JP2005154299A

JP2005154299A - 核酸の分離精製方法

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Publication number: JP2005154299A
Application number: JP2003391771A
Authority: JP
Inventors: Yoshihide Iwaki; 義英岩木
Original assignee: Fuji Photo Film Co Ltd
Current assignee: Fujifilm Holdings Corp
Priority date: 2003-11-21
Filing date: 2003-11-21
Publication date: 2005-06-16

Abstract

【課題】分離性能に優れ、洗浄効率が良く、簡便で、迅速で、自動化および小型化適性に優れ、実質的に同一の分離性能を有するものを大量に生産可能であり、かつ抽出精製された核酸が酵素反応阻害を起すこともなく、安全な分離精製操作可能な、多孔膜を使用した核酸の分離精製方法を提供すること。
【解決手段】 (1)核酸を含む試料溶液を核酸吸着性多孔性膜に通過させて、多孔性膜内に核酸を吸着させる工程、(2)核酸が吸着した状態で、多孔性膜を洗浄する工程、及び(3)回収液を、多孔性膜に通過させて、多孔性膜内から核酸を脱着させる工程を含有する核酸の分離精製方法において、該核酸吸着性多孔性膜がイオン結合が実質的に関与しない相互作用で核酸が吸着する多孔性膜であり、且つ、該洗浄液はカオトロピック物質を含有していないことを特徴とする核酸の分離精製方法。
【選択図】なし

Description

本発明は、核酸を分離精製する方法に関する。より詳細には、本発明は、核酸を分離精製するために、検体から核酸を含む試料溶液を得る方法に関する。さらに詳しくは、得られた核酸を含む試料溶液を用いて、少なくとも二個の開口を有する容器内に核酸吸着性多孔膜を収容した核酸分離精製カ−トリッジと圧力発生装置を用いて、核酸を含む検体から核酸を分離精製する方法に関する。

核酸は、様々な分野で種々の形態で使用されている。例えば、組換え核酸技術の領域においては、核酸をプローブ、ゲノム核酸、およびプラスミド核酸の形状で用いることを要求する。

診断分野においても、核酸は種々の方法で用いられている。例えば、核酸プローブは、ヒトの病原体の検出および診断に日常的に用いられている。同様に核酸は遺伝障害の検出に用いられている。核酸はまた食品汚染物質の検出にも用いられている。さらに、核酸は遺伝地図の作製からクローニングおよび組換え発現におよぶ種々の理由により、興味ある核酸の位置確認、同定および単離において日常的に用いられている。

多くの場合、核酸は極めて少量でしか入手できず、そして単離および精製操作が煩雑で時間を要する。このしばしば時間を消費する煩雑な操作は核酸の損失に結びつきやすい。血清、尿およびバクテリアのカルチャーから得られた試料の核酸の精製においては、コンタミネーションおよび疑陽性の結果が生じるという危険性も加わる。

広く知られた精製方法の一つに、核酸を二酸化珪素、シリカポリマー、珪酸マグネシウム等の固相に吸着させ、引き続く洗浄、脱着等の操作によって精製する方法がある（例えば、特許文献１）。この方法は、分離性能としては優れているが、簡便性、迅速性、自動化および小型化適性においては十分でなく、同一性能の吸着媒体の工業的大量生産が困難であり、かつ取扱いが不便で、種々の形状に加工しがたい等の問題点がある。

また、特許文献２には、簡便かつ効率よく核酸を分離精製する方法の一つとして、固相に核酸を吸着させる溶液及び固相から核酸を脱着させる溶液をそれぞれ用いて、表面に水酸基を有する有機高分子から成る固相に核酸を吸着及び脱着させることによって、核酸を分離精製する方法が報告されている。

この出願の発明に関連する前記の先行技術には、次ぎの文献がある。
特公平７−５１０６５号公報特開２００３−１２８６９１号公報

核酸を分離精製する操作は、簡易性と迅速性が求められており、前記した従来の核酸を分離精製する方法は、その点で進歩した方法ではあるが、一層の改善が求められている。これら従来技術では、検体から核酸の分離の容易化のためにカオトロピック物質が用いられて効果を発揮しているが、その結果分離された核酸に例えば酵素反応を施す場合には、残留カオトロピック物質が酵素反応阻害を引起すというマイナス作用が伴う。また、カオトロピック物質は、多くの場合に健康有害物質でもある。
本発明は、このような背景から行われたものであって、その目的は、検体中の核酸を核酸吸着性の多孔膜に吸着させた後、洗浄等を経て脱着させて核酸を分離精製する方法を提供することである。より具体的には、分離性能に優れ、洗浄効率が良く、簡便で、迅速で、自動化および小型化適性に優れ、実質的に同一の分離性能を有するものを大量に生産可能である多孔膜を使用した核酸の分離精製方法を提供することである。
本発明の更なる目的は、抽出精製された核酸を酵素をさせる場合に反応阻害などの問題を起すことの無い核酸の分離精製方法を提供することである。
また、有害なカオトロピック物質の使用に係る安全性リスクが回避できる分離精製操作を行うことが出来るようにすることである。

本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、核酸を多孔性膜に吸着及び脱着させる過程を含む核酸の分離精製方法において、該多孔性膜として実質的にイオン結合が関与しない相互作用で核酸が吸着する多孔性膜を使用することによって、カオトロピック物質を含まない洗浄液であっても、核酸を含む検体から核酸を収率よく、高純度で分離精製することができて、かつ残留カオトロピック物質の酵素反応阻害作用や健康リスクを回避できることを見出した。本発明はこの知見に基づいて完成したものである。

即ち、本発明によれば、（１）核酸を含む試料溶液を核酸吸着性多孔性膜に通過させて、該多孔性膜内に核酸を吸着させる工程、(2) 洗浄液を該核酸吸着性多孔性膜に通過させて、核酸が吸着した状態で該核酸吸着性多孔性膜を洗浄する工程、及び(3)回収液を、該核酸吸着性多孔性膜に通過させて、該多孔性膜内から核酸を脱着させる工程を含有する核酸の分離精製方法において、該核酸吸着性多孔性膜が実質的にイオン結合が関与しない相互作用で核酸が吸着する多孔性膜であり、且つ、該洗浄液はカオトロピック物質を含有していないことを特徴とする核酸の分離精製方法が提供される。
本発明の核酸の分離精製方法では、上記(1)、(2)及び(3)の各工程において、核酸を含む試料溶液、洗浄液又は回収液を、加圧状態で核酸吸着性多孔性膜に通過させることが好ましい。
また、上記各工程において、少なくとも二個の開口を有する容器内に該核酸吸着性多孔性膜を収容した核酸分離精製カートリッジの一の開口に、核酸を含む試料溶液、洗浄液又は回収液を注入し、カートリッジの上記一の開口に結合された圧力差発生装置を用いてカートリッジ内を加圧状態にして、該注入した各液を通過させ、他の開口より排出させることが好ましい。

上記洗浄工程に用いる洗浄液は、カオトロピック物質を含有していないことを特徴としている。カオトロピック物質は、尿素、グアニジン塩、イソチオシアン酸塩、チオシアン酸塩及びアルカリ金属のヨウ化物から選択される化合物であり、これらを洗浄液に含ませることによって、多孔性膜に吸着した核酸由来の蛋白質やその分解物の洗浄液への溶解が容易に進行するが、本発明では実質的にイオン結合が関与しない相互作用で核酸が吸着する多孔性膜を用いることによって洗浄液にカオトロピック物質を含ませなくても、洗浄作用が保たれ、しかも回収液にカオトロピック物質の混入が抑制される。したがって、回収される核酸やそのセグメントの純度を高めることが可能となる。それによって、１回の洗浄ですませることが可能であり、この点でも核酸の分離精製操作を迅速化できる。また、洗浄工程と回収工程の間に乾燥工程を設ける必要もないので、この点からも簡易化と迅速化を促進させることができる。

さらに、洗浄液がカオトロピック物質を含有しないことは、核酸含有検体中の細胞膜や細胞質を分解するタンパク分解酵素などの酵素の活性が維持にも好都合で、洗浄液中にタンパク質分解酵素、核酸分解酵素、ＤＮＡ分解酵素などを含有させる態様にも好ましく適用できる。
洗浄液には、カオトロピック物質に代わって、核酸分離能向上の目的の水溶性塩として、ハロゲン化物の塩が含まれていることも好ましく、ハロゲン化物の中でも核酸を吸着させたまま、不純物の溶解を促して核酸と不純物の分離性を高める点で塩化物が適している。
一方、水溶性塩のカチオン成分として好ましいのは、一価または二価のカチオンであり、特にカリウム塩又はナトリウム塩が好ましく、中でもナトリウム塩が適している。
塩の濃度は１０ｍｍｏｌ／Ｌ以上含まれているのが好ましい。特に塩化ナトリウムが２０ｍｍｏｌ／Ｌ以上含まれていることが目的の効果を発揮するのに好ましい。

本発明による簡易で迅速な核酸の分離精製方法は、核酸吸着性多孔膜として水酸基を有する有機材料の多孔性膜を用いる場合に洗浄が迅速に行われ、残液も少なく、特に本発明の効果が顕著となる。水酸基を有する有機材料の多孔性膜の中でも、多糖構造を有する多孔性膜が好ましく、とりわけ再生セルロ−スの多孔性膜が効果的である。多孔性膜の更なる詳細は後述する。

本発明の上記核酸分離精製方法は、核酸分離精製カ−トリッジ、試薬のキット及び核酸分離精製陽自動装置を用いることにより、とくに簡易,迅速に行なうことができる。

多孔性膜としてイオン結合が関与しない相互作用で核酸が吸着する多孔性膜を用い、且つ多孔膜に吸着した核酸の洗浄にカオトロピック物質を含まない洗浄液を用い、続いて回収する本発明の核酸の分離精製方法により、分離性能良く、簡便で、迅速に、かつ自動化可能に、核酸を含む検体から核酸を分離精製することができ、しかも回収工程においてカオトロピック物質混入の可能性がなくなり、抽出精製された核酸を酵素反応に問題無く用いることが出来る。また、有害なカオトロピック物質を用いないので、ユーザーが安全に分離精製操作を行うことが出来るようになる。

本発明の核酸分離精製方法は、(1)核酸を含む試料溶液を核酸吸着性多孔性膜に通過させて、該多孔性膜内に核酸を吸着させる工程、(2)該核酸吸着性多孔性膜を、核酸が吸着した状態で、洗浄する工程、及び(3)回収液を、該核酸吸着性多孔性膜に通過させて、該多孔性膜内から核酸を脱着させる工程を少なくとも含むものである。
好ましくは、上記(1)、(2)及び(3)の各工程において、核酸を含む試料溶液、洗浄液又は回収液を、加圧状態で核酸吸着性多孔性膜に通過させるものであり、より好ましくは、上記(1)、(2)及び(3)の各工程において、少なくとも二個の開口を有する容器内に該核酸吸着性多孔性膜を収容した核酸分離精製カートリッジの一の開口に、核酸を含む試料溶液、洗浄液又は回収液を注入し、カートリッジの上記一の開口に結合された圧力差発生装置を用いてカートリッジ内を加圧状態にして、該注入した各液を通過させ、他の開口より排出させるものである。核酸を含む試料溶液、洗浄液又は回収液を加圧状態で上記多孔性膜に通過させることにより、装置をコンパクトに自動化することができ、好ましい。加圧は、好ましくは１０〜２００ｋｐａ、より好ましくは４０〜１００ｋｐａの程度で行われる。

上記の核酸分離精製の工程では、最初の核酸を含む試料液を注入する工程から核酸分離精製カ−トリッジ外に核酸を得るまでの工程を１０分以内、好適な状況では核酸を含む試料２分以内で終了することが可能である。また、上記の核酸分離精製の工程では核酸を５０％以上、好適な状況では核酸を含む試料９０％以上の収率で得ることが可能である。

また、上記の核酸分離精製の工程では、１ｋｂｐから２００ｋｂｐ、好ましくは２０ｋｂｐから１４０ｋｂｐと広範囲に及ぶ分子量の核酸を回収することができる。すなわち、従来行なわれているガラスフィルタ−を用いたスピンカラム法（キアゲン社）に比べて、長鎖の核酸を回収できる。

また、上記の核酸分精製の工程では、紫外可視分光光度計で求めた２６０ｎｍ及び２８０ｎｍの分光吸光度の吸光度比（２６０ｎｍ／２８０ｎｍ）が、ＤＮＡの場合は１．６〜２．０、ＲＮＡの場合は１．８〜２．２となる純度を持つ核酸を回収することができ、不純物混入量の少ない高純度の核酸を定常的に得ることができる。さらには、紫外可視分光光度計での吸光度比（２６０ｎｍ／２８０ｎｍ）がＤＮＡの場合は１．８付近、ＲＮＡの場合は２．０付近となる純度を持つ核酸を回収することができる。

また、上記工程において、圧力差発生装置としては、注射器、ピペッタ、エバポレーター、あるいはペリスタポンプのような加圧が可能なポンプ、或いは、エバポレーター等の減圧可能なもの等が挙げられる。これらの内、手動操作には注射器が、自動操作にはポンプが適している。また、ピペッタは片手操作が容易にできるという利点を有する。好ましくは、圧力差発生装置は、核酸分離精製カ−トリッジの一の開口に着脱可能に結合されている。

本発明において使用できる検体に制限はないが、例えば診断分野においては、検体として採取された全血、血漿、血清、尿、便、精液、唾液等の体液、あるいは植物（又はその一部）、動物（またはその一部）、細菌、ウイルスなど、あるいはそれらの溶解物およびホモジネートなどの生物材料から調製された溶液が対象となる。

最初にこれらの検体について細胞膜および核膜等を溶解して核酸を可溶化する試薬を含む水溶液（核酸可溶化試薬）で処理する。これにより細胞膜および核膜が溶解されて、核酸が水溶液内に分散し、核酸を含む試料溶液を得る。

細胞膜および核膜を溶解して、核酸を可溶化するためには、例えば、対象となる試料が全血の場合、（1）赤血球の除去、（２）各種タンパク質の除去、及び（３）白血球の溶解及び核膜の溶解が必要となる。（1）赤血球の除去および（２）各種タンパク質の除去は、膜への非特異吸着および多孔性膜の目詰まりを防ぐために、（３）白血球の溶解及び核膜の溶解は、抽出の対象である核酸を可溶化させるためにそれぞれ必要となる。特に、（３）白血球の溶解及び核膜の溶解は重要な工程であり、本発明の方法では、この工程により核酸を可溶化することが必要である。

核酸を含む検体は、単一の核酸を含む検体でもよいし、異なる複数種類の核酸を含む検体でもよい。回収する核酸の種類は、ＤＮＡやＲＮＡ等、特に制限されない。検体の数は一つでも複数であってもよい。回収する核酸の長さも特に限定されず、例えば、数ｂｐ〜数Ｍｂｐの任意の長さの核酸を使用することができる。取扱い上の観点からは、回収する核酸の長さは一般的には、数ｂｐ〜数百ｋｂｐ程度である。本発明の核酸分離精製方法は、従来の簡易的な核酸分離精製方法より比較的長い核酸を迅速に取り出すことができ、好ましくは５０ｋｂｐ以上、より好ましくは７０ｋｂｐ以上の核酸を回収することに用いることがでる。

以下に、細胞膜および核膜を溶解し、核酸を可溶化して、検体から核酸を含む試料溶液を得る工程について説明する。本発明で、細胞膜および核膜を溶解して核酸を可溶化するには、核酸可溶化試薬を用いる。核酸可溶化試薬としては、カオトロピック塩、界面活性剤およびタンパク質分解酵素を含む溶液が挙げられる。

細胞膜および核膜を溶解し、核酸を可溶化して、検体から核酸を含む試料溶液を得る方法としては、(Ｉ)細胞又はウイルスを含む検体を容器に注入する工程、(ＩＩ)上記容器に、カオトロピック塩と界面活性剤を含む核酸可溶化試薬溶液を添加し、検体と核酸可溶化試薬溶液を混合する工程、(ＩＩＩ)上記で得られた混合液をインキュベ−トする工程、(ＩＶ)インキュベ−トされた混合液に水溶性有機溶媒を添加する工程を含む方法を挙げることができる。

上記の細胞膜および核膜を溶解し、核酸を可溶化して、検体から核酸を含む試料溶液を得る工程において、検体をホモジナイズ処理することで、自動化処理適性が向上する。ホモジナイズ処理は、例えば、超音波処理、鋭利な突起物を用いる、高速攪拌処理を用いる、微細空隙から押し出す処理、ガラスビーズを用いる処理等で行うことができる。

また、上記の細胞膜および核膜を溶解し、核酸を可溶化して、検体から核酸を含む試料溶液を得る工程において、タンパク質分解酵素を含む核酸可溶化試薬を使用することにより、核酸の回収量及び回収効率が向上し、必要な核酸を含む検体の微量化及び迅速化が可能となる。

タンパク質分解酵素は、セリンプロテア−ゼ、システインプロテア−ゼ、金属プロテア−ゼなどから、少なくとも１つのタンパク質分解酵素を好ましく用いることができる。また、タンパク質分解酵素は、複数種以上のタンパク質分解酵素の混合物も好ましく用いることができる。
セリンプロテアーゼとしては、特に限定されず、例えばプロテアーゼＫなどを好ましく用いることができる。
システインプロテアーゼとしては、特に限定されず、例えばパパイン、カテプシン類などを好ましく用いることができる。
金属プロテアーゼとしては、特に限定されず、例えばカルボキシペプチターゼ等を好ましく用いることができる。
タンパク質分解酵素は、添加時の反応系全容積１ｍｌあたり好ましくは０．００１ＩＵ〜１０ＩＵ、より好ましくは０．０１ＩＵ〜１ＩＵの濃度で用いることができる。

また、タンパク質分解酵素は、核酸分解酵素を含まないタンパク質分解酵素を好ましく用いることができる。また、安定化剤を含んだタンパク質分解酵素を好ましく用いることができる。安定化剤としては、金属イオンを好ましく用いることができる。具体的には、マグネシウムイオンが好ましく、例えば塩化マグネシウムなどの形で添加することができる。タンパク質分解酵素の安定好ましく、例えば塩化マグネシウムなどの形で添加することができる。タンパク質分解酵素の安定化剤を含ませることにより、核酸の回収に必要なタンパク質分解酵素の微量化が可能となり、核酸の回収に必要なコストを低減することができる。タンパク質分解酵素の安定化剤は、反応系全量に対して好ましくは１〜１０００ｍＭ、より好ましくは１０〜１００ｍＭの濃度で含有することが好ましい。

タンパク質分解酵素は、予めカオトロピック塩、界面活性剤等のその他の試とともに混合されて１つの試薬として核酸の回収に供されても良い。
また、タンパク質分解酵素は、カオトロピック塩、界面活性剤等のその他の試薬とは個別の２つ以上の試薬として供されても良い。後者の場合、タンパク質分解酵素を含む試薬を先に検体と混合した後に、カオトロピック塩、界面活性剤を含む試薬と混合される。また、カオトロピック塩、界面活性剤を含む試薬を先に混合した後に、タンパク分解酵素を混合してもよい。
また、タンパク質分解酵素を検体または、検体とカオトロピック塩、界面活性剤を含む試薬との混合液に、タンパク質分解酵素保存容器から直接目薬状に滴下させることもできる。この場合、操作を簡便にすることができる。

核酸可溶化試薬は、乾燥された状態で供給されることも好ましい。また、凍結乾燥のように乾燥された状態のタンパク質分解酵素を予め含む容器を用いることができる。上記の、乾燥された状態で供給される核酸可溶化試薬、および乾燥された状態のタンパク質分解酵素を予め含む容器の両方を用いて、核酸を含む試料溶液を得ることもできる。
上記の方法で核酸を含む試料溶液を得る場合、核酸可溶化試薬およびタンパク質分解酵素の保存安定性が良く、核酸収量を変えずに操作を簡便にすることができる。

検体とカオトロピック塩および界面活性剤を含む核酸可溶化試薬溶液とを混合する方法は、特に限定されない。
混合する際、攪拌装置により３０から３０００ｒｐｍで１秒から３分間混合することが好ましい。これにより、分離精製される核酸収量を増加させることができる。または、転倒混和を５から３０回行うことで混合することも好ましい。また、ピペッティング操作を、１０から５０回行うことによっても混合することができる、この場合、簡便な操作で分離精製される核酸収量を増加させることができる。

検体とカオトロピック塩および界面活性剤を含む核酸可溶化試薬溶液との混合液を、タンパク質分解酵素の至適温度および反応時間でインキュベ−トすることにより、分離精製される核酸の収量を増加させることがきる。インキュベーション温度は、通常２０℃〜７０℃、好ましくはタンパク分解酵素の至適温度であり、３７℃〜７０℃で使用することが好ましく、特に５０℃〜６５℃で使用することが好ましい。インキュベーション時間は通常１〜９０分、好ましくはタンパク分解酵素の至適反応時間である。インキュベーション方法は特に限定されず、湯浴や加温器に入れることで行うことができる。

上記の細胞膜および核膜を溶解し、核酸を可溶化して、検体から核酸を含む試料溶液を得る工程において、界面活性剤とカオトロピック塩を含む核酸可溶化試薬溶液は、好ましくはｐＨ５〜１０、より好ましくはｐＨ６〜９、さらに好ましくはｐＨ７〜８のものが用いられる。

また、上記の細胞膜および核膜を溶解し、核酸を可溶化して、検体から核酸を含む試料溶液を得る工程において、カオトロピック塩の核酸可溶化試薬溶液における濃度は、０．５ mol/L以上であることが好ましく、より好ましくは０．５mol/L〜７ mol/L、さらに好ましくは、２mol/L〜６ mol/Lである。上記カオトロピック塩としては、塩酸グアニジンが好ましいが、他のカオトロピック塩（イソチオシアン酸グアニジン、チオシアン酸グアニジン、尿素、イソチオシアン酸ナトリウム、ヨウ化カリウム、ヨウ化ナトリウム）を使用することもできる。また、これらの塩は単独または複数組み合わせて用いてもよい。

また、上記の核酸可溶化試薬溶液は水溶性有機溶媒を含んでいても良い。この水溶性有機溶媒としてはアルコールが好ましい。アルコールは、1級アルコール、２級アルコール、３級アルコールのいずれでも良い。アルコールがメチルアルコール、エチルアルコール、プロピルアルコール及びその異性体、ブチルアルコール及びその異性体を好ましく用いることができる。これらの水溶性有機溶媒は単独または複数組み合わせて用いてもよい。これら水溶性有機溶媒の核酸可溶化試薬溶液における濃度は１〜２０％であることが好ましい。

また、上記の細胞膜および核膜を溶解し、核酸を可溶化して、検体から核酸を含む試料溶液を得る工程において、検体にカオトロピック塩およびタンパク質分解酵素とともに混合する界面活性剤は、例えば、ノニオン界面活性剤、カチオン界面活性剤、アニオン界面活性剤、両性界面活性剤である。
本発明においてはノニオン界面活性剤をこのましく用いることができる。ノニオン界面活性剤は、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル系界面活性剤、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系界面活性剤、脂肪酸アルカノールアミドを用いることができるが、好ましくは、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系界面活性剤を用いることができる、さらに好ましくは、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系界面活性剤は、ＰＯＥデシルエ−テル、ＰＯＥラウリルエ−テル、ＰＯＥトリデシルエ−テル、ＰＯＥアルキレンデシルエ−テル、ＰＯＥソルビタンモノラウレ−ト、ＰＯＥソルビタンモノオレエ−ト、ＰＯＥソルビタンモノステアレ−ト、テトラオレイン酸ポリオキシエチレンソルビット、ＰＯＥアルキルアミン、ＰＯＥアセチレングリコ−ルから選択されるポリオキシエチレンアルキルエーテル系界面活性剤である。

また、カチオン界面活性剤も好ましく用いることができる。さらに好ましくは、カチオン界面活性剤は、セチルトリメチルアンモニウムプロミド、ドデシルトリメチルアンモニウムクロリド、テトラデシルトリメチルアンモニウムクロリド、セチルピリジニウムクロリドから選択されるカチオン界面活性剤である。これらの界面活性剤は、単独または複数組み合わせて用いてもよい。
これら界面活性剤の核酸可溶化試薬溶液における濃度は０．１〜２０質量％であることが好ましい。

ＤＮＡなどＲＮＡ以外の核酸を回収する場合、上記の細胞膜および核膜を溶解し、核酸を可溶化して、検体から核酸を含む試料溶液を得る工程において、核酸可溶化試薬溶液にＲＮＡ分解酵素を加えることが好ましい。この場合、回収された核酸に共存するＲＮＡによる干渉を軽減することができる。また、ＤＮＡ分解酵素阻害剤を加えることも好ましい。
一方、ＲＮＡなどＤＮＡ以外の核酸を回収する場合、核酸可溶化試薬溶液にＤＮＡ分解酵素を加えることが好ましい。この場合、回収された核酸に共存するＤＮＡによる干渉を軽減することができる。また、ＲＮＡ分解酵素阻害剤を加えることも好ましい。ＲＮＡ分解酵素阻害剤としては、ＲＮＡ分解酵素を特異的に阻害するものが好ましい。
ＲＮＡ分解酵素は特に限定されず、例えば、リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅＨ）等のＲＮＡ特異的分解酵素を好ましく用いることができる。
ＤＮＡ分解酵素は特に限定されず、例えば、ＤＮａｓｅＩ等のＤＮＡ特異的分解酵素を好ましく用いることができる。

上記の細胞膜および核膜を溶解し、核酸を可溶化して、検体から核酸を含む試料溶液を得る工程において、インキュベ−トされた混合液に添加する水溶性有機溶媒は、アルコールを好ましく用いることができる。アルコールは、１級アルコール、２級アルコール、３級アルコールのいずれでもよく、メチルアルコール、エチルアルコール、プロピルアルコール、ブチルアルコール及びその異性体を好ましく用いることができる。これら水溶性有機溶媒の核酸可溶化試薬溶液における最終濃度は、５〜９０％であることが好ましい。

上記の細胞膜および核膜を溶解し、核酸を可溶化して、検体から核酸を含む試料溶液を得る工程において、核酸を含む試料溶液には、消泡剤を含有させることも好ましい。上記消泡剤としては、シリコン系消泡剤とアルコール系消泡剤の２つの成分が好ましく挙げられ、また、アルコール系消泡剤としては、アセチレングリコール系界面活性剤が好ましい。

消泡剤の具体例としては、シリコン系消泡剤（例えば、シリコーンオイル、ジメチルポリシロキサン、シリコーンエマルジョン、変性ポリシロキサン、シリコーンコンパウンドなど）、アルコール系消泡剤（例えば、アセチレングリコール、ヘプタノール、エチルエキサノール、高級アルコール、ポリオキシアルキレングリコールなど）、エーテル系消泡剤（例えば、ヘプチルセロソルブ、ノニルセロソルブ−３−ヘプチルコルビトールなど）、油脂系消泡剤（例えば、動植物油など）、脂肪酸系消泡剤（例えば、ステアリン酸、オレイン酸、パルミチン酸など）、金属セッケン系消泡剤（例えば、ステアリン酸アルミ、ステアリン酸カルシウムなど）、脂肪酸エステル系消泡剤（例えば、天然ワックス、トリブチルホスフェートなど）、リン燐酸エステル系消泡剤（例えば、オクチルリン酸ナトリウムなど）、アミン系消泡剤（例えば、ジアミルアミンなど）、アミド系消泡剤（例えば、ステアリン酸アミドなど）、その他の消泡剤（例えば、硫酸第二鉄、ボーキサイトなど）などが挙げられる。特に好ましくは、消泡剤として、シリコン系消泡剤とアルコール系消泡剤の２つの成分を組み合わせて使用することができる。また、アルコール系消泡剤としては、アセチレングリコール系界面活性剤を使用することも好ましい。

また、上記の細胞膜および核膜を溶解し、核酸を可溶化して、検体から核酸を含む試料溶液を得る工程において、得られた核酸を含む試料溶液は、表面張力は５０ｍＰａ・ｍ以下であることが好ましく、また、粘度は、１〜１００００ｍＰａ・ｓであることが好ましく、比重は、０．８〜１．２であることが好ましい。

以下に、本発明で用いる核酸吸着性多孔性膜および吸着工程について説明する。本発明の核酸吸着性多孔性膜は、溶液が内部を通過可能なものである。ここで「溶液が内部を通過可能」とは、膜の一方の面が接する空間と膜の他方の面が接する空間の間に圧力差を生じさせた場合に、高圧の空間側から低圧の空間側へと、膜の内部を溶液が通過することが可能であることを意味する。または、膜に遠心力を掛けた場合に、遠心力の方向に、膜の内部を溶液が通過することが可能であることを意味する。

本発明の核酸吸着性多孔性膜は、イオン結合が関与しない相互作用で核酸が吸着する多孔性膜であることを特徴とし、これにより分離性能に優れ、しかも洗浄効率よく、核酸を単離精製することができる。特に洗浄液が水溶性塩を含んでいる場合、中でも水溶性塩と水溶性勇気溶剤とを含んでいる場合には、洗浄効果が優れていて高純度で核酸を回収することができる。さらに好ましくは核酸吸着性多孔性膜は、親水基を有する多孔性膜であり、多孔性膜を形成する材料自体が、親水性基を有する多孔性膜、または多孔性膜を形成する材料を処理またはコーティングすることによって親水基を導入した多孔性膜を意味する。多孔性膜を形成する材料は有機物、無機物のいずれでも良い。例えば、多孔性膜を形成する材料自体が親水基を有する有機材料である多孔性膜、親水基を持たない有機材料の多孔性膜を処理して親水基を導入した多孔性膜、親水基を持たない有機材料の多孔性膜に対し親水基を有する材料でコーティングして親水基を導入した多孔性膜、多孔性膜を形成する材料自体が親水基を有する無機材料である多孔性膜、親水基を持たない無機材料の多孔性膜を処理して親水基を導入した多孔性膜、親水基を持たない無機材料の多孔性膜に対し親水基を有する材料でコーティングして親水基を導入した多孔性膜などを、使用することができるが、加工の容易性から、多孔性膜を形成する材料は有機高分子などの有機材料を用いることが好ましい。

親水基とは、水との相互作用を持つことができる有極性の基（原子団）を指し、核酸の吸着に関与する全ての基（原子団）が当てはまる。親水基としては、水との相互作用の強さが中程度のものが良く、水酸基、カルボキシル基、シアノ基、オキシエチレン基などを挙げることができるが、好ましくは水酸基である。

親水基を有する多孔性膜としては、水酸基を有する有機材料の多孔性膜を挙げることができる。水酸基を有する有機材料としては、特開２００３−１２８６９１号公報に記載の、アセチルセルロースの表面鹸化物が挙げられる。アセチルセルロースしては、モノアセチルセルロース、ジアセチルセルロース、トリアセチルセルロースの何れでもよいが、特にはトリアセチルセルロースが好ましい。この場合、鹸化処理の程度（鹸化度）で固相表面の水酸基の量（密度）をコントロールすることができる。核酸の分離効率を挙げるためには、水酸基の量（密度）が多い方が好ましい。例えば、トリアセチルセルロースなどのアセチルセルロースの場合には、鹸化率が約５％以上であることが好ましく、１０％以上であることが更に好ましい。また、水酸基を有する有機高分子の表面積を大きくするために、アセチルセルロースの多孔性膜を鹸化処理する。
この鹸化処理の程度（鹸化度）と多孔性膜の孔径との組合せによりにより空間的な水酸基の量（密度）をコントロールすることができる。この場合、多孔性膜は、表裏対称性の多孔性膜であってもよいが、裏非対称性の多孔性膜を好ましく使用することができる。

水酸基を有する有機材料の多孔性膜としては、ポリヒドロキシエチルアクリル酸、ポリヒドロキシエチルメタアクリル酸、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリオキシエチレン、アセチルセルロース、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物などで、形成された多孔性膜を挙げることができるが、特に多糖構造を有する有機材料の多孔性膜を好ましく使用することができる。

特に、水酸基を有する有機材料の多孔性膜としては、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物から成る有機高分子の多孔性膜を好ましく使用することができる。アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物として、トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースの混合物、トリアセチルセルロースとモノアセチルセルロースの混合物、トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースとモノアセチルセルロースの混合物、ジアセチルセルロースとモノアセチルセルロースの混合物を好ましく使用する事ができる。特にトリアセチルセルロースとジアセチルセルロースの混合物を好ましく使用することができる。
トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースの混合比（モル比）は、９９：１〜１：９９であることが好ましい。さらには、トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースの混合比は、９０：１０〜５０：５０である事が好ましい。

また、水酸基を有する有機材料の多孔性膜としては、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物を鹸化処理した有機材料からなる多孔性膜を好ましく用いることができる。アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物を鹸化処理した有機材料としては、トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースの混合物の鹸化物、トリアセチルセルロースとモノアセチルセルロースの混合物の鹸化物、トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースとモノアセチルセルロースの混合物の鹸化物、ジアセチルセルロースとモノアセチルセルロースの混合物の鹸化物も好ましく使用する事ができる。特に、トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースの混合物の鹸化物を好ましく使用することができる。
トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースの混合比は、９９：１〜１：９９である事が好ましい。さらには、トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースの混合比は、９０：１０〜５０：５０である事が好ましい。

鹸化処理とは、アセチルセルロースを鹸化処理液(例えば水酸化ナトリウム水溶液)に接触させることを言う。これにより、鹸化処理液に接触したアセチルセルロースの部分に、再生セルロースとなり水酸基が導入される。
核酸の分離効率を上げるためには、導入される水酸基の数が多い方が好ましい。例えば、鹸化率が約５％以上であることが好ましい。さらには、鹸化率が約１０％以上であることが好ましい。
鹸化率を変えるには、水酸化ナトリウムの濃度を変えて鹸化処理を行えば良い。表面鹸化率は、ＮＭＲまたはＩＲにより、定めることができる。

また、水酸基を有する有機材料の多孔性膜としては、セルロースの多孔性膜を好ましく使用する事ができる。セルロースの多孔性膜としては、再生セルロースの多孔性膜を好ましく使用する事ができる。再生セルロースとは、アセチルセルロースの固体の表面または全体を、鹸化処理によりセルロース化したもので、本来のセルロースとは、結晶状態等の点で異なっている。

親水基を持たない有機材料の多孔性膜に親水基を導入する方法として、ポリマー鎖内または側鎖に親水基を有すグラフトポリマー鎖を多孔性膜に結合することができる。
有機材料の多孔性膜にグラフトポリマー鎖を結合する方法としては、多孔性膜とグラフトポリマー鎖とを化学結合させる方法と、多孔性膜を起点として重合可能な二重結合を有する化合物を重合させグラフトポリマー鎖とする２つの方法がある。

まず、多孔性膜とグラフトポリマー鎖とを化学結合にて付着させる方法においては、ポリマーの末端または側鎖に多孔性膜と反応する官能基を有するポリマーを使用し、この官能基と、多孔性膜の官能基とを化学反応させることでグラフトさせることができる。多孔性膜と反応する官能基としては、多孔性膜の官能基と反応し得るものであれば特に限定はないが、例えば、アルコキシシランのようなシランカップリング基、イソシアネート基、アミノ基、水酸基、カルボキシル基、スルホン酸基、リン酸基、エポキシ基、アリル基、メタクリロイル基、アクリロイル基等を挙げることができる。

ポリマーの末端、または側鎖に反応性官能基を有するポリマーとして特に有用な化合物は、トリアルコキシシリル基をポリマー末端に有するポリマー、アミノ基をポリマー末端に有するポリマー、カルボキシル基をポリマー末端に有するポリマー、エポキシ基をポリマー末端に有するポリマー、イソシアネート基をポリマー末端に有するポリマーが挙げられる。この時に使用されるポリマーとしては、核酸の吸着に関与する親水基を有するものであれば特に限定はないが、具体的には、ポリヒドロキシエチルアクリル酸、ポリヒドロキシエチルメタアクリル酸及びそれらの塩、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸及びそれらの塩、ポリオキシエチレンなどを挙げることができる。

多孔性膜を基点として重合可能な二重結合を有する化合物を重合させ、グラフトポリマー鎖を形成させる方法は、一般的には表面グラフト重合と呼ばれる。表面グラフト重合法とは、プラズマ照射、光照射、加熱などの方法で基材表面上に活性種を与え、多孔性膜と接するように配置された重合可能な二重結合を有する化合物を重合によって多孔性膜と結合させる方法を指す。
基材に結合しているグラフトポリマー鎖を形成するのに有用な化合物は、重合可能な二重結合を有しており、核酸の吸着に関与する親水基を有するという、２つの特性を兼ね備えていることが必要である。これらの化合物としては、分子内に二重結合を有していれば、親水基を有するポリマー、オリゴマー、モノマーのいずれの化合物をも用いることができる。特に有用な化合物は親水基を有するモノマーである。

特に有用な親水基を有するモノマーの具体例としては、次のモノマーを挙げることができる。例えば、２−ヒドロキシエチルアクリレート、２−ヒドロキシエチルメタクリレート、グリセロールモノメタクリレート等の水酸性基含有モノマーを特に好ましく用いることができる。また、アクリル酸、メタアクリル酸等のカルボキシル基含有モノマー、もしくはそのアルカリ金属塩及びアミン塩も好ましく用いることができる。

親水基を持たない有機材料の多孔性膜に親水基を導入する別の方法として、親水基を有する材料をコーテイングすることができる。コーテイングに使用する材料は、核酸の吸着に関与する親水基を有するものであれば特に限定はないが、作業の容易さから有機材料のポリマーが好ましい。ポリマーとしては、ポリヒドロキシエチルアクリル酸、ポリヒドロキシエチルメタアクリル酸及びそれらの塩、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸及びそれらの塩、ポリオキシエチレン、アセチルセルロース、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物などを挙げることができるが、多糖構造を有するポリマーが好ましい。

また、親水基を持たない有機材料の多孔性膜に、アセチルセルロースまたは、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物をコーティングした後に、コーティングしたアセチルセルロースまたは、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物を鹸化処理することもできる。この場合、鹸化率が約５％以上であることが好ましい。さらには、鹸化率が約１０％以上であることが好ましい。

親水基を有する無機材料である多孔性膜としては、シリカ化合物を含有する多孔性膜を挙げることができる。シリカ化合物を含有する多孔性膜としては、ガラスフィルターを挙げることができる。また、特許公報第３０５８３４２号に記載されているような、多孔質のシリカ薄膜を挙げることができる。この多孔質のシリカ薄膜とは、二分子膜形成能を有するカチオン型の両親媒性物質の展開液を基板上に展開した後、基板上の液膜から溶媒を除去することによって両親媒性物質の多層二分子膜薄膜を調整し、シリカ化合物を含有する溶液に多層二分子膜薄膜を接触させ、次いで前記多層二分子膜薄膜を抽出除去することで作製することができる。

親水基を持たない無機材料の多孔性膜に親水基を導入する方法としては、多孔性膜とグラフトポリマー鎖とを化学結合させる方法と、分子内に二重結合を有している親水基を有するモノマーを使用して、多孔性膜を起点として、グラフトポリマー鎖を重合する２つの方法がある。
多孔性膜とグラフトポリマー鎖とを化学結合にて付着させる場合は、グラフトポリマー鎖の末端の官能基と反応する官能基を無機材料に導入し、そこにグラフトポリマーを化学結合させる。また、分子内に二重結合を有している親水基を有するモノマーを使用して、多孔性膜を起点として、グラフトポリマー鎖を重合する場合は、二重結合を有する化合物を重合する際の起点となる官能基を無機材料に導入する。
親水性基を持つグラフトポリマー、および分子内に二重結合を有している親水基を有するモノマーとしては、上記、親水基を持たない有機材料の多孔性膜とグラフトポリマー鎖とを化学結合させる方法において、記載した親水性基を持つグラフトポリマー、および分子内に二重結合を有している親水基を有するモノマーを好ましく使用することができる。

親水基を持たない無機材料の多孔性膜に親水基を導入する別の方法として、親水基を有する材料をコーテイングすることができる。コーテイングに使用する材料は、核酸の吸着に関与する親水基を有するものであれば特に限定はないが、作業の容易さから有機材料のポリマーが好ましい。ポリマーとしては、ポリヒドロキシエチルアクリル酸、ポリヒドロキシエチルメタアクリル酸及びそれらの塩、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸及びそれらの塩、ポリオキシエチレン、アセチルセルロース、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物などを挙げることができる。

また、親水基を持たない無機材料の多孔性膜に、アセチルセルロースまたは、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物をコーテイングした後に、コ−ティングしたアセチルセルロ−スまたは、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物を鹸化処理することもできる。この場合、鹸化率が約５％以上であることが好ましい。さらには、鹸化率が約１０％以上であることが好ましい。

親水基を持たない無機材料の多孔性膜としては、アルミニウム等の金属、ガラス、セメント、陶磁器等のセラミックス、もしくはニューセラミックス、シリコン、活性炭等を加工して作製した多孔性膜を挙げることができる。

上記の、溶液が内部を通過可能な核酸吸着性多孔性膜としては、厚さが１０μｍ〜５００μｍである多孔性膜を用いることができる。さらに好ましくは、厚さが５０μｍ〜２５０μｍである多孔性膜を用いることができる。

また、溶液が内部を通過可能な核酸吸着性多孔性膜としては、最小孔径が０．２２μｍ以上である多孔性膜を用いることができる。さらに好ましくは、最小孔径が０．５μｍ以上である多孔性膜を用いることができる。また、溶液が内部を通過可能な核酸吸着性多孔性膜としては、最大孔径と最小孔径の比が２以上である多孔性膜を用いることができる。さらに好ましくは、最大孔径と最小孔径の比が５以上である多孔性膜を用いることができる。

また、溶液が内部を通過可能な核酸吸着性多孔性膜としては、空隙率が５０〜９５％である多孔性膜を用いることができる。さらに好ましくは、空隙率が６５〜８０％である多孔性膜を用いることができる。また、溶液が内部を通過可能な核酸吸着性多孔性膜としては、バブルポイントが、０．１〜１０ｋｇｆ／ｃｍ^２である多孔性膜を用いることができる。さらに好ましくは、バブルポイントが、０．２〜４ｋｇｆ／ｃｍ^２である多孔性膜を用いることができる。

また、溶液が内部を通過可能な核酸吸着性多孔性膜としては、圧力損失が、０．１〜１００ｋＰａである多孔性膜を用いる事ができる。さらに好ましくは、圧力損失が、０．５〜５０ｋＰａである多孔性膜を用いる事ができる。ここで、圧力損失とは、膜の厚さ１００μｍあたり、水を通過させるのに必要な最低圧力である。

また、溶液が内部を通過可能な核酸吸着性多孔性膜としては、また、２５℃で１ｋｇ／ｃｍ^２の圧力で水を通過させたときの透水量が、膜１ｃｍ^２あたり１分間で１〜５０００ｍＬである多孔性膜を用いることができる。さらに好ましくは、２５℃で１ｋｇ／ｃｍ^２の圧力で水を通過させたときの透水量が、膜１ｃｍ^２あたり１分間で５〜１０００ｍＬである多孔性膜を用いることができる

また、溶液が内部を通過可能な核酸吸着性多孔性膜としては、多孔性膜1ｍｇあたりの核酸の吸着量が０．１μｇ以上である多孔性膜を好ましく使用することができる。さらに好ましくは、多孔性膜1ｍｇあたりの核酸の吸着量が０．９μｇ以上である多孔性膜を用いることができる。

また、溶液が内部を通過可能な核酸吸着性多孔性膜としては、一辺が５ｍｍの正方形の多孔性膜をトリフルオロ酢酸５ｍＬに浸漬したときに、１時間以内では溶解しないが４８時間以内に溶解するセルロース誘導体からなる多孔性膜を好ましく使用することができる。また、一辺が５ｍｍの正方形の多孔質膜をトリフルオロ酢酸５ｍＬに浸漬したときに１時間以内に溶解するが、ジクロロメタン５ｍＬに浸漬したときには２４時間以内に溶解しないセルロース誘導体からなる多孔性膜を好ましく使用することができる。

核酸吸着性多孔性膜中を、核酸を含む試料溶液を通過させる場合、試料溶液を一方の面から他方の面へと通過させることが好ましい。核酸吸着性多孔性膜中を、核酸を含む試料溶液を通過させる場合、試料溶液を核酸吸着性多孔性膜の孔径が大きい側から小さい側に通過させることが好ましい。

核酸を含む試料溶液を核酸吸着性多孔性膜を通過させる場合の流速は、膜の面積ｃｍ^２あたり、２〜１５００μＬ/secであることが好ましい。さらに、膜の面積ｃｍ^２あたり、５〜７００μＬ/secであることが好ましい。

また、使用する溶液が内部を通過可能な核酸吸着性多孔性膜は、１枚であってもよいが、複数枚を使用することもできる。複数枚の核酸吸着性多孔性膜は、同一のものであっても、異なるものであって良い。

少なくとも二個の開口を有する容器内に、上記のような溶液が内部を通過可能な核酸吸着性多孔性膜を収容した核酸分離精製カートリッジを好ましく使用することができる。また、少なくとも二個の開口を有する容器内に、上記のような溶液が内部を通過可能な核酸吸着性多孔性膜を複数枚収容した核酸分離精製カートリッジを好ましく使用することができる。この場合、少なくとも二個の開口を有する容器内に収容される複数枚の核酸吸着性多孔性膜は、同一のものであっても、異なるものであって良い。

複数枚の核酸吸着性多孔性膜は、無機材料の核酸吸着性多孔性膜と有機材料の核酸吸着性多孔性膜との組合せであっても良い。例えば、ガラスフイルターと再生セルロースの多孔性膜との組合せを挙げることができる。また、複数枚の核酸吸着性多孔性膜は、無機材料の核酸吸着性多孔性膜と有機材料の核酸非吸着性多孔性膜との組合せであってもよい、例えば、ガラスフイルターと、ナイロンまたはポリスルホンの多孔性膜との組合せを挙げることができる。

核酸分離精製カートリッジは、少なくとも二個の開口を有する容器内に、上記のような溶液が内部を通過可能な核酸吸着性多孔性膜を収容する以外、その他の部材を収容していないことが好ましい。上記の容器の材料としては、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリ塩化ビニル、ポリメタアクリル酸エステル、ポリエチレン、ポリエステル、ナイロンなどのプラスチックを使用することができる。また、生分解性の材料も好ましく使用することができる。また、上記の容器は透明であっても、着色してあっても良い。

上記カ−トリッジに収容される核酸吸着性多孔膜の形状としては、円形、正方形、長方形、楕円等、任意のいずれの形状でも良く、特に円が好ましい。

核酸分離精製カートリッジとして、個々の核酸分離精製カートリッジを識別する手段を備えている核酸分離精製カートリッジを使用することができる。個々の核酸分離精製カートリッジを識別する手段としては、バーコード、磁気テープなどが挙げられる。

また、少なくとも二個の開口を有する容器内から核酸吸着性多孔性膜を容易に取り出すことが可能になっている構造を有した核酸分離精製カートリッジを使用することもできる。

上記に記載した、各々の溶液が内部を通過可能な核酸吸着性多孔性膜を収容する核酸分離精製カートリッジを用いて、以下の工程で核酸を分離精製することができる。すなわち、(a)核酸を含む試料溶液を、少なくとも二個の開口を有する容器内に、溶液が内部を通過可能な、核酸吸着性多孔性膜を収容した核酸分離精製カートリッジの一の開口に注入する工程、(b)核酸分離精製カートリッジの他の開口に結合された圧力差発生装置を用いて核酸分離精製カートリッジト内を減圧状態にし、注入した核酸を含む試料溶液を、核酸吸着性多孔性膜を通過させ、核酸分離精製カートリッジの上記他の開口より排出することによって、核酸吸着性多孔性膜内に核酸を吸着させる工程、(c)核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に洗浄液を注入する工程、(d)核酸分離精製カートリッジの上記他の開口に結合された圧力差発生装置を用いて核酸分離精製カートリッジ内を減圧状態にし、注入した洗浄液を、核酸吸着性多孔性膜を通過させ、上記他の開口より排出することによって、核酸吸着性多孔性膜を、核酸が吸着した状態で、洗浄する工程、(e)核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に回収液を注入する工程、(f)核酸分離精製カートリッジの上記他の開口に結合された圧力差発生装置を用いて核酸分離精製カートリッジ内を減圧状態にし、又は核酸分離精製カートリッジに遠心力を作用させ、注入した回収液を、核酸吸着性多孔性膜を通過させ、上記他の開口より排出することによって、核酸吸着性多孔性膜内から核酸を脱着させ、核酸分離精製カートリッジ容器外に排出する工程を行なうことができる。

また、別の核酸分離精製工程としては、(a)核酸を含む試料溶液を、少なくとも二個の開口を有する容器内に、溶液が内部を通過可能な、核酸吸着性多孔性膜を収容した核酸分離精製カートリッジの一の開口に注入する工程、 (b)核酸分離精製カートリッジに遠心力を作用させ、注入した核酸を含む試料溶液を、核酸吸着性多孔性膜を通過させ、核酸分離精製カートリッジの他の開口より排出することによって、核酸吸着性多孔性膜内に核酸を吸着させる工程、 (c)核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に洗浄液を注入する工程 (d)核酸分離精製カートリッジに遠心力を作用させ、注入した洗浄液を、核酸吸着性多孔性膜を通過させ、他の開口より排出することによって、核酸吸着性多孔性膜を、核酸が吸着した状態で、洗浄する工程、(e)核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に回収液を注入する工程 (f)核酸分離精製カートリッジに遠心力を作用させ、注入した回収液を、核酸吸着性多孔性膜を通過させ、他の開口より排出することによって、核酸吸着性多孔性膜内から核酸を脱着させ、核酸分離精製カートリッジ容器外に排出する工程を行うこともできる。

以下、洗浄工程について説明する。洗浄を行うことにより、核酸の回収量及び純度が向上し、必要な核酸を含む検体の量を微量とすることができる。また、洗浄や回収操作を自動化することによって、操作が簡便かつ迅速に行うことが可能になる。洗浄工程は、迅速化のためには1回の洗浄で済ませることができる。また純度がより重要な場合には複数回洗浄を繰返してもよい。

洗浄工程において、洗浄液は、チューブ、ピペット、又は自動注入装置、もしくはこれらと同じ機能をもつ供給手段を使用して、核酸吸着性多孔性膜を収容した核酸分離精製カートリッジへ供給される。供給された洗浄液は、核酸分離精製カートリッジの一の開口（核酸を含む試料溶液を注入した開口）から供給され、該開口に結合された圧力差発生装置（例えばスポイド、注射器、ポンプ、パワーピペットなど）を用いて核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にして核酸吸着性多孔性膜を通過させ、一の開口と異なる開口より排出させることができる。また、洗浄液を一の開口から供給し、同じ一の開口より排出させることもできる。さらには、核酸分離精製カートリッジの核酸を含む試料溶液を供給した一の開口と異なる開口より洗浄液を供給し、排出させることも可能である。しかしながら、核酸分離精製カートリッジの一の開口から供給し、核酸吸着性多孔性膜を通過させ、一の開口と異なる開口より排出さる方法が洗浄効率が優れてより好ましい。
特に好ましい態様は、試料溶液を注入した一の開口から洗浄液も供給し、核酸吸着性多孔性膜を通過させ、一の開口と異なる開口より排出さる方法と、試料溶液を注入した一の開口と異なる開口から洗浄液を供給し、核酸吸着性多孔性膜を通過させ、一の開口より排出さる方法である。
洗浄工程における洗浄液の液量は、２μｌ/ｍｍ^２以上が好ましい。洗浄液量が多量であれば洗浄効果は向上するが、操作性を保ち、試料の流出を抑止するためには、２００μｌ/ｍｍ^２以下が好ましい。

洗浄工程において、洗浄液を核酸吸着性多孔性膜を通過させる場合の流速は、膜の単位面積（ｃｍ^２）あたり、２〜１５００μＬ/secであることが好ましく、５〜７００μＬ/secであることがより好ましい。通過速度を下げて時間を掛ければ洗浄がそれだけ十分に行なわれることになるが、核酸の分離精製操作の迅速化も重要であるので上記した範囲が選択される。

洗浄工程において、洗浄液の液温は４〜７０℃であることが好ましい。さらには、洗浄液の液温を室温とすることがより好ましい。
また洗浄工程において、その核酸分離精製カートリッジを器械的な振動や超音波による攪拌を与えながら、または遠心分離により洗浄することもできる。

洗浄工程において、洗浄液には、一般的には核酸分解酵素のような酵素を含ませないが、タンパク質等の夾雑物質を分解する酵素を含ませることができる。また、場合によってはＤＮＡ分解酵素、ＲＮＡ分解酵素などを含ませることもできる。ＤＮＡ分解酵素を含む洗浄液は、検体中のＲＮＡのみを選択的に回収する場合に好ましく用いられる。逆に、ＲＮＡ分解酵素を含む洗浄液は、検体中のＤＮＡのみを選択的に回収する場合に好ましく用いられる。

洗浄工程において、洗浄液として、水溶性有機溶媒及び/または水溶性塩を含んでいる溶液を用いることができる。洗浄液は、核酸吸着性多孔性膜に核酸と共に吸着した試料溶液中の不純物を洗い流す機能を有する必要がある。そのためには、核酸吸着性多孔性膜から核酸は脱着させないが不純物は脱着させる組成であることが必要である。この目的には、アルコール等の水溶性有機溶媒が核酸が難溶性であるので、核酸を保持したまま核酸以外の成分を脱着させるのに適している。また、水溶性塩を添加することにより、核酸の吸着効果が高まるので、不要成分の選択的除去作用が向上する。

洗浄液に含まれる水溶性有機溶媒としては、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ｎ−イソプロパノール、ブタノール、アセトンなどを用いることができ、中でもエタノ―ルを用いることが好ましい。洗浄液中に含まれる水溶性有機溶媒の量は、２０〜１００重量％であることが好ましく、４０〜８０重量％であることがより好ましい。

本発明の核酸の分離精製方法の特徴は、前記したように核酸吸着性多孔性膜が実質的にイオン結合が関与しない相互作用で核酸が吸着する多孔性膜であることと同時に、洗浄液にカオトロピック物質を含有していないことを特徴としている。カオトロピック物質は前記したように、核酸可溶化試薬溶液では核酸の分離に効果的であり、洗浄液に添加してもその点では効果がある。しかしながら、本発明では、カオトロピック物質を含まない洗浄液を用いることによって、多孔性膜に吸着した核酸由来の蛋白質やその分解物の洗浄液への溶解作用の促進を図っている。同時に、回収液にカオトロピック物質の混入が抑制される。回収工程時に、カオトロピック物質が混入すると、しばしばＰＣＲ反応等の酵素反応を阻害するので、洗浄液にカオトロッピク物質を含まないことは、この点でも有利である。したがって、洗浄効率が高くなるので、１回の洗浄ですませることが可能であり、この点でも核酸の分離精製操作を迅速化できる。また、洗浄工程と回収工程の間に乾燥工程を設ける必要もないので、この点からも簡易化と迅速化を促進させることができる。

また、カオトロピック物質は、腐食性で有害であるので、この点でもカオトロピック物質を用いないで済むことは、作業者にとっても試験操作の安全上極めて有利である。
ここで、カオトロピック物質とは、前記したように尿素、グアニジン塩（特に塩酸塩、酢酸塩、リン酸塩）、イソチオシアン酸塩（とくにナトリウム塩やカリウム塩）、チオシアン酸塩（とくにナトリウム塩やカリウム塩）、水溶性ヨウ化物（とくにナトリウム塩、カリウム塩）などである。

さらに、洗浄液がカオトロピック物質を含有しないことは、核酸含有検体中の細胞膜や細胞質を分解するタンパク分解酵素などの酵素の活性が維持にも好都合で、洗浄液中にタンパク質分解酵素、核酸分解酵素、ＤＮＡ分解酵素などを含有させる態様にも好ましく適用できる。
カオトロピック物質を含まなくても、回収するべき核酸と検体中の細胞膜や細胞質由来のタンパク質などの不純物との分離を良くして洗浄性を維持するには、洗浄液のイオン強度を５〜５００ｍｍｏｌ／Ｌの範囲に選択すること、及び洗浄液に１０〜１０００ｍｍｏｌ／Ｌの範囲の水溶性塩を含ませることも効果的である。
イオン強度の調整は、洗浄液中の塩類やイオン性界面活性剤の種類と濃度などの調節によって行うことができる。
水溶性塩としては、ハロゲン化物の塩が好ましく、とくに塩化物が適している。また、少量でイオン強度を高めるためには硫酸塩やリン酸塩を用いてもよい。
一方、水溶性塩のカチオン成分として好ましいのは、一価または二価のカチオンであり、特にカリウム塩又はナトリウム塩が好ましく、中でもナトリウム塩が適している。また、少量でイオン強度を高めるためにはマグネシウム塩を用いてもよい
塩の濃度は１０ｍｍｏｌ／Ｌ以上含まれているのが好ましい。特に塩化ナトリウムが２０ｍｍｏｌ／Ｌ以上含まれていることが目的の効果を発揮するのに好ましい。
本発明の請求項１〜１６に記載の核酸分離精製方法を行うために、核酸分離精製カ−トリッジ、試薬のキット及び核酸分離精製陽自動装置を用いて簡易,迅速に行なうことができる。

従来、核酸分離精製工程における洗浄工程の際、洗浄液がカ−トリジなどの容器に対する濡れ性が低いため、しばしば洗浄液が容器中に残留することになり、洗浄工程に続く回収工程への洗浄液の混入して核酸の純度の低下や次工程における反応性の低下などの原因となっている。したがって、カ−トリッジなどの容器を用いて核酸の吸着及び脱着を行う場合、吸着、洗浄時に用いる液、特に洗浄液が、次の工程に影響を及ぼさないように、カートリッジ内に洗浄残液が残留しないことは重要である。

したがって、洗浄工程における洗浄液が次工程の回収液に混入することを防止して、洗浄液のカ−トリッジ内への残留を最小限に留めるため、洗浄液の表面張力を３５ｍPa・ｍ以下にすることが好ましい。表面張力を低くすれば洗浄液とカートリッジの濡れ性が向上し、残留する液量を抑えることができる。洗浄液の表面張力の下限に付いては特に規定する必要はないが、１５ｍPa・ｍ以下にしても更なる効果は得られない。

逆に、場合によっては、洗浄工程における洗浄液のカートリッジへの残留を減少させる目的で、洗浄液の表面張力を３５ｍPa・ｍ以上にして、カートリッジとの撥水性を高めて液滴を形成させ、その液滴が流れ落ちることによって残留する液量を抑えることもできる。核酸を吸着した多孔性膜、回収液、洗浄液の組合せなどによっていずれかの表面張力が選択される。したがって、本発明は、洗浄液の方面張力を３５ｍPa・ｍ以下に限定するものではない。

本発明に係る核酸吸着性多孔性膜を利用して洗浄工程を簡素化することができる。(1)洗浄液が核酸吸着性多孔性膜を通過する回数を1回でよい、(2)洗浄工程を室温でできる。(3)洗浄後、直ちに回収液をカートリッジに注入することができる。前記（１）、（２）、（３）のすべてを用いることが操作の簡易・迅速化の点で優れているが、いずれか1つもしくは２つでも効果は認められる。従来法においては、洗浄液中に含まれる有機溶媒を迅速に取り除くため、しばしば乾燥工程を必要としたが、本発明に係る核酸吸着性多孔性膜は薄膜であるためにこれを省略できるからである。

従来、核酸分離精製工程において、洗浄工程の際、しばしば洗浄液が飛散し他に付着することによって、試料のコンタミネーション（汚染）が起きることが問題となっている。洗浄工程におけるこの種のコンタミネーションは、二個の開口を有する容器内に核酸吸着性多性孔膜を収容した核酸分離精製カートリッジと廃液容器の形状とを工夫することによって抑止することができる。

以下に核酸吸着性多性孔膜から核酸を脱着させて回収する工程について示す。回収工程において、回収液は、チューブ、ピペット、又は自動注入装置、もしくはこれらと同じ機能をもつ供給手段を使用して、核酸吸着性多孔性膜を装着した核酸分離精製カートリッジへ供給される。回収液は、核酸分離精製カートリッジの一の開口（核酸を含む試料溶液を注入した開口）から供給され、該開口に結合された圧力差発生装置（例えばスポイド、注射器、ポンプ、パワーピペットなど）を用いて核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にして核酸吸着性多孔性膜を通過させ、一の開口と異なる開口より排出させることができる。また、回収液を一の開口から供給し、同じ一の開口より排出させることもできる。さらには、核酸分離精製カートリッジの核酸を含む試料溶液を供給した一の開口と異なる開口より回収液を供給し、排出させることも可能である。しかしながら、核酸分離精製カートリッジの一の開口から供給し、核酸吸着性多孔性膜を通過させ、一の開口と異なる開口より排出さる方法が回収効率が優れてより好ましい。

検体から調整した核酸を含む試料溶液の体積に対して、回収液の体積を調整して核酸の脱着を行うことができる。分離精製された核酸を含む回収液量は、そのとき使用する検体量による。一般的によく使われる回収液量は数１０から数１００μｌであるが、検体量が極微量である時や、逆に大量の核酸を分離精製したい場合には回収液量は１μｌから数１０ｍｌの範囲で変えることができる。

回収液のｐＨは、ｐＨ２〜１１であることが好ましい。さらには、ｐＨ５〜９であることが好ましい。また特にイオン強度と塩濃度は吸着核酸の溶出に効果を及ぼす。回収液は、２９０ｍｍｏｌ／Ｌ以下のイオン強度であることが好ましく、さらには、９０ｍｍｏｌ／Ｌ以下の塩濃度であることが好ましい。こうすることで、核酸の回収率が向上し、より多くの核酸を回収できることができる。しかしながら、本発明では、回収液として単に水（蒸留水、純水など）を用いることを妨げない。回収される核酸は１本鎖でもよく、２本鎖でも良い。

回収液の体積を当初の核酸を含む試料溶液の体積と比較して少なくすることによって、濃縮された核酸を含む回収液を得ることができる。好ましくは、(回収液体積)：(試料溶液体積)＝１：１００〜９９：１００、更に好ましくは、(回収液体積)：(試料溶液体積)＝１：１０〜９：１０にすることができる。これにより核酸分離精製後工程において濃縮のための操作をすることなく、簡単に核酸を濃縮できる。これらの方法により検体よりも核酸が濃縮されている核酸溶液を得る方法を提供できる。

また別の方法としては、回収液の体積を当初の核酸を含む試料溶液よりも多い条件で核酸の脱着を行うことにより、希望の濃度の核酸を含む回収液を得ることができ、次工程（ＰＣＲなど）に適した濃度の核酸を含む回収液を得ることができる。好ましくは、(回収液体積)：(試料溶液体積)＝１：１〜５０：１、更に好ましくは、 (回収液体積)：(試料溶液体積)＝１：１〜５：１にすることができる。これにより核酸分離精製後に濃度調整をする煩雑さがなくなるというメリットを得られる。更に、十分量の回収液を使用することにより、多孔性膜からの核酸回収率の増加を図ることができる。

また、目的に応じて回収液の温度を変化させることで簡便に核酸を回収することができる。例えば、回収液の温度を０〜１０℃にして多孔性膜からの核酸の脱着を行うことで、酵素による分解を防止する何らかの試薬や特別な操作を加えることなく核酸分解酵素の働きを抑制して、核酸の分解を防ぎ、簡便に、効率よく核酸溶液を得ることができる。

また、回収液の温度を１０〜３５℃とした場合、一般的な室温で核酸の回収を実施することが出来、複雑な工程を必要とせずに核酸を脱着させて分離精製することができる。

また別の方法としては、回収液の温度を高温、例えば３５〜７０℃することで、多孔性膜からの核酸の脱着を煩雑な操作を経ず簡便に高い回収率で実施することができる。

回収液の注入回数は限定されるものではなく、１回でも複数回でもよい。通常、迅速、簡便に核酸を分離精製する場合は、１回の回収で実施するが、大量の核酸を回収する場合等複数回にわたり回収液を注入する事がある。

回収工程においては、核酸の回収液をその後の後工程に使用できる組成にしておくことが可能である。分離精製された核酸は、しばしばＰＣＲ(ポリメラ−ゼチェインリアクション)法により増幅される。この場合、分離精製された核酸溶液はＰＣＲ法に適したバッファ−液で希釈する必要がある。本方法による回収工程において、回収液にＰＣＲ法に適したバッファ−液を用いることで、その後のＰＣＲ工程へ簡便、迅速に移行することができる。

また、回収工程において、核酸の回収液に回収した核酸の分解を防ぐための安定化剤を添加しておくことも可能である。安定化剤としては、抗菌剤、抗カヒ゛剤や核酸分解抑制剤などを添加することができる。核酸分解酵素の阻害剤としてはＥＤＴＡなどが上げられる。また別の実施態様として、回収容器にあらかじめ安定化剤を添加しておくこともできる。

また、回収工程で用いられる回収容器には特に限定はないが、２６０ｎｍの吸収が無い素材で作製された回収容器を用いることができる。この場合、回収した核酸溶液の濃度を、他の容器に移し替えずに測定できる。２６０nmに吸収のない素材は、例えば石英ガラス等が上げられるが，それに限定されるものではない。

上記の核酸分離精製の工程では、核酸含有試料液の注入から核酸分離精製カートリッジ容器外に核酸を得るまでの工程を2分〜10分で終了することができる。また、上記の核酸分離精製の工程では、核酸を５０％から９０％の収率で得ることができる。

[実施例１]
（１）核酸精製カートリッジの作製
内径７ｍｍ、核酸吸着性多孔膜を収容する部分を持つ核酸分離精製カートリッジ用容器をハイインパクトポリスチレンで作製した。
（２）核酸吸着性多孔膜として、トリアセチルセルロ−スの多孔膜（膜厚＝７０μｍ、平均孔径＝１．２μｍ）を鹸化処理した多孔膜（鹸化率２０％）を使用し、これを上記核酸分離精製カートリッジ用容器の核酸吸着性多孔膜を収容する部分に収容した。

（３）核酸可溶化試薬及び洗浄液の調製
表１に示す処方の核酸可溶化試薬溶液及び洗浄液を調製した。

（４）核酸分離精製操作
ガン化人骨髄細胞（ＨＬ６０）培養液から細胞中の核酸の分離精製操作を下記の手順で行なった。すなわち、この培養液２００μｌに核酸可溶化試薬溶液２００μｌとプロテアーゼＫ（ＳＩＧＭＡ製）溶液２０μｌを添加して６０℃で１０分間インキュベートした。インキュベートしたのち、エタノ−ル２００μｌを添加して攪拌し、攪拌後、この細胞培養試料を上記核酸吸着性多孔膜を備えた核酸分離精製カートリッジの一の開口に注入し、続いて上記一の開口に圧力発生装置（パワーピペット）を結合し、核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にし、注入した該ＲＮＡを含む試料溶液を、上記核酸吸着性多孔膜に通過させることにより、上記核酸吸着性多孔膜に接触させ、核酸分離精製カートリッジの他の開口より排出する。続いて、上記核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に洗浄液を５００μＬ注入し、上記核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に圧力発生装置を結合し、核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にし、注入した洗浄液を、上記核酸吸着性多孔膜に通過させ、他の開口より排出した。続いて、上記核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に回収液として水を２００μＬ注入し、上記核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に圧力発生装置を結合して、核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にし、注入した回収液を、上記核酸吸着性多孔膜に通過させ、他の開口より排出し、この液を回収した。

比較例１
洗浄液として表２に示した組成のものを使用した以外は、実施例１と同じ条件及び操作により、分離した核酸を含有する液を回収した。

（５）核酸の回収量の定量
実施例１と比較例１の実験を１０回繰返し、各実験毎の回収液の分光吸光度を求め、２６０ｎｍの吸光度からＤＮＡの回収量を、２６０ｎｍと２８０ｎｍの吸光度比（A260/A280と記す）から純度を求めた。その結果を表３に示した。

表３の結果から明らかなように、本発明用の方法を用いることにより、洗浄液にカオトロピック物質を用いなくても、用いたときとほぼ同様かむしろ優れた収量及び純度と、ほぼ同様の再現性で核酸を回収及び精製できることが示された。
この核酸の分離精製は、約５分の短時間で簡易な操作と装置とによって行うことができた。

Claims

(1)核酸を含む試料溶液を核酸吸着性多孔性膜に通過させて、該多孔性膜内に核酸を吸着させる工程、
(2) 洗浄液を該核酸吸着性多孔性膜に通過させて、核酸が吸着した状態で該核酸吸着性多孔性膜を洗浄する工程、及び
(3)回収液を、該核酸吸着性多孔性膜に通過させて、該多孔性膜内から核酸を脱着させる工程を含む核酸の分離精製方法において、該核酸吸着性多孔性膜がイオン結合が実質的に関与しない相互作用で核酸が吸着する多孔性膜であり、且つ、該洗浄液はカオトロピック物質を含有していないことを特徴とする核酸の分離精製方法。
上記(1)、(2)及び(3)の各工程において、核酸を含む試料溶液、洗浄液又は回収液を、加圧状態で核酸吸着性多孔性膜に通過させることを特徴とする請求項１記載の核酸の分離精製方法。
上記(1)、(2)及び(3)の各工程において、少なくとも二個の開口を有する容器内に該核酸吸着性多孔性膜を収容した核酸分離精製カートリッジの一の開口に、核酸を含む試料溶液、洗浄液又は回収液を注入し、カートリッジの上記一の開口に結合された圧力差発生装置を用いてカートリッジ内を加圧状態にして、該注入した各液を通過させ、他の開口より排出させることを特徴とする請求項１記載の核酸の分離精製方法。
カオトロピック物質が、尿素、グアニジン塩、イソチオシアン酸塩、チオシアン酸塩及びアルカリ金属のヨウ化物から選択される化合物であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
核酸が吸着した核酸吸着性多孔性膜に洗浄液を通過させて、該核酸吸着性多孔性膜を洗浄する回数が１回であることを特徴とする請求項１〜〜４のいずれかに記載の核酸の分離精製方法
該洗浄工程と回収工程の間に、核酸を吸着した多孔性膜を乾燥させる工程を含まないことを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の核酸の分離精製方法
核酸吸着性多孔性膜が、水酸基を有する有機高分子材料の多孔性膜であることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
核酸吸着性多孔性膜が、多糖構造を有する多孔性膜であることを特徴とする請求項７に記載の核酸の分離精製方法。
核酸吸着性多孔性膜が、再生セルロースの多孔性膜であることを特徴とする請求項７又は８に記載の核酸の分離精製方法。
核酸を含む試料溶液が、核酸の水溶液または核酸のバッファ溶液に水溶性有機溶媒を添加した溶液であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
核酸を含む試料溶液が、細胞又はウイルスを含む検体を核酸可溶化試薬で処理して得られた溶液に水溶性有機溶媒を添加した溶液であることを特徴とする請求項１〜３及び１０のいずれかに記載の方法。
水溶性有機溶媒が、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ｎ−プロパノール又はそれらの混合物であることを特徴とする請求項１０又は１１に記載の方法。
核酸可溶化試薬が、カオトロピック塩、界面活性剤およびタンパク質分解酵素を含む溶液であることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
洗浄液が、メタノール、エタノール、イソプロパノール又はｎ−プロパノールを２０〜１００重量％含む溶液であることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
洗浄液が、１価又は２価金属の水溶性塩を５〜５００ｍｍｏｌ／Ｌ含む溶液であることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
回収液が、塩濃度が０．５ｍｏｌ／Ｌ以下の溶液であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の方法。