解は重要である。
（I）血液および白血球の少なくともいずれかを含み、かつ抗凝固剤を含む検体を容器に注入する工程
本発明において検体は血液および白血球の少なくともいずれかを含む。血液としては例えば全血が挙げられる。また白血球は全血から得られたものも対象となる。
さらに、本発明における検体には抗凝固剤が含有される。抗凝固剤としては一般に、EDTA、ヘパリン、クエン酸ナトリウム、フッ化ナトリウム、ＡＣＤ（acid citrate dextrose solution）などが挙げられ、単独または二つ以上の組み合わせで用いられる。含有量は一般的な使用量の範囲で使用する。本発明はこれらの抗凝固剤に限られず、検体に含まれる抗凝固剤の種類によらずに、上記（１）〜（３）の工程を含む核酸分離精製方法において効率よく核酸を分離精製することができる。
本発明において検体は血液および白血球の少なくともいずれかを含む。血液としては例えば全血が挙げられる。また白血球は全血から得られたものも対象となる。
さらに、本発明における検体には抗凝固剤が含有される。抗凝固剤としては一般に、EDTA、ヘパリン、クエン酸ナトリウム、フッ化ナトリウム、ＡＣＤ（acid citrate dextrose solution）などが挙げられ、単独または二つ以上の組み合わせで用いられる。含有量は一般的な使用量の範囲で使用する。本発明はこれらの抗凝固剤に限られず、検体に含まれる抗凝固剤の種類によらずに、上記（１）〜（３）の工程を含む核酸分離精製方法において効率よく核酸を分離精製することができる。
核酸を含む検体は、単一の核酸を含む検体でもよいし、異なる複数種類の核酸を含む検体でもよい。回収する核酸の種類は、ＤＮＡやＲＮＡ等、特に制限されない。検体の数は一つでも複数（複数の容器を用いての複数の検体の並列処理）であってもよい。回収する核酸の長さも特に限定されず、例えば、数ｂｐ〜数Ｍｂｐの任意の長さの核酸を使用することができる。取扱い上の観点からは、回収する核酸の長さは一般的には、数ｂｐ〜数百ｋｂｐ程度である。本発明の核酸分離精製方法は、従来の簡易的な核酸分離精製方法より比較的長い核酸を迅速に取り出すことができ、好ましくは５０ｋｂｐ以上、より好ましくは７０ｋｂｐ、更に好ましくは１００ｋｂｐ以上の核酸を回収することに用いることができる。
検体を注入する容器としては、限定されないが、プラスチック製のチューブやガラス製のバイアルや試験管などが好ましい。これらの容器が、ヌクレアーゼフリーかつパイロジェンフリーであれば、より好ましい。
検体を容器に注入する際の注入方法としては、限定はされないが、ピペットやスポイトなどの実験用器具を使用するのが好ましい。これらの器具が、ヌクレアーゼフリーかつパイロジェンフリーであれば、より好ましい。
容器への注入は特に限定なく、何れの方法、器具を用いることもできる。
検体を容器に注入する際の注入方法としては、限定はされないが、ピペットやスポイトなどの実験用器具を使用するのが好ましい。これらの器具が、ヌクレアーゼフリーかつパイロジェンフリーであれば、より好ましい。
容器への注入は特に限定なく、何れの方法、器具を用いることもできる。
（II）上記容器に、カオトロピック塩、界面活性剤、バッファー及びタンパク質分解酵素を添加し、検体と混合して混合液を得る工程
本発明では、カオトロピック塩、界面活性剤、バッファー及びタンパク質分解酵素により、検体に含まれる細胞膜および核膜を溶解して核酸を可溶化する。以下、本発明において、便宜上、カオトロピック塩、界面活性剤及びバッファーを含む試薬を「核酸可溶化試薬原薬」という。さらにタンパク質分解酵素を含む試薬を「核酸可溶化試薬」という。「核酸可溶化試薬原薬」および「核酸可溶化試薬」は、溶液であっても、後述のように乾燥物であってもよい。溶液を用いることが好ましい。また、後述するように、カオトロピック塩、界面活性剤、バッファー及びタンパク質分解酵素以外の成分を含んでもよい。
本発明では、カオトロピック塩、界面活性剤、バッファー及びタンパク質分解酵素により、検体に含まれる細胞膜および核膜を溶解して核酸を可溶化する。以下、本発明において、便宜上、カオトロピック塩、界面活性剤及びバッファーを含む試薬を「核酸可溶化試薬原薬」という。さらにタンパク質分解酵素を含む試薬を「核酸可溶化試薬」という。「核酸可溶化試薬原薬」および「核酸可溶化試薬」は、溶液であっても、後述のように乾燥物であってもよい。溶液を用いることが好ましい。また、後述するように、カオトロピック塩、界面活性剤、バッファー及びタンパク質分解酵素以外の成分を含んでもよい。
カオトロピック塩としては、特に限定は無く公知のカオトロピック塩を使用することができる。グアニジン塩、イソチアン酸ナトリウム、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウム等を使用することができる。中でもグアニジン塩が好ましい。グアニジン塩としては、塩酸グアニジン、イソチオシアン酸グアニジン、グアニジンチオシアン酸塩（チオシアン酸グアニジン）が挙げられ、中でも塩酸グアニジンまたはグアニジンチオシアン酸塩が好ましい。これらの塩は単独でも、複数組み合わせて用いてもよい。
カオトロピック塩の核酸可溶化試薬溶液における濃度は、０．５ｍｏｌ／Ｌ以上であることが好ましく、より好ましくは０．５ｍｏｌ／Ｌ〜７ｍｏｌ／Ｌ、さらに好ましくは、１ｍｏｌ／Ｌ〜６ｍｏｌ／Ｌである。
カオトロピック塩の核酸可溶化試薬溶液における濃度は、０．５ｍｏｌ／Ｌ以上であることが好ましく、より好ましくは０．５ｍｏｌ／Ｌ〜７ｍｏｌ／Ｌ、さらに好ましくは、１ｍｏｌ／Ｌ〜６ｍｏｌ／Ｌである。
界面活性剤としては、例えば、ノニオン系界面活性剤、カチオン系界面活性剤、アニオン系界面活性剤、両性界面活性剤が挙げられる。
本発明においてはノニオン系界面活性剤をこのましく用いることができる。ノニオン系界面活性剤は、好ましくは、ポリオキシエチレン（以下、ＰＯＥとも言う。）系界面活性剤を用いることができる。例えば、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル系界面活性剤、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系界面活性剤、脂肪酸アルカノールアミドを用いることができる。さらに好ましくは、ＰＯＥデシルエ−テル、ＰＯＥラウリルエ−テル、ＰＯＥトリデシルエ−テル、ＰＯＥアルキレンデシルエ−テル、ＰＯＥソルビタンモノラウレ−ト、ＰＯＥソルビタンモノオレエ−ト、ＰＯＥソルビタンモノステアレ−ト、テトラオレイン酸ポリオキシエチレンソルビット、ＰＯＥアルキルアミン、ＰＯＥアセチレングリコ−ルから選択されるポリオキシエチレンアルキルエーテル系界面活性剤である。特に好ましくは、ＰＯＥソルビタンモノラウレ−ト、ＰＯＥソルビタンモノオレエ−ト、ＰＯＥソルビタンモノステアレ−トから選択されるポリオキシエチレンソルビタン系界面活性剤である。
界面活性剤の核酸可溶化試薬溶液における濃度は、０．１〜５０質量％であることが好ましく、より好ましくは１〜３０質量％、更に好ましくは２〜２０質量％である。
本発明においてはノニオン系界面活性剤をこのましく用いることができる。ノニオン系界面活性剤は、好ましくは、ポリオキシエチレン（以下、ＰＯＥとも言う。）系界面活性剤を用いることができる。例えば、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル系界面活性剤、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系界面活性剤、脂肪酸アルカノールアミドを用いることができる。さらに好ましくは、ＰＯＥデシルエ−テル、ＰＯＥラウリルエ−テル、ＰＯＥトリデシルエ−テル、ＰＯＥアルキレンデシルエ−テル、ＰＯＥソルビタンモノラウレ−ト、ＰＯＥソルビタンモノオレエ−ト、ＰＯＥソルビタンモノステアレ−ト、テトラオレイン酸ポリオキシエチレンソルビット、ＰＯＥアルキルアミン、ＰＯＥアセチレングリコ−ルから選択されるポリオキシエチレンアルキルエーテル系界面活性剤である。特に好ましくは、ＰＯＥソルビタンモノラウレ−ト、ＰＯＥソルビタンモノオレエ−ト、ＰＯＥソルビタンモノステアレ−トから選択されるポリオキシエチレンソルビタン系界面活性剤である。
界面活性剤の核酸可溶化試薬溶液における濃度は、０．１〜５０質量％であることが好ましく、より好ましくは１〜３０質量％、更に好ましくは２〜２０質量％である。
バッファーとしては、通常用いられるｐＨ緩衝剤（ｂｕｆｆｅｒ）を挙げることができる。好ましくは、生化学用のｐＨ緩衝剤が挙げられる。このような緩衝剤としては、クエン酸塩、リン酸塩または酢酸塩を含む緩衝剤、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ＴＥ（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／ＥＤＴＡ）、ＴＢＥ（Ｔｒｉｓ−Ｂｏｒａｔｅ／ＥＤＴＡ）、ＴＡＥ（Ｔｒｉｓ−Ａｃｅｔａｔｅ／ＥＤＴＡ）、グッド緩衝剤が挙げられる。グッド緩衝剤としては、ＭＥＳ（２‐Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（Ｂｉｓ（２‐ｈｙｄｏｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｉｍｉｎｏｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｍｅｔｈａｎｅ）、ＨＥＰＥＳ（２‐［４‐（２‐Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）‐１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ］ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、ＰＩＰＥＳ（Ｐｉｐｅｒａｘｉｎｅ‐１，４‐ｂｉｓ（２‐ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ））、ＡＣＥＳ（Ｎ‐（２‐Ａｃｅｔａｍｉｎｏ）−２‐ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、ＣＡＰＳ（Ｎ‐Ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ−３‐ａｍｉｎｏｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、ＴＥＳ（Ｎ‐Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ−２‐ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）が挙げられる。中でもＢｉｓ−Ｔｒｉｓ（Ｂｉｓ（２‐ｈｙｄｏｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｉｍｉｎｏｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｍｅｔｈａｎｅ）がこのましい。
これらのバッファーは、核酸可溶化試薬中の濃度は１〜５００ｍｍｏｌ／Ｌであることが好ましい。より好ましくは２０〜４００ｍｍｏｌ／Ｌであり、更に好ましくは５０〜３００ｍｍｏｌ／Ｌである。
これらのバッファーは、核酸可溶化試薬中の濃度は１〜５００ｍｍｏｌ／Ｌであることが好ましい。より好ましくは２０〜４００ｍｍｏｌ／Ｌであり、更に好ましくは５０〜３００ｍｍｏｌ／Ｌである。
核酸可溶化試薬原薬、核酸可溶化試薬溶液は、好ましくはｐＨ５〜１０、より好ましくはｐＨ５．５〜７．５のものが用いられる。
タンパク質分解酵素を含む核酸可溶化試薬を使用することにより、核酸の回収量及び回収効率が向上し、必要な核酸を含む検体の微量化及び迅速化が可能となる。
タンパク質分解酵素は、セリンプロテア−ゼ、システインプロテア−ゼ、金属プロテア−ゼなどから、少なくとも１つのタンパク質分解酵素を好ましく用いることができる。また、タンパク質分解酵素は、複数種以上のタンパク質分解酵素の混合物も好ましく用いることができる。
セリンプロテアーゼとしては、特に限定されず、例えばプロテアーゼＫなどを好ましく用いることができる。
システインプロテアーゼとしては、特に限定されず、例えばパパイン、カテプシン類などを好ましく用いることができる。
金属プロテアーゼとしては、特に限定されず、例えばカルボキシペプチターゼ等を好ましく用いることができる。
タンパク質分解酵素は、添加時の反応系全容積１ｍｌあたり好ましくは０．００１ＩＵ〜１０ＩＵ、より好ましくは０．０１ＩＵ〜１ＩＵの濃度で用いることができる。
セリンプロテアーゼとしては、特に限定されず、例えばプロテアーゼＫなどを好ましく用いることができる。
システインプロテアーゼとしては、特に限定されず、例えばパパイン、カテプシン類などを好ましく用いることができる。
金属プロテアーゼとしては、特に限定されず、例えばカルボキシペプチターゼ等を好ましく用いることができる。
タンパク質分解酵素は、添加時の反応系全容積１ｍｌあたり好ましくは０．００１ＩＵ〜１０ＩＵ、より好ましくは０．０１ＩＵ〜１ＩＵの濃度で用いることができる。
また、タンパク質分解酵素は、核酸分解酵素を含まないタンパク質分解酵素を好ましく用いることができる。さらにまた、安定化剤を含んだタンパク質分解酵素を好ましく用いることができる。
安定化剤としては、金属イオンを好ましく用いることができる。具体的には、マグネシウムイオンが好ましく、例えば塩化マグネシウムなどの形で添加することができる。タンパク質分解酵素に安定化剤を含ませることにより、核酸の回収に必要なタンパク質分解酵素の微量化が可能となり、核酸の回収に必要なコストを低減することができる。タンパク質分解酵素の安定化剤は、反応系全量に対して好ましくは１〜１０００ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは１０〜１００ｍｍｏｌ／Ｌの濃度で含有することが好ましい。
安定化剤としては、金属イオンを好ましく用いることができる。具体的には、マグネシウムイオンが好ましく、例えば塩化マグネシウムなどの形で添加することができる。タンパク質分解酵素に安定化剤を含ませることにより、核酸の回収に必要なタンパク質分解酵素の微量化が可能となり、核酸の回収に必要なコストを低減することができる。タンパク質分解酵素の安定化剤は、反応系全量に対して好ましくは１〜１０００ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは１０〜１００ｍｍｏｌ／Ｌの濃度で含有することが好ましい。
タンパク質分解酵素は、予めカオトロピック塩、界面活性剤等のその他の試薬とともに混合されて１つの試薬（核酸可溶化試薬）として核酸の回収に供されても良い。
また、タンパク質分解酵素を含まずにカオトロピック塩、界面活性剤等のその他の試薬を核酸可溶化試薬原薬とし、タンパク質分解酵素とは個別の、２つ以上の試薬として供されても良い。後者の場合、タンパク質分解酵素を含む試薬を先に検体と混合した後に、核酸可溶化試薬原薬と混合される。また、核酸可溶化試薬原薬を先に混合した後に、タンパク分解酵素を混合してもよい。
また、タンパク質分解酵素を検体または、検体と核酸可溶化試薬原薬との混合液に、タンパク質分解酵素保存容器から直接目薬状に滴下させることもできる。この場合、操作を簡便にすることができる。
また、タンパク質分解酵素を含まずにカオトロピック塩、界面活性剤等のその他の試薬を核酸可溶化試薬原薬とし、タンパク質分解酵素とは個別の、２つ以上の試薬として供されても良い。後者の場合、タンパク質分解酵素を含む試薬を先に検体と混合した後に、核酸可溶化試薬原薬と混合される。また、核酸可溶化試薬原薬を先に混合した後に、タンパク分解酵素を混合してもよい。
また、タンパク質分解酵素を検体または、検体と核酸可溶化試薬原薬との混合液に、タンパク質分解酵素保存容器から直接目薬状に滴下させることもできる。この場合、操作を簡便にすることができる。
核酸可溶化試薬原薬、核酸可溶化試薬は、乾燥された状態で供給されることも好ましい。また、凍結乾燥のように乾燥された状態のタンパク質分解酵素を予め含む容器を用いることができる。上記の、乾燥された状態で供給される核酸可溶化試薬原薬、および乾燥された状態のタンパク質分解酵素を予め含む容器の両方を用いて、検体と混合された混合液を得ることもできる。
上記の方法で検体と混合された混合液を得る場合、核酸可溶化試薬原薬およびタンパク質分解酵素の保存安定性が良く、核酸収量を変えずに操作を簡便にすることができる。
上記の方法で検体と混合された混合液を得る場合、核酸可溶化試薬原薬およびタンパク質分解酵素の保存安定性が良く、核酸収量を変えずに操作を簡便にすることができる。
ＤＮＡなどＲＮＡ以外の核酸を回収する場合、核酸可溶化試薬原液または核酸可溶化試薬にＲＮＡ分解酵素を加えることが好ましい。この場合、回収された核酸に共存するＲＮＡによる干渉を軽減することができる。また、ＤＮＡ分解酵素阻害剤を加えることも好ましい。
一方、ＲＮＡなどＤＮＡ以外の核酸を回収する場合、核酸可溶化試薬原液または核酸可溶化試薬にＤＮＡ分解酵素を加えることが好ましい。この場合、回収された核酸に共存するＤＮＡによる干渉を軽減することができる。また、ＲＮＡ分解酵素阻害剤を加えることも好ましい。ＲＮＡ分解酵素阻害剤としては、ＲＮＡ分解酵素を特異的に阻害するものが好ましい。
ＲＮＡ分解酵素は特に限定されず、例えば、リボヌクレアーゼ Ｈ（ＲＮａｓｅ Ｈ）等のＲＮＡ特異的分解酵素を好ましく用いることができる。
ＤＮＡ分解酵素は特に限定されず、例えば、ＤＮａｓｅ Ｉ等のＤＮＡ特異的分解酵素を好ましく用いることができる。
核酸分解酵素および核酸分解酵素阻害剤は、通常用いられる濃度で用いることが出来る。また、通常どおり加温処理することができる。加温処理は、タンパク質分解酵素による処理と同時におこなうことがこのましい。
一方、ＲＮＡなどＤＮＡ以外の核酸を回収する場合、核酸可溶化試薬原液または核酸可溶化試薬にＤＮＡ分解酵素を加えることが好ましい。この場合、回収された核酸に共存するＤＮＡによる干渉を軽減することができる。また、ＲＮＡ分解酵素阻害剤を加えることも好ましい。ＲＮＡ分解酵素阻害剤としては、ＲＮＡ分解酵素を特異的に阻害するものが好ましい。
ＲＮＡ分解酵素は特に限定されず、例えば、リボヌクレアーゼ Ｈ（ＲＮａｓｅ Ｈ）等のＲＮＡ特異的分解酵素を好ましく用いることができる。
ＤＮＡ分解酵素は特に限定されず、例えば、ＤＮａｓｅ Ｉ等のＤＮＡ特異的分解酵素を好ましく用いることができる。
核酸分解酵素および核酸分解酵素阻害剤は、通常用いられる濃度で用いることが出来る。また、通常どおり加温処理することができる。加温処理は、タンパク質分解酵素による処理と同時におこなうことがこのましい。
カオトロピック塩、界面活性剤、バッファー及びタンパク質分解酵素を添加し、検体と混合する方法は、特に限定されない。
混合する際、攪拌装置により３０から３０００ｒｐｍで１秒から３分間混合することが好ましい。これにより、分離精製される核酸収量を増加させることができる。または、転倒混和を５から３０回行うことで混合することも好ましい。また、ピペッティング操作を、１０から５０回行うことによっても混合することができる、この場合、簡便な操作で分離精製される核酸収量を増加させることができる。
混合する際、攪拌装置により３０から３０００ｒｐｍで１秒から３分間混合することが好ましい。これにより、分離精製される核酸収量を増加させることができる。または、転倒混和を５から３０回行うことで混合することも好ましい。また、ピペッティング操作を、１０から５０回行うことによっても混合することができる、この場合、簡便な操作で分離精製される核酸収量を増加させることができる。
（III）混合液をインキュベ−トし、インキュベ−トされた混合液を得る工程
混合液を、タンパク質分解酵素の至適温度および反応時間でインキュベ−トすることにより、分離精製される核酸の収量を増加させることがきる。インキュベーション温度は、通常２０℃〜７０℃、好ましくはタンパク分解酵素の至適温度であり、インキュベーション時間は通常１〜９０分、好ましくはタンパク分解酵素の至適反応時間である。インキュベーション方法は特に限定されず、湯浴や加温器に入れることで行うことができる。
混合液を、タンパク質分解酵素の至適温度および反応時間でインキュベ−トすることにより、分離精製される核酸の収量を増加させることがきる。インキュベーション温度は、通常２０℃〜７０℃、好ましくはタンパク分解酵素の至適温度であり、インキュベーション時間は通常１〜９０分、好ましくはタンパク分解酵素の至適反応時間である。インキュベーション方法は特に限定されず、湯浴や加温器に入れることで行うことができる。
（IV）インキュベ−トされた混合液に水溶性有機溶媒を添加し、核酸を含む試料溶液を得る工程
インキュベ−トされた混合液に添加する水溶性有機溶媒は、アルコールを好ましく用いることができる。アルコールは、１級アルコール、２級アルコール、３級アルコールのいずれでもよく、メタノール、エタノール、プロパノールまたはその異性体、ブタノールまたはその異性体を好ましく用いることができる。これらを混合して用いてもよい。これら水溶性有機溶媒の核酸を含む試料溶液における最終濃度は、５〜９０質量％であることが好ましい。
インキュベ−トされた混合液に添加する水溶性有機溶媒は、アルコールを好ましく用いることができる。アルコールは、１級アルコール、２級アルコール、３級アルコールのいずれでもよく、メタノール、エタノール、プロパノールまたはその異性体、ブタノールまたはその異性体を好ましく用いることができる。これらを混合して用いてもよい。これら水溶性有機溶媒の核酸を含む試料溶液における最終濃度は、５〜９０質量％であることが好ましい。
上記の試料溶液調製工程において、核酸を含む試料溶液には、消泡剤を含有させることも好ましい。消泡剤は試料溶液調製工程に含まれるいずれの工程において添加してもよく、核酸可溶化試薬原薬または核酸可溶化試薬に含まれてもよく、また、水溶性有機溶媒を添加した後でもよい。
上記消泡剤としては、シリコン系消泡剤とアルコール系消泡剤の２つの成分が好ましく
挙げられ、また、アルコール系消泡剤としては、アセチレングリコール系界面活性剤が好ましい。
上記消泡剤としては、シリコン系消泡剤とアルコール系消泡剤の２つの成分が好ましく
挙げられ、また、アルコール系消泡剤としては、アセチレングリコール系界面活性剤が好ましい。
消泡剤の具体例としては、シリコン系消泡剤（例えば、シリコーンオイル、ジメチルポリシロキサン、シリコーンエマルジョン、変性ポリシロキサン、シリコーンコンパウンドなど）、アルコール系消泡剤（例えば、アセチレングリコール、ヘプタノール、エチルエキサノール、高級アルコール、ポリオキシアルキレングリコールなど）、エーテル系消泡剤（例えば、ヘプチルセロソルブ、ノニルセロソルブ−３−ヘプチルコルビトールなど）、油脂系消泡剤（例えば、動植物油など）、脂肪酸系消泡剤（例えば、ステアリン酸、オレイン酸、パルミチン酸など）、金属セッケン系消泡剤（例えば、ステアリン酸アルミ、ステアリン酸カルシウムなど）、脂肪酸エステル系消泡剤（例えば、天然ワックス、トリブチルホスフェートなど）、リン燐酸エステル系消泡剤（例えば、オクチルリン酸ナトリウムなど）、アミン系消泡剤（例えば、ジアミルアミンなど）、アミド系消泡剤（例えば、ステアリン酸アミドなど）、その他の消泡剤（例えば、硫酸第二鉄、ボーキサイトなど）などが挙げられる。特に好ましくは、消泡剤として、シリコン系消泡剤とアルコール系消泡剤の２つの成分を組み合わせて使用することができる。また、アルコール系消泡剤としては、アセチレングリコール系界面活性剤を使用することも好ましい。
消泡剤の含有量としては、０〜１０質量％であることが好ましく、より好ましくは０．０１〜５質量％である。
また、得られた核酸を含む試料溶液は、表面張力は０．０５Ｊ／ｍ２以下であることが好ましく、また、粘度は、１〜１００００ｍＰａであることが好ましく、比重は、０．８〜１．２であることが好ましい。
（１）吸着工程
以下に、本発明で用いる核酸吸着性多孔性膜および吸着工程について説明する。
本発明の核酸吸着性多孔性膜は、溶液が内部を通過可能なものである。ここで「溶液が内部を通過可能」とは、膜の一方の面が接する空間と膜の他方の面が接する空間の間に圧力差を生じさせた場合に、高圧の空間側から低圧の空間側へと、膜の内部を溶液が通過することが可能であることを意味する。または、膜に遠心力を掛けた場合に、遠心力の方向に、膜の内部を溶液が通過することが可能であることを意味する。
以下に、本発明で用いる核酸吸着性多孔性膜および吸着工程について説明する。
本発明の核酸吸着性多孔性膜は、溶液が内部を通過可能なものである。ここで「溶液が内部を通過可能」とは、膜の一方の面が接する空間と膜の他方の面が接する空間の間に圧力差を生じさせた場合に、高圧の空間側から低圧の空間側へと、膜の内部を溶液が通過することが可能であることを意味する。または、膜に遠心力を掛けた場合に、遠心力の方向に、膜の内部を溶液が通過することが可能であることを意味する。
本発明の核酸吸着性多孔性膜は、イオン結合が実質的に関与しない相互作用で核酸が吸着する多孔性膜であることを特徴とする。これは、多孔性膜側の使用条件で「イオン化」していないことを意味し、環境の極性を変化させることで、核酸と多孔性膜が引き合うようになると推定される。これにより分離性能に優れ、しかも洗浄効率よく、核酸を単離精製することができる。好ましくは、核酸吸着性多孔性膜は、親水基を有する多孔性膜であり、環境の極性を変化させることで、酢酸と多孔性膜の親水基同士が引きあるようになると推定される。ここで、親水基を有する多孔性膜とは、多孔性膜を形成する材料自体が、親水性基を有する多孔性膜、または多孔性膜を形成する材料を処理またはコーティングすることによって親水基を導入した多孔性膜を意味する。多孔性膜を形成する材料は有機物、無機物のいずれでも良い。例えば、多孔性膜を形成する材料自体が親水基を有する有機材料である多孔性膜、親水基を持たない有機材料の多孔性膜を処理して親水基を導入した多孔性膜、親水基を持たない有機材料の多孔性膜に対し親水基を有する材料でコーティングして親水基を導入した多孔性膜、多孔性膜を形成する材料自体が親水基を有する無機材料である多孔性膜、親水基を持たない無機材料の多孔性膜を処理して親水基を導入した多孔性膜、親水基を持たない無機材料の多孔性膜に対し親水基を有する材料でコーティングして親水基を導入した多孔性膜などを、使用することができるが、加工の容易性から、多孔性膜を形成する材料は有機高分子などの有機材料を用いることが好ましい。
親水基とは、水との相互作用を持つことができる有極性の基（原子団）を指し、核酸の吸着に関与する全ての基（原子団）が当てはまる。親水基としては、水との相互作用の強さが中程度のもの（化学大事典、共立出版株式会社発行、「親水基」の項の「あまり親水性の強くない基」参照）が良く、例えば、水酸基、カルボキシル基、シアノ基、オキシエチレン基などを挙げることができる。好ましくは水酸基である。
親水基を有する多孔性膜としては、水酸基を有する有機材料の多孔性膜を挙げることができる。水酸基を有する有機材料としては、特開２００３−１２８６９１号公報に記載の、アセチルセルロースの表面鹸化物が挙げられる。アセチルセルロースしては、モノアセチルセルロース、ジアセチルセルロース、トリアセチルセルロースの何れでもよいが、特にはトリアセチルセルロースが好ましい。この場合、鹸化処理の程度（鹸化率）で固相表面の水酸基の量（密度）をコントロールすることができる。核酸の分離効率を挙げるためには、水酸基の量（密度）が多い方が好ましい。例えば、トリアセチルセルロースなどのアセチルセルロースの場合には、鹸化率（表面鹸化率）が約５％以上であることが好ましく、１０％以上であることが更に好ましい。また、水酸基を有する有機高分子の表面積を大きくするために、アセチルセルロースの多孔性膜を鹸化処理することが好ましい。この場合、多孔性膜は、表裏対称性の多孔性膜であってもよいが、裏非対称性の多孔性膜を好ましく使用することができる。
鹸化処理とは、アセチルセルロースを鹸化処理液（例えば水酸化ナトリウム水溶液）に接触させることを言う。これにより、鹸化処理液に接触したアセチルセルロースの部分に、再生セルロースとなり水酸基が導入される。
鹸化率を変えるには、水酸化ナトリウムの濃度を変えて鹸化処理を行えば良い。鹸化率は、ＮＭＲ、ＩＲ又はＸＰＳにより、容易に測定することができる（例えば、カルボニル基のピーク減少の程度で定めることができる）。
鹸化率を変えるには、水酸化ナトリウムの濃度を変えて鹸化処理を行えば良い。鹸化率は、ＮＭＲ、ＩＲ又はＸＰＳにより、容易に測定することができる（例えば、カルボニル基のピーク減少の程度で定めることができる）。
水酸基を有する有機材料の多孔性膜としては、ポリヒドロキシエチルアクリル酸、ポリヒドロキシエチルメタアクリル酸、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリオキシエチレン、アセチルセルロース、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物などで、形成された多孔性膜を挙げることができるが、特に多糖構造を有する有機材料の多孔性膜を好ましく使用することができる。
特に、水酸基を有する有機材料の多孔性膜としては、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物から成る有機高分子の多孔性膜を好ましく使用することができる。アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物として、トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースの混合物、トリアセチルセルロースとモノアセチルセルロースの混合物、トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースとモノアセチルセルロースの混合物、ジアセチルセルロースとモノアセチルセルロースの混合物を好ましく使用する事ができる。
特にトリアセチルセルロースとジアセチルセルロースの混合物を好ましく使用することができる。トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースの混合比（質量比）は、９９：１〜１：９９である事が好ましく、９０：１０〜５０：５０である事がより好ましい。
特にトリアセチルセルロースとジアセチルセルロースの混合物を好ましく使用することができる。トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースの混合比（質量比）は、９９：１〜１：９９である事が好ましく、９０：１０〜５０：５０である事がより好ましい。
また、水酸基を有する有機材料の多孔性膜としては、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物を鹸化処理した有機材料からなる多孔性膜を好ましく用いることができる。アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物を鹸化処理した有機材料としては、トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースの混合物の鹸化物、トリアセチルセルロースとモノアセチルセルロースの混合物の鹸化物、トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースとモノアセチルセルロースの混合物の鹸化物、ジアセチルセルロースとモノアセチルセルロースの混合物の鹸化物も好ましく使用する事ができる。特に、トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースの混合物の鹸化物を好ましく使用することができる。
トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースの混合比（質量比）は、９９：１〜１：９９である事が好ましい。さらには、トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースの混合比は、９０：１０〜５０：５０である事が好ましい。
トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースの混合比（質量比）は、９９：１〜１：９９である事が好ましい。さらには、トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースの混合比は、９０：１０〜５０：５０である事が好ましい。
また、水酸基を有する有機材料の多孔性膜としては、セルロースの多孔性膜を好ましく使用する事ができる。セルロースの多孔性膜としては、再生セルロースの多孔性膜を好ましく使用する事ができる。再生セルロースとは、アセチルセルロースの固体の表面または全体を、鹸化処理によりセルロース化したもので、本来のセルロースとは、結晶状態等の点で異なっている。
親水基を持たない有機材料の多孔性膜に親水基を導入する方法として、ポリマー鎖内または側鎖に親水基を有すグラフトポリマー鎖を多孔性膜に結合することができる。
有機材料の多孔性膜にグラフトポリマー鎖を結合する方法としては、多孔性膜とグラフトポリマー鎖とを化学結合させる方法と、多孔性膜を起点として重合可能な二重結合を有する化合物を重合させグラフトポリマー鎖とする２つの方法がある。
有機材料の多孔性膜にグラフトポリマー鎖を結合する方法としては、多孔性膜とグラフトポリマー鎖とを化学結合させる方法と、多孔性膜を起点として重合可能な二重結合を有する化合物を重合させグラフトポリマー鎖とする２つの方法がある。
まず、多孔性膜とグラフトポリマー鎖とを化学結合にて付着させる方法においては、ポリマーの末端または側鎖に多孔性膜と反応する官能基を有するポリマーを使用し、この官能基と、多孔性膜の官能基とを化学反応させることでグラフトさせることができる。多孔性膜と反応する官能基としては、多孔性膜の官能基と反応し得るものであれば特に限定はないが、例えば、アルコキシシランのようなシランカップリング基、イソシアネート基、アミノ基、水酸基、カルボキシル基、スルホン酸基、リン酸基、エポキシ基、アリル基、メタクリロイル基、アクリロイル基等を挙げることができる。
ポリマーの末端、または側鎖に反応性官能基を有するポリマーとして特に有用な化合物は、トリアルコキシシリル基をポリマー末端に有するポリマー、アミノ基をポリマー末端に有するポリマー、カルボキシル基をポリマー末端に有するポリマー、エポキシ基をポリマー末端に有するポリマー、イソシアネート基をポリマー末端に有するポリマーが挙げられる。この時に使用されるポリマーとしては、核酸の吸着に関与する親水基を有するものであれば特に限定はないが、具体的には、ポリヒドロキシエチルアクリル酸、ポリヒドロキシエチルメタアクリル酸及びそれらの塩、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸及びそれらの塩、ポリオキシエチレンなどを挙げることができる。
多孔性膜を基点として重合可能な二重結合を有する化合物を重合させ、グラフトポリマー鎖を形成させる方法は、一般的には表面グラフト重合と呼ばれる。表面グラフト重合法とは、プラズマ照射、光照射、加熱などの方法で基材表面上に活性種を与え、多孔性膜と接するように配置された重合可能な二重結合を有する化合物を重合によって多孔性膜と結合させる方法を指す。
基材に結合しているグラフトポリマー鎖を形成するのに有用な化合物は、重合可能な二重結合を有しており、核酸の吸着に関与する親水基を有するという、２つの特性を兼ね備えていることが必要である。これらの化合物としては、分子内に二重結合を有していれば、親水基を有するポリマー、オリゴマー、モノマーのいずれの化合物をも用いることができる。特に有用な化合物は親水基を有するモノマーである。
基材に結合しているグラフトポリマー鎖を形成するのに有用な化合物は、重合可能な二重結合を有しており、核酸の吸着に関与する親水基を有するという、２つの特性を兼ね備えていることが必要である。これらの化合物としては、分子内に二重結合を有していれば、親水基を有するポリマー、オリゴマー、モノマーのいずれの化合物をも用いることができる。特に有用な化合物は親水基を有するモノマーである。
特に有用な親水基を有するモノマーの具体例としては、次のモノマーを挙げることができる。例えば、２−ヒドロキシエチルアクリレート、２−ヒドロキシエチルメタクリレート、グリセロールモノメタクリレート等の水酸性基含有モノマーを特に好ましく用いることができる。また、アクリル酸、メタアクリル酸等のカルボキシル基含有モノマー、もし
くはそのアルカリ金属塩及びアミン塩も好ましく用いることができる。
くはそのアルカリ金属塩及びアミン塩も好ましく用いることができる。
親水基を持たない有機材料の多孔性膜に親水基を導入する別の方法として、親水基を有する材料をコーティングすることができる。コーティングに使用する材料は、核酸の吸着に関与する親水基を有するものであれば特に限定はないが、作業の容易さから有機材料のポリマーが好ましい。ポリマーとしては、ポリヒドロキシエチルアクリル酸、ポリヒドロキシエチルメタアクリル酸及びそれらの塩、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸及びそれらの塩、ポリオキシエチレン、アセチルセルロース、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物などを挙げることができるが、多糖構造を有するポリマーが好ましい。
また、親水基を持たない有機材料の多孔性膜に、アセチルセルロースまたは、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物をコーティングした後に、コーティングしたアセチルセルロースまたは、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物を鹸化処理することもできる。この場合、鹸化率が約５％以上であることが好ましい。さらには、鹸化率が約１０％以上であることが好ましい。
親水基を有する無機材料である多孔性膜としては、シリカ化合物を含有する多孔性膜を挙げることができる。シリカ化合物を含有する多孔性膜としては、ガラスフィルターを挙げることができる。また、特許公報第３０５８３４２号に記載されているような、多孔質のシリカ薄膜を挙げることができる。この多孔質のシリカ薄膜とは、二分子膜形成能を有するカチオン型の両親媒性物質の展開液を基板上に展開した後、基板上の液膜から溶媒を除去することによって両親媒性物質の多層二分子膜薄膜を調整し、シリカ化合物を含有する溶液に多層二分子膜薄膜を接触させ、次いで前記多層二分子膜薄膜を抽出除去することで作製することができる。
親水基を持たない無機材料の多孔性膜に親水基を導入する方法としては、多孔性膜とグラフトポリマー鎖とを化学結合させる方法と、分子内に二重結合を有している親水基を有するモノマーを使用して、多孔性膜を起点として、グラフトポリマー鎖を重合する２つの方法がある。
多孔性膜とグラフトポリマー鎖とを化学結合にて付着させる場合は、グラフトポリマー鎖の末端の官能基と反応する官能基を無機材料に導入し、そこにグラフトポリマーを化学結合させる。また、分子内に二重結合を有している親水基を有するモノマーを使用して、多孔性膜を起点として、グラフトポリマー鎖を重合する場合は、二重結合を有する化合物を重合する際の起点となる官能基を無機材料に導入する。
親水性基を持つグラフトポリマー、および分子内に二重結合を有している親水基を有するモノマーとしては、上記、親水基を持たない有機材料の多孔性膜とグラフトポリマー鎖とを化学結合させる方法において、記載した親水性基を持つグラフトポリマー、および分子内に二重結合を有している親水基を有するモノマーを好ましく使用することができる。
多孔性膜とグラフトポリマー鎖とを化学結合にて付着させる場合は、グラフトポリマー鎖の末端の官能基と反応する官能基を無機材料に導入し、そこにグラフトポリマーを化学結合させる。また、分子内に二重結合を有している親水基を有するモノマーを使用して、多孔性膜を起点として、グラフトポリマー鎖を重合する場合は、二重結合を有する化合物を重合する際の起点となる官能基を無機材料に導入する。
親水性基を持つグラフトポリマー、および分子内に二重結合を有している親水基を有するモノマーとしては、上記、親水基を持たない有機材料の多孔性膜とグラフトポリマー鎖とを化学結合させる方法において、記載した親水性基を持つグラフトポリマー、および分子内に二重結合を有している親水基を有するモノマーを好ましく使用することができる。
親水基を持たない無機材料の多孔性膜に親水基を導入する別の方法として、親水基を有する材料をコーティングすることができる。コーティングに使用する材料は、核酸の吸着に関与する親水基を有するものであれば特に限定はないが、作業の容易さから有機材料のポリマーが好ましい。ポリマーとしては、ポリヒドロキシエチルアクリル酸、ポリヒドロキシエチルメタアクリル酸及びそれらの塩、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸及びそれらの塩、ポリオキシエチレン、アセチルセルロース、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物などを挙げることができる。
また、親水基を持たない無機材料の多孔性膜に、アセチルセルロースまたは、アセチル
価の異なるアセチルセルロースの混合物をコーティングした後に、コ−ティングしたアセチルセルロ−スまたは、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物を鹸化処理することもできる。この場合、鹸化率が約５％以上であることが好ましい。さらには、鹸化率が約１０％以上であることが好ましい。
価の異なるアセチルセルロースの混合物をコーティングした後に、コ−ティングしたアセチルセルロ−スまたは、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物を鹸化処理することもできる。この場合、鹸化率が約５％以上であることが好ましい。さらには、鹸化率が約１０％以上であることが好ましい。
親水基を持たない無機材料の多孔性膜としては、アルミニウム等の金属、ガラス、セメント、陶磁器等のセラミックス、もしくはニューセラミックス、シリコン、活性炭等を加工して作製した多孔性膜を挙げることができる。
上記の、溶液が内部を通過可能な核酸吸着性多孔性膜としては、厚さが１０μｍ〜５００μｍである多孔性膜を用いる事ができる。さらに好ましくは、厚さが５０μｍ〜２５０μｍである多孔性膜を用いる事ができる。洗浄がし易い点で、厚さが薄いほど好ましい。
また、溶液が内部を通過可能な核酸吸着性多孔性膜としては、最小孔径が０．２２μｍ以上である多孔性膜を用いる事ができる。さらに好ましくは、最小孔径が０．５μｍ以上である多孔性膜を用いる事ができる。また、溶液が内部を通過可能な核酸吸着性多孔性膜としては、最大孔径と最小孔径の比が２以上である多孔性膜を用いる事が好ましい。これにより、核酸が吸着するのに十分な表面積が得られるとともに、目詰まりし難い。さらに好ましくは、最大孔径と最小孔径の比が５以上である多孔性膜を用いる。
また、溶液が内部を通過可能な核酸吸着性多孔性膜としては、空隙率が５０〜９５％である多孔性膜を用いる事ができる。さらに好ましくは、空隙率が６５〜８０％である多孔性膜を用いる事ができる。また、溶液が内部を通過可能な核酸吸着性多孔性膜としては、バブルポイントが、０．１〜１０ｋｇｆ／ｃｍ2である多孔性膜を用いる事ができる。さらに好ましくは、バブルポイントが、０．２〜４ｋｇｆ／ｃｍ2である多孔性膜を用いる事ができる。
また、溶液が内部を通過可能な核酸吸着性多孔性膜としては、圧力損失が、０．１〜１００ｋＰａである多孔性膜を用いる事が好ましい。これにより、過圧時に均一な圧力が得られ、好ましい。さらに好ましくは、圧力損失が、０．５〜５０ｋＰａである多孔性膜を用いる事ができる。ここで、圧力損失とは、膜の厚さ１００μｍあたり、水を通過させるのに必要な最低圧力である。
また、溶液が内部を通過可能な核酸吸着性多孔性膜としては、また、２５℃で１ｋｇ／ｃｍ2の圧力で水を通過させたときの透水量が、膜１ｃｍ2あたり１分間で１〜５０００ｍＬである多孔性膜を用いることができる。さらに好ましくは、２５℃で１ｋｇ／ｃｍ2の圧力で水を通過させたときの透水量が、膜１ｃｍ2あたり１分間で５〜１０００ｍＬである多孔性膜を用いることができる
また、溶液が内部を通過可能な核酸吸着性多孔性膜としては、多孔性膜1ｍｇあたりの核酸の吸着量が０．１μｇ以上である多孔性膜を好ましく使用する事ができる。さらに好ましくは、多孔性膜１ｍｇあたりの核酸の吸着量が０．９μｇ以上である多孔性膜を用いることができる。
また、溶液が内部を通過可能な核酸吸着性多孔性膜としては、一辺が５ｍｍの正方形の多孔性膜をトリフルオロ酢酸５ｍＬに浸漬したときに、１時間以内では溶解しないが４８時間以内に溶解するセルロース誘導体からなる多孔性膜を好ましく使用する事ができる。 また、一辺が５ｍｍの正方形の多孔質膜をトリフルオロ酢酸５ｍＬに浸漬したときに１時間以内に溶解するが、ジクロロメタン５ｍＬに浸漬したときには２４時間以内に溶解しないセルロース誘導体からなる多孔性膜を好ましく使用する事ができる。
核酸吸着性多孔性膜中を、核酸を含む試料溶液を通過させる場合、試料溶液を一方の面から他方の面へと通過させることが、液を多孔性膜へ均一に接触させることができる点で、好ましい。核酸吸着性多孔性膜中を、核酸を含む試料溶液を通過させる場合、試料溶液を核酸吸着性多孔性膜の孔径が大きい側から小さい側に通過させることが、目詰まりし難い点で、好ましい。
核酸を含む試料溶液を核酸吸着性多孔性膜を通過させる場合の流速は、液の多孔性膜への適切な接触時間を得るために、膜の面積ｃｍ2あたり、２〜１５００μＬ/secである事が好ましい。液の多孔性膜への接触時間が短すぎると十分な分離精製効果が得られず、長すぎると操作性の点から好ましくない。さらに、上記流速は、膜の面積ｃｍ2あたり、５〜７００μＬ/secである事が好ましい。
また、使用する溶液が内部を通過可能な核酸吸着性多孔性膜は、１枚であってもよいが、複数枚を使用することもできる。複数枚の核酸吸着性多孔性膜は、同一のものであっても、異なるものであって良い。
少なくとも二個の開口を有する容器内に、上記のような溶液が内部を通過可能な核酸吸着性多孔性膜を収容した核酸分離精製カートリッジを好ましく使用することができる。また、少なくとも二個の開口を有する容器内に、上記のような溶液が内部を通過可能な核酸吸着性多孔性膜を複数枚収容した核酸分離精製カートリッジを好ましく使用することができる。この場合、少なくとも二個の開口を有する容器内に収容される複数枚の核酸吸着性多孔性膜は、同一のものであっても、異なるものであって良い。
複数枚の核酸吸着性多孔性膜は、無機材料の核酸吸着性多孔性膜と有機材料の核酸吸着性多孔性膜との組合せであっても良い。例えば、ガラスフィルターと再生セルロースの多孔性膜との組合せを挙げることができる。また、複数枚の核酸吸着性多孔性膜は、無機材料の核酸吸着性多孔性膜と有機材料の核酸非吸着性多孔性膜との組合せであってもよい、例えば、ガラスフィルターと、ナイロンまたはポリスルホンの多孔性膜との組合せを挙げることができる。
核酸分離精製カートリッジは、少なくとも二個の開口を有する容器内に、上記のような溶液が内部を通過可能な核酸吸着性多孔性膜を収容する以外、その他の部材を収容していないことが好ましい。上記の容器の材料としては、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリ塩化ビニルなどのプラスチックを使用することができる。また、生分解性の材料も好ましく使用することができる。また、上記の容器は透明であっても、着色してあっても良い。
核酸分離精製カートリッジとして、個々の核酸分離精製カートリッジを識別する手段を備えている核酸分離精製カートリッジを使用する事ができる。個々の核酸分離精製カートリッジを識別する手段としては、バーコード、磁気テープなどが挙げられる。
また、少なくとも二個の開口を有する容器内から核酸吸着性多孔性膜を容易に取り出す事が可能になっている構造を有した核酸分離精製カートリッジを使用することもできる。
上記に記載した、各々の溶液が内部を通過可能な核酸吸着性多孔性膜を収容する核酸分離精製カートリッジを用いて、以下の工程で核酸を分離精製することができる。
すなわち、（a）核酸を含む試料溶液を、少なくとも二個の開口を有する容器内に、溶液が内部を通過可能な、核酸吸着性多孔性膜を収容した核酸分離精製カートリッジの一の開口に注入する工程、（b）核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に結合された圧力差発生装置を用いて核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にし、注入した核酸を含む試料溶液を、核酸吸着性多孔性膜を通過させ、核酸分離精製カートリッジの他の開口より排出することによって、核酸吸着性多孔性膜内に核酸を吸着させる工程、（c）核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に洗浄液を注入する工程、（d）核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に結合された圧力差発生装置を用いて核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にし、注入した洗浄液を、核酸吸着性多孔性膜を通過させ、他の開口より排出することによって、核酸吸着性多孔性膜を、核酸が吸着した状態で、洗浄する工程、（e）核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に回収液を注入する工程、（f）核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に結合された圧力差発生装置を用いて核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にし、注入した回収液を、核酸吸着性多孔性膜を通過させ、他の開口より排出することによって、核酸吸着性多孔性膜内から核酸を脱着させ、核酸分離精製カートリッジ容器外に排出する工程が挙げることができる。
すなわち、（a）核酸を含む試料溶液を、少なくとも二個の開口を有する容器内に、溶液が内部を通過可能な、核酸吸着性多孔性膜を収容した核酸分離精製カートリッジの一の開口に注入する工程、（b）核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に結合された圧力差発生装置を用いて核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にし、注入した核酸を含む試料溶液を、核酸吸着性多孔性膜を通過させ、核酸分離精製カートリッジの他の開口より排出することによって、核酸吸着性多孔性膜内に核酸を吸着させる工程、（c）核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に洗浄液を注入する工程、（d）核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に結合された圧力差発生装置を用いて核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にし、注入した洗浄液を、核酸吸着性多孔性膜を通過させ、他の開口より排出することによって、核酸吸着性多孔性膜を、核酸が吸着した状態で、洗浄する工程、（e）核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に回収液を注入する工程、（f）核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に結合された圧力差発生装置を用いて核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にし、注入した回収液を、核酸吸着性多孔性膜を通過させ、他の開口より排出することによって、核酸吸着性多孔性膜内から核酸を脱着させ、核酸分離精製カートリッジ容器外に排出する工程が挙げることができる。
また、別の態様としては、（a）核酸を含む試料溶液を、少なくとも二個の開口を有する容器内に、溶液が内部を通過可能な、核酸吸着性多孔性膜を収容した核酸分離精製カートリッジの一の開口に注入する工程、（b）核酸分離精製カートリッジの他の開口に結合された圧力差発生装置を用いて核酸分離精製カートリッジ内を減圧状態にし、注入した核酸を含む試料溶液を、核酸吸着性多孔性膜を通過させ、核酸分離精製カートリッジの上記他の開口より排出することによって、核酸吸着性多孔性膜内に核酸を吸着させる工程、（c）核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に洗浄液を注入する工程、（d）核酸分離精製カートリッジの上記他の開口に結合された圧力差発生装置を用いて核酸分離精製カートリッジ内を減圧状態にし、注入した洗浄液を、核酸吸着性多孔性膜を通過させ、上記他の開口より排出することによって、核酸吸着性多孔性膜を、核酸が吸着した状態で、洗浄する工程、（e）核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に回収液を注入する工程、（f）核酸分離精製カートリッジの上記他の開口に結合された圧力差発生装置を用いて核酸分離精製カートリッジ内を減圧状態にし、又は核酸分離精製カートリッジに遠心力を作用させ、注入した回収液を、核酸吸着性多孔性膜を通過させ、上記他の開口より排出することによって、核酸吸着性多孔性膜内から核酸を脱着させ、核酸分離精製カートリッジ容器外に排出する工程をおこなうことができる。
また、別の核酸分離精製工程としては、（a）核酸を含む試料溶液を、少なくとも二個の開口を有する容器内に、溶液が内部を通過可能な、核酸吸着性多孔性膜を収容した核酸分離精製カートリッジの一の開口に注入する工程、（b）核酸分離精製カートリッジに遠心力を作用させ、注入した核酸を含む試料溶液を、核酸吸着性多孔性膜を通過させ、核酸分離精製カートリッジの他の開口より排出することによって、核酸吸着性多孔性膜内に核酸を吸着させる工程、（c）核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に洗浄液を注入する工程、（d）核酸分離精製カートリッジに遠心力を作用させ、注入した洗浄液を、核酸吸着性多孔性膜を通過させ、他の開口より排出することによって、核酸吸着性多孔性膜を、核酸が吸着した状態で、洗浄する工程、（e）核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に回収液を注入する工程、（f）核酸分離精製カートリッジに遠心力を作用させ、注入した回収液を、核酸吸着性多孔性膜を通過させ、他の開口より排出することによって、核酸吸着性多孔性膜内から核酸を脱着させ、核酸分離精製カートリッジ容器外に排出する工程を行うこともできる。
（２）洗浄工程
以下、洗浄工程について説明する。
洗浄を行うことにより、核酸の回収量及び純度が向上し、必要な核酸を含む検体の量を微量とすることができる。また、洗浄や回収操作を自動化することによって、操作が簡便かつ迅速に行うことが可能になる。洗浄工程は、迅速化のためには1回の洗浄で済ませてもよく、また純度がより重要な場合には複数回洗浄を繰返すことが好ましい。
以下、洗浄工程について説明する。
洗浄を行うことにより、核酸の回収量及び純度が向上し、必要な核酸を含む検体の量を微量とすることができる。また、洗浄や回収操作を自動化することによって、操作が簡便かつ迅速に行うことが可能になる。洗浄工程は、迅速化のためには1回の洗浄で済ませてもよく、また純度がより重要な場合には複数回洗浄を繰返すことが好ましい。
洗浄工程において、洗浄液は、チューブ、ピペット、又は自動注入装置、もしくはこれらと同じ機能をもつ供給手段を使用して、核酸吸着性多孔性膜を収容した核酸分離精製カートリッジへ供給される。供給された洗浄液は、核酸分離精製カートリッジの一の開口（核酸を含む試料溶液を注入した開口）から供給され、該開口に結合された圧力差発生装置（例えばスポイド、注射器、ポンプ、パワーピペットなど）を用いて核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にして核酸吸着性多孔性膜を通過させ、一の開口と異なる開口より排出させることができる。また、洗浄液を一の開口から供給し、同じ一の開口より排出させることもできる。さらには、核酸分離精製カートリッジの核酸を含む試料溶液を供給した一の開口と異なる開口より洗浄液を供給し、排出させることも可能である。しかしながら、核酸分離精製カートリッジの一の開口から供給し、核酸吸着性多孔性膜を通過させ、一の開口と異なる開口より排出さる方法が洗浄効率が優れてより好ましい。
洗浄工程における洗浄液の液量は、２μｌ/ｍｍ2以上が好ましい。洗浄液量が多量であれば洗浄効果は向上するが、操作性を保ち、試料の流出を抑止するためには、２００μｌ/ｍｍ2以下が好ましい。
洗浄工程における洗浄液の液量は、２μｌ/ｍｍ2以上が好ましい。洗浄液量が多量であれば洗浄効果は向上するが、操作性を保ち、試料の流出を抑止するためには、２００μｌ/ｍｍ2以下が好ましい。
洗浄工程において、洗浄液を核酸吸着性多孔性膜を通過させる場合の流速は、膜の単位面積（ｃｍ2）あたり、２〜１５００μＬ/secであることが好ましく、５〜７００μＬ/secであることがより好ましい。通過速度を下げて時間を掛ければ洗浄がそれだけ十分に行なわれることになるが、核酸の分離精製操作の迅速化も重要であるので上記した範囲が選択される。
洗浄工程において、洗浄液の液温は４〜７０℃であることが好ましい。さらには、洗浄液の液温を室温とすることがより好ましい。
また洗浄工程において、その核酸分離精製カートリッジを器械的な振動や超音波による攪拌を与えながら、または遠心分離により洗浄することもできる。
また洗浄工程において、その核酸分離精製カートリッジを器械的な振動や超音波による攪拌を与えながら、または遠心分離により洗浄することもできる。
洗浄工程において、洗浄液には、一般的には核酸分解酵素のような酵素を含ませないが、タンパク質等の夾雑物質を分解する酵素を含ませることができる。また、場合によってはＤＮＡ分解酵素、ＲＮＡ分解酵素などを含ませることもできる。ＤＮＡ分解酵素を含む洗浄液を使用することにより、検体中のＲＮＡのみを選択的に回収することができる。逆に、ＲＮＡ分解酵素を含む洗浄液を使用することにより、検体中のＤＮＡのみを選択的に回収することができる。
洗浄工程において、洗浄液は、水溶性有機溶媒及び/または水溶性塩を含んでいる溶液であることが好ましい。洗浄液は、核酸吸着性多孔性膜に核酸と共に吸着した試料溶液中の不純物を洗い流す機能を有する必要がある。そのためには、核酸吸着性多孔性膜から核酸は脱着させないが不純物は脱着させる組成であることが必要である。この目的には、アルコール等の水溶性有機溶媒が核酸が難溶性であるので、核酸を保持したまま核酸以外の成分を脱着させるのに適している。また、水溶性塩を添加することにより、核酸の吸着効果が高まるので、不要成分の選択的除去作用が向上する。
洗浄液に含まれる水溶性有機溶媒としては、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ｎ−イソプロパノール、ブタノール、アセトンなどを用いることができ、中でもエタノ―ルを用いることが好ましい。洗浄液中に含まれる水溶性有機溶媒の量は、２０〜１００質量％であることが好ましく、４０〜８０質量％であることがより好ましい。
一方、洗浄液に含まれる水溶性塩は、ハロゲン化物の塩であることが好ましく、中でも塩化物が好ましい。また、水溶性塩は、一価または二価のカチオンであることが好ましく、特にアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩が好ましく、中でもナトリウム塩及びカリウム塩が好ましくナトリウム塩が最も好ましい。
水溶性塩が洗浄液中に含まれる場合、その濃度は１０ｍｍｏｌ／Ｌ以上であることが好ましく、その上限は不純物の溶解性を損なわない範囲であれば特に問わないが、１ｍｏｌ／Ｌ以下であることが好ましく、０．１ｍｏｌ／Ｌ以下であることがより好ましい。
とりわけ、水溶性塩が塩化ナトリウムであり、さらには、塩化ナトリウムが２０ｍｍｏｌ／Ｌ以上含まれていることが特に好ましい。
水溶性塩が洗浄液中に含まれる場合、その濃度は１０ｍｍｏｌ／Ｌ以上であることが好ましく、その上限は不純物の溶解性を損なわない範囲であれば特に問わないが、１ｍｏｌ／Ｌ以下であることが好ましく、０．１ｍｏｌ／Ｌ以下であることがより好ましい。
とりわけ、水溶性塩が塩化ナトリウムであり、さらには、塩化ナトリウムが２０ｍｍｏｌ／Ｌ以上含まれていることが特に好ましい。
洗浄液は、カオトロピック物質を含んでいないことが好ましい。それによって、洗浄工程に引き続く回収工程にカオトロピック物質が混入する可能性を減らすことができる。回収工程時に、カオトロピック物質が混入すると、しばしばＰＣＲ反応等の酵素反応を阻害するので、後の酵素反応等を考慮すると洗浄液にカオトロピック物質を含まないことが理想的である。また、カオトロピック物質は、腐食性で有害であるので、この点でもカオトロピック物質を用いないで済むことは、実験者にとっても試験操作の安全上極めて有利である。
ここで、カオトロピック物質とは、前記のカオトロピック塩のほか、尿素などが含まれる。
ここで、カオトロピック物質とは、前記のカオトロピック塩のほか、尿素などが含まれる。
従来、核酸分離精製工程における洗浄工程の際、洗浄液がカ−トリジなどの容器に対する濡れ性が高いため、しばしば洗浄液が容器中に残留することになり、洗浄工程に続く回収工程への洗浄液の混入して核酸の純度の低下や次工程における反応性の低下などの原因となっている。したがって、カ−トリッジなどの容器を用いて核酸の吸着及び脱着を行う場合、吸着、洗浄時に用いる液、特に洗浄液が、次の工程に影響を及ぼさないように、カートリッジ内に洗浄残液が残留しないことは重要である。
したがって、洗浄工程における洗浄液が次工程の回収液に混入することを防止して、洗浄液のカ−トリッジ内への残留を最小限に留めるため、洗浄液の表面張力を０．０３５Ｊ／ｍ２未満にすることが好ましい。表面張力を低くすれば洗浄液とカートリッジの濡れ性が向上し、残留する液量を抑えることができる。
逆に、洗浄工程における洗浄液のカートリッジへの残留を減少させる目的で、洗浄液の表面張力を０．０３５Ｊ／ｍ２以上にして、カートリッジとの撥水性を高めて液滴を形成させ、その液滴が流れ落ちることによって残留する液量を抑えることもできる。核酸を吸着した多孔性膜、回収液、洗浄液の組合せなどによっていずれかの表面張力が選択される。
本発明に係る核酸吸着性多孔性膜を利用して洗浄工程を簡素化することができる。（イ）洗浄液が核酸吸着性多孔性膜を通過する回数を1回でよい、（ロ）洗浄工程を室温でできる。（ハ）洗浄後、直ちに回収液をカートリッジに注入することができる。（ニ）前記（イ）、（ロ）、（ハ）のいずれか1つもしくは２つ以上のも可能である。従来法においては、洗浄液中に含まれる有機溶媒を迅速に取り除くため、しばしば乾燥工程を必要としたが、本発明に係る核酸吸着性多孔性膜は薄膜であるためにこれを省略できるからである。
従来、核酸分離精製工程において、洗浄工程の際、しばしば洗浄液が飛散し他に付着することによって、試料のコンタミネーション（汚染）が起きることが問題となっている。 洗浄工程におけるこの種のコンタミネーションは、二個の開口を有する容器内に核酸吸着性多性孔膜を収容した核酸分離精製カートリッジと廃液容器の形状とを工夫することによって抑止することができる。
以下に核酸吸着性多性孔膜から核酸を脱着させて回収する工程について示す。
回収工程において、回収液は、チューブ、ピペット、又は自動注入装置、もしくはこれ
らと同じ機能をもつ供給手段を使用して、核酸吸着性多孔性膜を装着した核酸分離精製カートリッジへ供給される。回収液は、核酸分離精製カートリッジの一の開口（核酸を含む試料溶液を注入した開口）から供給され、該開口に結合された圧力差発生装置（例えばスポイド、注射器、ポンプ、パワーピペットなど）を用いて核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にして核酸吸着性多孔性膜を通過させ、一の開口と異なる開口より排出させることができる。また、回収液を一の開口から供給し、同じ一の開口より排出させることもできる。さらには、核酸分離精製カートリッジの核酸を含む試料溶液を供給した一の開口と異なる開口より回収液を供給し、排出させることも可能である。しかしながら、核酸分離精製カートリッジの一の開口から供給し、核酸吸着性多孔性膜を通過させ、一の開口と異なる開口より排出さる方法が回収効率が優れてより好ましい。
回収工程において、回収液は、チューブ、ピペット、又は自動注入装置、もしくはこれ
らと同じ機能をもつ供給手段を使用して、核酸吸着性多孔性膜を装着した核酸分離精製カートリッジへ供給される。回収液は、核酸分離精製カートリッジの一の開口（核酸を含む試料溶液を注入した開口）から供給され、該開口に結合された圧力差発生装置（例えばスポイド、注射器、ポンプ、パワーピペットなど）を用いて核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にして核酸吸着性多孔性膜を通過させ、一の開口と異なる開口より排出させることができる。また、回収液を一の開口から供給し、同じ一の開口より排出させることもできる。さらには、核酸分離精製カートリッジの核酸を含む試料溶液を供給した一の開口と異なる開口より回収液を供給し、排出させることも可能である。しかしながら、核酸分離精製カートリッジの一の開口から供給し、核酸吸着性多孔性膜を通過させ、一の開口と異なる開口より排出さる方法が回収効率が優れてより好ましい。
検体から調整した核酸を含む試料溶液の体積に対して、回収液の体積を調整して核酸の脱着を行うことができる。分離精製された核酸を含む回収液量は、そのとき使用する検体量による。一般的によく使われる回収液量は数１０から数１００μｌであるが、検体量が極微量である時や、逆に大量の核酸を分離精製したい場合には回収液量は１μｌから数１０ｍｌの範囲で変える事ができる。
回収液としては好ましくは精製蒸留水、Ｔｒｉｓ／ＥＤＴＡバッファ等が使用できる。 また、回収した核酸をＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）に供する場合、ＰＣＲ反応において用いる緩衝溶液 （例えば、ＫＣｌ ５０ｍｍｏｌ／Ｌ、Ｔｒｉｓ−Ｃｌ １０ｍｍｏｌ／Ｌ、ＭｇＣｌ2 １．５ｍｍｏｌ／Ｌを最終濃度とする水溶液）を用いることもできる。
回収液のｐＨは、ｐＨ２〜１１であることが好ましい。さらには、ｐＨ５〜９であることが好ましい。また特にイオン強度と塩濃度は吸着核酸の溶出に効果を及ぼす。回収液は、２９０ｍｍｏｌ／Ｌ以下のイオン強度であることが好ましく、さらには、９０ｍｍｏｌ／Ｌ以下の塩濃度であることが好ましい。こうすることで、核酸の回収率が向上し、より多くの核酸を回収できることができる。回収される核酸は１本鎖でもよく、２本鎖でも良い。
回収液の体積を当初の核酸を含む試料溶液の体積と比較して少なくすることによって、濃縮された核酸を含む回収液を得ることができる。好ましくは、（回収液体積）：（試料溶液体積）＝１：１００〜９９：１００、更に好ましくは、（回収液体積）：（試料溶液体積）＝１：１０〜９：１０にすることができる。これにより核酸分離精製後工程において濃縮のための操作をすることなく、簡単に核酸を濃縮できる。これらの方法により検体よりも核酸が濃縮されている核酸溶液を得る方法を提供できる。
また別の方法としては、回収液の体積を当初の核酸を含む試料溶液よりも多い条件で核酸の脱着を行うことにより、希望の濃度の核酸を含む回収液を得ることができ、次工程（ＰＣＲなど）に適した濃度の核酸を含む回収液を得ることができる。好ましくは、（回収液体積）：（試料溶液体積）＝１：１〜５０：１、更に好ましくは、（回収液体積）：（試料溶液体積）＝１：１〜５：１にすることができる。これにより核酸分離精製後に濃度調整をする煩雑さがなくなるというメリットを得られる。更に、十分量の回収液を使用することにより、多孔性膜からの核酸回収率の増加を図ることができる。
また、目的に応じて回収液の温度を変化させることで簡便に核酸を回収することができる。例えば、回収液の温度を０〜１０℃にして多孔性膜からの核酸の脱着を行うことで、酵素による分解を防止する何らかの試薬や特別な操作を加えることなく核酸分解酵素の働きを抑制して、核酸の分解を防ぎ、簡便に、効率よく核酸溶液を得ることができる。
また、回収液の温度を１０〜３５℃とした場合、一般的な室温で核酸の回収を実施することが出来、複雑な工程を必要とせずに核酸を脱着させて分離精製することができる。
また別の方法としては、回収液の温度を高温、例えば３５〜７０℃することで、多孔性膜からの核酸の脱着を煩雑な操作を経ず簡便に高い回収率で実施することができる。
回収液の注入回数は限定されるものではなく、１回でも複数回でもよい。通常、迅速、簡便に核酸を分離精製する場合は、１回の回収で実施するが、大量の核酸を回収する場合等複数回にわたり回収液を注入する事がある。
回収工程においては、核酸の回収液をその後の後工程に使用できる組成にしておくことが可能である。分離精製された核酸は、しばしばＰＣＲ（ポリメラ−ゼチェインリアクション）法により増幅される。この場合、分離精製された核酸溶液はＰＣＲ法に適したバッファ−液で希釈する必要がある。本方法による回収工程において、回収液にＰＣＲ法に適したバッファー液を用いることで、その後のＰＣＲ工程へ簡便、迅速に移行することができる。
また、回収工程において、核酸の回収液に回収した核酸の分解を防ぐための安定化剤を添加しておくことも可能である。安定化剤としては、抗菌剤、抗カビ剤や核酸分解抑制剤などを添加することができる。核酸分解酵素の阻害剤としてはＥＤＴＡなどが上げられる。また別の実施態様として、回収容器にあらかじめ安定化剤を添加しておくこともできる。
また、回収工程で用いられる回収容器には特に限定はないが、２６０ｎｍの吸収が無い素材で作製された回収容器を用いることができる。この場合、回収した核酸溶液の濃度を、他の容器に移し替えずに測定できる。２６０ｎｍに吸収のない素材は、例えば石英ガラス等が上げられるがそれに限定されるものではない。
上記の、少なくとも二個の開口を有する容器内に核酸吸着性多孔性膜を収容した核酸分離精製カートリッジと圧力差発生装置を用いて、核酸を含む検体から核酸を分離精製する工程は、工程を自動で行う自動装置を用いて行うことが好ましい。それにより、操作が簡便化および迅速化するだけでなく、作業者の技能によらず一定の水準の、核酸を得ることが可能になる。
以上述べた核酸分離精製方法を行うための、（ｉ）核酸分離精製カ−トリッジと、（ii）タンパク質分解酵素、（iii）カオトロピック塩、界面活性剤及びバッファー、（iv）洗浄液、および（v）回収液の試薬とをキットとすることができる。
以下に、少なくとも二個の開口を有する容器内に核酸吸着性多孔性膜を収容した核酸分離精製カートリッジと圧力差発生装置を用いて、核酸を含む検体から核酸を分離精製する工程を自動で行う自動で行う自動装置の例を示すが、自動装置はこれの限定されるものではない。
自動装置は、溶液が内部を通過可能な、核酸吸着性多孔性膜を収容した核酸分離精製カートリッジを用い、該核酸分離精製カートリッジに核酸を含む試料液を注入し加圧して該試料液中の核酸を前記核酸吸着性多孔性膜に吸着させた後、前記核酸分離精製カートリッジに洗浄液を分注し加圧して不純物を除去した後、前記核酸分離精製カートリッジに、回収液を分注し核酸吸着性多孔性膜に吸着した核酸を脱着して回収液とともに回収する、分離精製動作を自動的に行う核酸分離精製装置であって、前記核酸分離精製カートリッジ、前記試料液および洗浄液の排出液を収容する廃液容器および前記核酸を含む回収液を収容する回収容器を保持する搭載機構と、前記核酸分離精製カートリッジに加圧エアを導入する加圧エア供給機構と、前記核酸分離精製カートリッジに洗浄液および回収液を分注する分注機構とを備えてなることを特徴とするものである。
前記搭載機構は、装置本体に搭載されるスタンドと、該スタンドに上下移動可能に支持され前記核酸分離精製カートリッジを保持するカートリッジホルダーと、該カートリッジホルダーの下方で前記核酸分離精製カートリッジに対する位置を交換可能に前記廃液容器および前記回収容器を保持する容器ホルダーとを備えてなるものが好適である。
また、前記加圧エア供給機構は、下端部より加圧エアを噴出するエアノズルと、該エアノズルを支持して前記カートリッジホルダーに保持された前記核酸分離精製カートリッジに対し前記エアノズルを昇降移動させる加圧ヘッドと、該加圧ヘッドに設置され前記搭載機構のラックにおける核酸分離精製カートリッジの位置決めをする位置決め手段とを備えてなるものが好適である。
また、前記分注機構は、前記洗浄液を分注する洗浄液分注ノズルと、前記回収液を分注する回収液分注ノズルと、前記洗浄液分注ノズルおよび前記回収液分注ノズルを保持し前記搭載機構に保持された核酸分離精製カートリッジ上を順に移動可能なノズル移動台と、洗浄液を収容した洗浄液ボトルより洗浄液を吸引し前記洗浄液分注ノズルに供給する洗浄液供給ポンプと、回収液を収容した回収液ボトルより回収液を吸引し前記回収液分注ノズルに供給する回収液供給ポンプとを備えてなるものが好適である。
上記のような自動装置によれば、核酸分離精製カートリッジ、廃液容器および回収容器を保持する搭載機構と、核酸分離精製カートリッジに加圧エアを導入する加圧エア供給機構と、核酸分離精製カートリッジに洗浄液および回収液を分注する分注機構とを備え、核酸吸着性多孔性膜部材を備えた核酸分離精製カートリッジに核酸を含む試料液を注入加圧し核酸を核酸吸着性多孔性膜部材に吸着させた後、洗浄液を分注して不純物を洗浄排出した後、回収液を分注して核酸吸着性多孔性膜部材に吸着した核酸を分離して回収する核酸分離精製工程を自動的に行って短時間で効率よく試料液の核酸を自動的に分離精製できる機構をコンパクトに構成することとができる。
また、前記搭載機構を、スタンドと、核酸分離精製カートリッジを保持する上下移動可能なカートリッジホルダーと、廃液容器および回収容器を交換可能に保持する容器ホルダーとを備えて構成すると、核酸分離精製カートリッジおよび両容器のセット並びに廃液容器と回収容器の交換が簡易に行える。
また、前記加圧エア供給機構を、エアノズルと、該エアノズルを昇降移動させる加圧ヘッドと、核酸分離精製カートリッジの位置決めをする位置決め手段とを備えて構成すると、簡易な機構で確実な加圧エアの供給が行える。
また、前記分注機構を、洗浄液分注ノズルと、回収液分注ノズルと、核酸分離精製カートリッジ上を順に移動可能なノズル移動台と、洗浄液ボトルより洗浄液を吸引し洗浄液分注ノズルに供給する洗浄液供給ポンプと、回収液ボトルより回収液を吸引し回収液分注ノズルに供給する回収液供給ポンプとを備えて構成すると、簡易な機構で順次洗浄液および回収液の分注が行える。
以下、本発明を実施例により更に具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
［実施例１］
（１）核酸精製カートリッジの作成
内径７ｍｍ、核酸吸着性多孔性膜を収容する部分を持つ核酸精製カートリッジをハイインパクトポリスチレンで作成した。
（１）核酸精製カートリッジの作成
内径７ｍｍ、核酸吸着性多孔性膜を収容する部分を持つ核酸精製カートリッジをハイインパクトポリスチレンで作成した。
（２）核酸吸着性多孔性膜として、トリアセチルセルロ−スの多孔性膜を鹸化処理した多孔性膜（孔径２．５μｍ、直径７ｍｍ、厚さ１００μｍ、鹸化率９５％）を使用し、上記（１）で作成した核酸精製カートリッジの核酸吸着性多孔性膜収納部に収容する。
（３）核酸可溶化試薬原薬及び洗浄液の調製
下記に示す処方の核酸可溶化試薬原薬及び洗浄液を調製する。
下記に示す処方の核酸可溶化試薬原薬及び洗浄液を調製する。
（核酸可溶化試薬原薬１） ｐＨ６．０に調整
塩酸グアニジン（和光純薬社製） ５ｍｏｌ／Ｌ
ＢｉｓＴｒｉｓ（同仁堂社製） ３００ｍｍｏｌ／Ｌ
ＰＯＥソルビタンモノオレエート（和光純薬社製） ７．５％（ｖ／ｖ）
蒸留水 １０００ｍＬ
塩酸グアニジン（和光純薬社製） ５ｍｏｌ／Ｌ
ＢｉｓＴｒｉｓ（同仁堂社製） ３００ｍｍｏｌ／Ｌ
ＰＯＥソルビタンモノオレエート（和光純薬社製） ７．５％（ｖ／ｖ）
蒸留水 １０００ｍＬ
（洗浄液）
１０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ（ライフテクノロジー社製）
５０％（ｖ／ｖ）エタノール
１０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ（ライフテクノロジー社製）
５０％（ｖ／ｖ）エタノール
（回収液）
１０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ（ライフテクノロジー社製）
１０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ（ライフテクノロジー社製）
（４）核酸分離精製操作
抗凝固剤としてヘパリンＮａまたはＥＤＴＡ−２Ｎａを使用したヒト全血２００μｌにタンパク質分解酵素溶液（プロテアーゼＮ「アマノ」Ｇ）３０μｌと核酸可溶化試薬原薬１ ２５０μlを添加して５６℃で２分間インキュベートした。尚、ヘパリンＮａは１３単位／ｍｌ、ＥＤＴＡ−２Ｎａは１．５ｍｇ／ｍｌの濃度で含有される。インキュベート後、エタノール２５０μｌを加え、攪拌した。攪拌後、上記（２）で作成した核酸吸着性多孔性膜を有する核酸精製カートリッジの一の開口に注入し、続いて上記一の開口に圧力差発生装置（チュービングポンプ）を結合し、核酸分離精製カ−トリッジ内を加圧状態（８０ｋｐａ）にし、注入した核酸を含む試料溶液を、核酸吸着性多孔性膜に通過させることで、核酸吸着性多孔性膜に接触させ、核酸分離精製カ−トリッジの他の開口より排出した。続いて、上記核酸分離精製カ−トリッジの上記一の開口に洗浄液を注入し、上記一の開口にチュービングポンプを結合し、核酸分離精製カ−トリッジ内を加圧状態（８０ｋｐａ）にし、注入した洗浄液を、核酸吸着性多孔性膜に通過させ、他の開口より排出した。続いて、上記核酸分離精製カ−トリッジの上記一の開口に回収液を注入し、核酸分離精製カ−トリッジの上記一の開口にチュービングポンプを結合して核酸分離精製カ−トリッジ内を加圧状態（８０ｋｐａ）にし、注入した回収液を、核酸吸着性多孔性膜に通過させ、他の開口より排出し、この液を回収した。
抗凝固剤としてヘパリンＮａまたはＥＤＴＡ−２Ｎａを使用したヒト全血２００μｌにタンパク質分解酵素溶液（プロテアーゼＮ「アマノ」Ｇ）３０μｌと核酸可溶化試薬原薬１ ２５０μlを添加して５６℃で２分間インキュベートした。尚、ヘパリンＮａは１３単位／ｍｌ、ＥＤＴＡ−２Ｎａは１．５ｍｇ／ｍｌの濃度で含有される。インキュベート後、エタノール２５０μｌを加え、攪拌した。攪拌後、上記（２）で作成した核酸吸着性多孔性膜を有する核酸精製カートリッジの一の開口に注入し、続いて上記一の開口に圧力差発生装置（チュービングポンプ）を結合し、核酸分離精製カ−トリッジ内を加圧状態（８０ｋｐａ）にし、注入した核酸を含む試料溶液を、核酸吸着性多孔性膜に通過させることで、核酸吸着性多孔性膜に接触させ、核酸分離精製カ−トリッジの他の開口より排出した。続いて、上記核酸分離精製カ−トリッジの上記一の開口に洗浄液を注入し、上記一の開口にチュービングポンプを結合し、核酸分離精製カ−トリッジ内を加圧状態（８０ｋｐａ）にし、注入した洗浄液を、核酸吸着性多孔性膜に通過させ、他の開口より排出した。続いて、上記核酸分離精製カ−トリッジの上記一の開口に回収液を注入し、核酸分離精製カ−トリッジの上記一の開口にチュービングポンプを結合して核酸分離精製カ−トリッジ内を加圧状態（８０ｋｐａ）にし、注入した回収液を、核酸吸着性多孔性膜に通過させ、他の開口より排出し、この液を回収した。
［比較例１］
下記に示す処方の核酸可溶化試薬原薬を調製する。
下記に示す処方の核酸可溶化試薬原薬を調製する。
（核酸可溶化試薬原薬２） （ｐＨ５．５）
塩酸グアニジン（和光純薬社製） ５ｍｏｌ／Ｌ
ＰＯＥソルビタンモノステアレート（花王社製） ３％（ｖ／ｖ）
蒸留水 １０００ｍＬ
塩酸グアニジン（和光純薬社製） ５ｍｏｌ／Ｌ
ＰＯＥソルビタンモノステアレート（花王社製） ３％（ｖ／ｖ）
蒸留水 １０００ｍＬ
核酸可溶化試薬原薬として上記の核酸可溶化試薬原薬２を用いた以外は、上記（４）と同様の操作を行った。
［実施例２］
下記に示す処方の核酸可溶化試薬原薬を調製する。
下記に示す処方の核酸可溶化試薬原薬を調製する。
（核酸可溶化試薬原薬３） ｐＨ７．０に調製
塩酸グアニジン（和光純薬社製） ５ｍｏｌ／Ｌ
Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ（ライフテクノロジー社製）（ｐＨ７．０）
１００ｍｍｏｌ／Ｌ
ＰＯＥソルビタンモノオレエート（和光純薬社製） ７．５％（ｖ／ｖ）
蒸留水 １０００ｍＬ
塩酸グアニジン（和光純薬社製） ５ｍｏｌ／Ｌ
Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ（ライフテクノロジー社製）（ｐＨ７．０）
１００ｍｍｏｌ／Ｌ
ＰＯＥソルビタンモノオレエート（和光純薬社製） ７．５％（ｖ／ｖ）
蒸留水 １０００ｍＬ
核酸可溶化試薬原薬として上記の核酸可溶化試薬原薬３を用いた以外は同様にして、上記（４）と同様の操作を行った。
（５）回収された核酸の純度の定量
上記回収した液の吸光度測定により、回収された核酸の純度を定量した。各波長における吸光度測定の結果を表１に示す。
上記回収した液の吸光度測定により、回収された核酸の純度を定量した。各波長における吸光度測定の結果を表１に示す。
回収された核酸の純度が低い場合、３２０ｎｍまたは４００ｎｍの吸光度が高くなる。 表１の結果から明らかなように、本発明の方法を用いることにより、抗凝固剤の種類によらず、血液から高純度の核酸を極めて効率よく、回収及び精製できることが分かる。
Claims (12)
- （1）核酸を含む試料溶液を核酸吸着性多孔性膜に通過させて、該多孔性膜内に核酸を吸着させる工程、
（2）洗浄液を該核酸吸着性多孔性膜に通過させて、核酸が吸着した状態で該多孔性膜を洗浄する工程、及び
（3）回収液を該核酸吸着性多孔性膜に通過させて、該多孔性膜内から核酸を脱着させる工程を含有する核酸の分離精製方法において、
該核酸吸着性多孔性膜がイオン結合が関与しない相互作用で核酸が吸着する多孔性膜であり、且つ、
核酸を含む試料溶液が、
（I）血液および白血球の少なくともいずれかを含み、かつ抗凝固剤を含む検体を容器に注入する工程、
（II）上記容器に、カオトロピック塩、界面活性剤、バッファー、及びタンパク質分解酵素を添加し、検体と混合して混合液を得る工程、
（III）混合液をインキュベ−トし、インキュベ−トされた混合液を得る工程、及び
（IV）インキュベ−トされた混合液に水溶性有機溶媒を添加し、核酸を含む試料溶液を得る工程、
を含有する試料溶液調製工程で得られることを特徴とする核酸の分離精製方法。 - 上記（II）の工程において、界面活性剤がノニオン系界面活性剤である、請求項１に記載の核酸の分離精製方法。
- ノニオン系界面活性剤がポリオキシエチレン系界面活性剤である、請求項２に記載の核酸の分離精製方法。
- ポリオキシエチレン系界面活性剤がポリオキシエチレンソルビタン系界面活性剤である、請求項３に記載の核酸の分離精製方法。
- 上記（II）の工程において、バッファーがＢｉｓＴｒｉｓ（Ｂｉｓ（２‐ｈｙｄｏｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｉｍｉｎｏｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｍｅｔｈａｎｅ）である、請求項１〜４のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
- 上記（II）の工程において、カオトロピック塩がグアニジウム塩である、請求項１〜５のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
- 上記（II）の工程において、さらに消泡剤が添加され、その含有量が０〜１０質量％である、請求項１〜６のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
- 上記（II）の工程において、さらに消泡剤が添加され、その含有量が０．０１〜５質量％である、請求項１〜６のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
- 上記（1）、（2）及び（3）の各工程において、核酸を含む試料溶液、洗浄液又は回収液を、加圧状態で核酸吸着性多孔性膜に通過させる、請求項１〜８のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
- 上記（IV）の工程において、水溶性有機溶媒が、メタノール、エタノール、プロパノールまたはその異性体、ブタノールまたはその異性体の少なくともいずれかである、請求項１〜９のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
- 請求項１〜１０のいずれかに記載の核酸分離精製方法を自動で行う装置。
- （ｉ）核酸分離精製カ−トリッジと、（ii）タンパク質分解酵素、（iii）カオトロピック塩、界面活性剤及びバッファー、（iv）洗浄液、および（v）回収液の試薬とを含む請求項１〜１０のいずれかに記載の核酸分離精製方法を行うためのキット。
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