JP4956727B2 - Ｒｎａ分離精製方法 - Google Patents

Description

本発明は、ＲＮＡを分離精製する方法に関する。

核酸は、様々な分野で種々の形態で使用されている。例えば、組換え核酸技術の領域においては、核酸をプローブ、ゲノム核酸、およびプラスミド核酸の形態で用いることが要求される。

診断分野においても、核酸は種々の形態で種々の目的に用いられている。例えば、核酸プローブは、ヒトの病原体の検出および診断に日常的に用いられている。同様に核酸は遺伝障害の検出に用いられている。核酸はまた食品汚染物質の検出にも用いられている。さらに、核酸は遺伝地図の作製からクローニングおよび組換え発現におよぶ種々の目的により、興味ある核酸の位置確認、同定および単離において日常的に用いられている。
近年、Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲやマイクロアレイなど、ＲＮＡの発現を検出する方法が開発され、ＲＮＡの発現パターンと疾患、薬効などの関係を調べることが重要視されている。

多くの場合、核酸は極めて少量でしか入手できず、そして単離および精製操作が煩雑で時間を要する。このしばしば時間を消費する煩雑な操作は核酸の損失に結びつきやすい。ＲＮＡは非常に不安定で、熱やアルカリ、また特にＲＮａｓｅによって分解されやすい。分解なく、かつ、高純度なＲＮＡを分離精製することは非常に難しい。
血清、尿およびバクテリアのカルチャーから得られた試料から核酸を精製する場合には、コンタミネーションおよび疑陽性の結果が生じるという危険性も加わる。

広く知られた分離精製方法の一つに、核酸を二酸化珪素、シリカポリマー、珪酸マグネシウム等の固相に吸着させ、これに引き続いて洗浄、脱着等の操作を行い、分離精製する方法がある（例えば、特許文献１）。この方法は、分離性能として優れているが、簡便性、迅速性、自動化適性において充分といえず、またこの方法に用いられる器具および装置は小型化に不向きであり、さらに器具および装置、特に吸着媒体を同一性能で工業的に大量生産することが困難であり、かつ取扱いが不便で、種々の形状に加工しがたい等の問題点がある。さらに、素材自体が脆いために機械的強度を得るには一定以上の厚みが必要となるため、特にＤＮＡとＲＮＡの混合試料からＲＮＡを選択的に回収するために、ＤＮａｓｅでＤＮＡを分解する際に、ＤＮａｓｅを固相に均一に作用させるには一定量以上の液量が必要となる等の問題がある。ＤＮａｓｅは比較的高価なものであり、今後ますます必要性が増加すると予測されるＲＮＡの選択的回収の際に問題となる。

また、簡便かつ効率よく核酸を分離精製する方法の一つとして、固相に核酸を吸着させる溶液及び固相から核酸を脱着させる溶液をそれぞれ用いて、表面に水酸基を有する有機高分子から成る固相に核酸を吸着及び脱着させることによって、核酸を分離精製する方法が提案されている（特許文献２）が、更なる改良が望まれる。

その他に、従来から知られている核酸分離精製法としては、遠心法によるもの、磁気ビーズを用いるもの、フィルターを用いるものなどがある。また、これらを利用した核酸分離精製装置が提案されている。例えば、フィルターを用いた核酸分離精製装置としては、フィルターを収容したフィルターチューブをラックに多数セットし、これに核酸を含む試料溶液を分注し、前記ラックの底部の周囲をシール材を介してエアチャンバーで密閉して内部を減圧し、全フィルターチューブを同時に排出側より吸引し試料液を通過させて核酸
をフィルターに吸着し、その後、洗浄液および回収液を分注して、再び減圧吸引して洗浄・脱着するようにした自動装置が提案されている（例えば、特許文献３参照）。
特公平７−５１０６５号公報 特開２００３−１２８６９１号公報 特許第２８３２５８６号公報

一方、特に白血球中のＲＮＡを分離する必要性も高まっている。血液中には、白血球に対し赤血球は１００倍程度の数が含まれる。さらに赤血球の中にもＲＮＡを持つ未熟な赤血球、即ち「網状赤血球」は赤血球の１％程度占めているので、白血球に対して１０倍程度の数となる。
網状赤血球の数が多いため、全血液中のＲＮＡ量の最大７０％を網状赤血球のＲＮＡが占めると言われている。そのため、白血球中のＲＮＡを回収したい場合、網状赤血球中のＲＮＡはノイズとなってしまうため予め除いておくことが重要である。

赤血球を溶血後白血球を溶菌し、得られた白血球溶液中の核酸を検出する方法が提案されている（特表平８−５０１２０８公報）。この技術は、溶血剤としてＣＴＡＢやサポニンが用いられており、溶血効果は検証されているが、白血球ペレットを溶解後核酸を分離精製することなく、直接核酸検出反応を行っているため、非常にノイズの多い方法と考えられる。特に近年、その検出が重要視されているＲＮＡの場合、ＤＮＡやタンパク質などの夾雑物をほぼ完全に除去しなければ正確な結果を得られない。この技術は、不安定なＲＮＡを高純度に分離精製するには至っていない。

また、多孔性膜を用いてＲＮＡを分離精製する場合、赤血球を壊さずに全血のまま溶解したものを試料溶液として用いると、目詰まりの可能性が高くなる。
以上２つの赤血球由来の問題点を回避するため、予め赤血球を破壊することが非常に重要である。
よって本発明の目的は、血液から白血球を壊すことなく赤血球を破壊し、白血球からＲＮＡを効率よく、高純度で分離精製することである。

本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、核酸を多孔性膜に吸着及びＲＮＡを脱着させる下記（１）〜（３）の工程を含む核酸の分離精製方法において、該多孔性膜としてイオン結合が関与しない相互作用で核酸が吸着する多孔性膜を用い、（１）〜（３）の工程前に試料溶液調製工程において白血球をペレットとして得ることによって、白血球からＲＮＡを効率よく、高純度で分離精製することができることを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。
〔１〕
（１）核酸を含む試料溶液を核酸吸着性多孔性膜に通過させて、該多孔性膜に核酸を吸着させる工程、
（２）洗浄液を核酸吸着性多孔性膜に通過させて、ＲＮＡが吸着した状態で該多孔性膜を洗浄する工程、及び
（３）回収液を核酸吸着性多孔性膜に通過させて、該多孔性膜からＲＮＡを脱着させる工程、
を含有するＲＮＡ分離精製方法において、
該核酸吸着性多孔性膜がイオン結合が関与しない相互作用で核酸が吸着する多孔性膜であり、且つ、
核酸を含む試料溶液が、
（Ｉ）血液および白血球の少なくともいずれかを含み、かつ抗凝固剤を含む検体を容器に注入する工程、
（ＩＩ）容器に溶血剤を添加した後に３００×ｇ〜３０００×ｇにて遠心分離することにより、白血球ペレットを得る工程、
（ＩＩＩ）白血球ペレットに核酸可溶化試薬を添加して混合液を得る工程、
（ＩＶ）混合液に水溶性有機溶媒を添加し、核酸を含む試料溶液を得る工程、
を含有する試料溶液調製工程で得ることを特徴とするＲＮＡ分離精製方法。
〔２〕
前記溶血剤が、塩化アンモニウム、塩化ナトリウム、シュウ酸アンモニウムおよびサポニンから選ばれる少なくとも一つを含む上記〔１〕に記載のＲＮＡ分離精製方法。
〔３〕
（ＩＩ）の工程において、前記溶血剤を添加後、０〜３５℃でインキュベートする上記〔１〕または〔２〕に記載のＲＮＡ分離精製方法。
〔４〕
前記核酸可溶化試薬が、カオトロピック塩、核酸安定化剤、界面活性剤、緩衝剤及び消泡剤から選ばれる少なくとも一つを含む上記〔１〕〜〔３〕のいずれか一項に記載のＲＮＡ分離精製方法。
〔５〕
前記カオトロピック塩がグアニジン塩である、上記〔４〕に記載のＲＮＡ分離精製方法。
〔６〕
前記核酸安定化剤が還元剤である上記〔４〕又は〔５〕に記載のＲＮＡ分離精製方法。
〔７〕
前記界面活性剤がノニオン性界面活性剤を含む、上記〔４〕〜〔６〕のいずれか一項に記載のＲＮＡ分離精製方法。
〔８〕
前記核酸を含む試料溶液、前記洗浄液および前記回収液の少なくともいずれかを、加圧状態で核酸吸着性多孔性膜に通過させる、上記〔１〕〜〔７〕のいずれか一項に記載のＲＮＡ分離精製方法。
本発明は上記〔１〕〜〔８〕の構成を有するものであるが、以下その他についても参考のため記載した。

１．（１）核酸を含む試料溶液を核酸吸着性多孔性膜に通過させて、該多孔性膜に核酸を吸着させる工程、
（２）洗浄液を核酸吸着性多孔性膜に通過させて、ＲＮＡが吸着した状態で該多孔性膜を洗浄する工程、及び
（３）回収液を核酸吸着性多孔性膜に通過させて、該多孔性膜からＲＮＡを脱着させる工程、
を含有するＲＮＡ分離精製方法において、
該核酸吸着性多孔性膜がイオン結合が関与しない相互作用で核酸が吸着する多孔性膜であり、且つ、
核酸を含む試料溶液が、
（Ｉ）血液および白血球の少なくともいずれかを含み、かつ抗凝固剤を含む検体を容器に注入する工程、
（II）容器に溶血剤を添加し、白血球ペレットを得る工程、
（III）白血球ペレットに核酸可溶化試薬を添加して混合液を得る工程、
（IV）混合液に水溶性有機溶媒を添加し、核酸を含む試料溶液を得る工程、
を含有する試料溶液調製工程で得ることを特徴とするＲＮＡ分離精製方法。
２． 溶血剤が、塩化アンモニウム、塩化ナトリウム、シュウ酸アンモニウムおよびサポニンから選ばれる少なくとも一つを含む前記１に記載のＲＮＡ分離精製方法。
３． （II）の工程において、溶血剤を添加後、０〜３５℃でインキュベートする前記１または２に記載のＲＮＡ分離精製方法。
４． 核酸可溶化試薬が、カオトロピック塩、核酸安定化剤、界面活性剤、緩衝剤及び消泡剤から選ばれる少なくとも一つを含む前記１〜３のいずれかに記載のＲＮＡ分離精製方法。
５． カオトロピック塩がグアニジン塩である、前記４に記載のＲＮＡ分離精製方法。
６． 核酸安定化剤が還元剤である前記４又は５に記載のＲＮＡ分離精製方法。
７． 界面活性剤がノニオン性界面活性剤を含む、前記４〜６のいずれかに記載のＲＮＡ分離精製方法。
８． 核酸を含む試料溶液、洗浄液および回収液の少なくともいずれかを、加圧状態で核酸吸着性多孔性膜に通過させる、前記１〜７のいずれかに記載のＲＮＡ分離精製方法。
９． 前記１〜８のいずれかに記載のＲＮＡ分離精製方法を自動で行う装置。
１０．（ｉ）核酸吸着性多孔性膜を収容した核酸分離精製カートリッジ、並びに（ii）溶血剤、（iii）核酸可溶化試薬、（iv）洗浄液および（v）回収液の試薬を含む前記１〜８のいずれかに記載のＲＮＡ分離精製方法を行うためのキット。
１１．前記１０に記載のキットの使用を、自動で行う装置。

本発明によれば、血液から白血球ペレットを分離し、効率よく、高純度のＲＮＡを、例えばＲＮＡ水溶液として得ることができる。

さらには、本発明のＲＮＡ分離精製方法により、分離性能良く、簡便で、迅速に、自動化可能に、検体からＲＮＡを分離精製することができる。

本発明のＲＮＡ分離精製方法は、
（１）核酸を含む試料溶液を核酸吸着性多孔性膜に通過させて、該多孔性膜に核酸を吸着させる工程（以下、「吸着工程」とも言う。）、
（２）洗浄液を核酸吸着性多孔性膜に通過させて、ＲＮＡが吸着した状態で、該多孔性膜を洗浄する工程（以下、「洗浄工程」とも言う。）、及び
（３）回収液を核酸吸着性多孔性膜に通過させて、該多孔性膜からＲＮＡを脱着させる工程（以下、「回収工程」とも言う。）
を少なくとも含むものである。

好ましくは、上記（１）、（２）及び（３）の各工程において、核酸を含む試料溶液、洗浄液又は回収液を、加圧状態で核酸吸着性多孔性膜に通過させるものであり、より好ましくは、上記（１）、（２）及び（３）の各工程において、少なくとも二個の開口を有する容器内に該核酸吸着性多孔性膜を収容した核酸分離精製カートリッジの一の開口に、核酸を含む試料溶液、洗浄液又は回収液を注入し、カートリッジの上記一の開口に結合された圧力差発生装置を用いてカートリッジ内を加圧状態にして、該注入した各液を通過させ、他の開口より排出させるものである。核酸を含む試料溶液、洗浄液又は回収液を加圧状態で上記多孔性膜に通過させることにより、装置をコンパクトに自動化することができ、
好ましい。加圧は、好ましくは１０〜３００ｋｐａ、より好ましくは４０〜２００ｋｐａの程度で行われる。

上記（１）〜（３）の工程では、最初の核酸を含む試料溶液を注入から核酸分離精製カートリッジ外にＲＮＡを得るまでの工程を２０分以内、好適な状況では２分以内で終了することが可能である。また、上記のＲＮＡ分離精製の工程ではＲＮＡを検体中に含まれる全量に対して好適には５０質量％以上、より好適な状況では９０質量％以上の収率で得る事が可能である。

また、上記のＲＮＡ分離精製の工程では、紫外可視分光光度計での測定値（２６０ｎｍ／２８０ｎｍ）が、１．８〜２．２となる純度を持つＲＮＡを回収することができ、不純物混入量の少ない高純度のＲＮＡを定常的に得ることができる。好適な状況では、紫外可視分光光度計での測定値（２６０ｎｍ／２８０ｎｍ）が２．０付近となる純度を持つＲＮＡを回収することができる。
また、上記工程において、圧力差発生装置としては、注射器、ピペッタ、あるいはペリスタポンプのような加圧が可能なポンプ等、或いは、エバポレーター等の減圧可能なものが挙げられる。これらの内、手動操作には注射器が、自動操作にはポンプが適している。
また、ピペッタは片手操作が容易にできるという利点を有する。好ましくは、圧力差発生装置は、核酸分離精製カートリッジの一の開口に着脱可能に結合されている。

本発明は、少なくとも下記（Ｉ）〜（IV）の工程を含有する試料溶液調製工程で、核酸を含む試料溶液を得る。
（Ｉ）血液および白血球の少なくともいずれかを含み、かつ抗凝固剤を含む検体を容器に注入する工程、
（II）上記容器に溶血剤を添加し、白血球ペレットを得る工程、
（III）白血球ペレットに核酸可溶化試薬を添加して混合液を得る工程、
（IV）IIIで得られた混合液に水溶性有機溶媒を添加し、核酸を含む試料溶液を得る工程。

以上の工程により、白血球が壊れることなく赤血球を破壊し、白血球ペレットを得、さらに、白血球の細胞膜および核膜を溶解して、核酸が水溶液内に分散した核酸を含む試料溶液が得られる。

白血球の細胞膜および核膜を効率的に溶解するためには、赤血球を予め破壊し、除去しておくことが重要である。赤血球を予め除去しておくことは、目詰まりを防ぐためにも重要である。

白血球の細胞膜および核膜の溶解は、抽出の対象である核酸、さらにはＲＮＡを可溶化させるために必要かつ重要である。

（Ｉ）血液および白血球の少なくともいずれかを含み、かつ抗凝固剤を含む検体を容器に注入する工程
本発明において検体は血液および白血球の少なくともいずれかを含む。血液としては例えば全血が挙げられる。また白血球は全血から得られたものも対象となる。
さらに、本発明における検体には抗凝固剤が含有される。抗凝固剤としては一般に、ＥＤＴＡ、ヘパリン、クエン酸ナトリウム、フッ化ナトリウム、ＡＣＤ（ａｃｉｄ ｃｉｔｒａｔｅ ｄｅｘｔｒｏｓｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）などが挙げられ、単独または二つ以上の組み合わせで用いられる。含有量は一般的な使用量の範囲で使用することができる。本発明はこれらの抗凝固剤に限られず、検体に含まれる抗凝固剤の種類によらずに、上記（１）〜（３）の工程を含むＲＮＡ分離精製方法において効率よくＲＮＡを分離精製すること
ができる。

核酸を含む検体は、単一の核酸を含む検体でもよいし、異なる複数種類の核酸を含む検体でもよい。検体の数は一つでも複数（複数の容器を用いての複数の検体の並列処理）であってもよい。回収する核酸の長さも特に限定されず、例えば、数ｂｐ〜数Ｍｂｐの任意の長さの核酸を使用することができる。取扱い上の観点からは、回収する核酸の長さは一般的には、数ｂｐ〜数百ｋｂｐ程度である。本発明の核酸分離精製方法は、従来の簡易的な核酸分離精製方法より比較的長い核酸を迅速に取り出すことができ、好ましくは５０ｋｂｐ以上、より好ましくは７０ｋｂｐ、更に好ましくは１００ｋｂｐ以上の核酸を回収することに用いることができる。

検体を注入する容器としては、限定されないが、プラスチック製のチューブやガラス製のバイアルや試験管などが好ましい。これらの容器が、ヌクレアーゼフリーかつパイロジェンフリーであれば、より好ましい。
検体を容器に注入する際の注入方法としては、限定はされないが、ピペットやスポイトなどの実験用器具を使用するのが好ましい。これらの器具が、ヌクレアーゼフリーかつパイロジェンフリーであれば、より好ましい。
容器への注入は特に限定なく、何れの方法、器具を用いることもできる。

（II）容器に溶血剤を添加し、白血球ペレットを得る工程
本発明では、溶血剤を添加し、白血球ペレットを得る。この工程によって、白血球を壊さずに赤血球を破壊し、主に白血球ペレットを得る事ができる。
溶血剤としては、塩化アンモニウム、塩化ナトリウム、シュウ酸アンモニウムおよびサポニンが挙げられ、これらの中から選ばれる少なくとも一つを含む溶血剤を用いて、白血球を壊すことなく赤血球を破壊することが好ましい。特に塩化アンモニウムを含む溶血剤を用いることが好ましい。溶血剤の至適濃度は溶血剤によって異なるが、０．１〜２０％の範囲で用いることが好ましい。塩化アンモニウムの場合は、０．８〜１．０％の範囲で用いることが好ましい。
溶血剤の液量は全血の場合、全血：溶血剤比は１：２〜２０が好ましい。１：４〜１０がさらに好ましい。
また、溶血剤を添加後、０〜３５℃でインキュベートすることが好ましい。インキュベートは1分〜３０分行うことが好ましい。さらに５分〜２０分インキュベートすることが好ましい。
溶血剤を全血に添加した場合、赤血球破壊が完了すると濁っているものが透明になる。そのような状態になった後３００×ｇ〜３０００×ｇにて遠心分離して、白血球ペレットを得ることができる。

（III）白血球ペレットに核酸可溶化試薬を添加して混合液を得る工程
本発明では、白血球の細胞膜および核膜を溶解し核酸を可溶化するために、核酸可溶化試薬を用いる。核酸可溶化試薬としては、カオトロピック塩、核酸安定化剤、界面活性剤、緩衝剤及び消泡剤から選ばれる少なくとも一つを含む試薬を用いることが好ましい。核酸可溶化試薬は、溶液であっても乾燥物であってもよい。溶液を用いることが好ましい。また、カオトロピック塩、核酸安定化剤、界面活性剤、緩衝剤及び消泡剤以外の成分を含んでもよい。

カオトロピック塩としては、特に限定は無く公知のカオトロピック塩を使用することができる。カオトロピック塩としては、グアニジン塩、イソチアン酸ナトリウム、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウム等を使用することができる。中でもＲＮａｓｅ阻害効果の観点からグアニジン塩が好ましい。グアニジン塩としては、塩酸グアニジン、イソチオシアン酸グアニジン、グアニジンチオシアン酸塩（チオシアン酸グアニジン）が挙げられ、中で
も塩酸グアニジンまたはグアニジンチオシアン酸塩が好ましい。これらの塩は単独でも、複数組み合わせて用いてもよい。
核酸可溶化試薬中のカオトロピック塩濃度は、０．５ｍｏｌ／Ｌ以上であることが好ましく、より好ましくは０．５ｍｏｌ／Ｌ〜８ｍｏｌ／Ｌ、さらに好ましくは、１ｍｏｌ／Ｌ〜６ｍｏｌ／Ｌである。
カオトロピック塩の代わりに、カオトロピック物質として尿素を用いることもできる。

核酸可溶化試薬は、核酸安定化剤を含むことが好ましい。核酸安定化剤は、検体中の核酸を安定に存在させることができ、好ましい。より好ましくは、カオトロピック塩、界面活性剤、緩衝剤および消泡剤の中から選ばれるいずれか１つ以上と共存させる。これにより、最終的に得られるＲＮＡの回収量及び回収効率が向上し、検体の微量化及び迅速化が可能となり、好ましい。
核酸安定化剤としては、ヌクレアーゼの活性を不活性化させる作用を有するものが挙げられる。検体によっては、核酸を分解するヌクレアーゼ等が含まれていることがあり、核酸をホモジナイズすると、このヌクレアーゼが核酸に作用し、収量が激減することがある。
ヌクレアーゼの活性を不活性化させる作用を有する核酸安定化剤としては、一般的に還元剤として使用される化合物を用いることができる。還元剤としては、水素、ヨウ化水素、硫化水素、水素化アルミニウムリチウム、水素化ホウ素ナトリウム等の水素化化合物、アルカリ金属、マグネシウム、カルシウム、アルミニウム、亜鉛等の電気的陽性の大きい金属、またはそれのアマルガム、アルデヒド類、糖類、ギ酸、シュウ酸などの有機酸化物、メルカプト化合物等が挙げられる。中でもメルカプト化合物が好ましい。メルカプト化合物としては、Ｎ−アセチルシステイン、メルカプトエタノールや、アルキルメルカプタン等が挙げられる。メルカプト化合物は単独または複数組み合わせて用いてもよい。
核酸安定化剤は、核酸可溶化試薬における濃度は０．１〜２０質量％であることが好ましく、より好ましくは、０．３〜１５質量％で用いることができる。メルカプト化合物は、核酸可溶化試薬における濃度は０．１〜２０質量％であることが好ましく、より好ましくは、０．５〜１５質量％で用いることができる。

界面活性剤としては、例えば、ノニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、両性界面活性剤が挙げられる。
本発明においてはノニオン性界面活性剤およびカチオン性界面活性剤を好ましく用いることができる。ノニオン性界面活性剤はより好適に環境の極性を変化させることができ特に好ましい。
ノニオン性界面活性剤としては、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル系界面活性剤、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系界面活性剤、脂肪酸アルカノールアミドが挙げられ、好ましくは、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系界面活性剤である。ポリオキシエチレン（ＰＯＥ）アルキルエーテル系界面活性剤としては、ＰＯＥデシルエーテル、ＰＯＥラウリルエーテル、ＰＯＥトリデシルエーテル、ＰＯＥアルキレンデシルエーテル、ＰＯＥソルビタンモノラウレート、ＰＯＥソルビタンモノオレエート、ＰＯＥソルビタンモノステアレート、テトラオレイン酸ポリオキシエチレンソルビット、ＰＯＥアルキルアミン、ＰＯＥアセチレングリコールが挙げられる。
カチオン性界面活性剤としては、セチルトリメチルアンモニウムプロミド、ドデシルトリメチルアンモニウムクロリド、テトラデシルトリメチルアンモニウムクロリド、セチルピリジニウムクロリドが挙げられる。
これらの界面活性剤は、単独または複数組み合わせて用いてもよい。界面活性剤の核酸可溶化試薬における濃度は０．１〜２０質量％であることが好ましい。

前記核酸可溶化試薬は、好ましくはｐＨ３〜８、より好ましくはｐＨ４〜７、さらに好ましくはｐＨ５〜７のものが用いられる。

緩衝剤としては、通常用いられるｐＨ緩衝剤（ｂｕｆｆｅｒ）を挙げることができる。好ましくは、生化学用のｐＨ緩衝剤が挙げられる。このような緩衝剤としては、クエン酸塩、リン酸塩または酢酸塩を含む緩衝剤、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ＴＥ（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／ＥＤＴＡ）、ＴＢＥ（Ｔｒｉｓ−Ｂｏｒａｔｅ／ＥＤＴＡ）、ＴＡＥ（Ｔｒｉｓ−Ａｃｅｔａｔｅ／ＥＤＴＡ）、グッド緩衝剤が挙げられる。グッド緩衝剤としては、ＭＥＳ（２−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ)、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（Ｂｉｓ（２‐ｈｙｄｏｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｉｍｉｎｏｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｍｅｔｈａｎｅ)、ＨＥＰＥＳ（２−［４−（２−Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ］ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、ＰＩＰＥＳ（Ｐｉｐｅｒａｘｉｎｅ−１，４−ｂｉｓ（２−ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ））、ＡＣＥＳ（Ｎ−（２−Ａｃｅｔａｍｉｎｏ）−２−ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、ＣＡＰＳ（Ｎ−Ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ−３−ａｍｉｎｏｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、ＴＥＳ（Ｎ−Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ−２−ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）が挙げられる。
これらの緩衝剤は、前記核酸可溶化試薬中の濃度は１〜５００ｍｍｏｌ／Ｌであることが好ましい。

消泡剤としては、シリコン系消泡剤（例えば、シリコーンオイル、ジメチルポリシロキサン、シリコーンエマルジョン、変性ポリシロキサン、シリコーンコンパウンドなど）、アルコール系消泡剤（例えば、アセチレングリコール、ヘプタノール、エチルエキサノール、高級アルコール、ポリオキシアルキレングリコールなど）、エーテル系消泡剤（例えば、ヘプチルセロソルブ、ノニルセロソルブ−３−ヘプチルコルビトールなど）、油脂系消泡剤（例えば、動植物油など）、脂肪酸系消泡剤（例えば、ステアリン酸、オレイン酸、パルミチン酸など）、金属セッケン系消泡剤（例えば、ステアリン酸アルミ、ステアリン酸カルシウムなど）、脂肪酸エステル系消泡剤（例えば、天然ワックス、トリブチルホスフェートなど）、リン燐酸エステル系消泡剤（例えば、オクチルリン酸ナトリウムなど）、アミン系消泡剤（例えば、ジアミルアミンなど）、アミド系消泡剤（例えば、ステアリン酸アミドなど）、その他の消泡剤（例えば、硫酸第二鉄、ボーキサイトなど）などが挙げられる。これらの消泡剤は、単独または複数組み合わせて用いてもよい。特に好ましくは、シリコン系消泡剤とアルコール系消泡剤の２つの成分を組み合わせて使用することである。
消泡剤の核酸可溶化試薬における濃度は０．１〜１０質量％であることが好ましい。

また、前記の核酸可溶化試薬は水溶性有機溶媒を含んでいても良い。水溶性有機溶媒としては、アセトン、アルコール類、ジメチルホルムアミド等が挙げられる。核酸可溶化試薬に含まれる各種試薬の溶解性を上げることができ、好ましい。中でも、アルコール類が好ましい。アルコール類は、１級アルコール、２級アルコール、３級アルコールのいずれでも良い。とりわけメタノール、エタノール、プロパノール及びその異性体、ブタノール及びその異性体をより好ましく用いることができる。これらの水溶性有機溶媒は単独でも複数組み合わせて用いてもよい。これら水溶性有機溶媒の核酸可溶化試薬における濃度は１〜２０質量％であることが好ましい。

白血球１０個〜１×１０⁹個に対して、核酸可溶化試薬５０〜１０００μｌで処理することが望ましい。白血球が溶解し、かつ、カートリッジの容量を超えない範囲で核酸可溶化試薬の液量を変えることができる。

白血球と核酸可溶化試薬とを混合する方法は、特に限定されない。例えば、混合する際、攪拌装置により３０から３０００ｒｐｍで１秒から３分間混合することが好ましい。こ
れにより、最終的に分離精製されるＲＮＡ収量を好適に増加させることができる。または、転倒混和を５から３０回行うことで混合することも好ましい。また、ピペッティング操作を、１０から５０回行うことによっても混合することができ、この場合、簡便な操作で最終的に分離精製されるＲＮＡ収量を増加させることができ、好ましい。

白血球に、核酸可溶化試薬を添加して得られた混合液をホモジナイズ処理することが好ましい。ホモジナイズ処理することで自動化処理適正が向上し、好ましい。ホモジナイズ処理は、例えば、超音波処理、鋭利な突起物を用いる処理、高速攪拌処理を用いる処理、微細空隙から押し出す処理、ガラス、ステンレス、ジルコニアなどのビーズを用いる処理等で行うことができる。これらの処理を行なうには、特に限定はなく、例えば、ボルテックスなどのミキサーや、Ｒｏｔｏｒ−Ｓｔａｔｏｒ型、ポッター型、ダウンス型などのホモジナイザーや、ビーズミル、ペッスル、フレンチプレス、グラインダー、ブレードホモジナイザーなどの市販のホモジナイザー等、いずれも使用することができる。核酸可溶化試薬を添加する前にホモジナイズ処理する場合は、検体を液体窒素で凍らせた後、ビーズミルやクラッシャーミル、すり鉢、粉砕機などを使用して処理することもできる。

（IV）IIIで得られた混合液に水溶性有機溶媒を添加し、核酸を含む試料溶液を得る工程
水溶性有機溶媒としては、特に限定は無いが、アルコール類を好ましく用いることができる。アルコール類としては、１級アルコール、２級アルコール、３級アルコールのいずれでもよく、メタノール、エタノール、プロパノール又はその異性体、ブタノール又はその異性体を好ましく用いることができる。これら水溶性有機溶媒は、単独でも複数組み合わせて用いてもよい。水溶性有機溶媒の核酸を含む試料溶液（以下、核酸混合物溶液とも言う。）における最終濃度は、５〜９０質量％であることが好ましい。より好ましくは１５〜７５質量％、１５〜５０質量％がさらにより好ましい。至適ＥｔＯＨ濃度を採用することで、ＤＮａｓｅを用いなくても回収サンプルへのゲノムＤＮＡの混入を減少させ、ＲＮＡを効率よく高純度で分離精製することが出来る。水溶性有機溶媒を添加後に混合する際、攪拌装置により３０から３０００ｒｐｍで１秒から３分間混合することが好ましい。これにより、分離精製されるＲＮＡ収量を増加させることができる。または、転倒混和を５から３０回行うことで混合することも好ましい。また、ピペッティング操作を、１０から５０回行うことによっても混合することができる。

また、得られた核酸混合物溶液は、表面張力は０．０５Ｊ／ｍ²以下であることが好ましく、また、粘度は、１〜１００００ｍＰａであることが好ましく、比重は、０．８〜１．２の範囲であることが好ましい。この範囲の溶液にすることで、次の工程において、核酸混合物溶液を核酸吸着性多孔性膜に通過させて、核酸を吸着させた後に、核酸混合物溶液残渣を除去しやすくする。

（１）核酸を含む試料溶液を核酸吸着性多孔性膜に通過させて、該多孔性膜に核酸を吸着させる工程（吸着工程）
以下に、（１）本発明で用いる核酸吸着性多孔性膜および核酸吸着性多孔性膜に核酸を吸着させる工程について説明する。
本発明の核酸吸着性多孔性膜は、溶液が内部を通過可能なものである。ここで「溶液が内部を通過可能」とは、膜の一方の面が接する空間と膜の他方の面が接する空間の間に圧力差を生じさせた場合に、高圧の空間側から低圧の空間側へと、膜の内部を溶液が通過することが可能であることを意味する。または、膜に遠心力を掛けた場合に、遠心力の方向に、膜の内部を溶液が通過することが可能であることを意味する。

また、本発明に用いられる核酸吸着性多孔性膜は、イオン結合が実質的に関与しない相互作用で核酸が吸着する多孔性膜である。これは、多孔性膜側の使用条件で「イオン化」していないことを意味し、環境の極性を変化させることで、核酸と多孔性膜が引き合うよ
うになると推定される。これにより分離性能に優れ、しかも洗浄効率よく、核酸を単離精製することができ、好ましい。さらに好ましくは、核酸吸着性多孔性膜は、親水基を有する多孔性膜であり、環境の極性を変化させることで、核酸と多孔性膜の親水基同士が引きあうようになると推定される。

ここで親水基とは、水との相互作用を持つことができる有極性の基（原子団）を指し、核酸の吸着に関与する全ての基（原子団）が当てはまる。親水基としては、水との相互作用の強さが中程度のもの（化学大事典、共立出版株式会社発行、「親水基」の項の「あまり親水性の強くない基」参照）が良く、例えば、水酸基、カルボキシル基、シアノ基、オキシエチレン基などを挙げることができる。好ましくは水酸基である。

ここで親水基を有する多孔性膜とは、多孔性膜を形成する材料自体が親水基を有する多孔性膜、または多孔性膜を形成する材料を処理またはコーティングすることによって親水基を導入した多孔性膜を意味する。多孔性膜を形成する材料は有機物、無機物のいずれでも良い。例えば、多孔性膜を形成する材料自体が親水基を有する有機材料である多孔性膜、親水基を持たない有機材料の多孔性膜を処理して親水基を導入した多孔性膜、親水基を持たない有機材料の多孔性膜に対し親水基を有する材料でコーティングして親水基を導入した多孔性膜、多孔性膜を形成する材料自体が親水基を有する無機材料である多孔性膜、親水基を持たない無機材料の多孔性膜を処理して親水基を導入した多孔性膜、親水基を持たない無機材料の多孔性膜に対し親水基を有する材料でコーティングして親水基を導入した多孔性膜などを使用することができるが、加工の容易性から、多孔性膜を形成する材料は有機高分子などの有機材料を用いることが好ましい。

親水基を有する材料の多孔性膜としては、ポリヒドロキシエチルアクリル酸、ポリヒドロキシエチルメタアクリル酸、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリオキシエチレン、アセチルセルロース、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物などで、形成された多孔性膜を挙げることができるが、特に水酸基を有する有機材料の多孔性膜、とりわけ水酸基を有する有機高分子からなる多孔性膜を好ましく使用することができる。

水酸基を有する有機材料の多孔性膜として、多糖構造を有する材料が好ましく、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物から成る有機高分子の多孔性膜をより好ましく使用することができる。アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物として、トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースの混合物、トリアセチルセルロースとモノアセチルセルロースの混合物、トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースとモノアセチルセルロースの混合物、ジアセチルセルロースとモノアセチルセルロースの混合物を好ましく使用する事ができる。特にトリアセチルセルロースとジアセチルセルロースの混合物を好ましく使用することができる。トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースの混合比（質量比）は、９９：１〜１：９９である事が好ましく、９０：１０〜５０：５０である事がより好ましい。

更に好ましい水酸基を有する有機材料としては、特開２００３−１２８６９１号公報に記載のアセチルセルロースの鹸化物が挙げられる。アセチルセルロースの鹸化物とは、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物を鹸化処理したものであり、トリアセチルセルロースとジアセチルセルロース混合物の鹸化物、トリアセチルセルロースとモノアセチルセルロース混合物の鹸化物、トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースとモノアセチルセルロース混合物の鹸化物、ジアセチルセルロースとモノアセチルセルロース混合物の鹸化物も好ましく使用することができる。より好ましくは、トリアセチルセルロースとジアセチルセルロース混合物の鹸化物を使用することである。トリアセチルセルロースとジアセチルセルロース混合物の混合比（質量比）は、９９：１〜１：９９であること
が好ましい。更に好ましくは、トリアセチルセルロースとジアセチルセルロース混合物の混合比は、９０：１０〜５０：５０であることである。この場合、鹸化処理の程度（鹸化率）で多孔性膜表面の水酸基の量（密度）をコントロールすることができる。
核酸の分離効率をあげるためには、水酸基の量（密度）が多いことが好ましい。鹸化処理により得られる有機材料の鹸化率（表面鹸化率）が５％以上１００％以下であることが好ましく、１０％以上１００％以下であることが更に好ましい。
また、水酸基を有する有機材料の表面積を大きくするために、アセチルセルロースの多孔性膜を鹸化処理することが好ましい。
多孔性膜は、表裏対称性の多孔性膜であってもよいが、表裏非対称性の多孔性膜を好ましく使用することができる。

ここで、鹸化処理とは、アセチルセルロースを鹸化処理液(例えば水酸化ナトリウム水溶液)に接触させることを言う。これにより、鹸化処理液に接触したセルロースのエステル誘導体のエステル基が加水分解され、水酸基が導入され再生セルロースとなる。こうして作成された再生セルロースは、本来のセルロースとは、結晶状態等の点で異なっている。また、鹸化率を変えるには、水酸化ナトリウムの濃度や処理時間を変えて鹸化処理を行えば良い。鹸化率は、ＮＭＲにより、容易に測定することができる（例えば、カルボニル基のピーク減少の程度で定めることができる）。

親水基を持たない有機材料の多孔性膜に親水基を導入する方法として、ポリマー鎖内または側鎖に親水基を有するグラフトポリマー鎖を多孔性膜に結合することができる。有機材料の多孔性膜にグラフトポリマー鎖を結合する方法としては、多孔性膜とグラフトポリマー鎖とを化学結合させる方法と、多孔性膜を起点として重合可能な二重結合を有する化合物を重合させグラフトポリマー鎖とする２つの方法がある。

まず、多孔性膜とグラフトポリマー鎖とを化学結合させる方法においては、ポリマーの末端または側鎖に多孔性膜と反応する官能基を有するポリマーを使用し、この官能基と、多孔性膜の官能基とを化学反応させることでグラフトさせることができる。多孔性膜と反応する官能基としては、多孔性膜の官能基と反応し得るものであれば特に限定はないが、例えば、アルコキシシランのようなシランカップリング基、イソシアネート基、アミノ基、水酸基、カルボキシル基、スルホン酸基、リン酸基、エポキシ基、アリル基、メタクリロイル基、アクリロイル基等を挙げることができる。ポリマーの末端、または側鎖に反応性官能基を有するポリマーとして特に有用な化合物は、トリアルコキシシリル基をポリマー末端に有するポリマー、アミノ基をポリマー末端に有するポリマー、カルボキシル基をポリマー末端に有するポリマー、エポキシ基をポリマー末端に有するポリマー、イソシアネート基をポリマー末端に有するポリマーが挙げられる。この時に使用されるポリマーとしては、核酸の吸着に関与する親水基を有するものであれば特に限定はないが、具体的には、ポリヒドロキシエチルアクリル酸、ポリヒドロキシエチルメタアクリル酸及びそれらの塩、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸及びそれらの塩、ポリオキシエチレンなどを挙げることができる。

多孔性膜を起点として重合可能な二重結合を有する化合物を重合させ、グラフトポリマー鎖とする方法は、一般的には表面グラフト重合と呼ばれる。表面グラフト重合法とは、プラズマ照射、光照射、加熱などの方法で多孔性膜表面上に活性種を与え、多孔性膜と接するように配置された重合可能な二重結合を有する化合物を重合によって多孔性膜と結合させる方法を指す。多孔性膜に結合するグラフトポリマー鎖を形成するのに有用な化合物は、重合可能な二重結合を有しており、核酸の吸着に関与する親水基を有するという、２つの特性を兼ね備えていることが必要である。これらの化合物としては、分子内に二重結合を有していれば、親水基を有するポリマー、オリゴマー、モノマーのいずれの化合物をも用いることができる。特に有用な化合物は親水基を有するモノマーである。特に有用な
親水基を有するモノマーの具体例としては、次のモノマーを挙げることができる。例えば、２−ヒドロキシエチルアクリレート、２−ヒドロキシエチルメタクリレート、グリセロールモノメタクリレート等の水酸性基含有モノマーを特に好ましく用いることができる。また、アクリル酸、メタアクリル酸等のカルボキシル基含有モノマー、もしくはそのアルカリ金属塩及びアミン塩も好ましく用いることができる。

親水基を持たない有機材料の多孔性膜に親水基を導入する別の方法として、親水基を有する材料をコーティングすることができる。コーティングに使用する材料は、核酸の吸着に関与する親水基を有するものであれば特に限定はないが、作業の容易さから有機材料のポリマーが好ましい。ポリマーとしては、ポリヒドロキシエチルアクリル酸、ポリヒドロキシエチルメタアクリル酸及びそれらの塩、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸及びそれらの塩、ポリオキシエチレン、アセチルセルロース、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物などを挙げることができるが、多糖構造を有するポリマーが好ましい。

また、親水基を持たない有機材料の多孔性膜に、アセチルセルロースまたは、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物をコーティングした後に、コーティングしたアセチルセルロースまたはアセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物を鹸化処理することもできる。この場合、鹸化率が５％以上１００％以下であることが好ましい。さらには、鹸化率が１０％以上１００％以下であることが好ましい。

親水基を有する無機材料である多孔性膜としては、シリカ化合物を含有する多孔性膜を挙げることができる。シリカ化合物を含有する多孔性膜としては、ガラスフィルターを挙げることができる。また、特許公報第３０５８３４２号に記載されているような、多孔質のシリカ薄膜を挙げることができる。この多孔質のシリカ薄膜とは、二分子膜形成能を有するカチオン型の両親媒性物質の展開液を基板上に展開した後、基板上の液膜から溶媒を除去することによって両親媒性物質の多層二分子膜薄膜を調整し、シリカ化合物を含有する溶液に多層二分子膜薄膜を接触させ、次いで前記多層二分子膜薄膜を抽出除去することで作製することができる。

親水基を持たない無機材料の多孔性膜に親水基を導入する方法としては、多孔性膜と親水基をもつグラフトポリマー鎖とを化学結合させる方法と、分子内に二重結合を有している親水基を有するモノマーを使用して、多孔性膜を起点として、グラフトポリマー鎖を重合する２つの方法がある。
多孔性膜と親水基をもつグラフトポリマー鎖とを化学結合させる場合は、グラフトポリマー鎖の末端の官能基と反応する官能基を無機材料に導入し、そこにグラフトポリマーを化学結合させる。また、分子内に二重結合を有している親水基を有するモノマーを使用して、多孔性膜を起点として、グラフトポリマー鎖を重合する場合は、二重結合を有する化合物を重合する際の起点となる官能基を無機材料に導入する。

親水基を持つグラフトポリマー、および分子内に二重結合を有している親水基を有するモノマーとしては、上記親水基を持たない有機材料の多孔性膜に親水基を導入する方法において記載した、親水基を有するグラフトポリマー、および分子内に二重結合を有している親水基を有するモノマーを好ましく使用することができる。

親水基を持たない無機材料の多孔性膜に親水基を導入する別の方法として、親水基を有する材料をコーティングすることができる。コーティングに使用する材料は、核酸の吸着に関与する親水基を有するものであれば特に限定はないが、作業の容易さから有機材料のポリマーが好ましい。ポリマーとしては、ポリヒドロキシエチルアクリル酸、ポリヒドロキシエチルメタアクリル酸及びそれらの塩、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリド
ン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸及びそれらの塩、ポリオキシエチレン、アセチルセルロース、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物などを挙げることができる。

また、親水基を持たない無機材料の多孔性膜に、アセチルセルロースまたは、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物をコーティングした後に、コーティングしたアセチルセルロースまたはアセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物を鹸化処理することもできる。この場合、鹸化率が５％以上１００％以下であることが好ましい。さらには、鹸化率が約１０％以上１００％以下であることが好ましい。

親水基を持たない無機材料の多孔性膜としては、アルミニウム等の金属、ガラス、セメント、陶磁器等のセラミックス、もしくはニューセラミックス、シリコン、活性炭等を加工して作製した多孔性膜を挙げることができる。

上記の核酸吸着性多孔性膜は、溶液が内部を通過可能であり、厚さが１０μｍ〜５００μｍであることが好ましい。さらに好ましくは、厚さが５０μｍ〜２５０μｍである。洗浄のし易さの観点からは、厚さが薄いほうが好ましい。

上記の、溶液が内部を通過可能な核酸吸着性多孔性膜は、最小孔径が０．２２μｍ以上であることが好ましい。さらに好ましくは、最小孔径が０．５μｍ以上である。また、最大孔径と最小孔径の比が２以上である多孔性膜を用いる事が好ましい。これにより、核酸が吸着するのに十分な表面積が得られるとともに、目詰まりし難い。さらに好ましくは、最大孔径と最小孔径の比が５以上である。

上記の、溶液が内部を通過可能な核酸吸着性多孔性膜は、空隙率が５０〜９５％であることがこのましい。さらに好ましくは、空隙率が６５〜８０％である。また、バブルポイントが、０．１〜１０ｋｇｆ／ｃｍ²である事が好ましい。さらに好ましくは、バブルポイントが、０．２〜４ｋｇｆ／ｃｍ²である。

上記の、溶液が内部を通過可能な核酸吸着性多孔性膜は、圧力損失が、０．１〜１００ｋＰａである事が好ましい。これにより、過圧時に均一な圧力が得られる。さらに好ましくは、圧力損失が、０．５〜５０ｋＰａである。ここで、圧力損失とは、膜の厚さ１００μｍあたり、水を通過させるのに必要な最低圧力である。

上記の、溶液が内部を通過可能な核酸吸着性多孔性膜は、２５℃で１ｋｇ／ｃｍ²の圧力で水を通過させたときの透水量が、膜１ｃｍ²あたり１分間で１〜５０００ｍＬであることが好ましい。さらに好ましくは、２５℃で１ｋｇ／ｃｍ²の圧力で水を通過させたときの透水量が、膜１ｃｍ²あたり1分間で５〜１０００ｍＬである。

上記の、溶液が内部を通過可能な核酸吸着性多孔性膜は、多孔性膜１ｍｇあたりの核酸の吸着量が０．１μｇ以上である事が好ましい。さらに好ましくは、多孔性膜１ｍｇあたりの核酸の吸着量が０．９μｇ以上である。

上記の、溶液が内部を通過可能な核酸吸着性多孔性膜は、一辺が５ｍｍの正方形の多孔性膜をトリフルオロ酢酸５ｍＬに浸漬したときに、１時間以内では溶解しないが４８時間以内に溶解するセルロース誘導体が、好ましい。また、一辺が５ｍｍの正方形の多孔質膜をトリフルオロ酢酸５ｍＬに浸漬したときに１時間以内に溶解するが、ジクロロメタン５ｍＬに浸漬したときには２４時間以内に溶解しないセルロース誘導体も好ましい。中でも、一辺が５ｍｍの正方形の多孔質膜をトリフルオロ酢酸５ｍＬに浸漬したときに１時間以内に溶解するが、ジクロロメタン５ｍＬに浸漬したときには２４時間以内に溶解しないセ
ルロース誘導体がより好ましい。

核酸吸着性多孔性膜中を、核酸混合物溶液を通過させる場合、核酸混合物溶液を一方の面から他方の面へと通過させることが、液を多孔性膜へ均一に接触させることができる点で、好ましい。核酸吸着性多孔性膜中を、核酸混合物溶液を通過させる場合、核酸混合物溶液を核酸吸着性多孔性膜の孔径が大きい側から小さい側に通過させることが、目詰まりし難い点で好ましい。

核酸混合物溶液を核酸吸着性多孔性膜に通過させる場合の流速は、液の多孔性膜への適切な接触時間を得るために、膜の面積ｃｍ²あたり、２〜１５００μＬ／ｓｅｃである事が好ましい。液の多孔性膜への接触時間が短すぎると十分な分離精製効果が得られず、長すぎると操作性の点から好ましくない。さらに、上記流速は、膜の面積ｃｍ²あたり、５〜７００μＬ／ｓｅｃである事が好ましい。

また、使用する溶液が内部を通過可能な核酸吸着性多孔性膜は、１枚であってもよいが、複数枚を使用することもできる。複数枚の核酸吸着性多孔性膜は、同一のものであっても、異なるものであって良い。

複数枚の核酸吸着性多孔性膜は、無機材料の核酸吸着性多孔性膜と有機材料の核酸吸着性多孔性膜との組合せであっても良い。例えば、ガラスフィルターと再生セルロースの多孔性膜との組合せを挙げることができる。また、複数枚の核酸吸着性多孔性膜、無機材料の核酸吸着性多孔性膜と有機材料の核酸非吸着性多孔性膜との組合せであってもよい、例えば、ガラスフィルターと、ナイロンまたはポリスルホンの多孔性膜との組合せを挙げることができる。

少なくとも二個の開口を有する容器内に、上記のような溶液が内部を通過可能な核酸吸着性多孔性膜を収容した核酸分離精製カートリッジを好ましく使用することができる。また、少なくとも二個の開口を有する容器内に、上記のような溶液が内部を通過可能な核酸吸着性多孔性膜を複数枚収容した核酸分離精製カートリッジを好ましく使用することができる。この場合、少なくとも二個の開口を有する容器内に収容される複数枚の核酸吸着性多孔性膜は、同一のものであっても、異なるものであっても良い。

核酸分離精製カートリッジは、少なくとも二個の開口を有する容器内に、上記のような溶液が内部を通過可能な核酸吸着性多孔性膜を収容する以外、その他の部材を収容していないことが好ましい。上記の容器の材料としては、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリ塩化ビニルなどのプラスチックを使用することができる。また、生分解性の材料も好ましく使用することができる。また、上記の容器は透明であっても、着色してあっても良い。

核酸分離精製カートリッジとして、個々の核酸分離精製カートリッジを識別する手段を備えている核酸分離精製カートリッジを使用する事ができる。個々の核酸分離精製カートリッジを識別する手段としては、バーコード、二次元バーコード、磁気テープ、ＩＣカードなどが挙げられる。

また、少なくとも二個の開口を有する容器内から核酸吸着性多孔性膜を容易に取り出す事が可能になっている構造を有した核酸分離精製カートリッジを使用することもできる。

（２）洗浄液を核酸吸着性多孔性膜に通過させて、ＲＮＡが吸着した状態で該多孔性膜を洗浄する工程（洗浄工程）
以下、（２）洗浄液を核酸吸着性多孔性膜に通過させて、ＲＮＡが吸着した状態で該多
孔性膜を洗浄する工程について説明する。
洗浄工程により、最終的に得られるＲＮＡの回収量及び純度が向上し、必要なＲＮＡを含む検体の量を微量とすることができる。また、洗浄や回収操作を自動化することによって、操作を簡便かつ迅速に行うことが可能になる。洗浄工程は、迅速化のためには１回の洗浄で済ませてもよく、また純度がより重要な場合には複数回洗浄を繰返すことが好ましい。

洗浄工程において、洗浄液は、チューブ、ピペット、又は自動注入装置、もしくはこれらと同じ機能をもつ供給手段を使用して、核酸吸着性多孔性膜を収容した核酸分離精製カートリッジへ供給される。供給された洗浄液は、核酸分離精製カートリッジの一の開口（核酸混合物溶液を注入した開口）から供給され、該開口に結合された圧力差発生装置（例えばスポイド、注射器、ポンプ、パワーピペットなど）を用いて核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にして核酸吸着性多孔性膜を通過させ、一の開口と異なる開口より排出させることができる。また、洗浄液を一の開口から供給し、同じ一の開口より排出させることもできる。さらには、核酸分離精製カートリッジの核酸混合物溶液を供給した一の開口と異なる開口より洗浄液を供給し、排出させることも可能である。中でも、核酸分離精製カートリッジの一の開口から供給し、核酸吸着性多孔性膜を通過させ、一の開口と異なる開口より排出させることが、洗浄効率が優れてより好ましい。
洗浄工程における洗浄液の液量は、２μｌ／ｍｍ²以上が好ましい。洗浄液量が多量であれば洗浄効果は向上する。しかし、２００μｌ／ｍｍ²以下とすることで、操作性を保ち、試料の流出を抑止することができ、好ましい。

洗浄工程において、洗浄液を核酸吸着性多孔性膜に通過させる場合の流速は、膜の単位面積（ｃｍ²）あたり、２〜１５００μＬ／ｓｅｃであることが好ましく、５〜７００μＬ／ｓｅｃであることがより好ましい。通常、通過速度を下げて時間を掛ければ洗浄がそれだけ十分に行なわれることになる。しかし、本発明では前記の範囲とすることで、洗浄効率を落とすことなく、ＲＮＡの分離精製操作を迅速化でき、好ましい。

洗浄工程において、洗浄液の液温は４〜７０℃であることが好ましい。さらには、洗浄液の液温を室温とすることがより好ましい。また洗浄工程において、洗浄工程と同時に核酸分離精製カートリッジに器械的な振動や超音波による攪拌を与えることもできる。または遠心分離を行うことにより洗浄することもできる。

洗浄工程において、洗浄液は、水溶性有機溶媒及び水溶性塩の少なくともいずれかを含んでいる溶液であることが好ましい。洗浄液は、核酸吸着性多孔性膜に核酸と共に吸着した核酸混合物溶液中の不純物を洗い流す機能を有する必要がある。そのためには、核酸吸着性多孔性膜から核酸は脱着させないが不純物は脱着させる組成であることが必要である。この目的には、核酸はアルコール等の水溶性有機溶媒に対し難溶性であるので、核酸を保持したまま核酸以外の成分を脱着させるのに水溶性有機溶媒が適している。また、水溶性塩を添加することにより、核酸の吸着効果が高まるので、不純物および不要成分の選択的除去作用を向上することができる。

洗浄液に含まれる水溶性有機溶媒としては、アルコールを用いることができる。アルコールとしては、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ｎ−イソプロパノール、ブタノールが挙げられる。プロパノールとしては、イソプロパノール、ｎ−プロパノールのいずれでもよく、ブタノールも直鎖状でも分岐状でもいずれでもよい。これらアルコールは、複数種類を使用することもできる。中でもエタノールを用いることが好ましい。
洗浄液中に含まれる水溶性有機溶媒の量は、１〜１００質量％であることが好ましく、５〜４０質量％であることがより好ましい。この範囲で、ＤＮＡのコンタミネーションが増大することなく、目的のＲＮＡが多孔性膜から脱着することがなく、したがって、ＲＮ
Ａを純度よく、回収量を高くすることができ好ましい。

一方、洗浄液に含まれる水溶性塩は、ハロゲン化物の塩であることが好ましく、中でも塩化物が好ましい。また、水溶性塩は、一価または二価のカチオンであることが好ましく、特にアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩が好ましく、中でもナトリウム塩、カリウム塩及びリチウム塩が好ましく、ナトリウム塩が最も好ましい。
水溶性塩が洗浄液中に含まれる場合、その濃度は１０ｍｍｏｌ／Ｌ以上であることが好ましく、その上限は不純物の溶解性を損なわない範囲であれば特に問わないが、１ｍｏｌ／Ｌ以下であることが好ましく、０．１ｍｏｌ／Ｌ以下であることがより好ましい。よりさらに好ましくは、水溶性塩が塩化ナトリウムであり、とりわけ、塩化ナトリウムが２０ｍｍｏｌ／Ｌ以上含まれていることが好ましい。
このように水溶性塩濃度を調整することにより、ＤＮａｓｅを用いなくとも、ＲＮＡは膜に保持したまま、ゲノムＤＮＡを効率よく洗浄し、ゲノムＤＮＡの回収サンプルへの混入を減少させ、ＲＮＡを効率よく高純度で分離精製することが出来る。

洗浄液は、カオトロピック物質を含んでいないことが好ましい。これによって、（３）の回収工程においてカオトロピック物質が混入する可能性を減らすことができる。回収工程時に、カオトロピック物質が混入すると、しばしばＲＴ−ＰＣＲ反応等を行う場合の酵素反応を阻害するので、後に酵素反応等を行う場合を考慮すると洗浄液にカオトロピック物質を含まないことが理想的である。また、カオトロピック物質は、腐食性があり有害であるので、この点でもカオトロピック物質を用いないで済むことは、実験者にとっても試験操作の安全上極めて有利である。
ここで、カオトロピック物質とは、前記した尿素、塩酸グアニジン、イソチオシアン酸グアニジン、チオシアン酸グアニジン、イソチオシアン酸ナトリウム、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウムなどである。

従来、核酸分離精製工程における洗浄工程の際、洗浄液がカートリッジなどの容器に対する濡れ性が高いため、しばしば洗浄液が容器中に残留することになり、回収工程の際に洗浄液が混入して核酸の純度の低下や次工程における反応性の低下などの原因となっている。したがって、カートリッジなどの容器を用いて核酸の吸着及び脱着を行う場合、吸着、洗浄時に用いる液、特に洗浄液が、次工程以降に影響を及ぼさないように、カートリッジ内に洗浄残液が残留しないことは重要である。

したがって、洗浄工程における洗浄液が回収工程の回収液に混入することを防止して、洗浄液のカートリッジ内への残留を最小限に留めるため、洗浄液の表面張力を０．０３５Ｊ／ｍ²未満にすることが好ましい。表面張力が低いと、洗浄液とカートリッジの濡れ性が向上し、残留する液量を抑えることができる。

しかし、洗浄効率を上げる為に、水の割合を増やすことができるが、この場合、洗浄液の表面張力は上昇し、残留する液量が増える。洗浄液の表面張力が０．０３５Ｊ／ｍ²以上の場合は、カートリッジの撥水性を高めることで、残留する液量を抑えることができる。カートリッジの撥水性を高めることで、液滴を形成させ、その液滴が流れ落ちることによって残留する液量を抑制できる。撥水性を高める方法としては、カートリッジ表面にシリコン等の撥水剤をコートするか、カートリッジ成型時にシリコン等の撥水剤を練り込む等の手段があるが、これに限らない。

本発明に係る核酸吸着性多孔性膜を利用して洗浄工程を簡素化することができる。（ａ）洗浄液が核酸吸着性多孔性膜を通過する回数を１回としてもよい、（ｂ）洗浄工程を室温でできる。（ｃ）洗浄工程の後、直ちに次工程を行うことができる。（ｄ）前記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）のいずれか１つもしくは２つ以上組み合わせることも可能である。従来法においては、洗浄液中に含まれる有機溶媒を迅速に取り除くためには、しばしば乾燥工程を必要としたが、本発明に用いる核酸吸着性多孔性膜は薄膜であるために乾燥工程を省略できる。

従来、ＲＮＡの分離精製方法において、洗浄工程の際、しばしば洗浄液が飛散し他に付着することによって、試料のコンタミネーション（汚染）が起きることが問題となっている。洗浄工程におけるこの種のコンタミネーションは、二個の開口を有する容器内に核酸吸着性多性孔膜を収容した核酸分離精製カートリッジと廃液容器の形状とを工夫することによって抑止することができる。

洗浄工程の途中でＤＮａｓｅを作用させることも可能である。ＤＮａｓｅを用いる場合のＤＮＡとＲＮＡを含む核酸混合物溶液からＲＮＡのみを選択的に分離精製する方法としては、核酸吸着性多孔性膜を収容した核酸分離精製カートリッジに通過させ、核酸吸着性多孔性膜に核酸を吸着させた（吸着工程）後、洗浄を行い（洗浄工程１）、ＤＮａｓｅを作用させる工程を経ることにより行うことが出来る。さらにＤＮａｓｅやその他タンパク質・塩類などの夾雑物を除去するため、ＤＮａｓｅ作用後に洗浄することができる（洗浄工程２）。
ＤＮａｓｅは特に限定無く、いずれのＤＮａｓｅも用いることが出来る。例えば、ウシなどの動物膵臓由来のＤＮａｓｅＩや、遺伝子組み換え技術により作成したリコンビナントＤＮａｓｅを用いることができる。
ＤＮａｓｅを作用させる際のＤＮａｓｅ溶液（以下、ＤＮａｓｅ反応液とも言う。）には、ＤＮａｓｅ活性の発現に好適なマグネシウム、カルシウム、マンガンなどの２価の金属イオンを添加してもよい。
ＤＮａｓｅ活性至適ｐＨに合わせるため、ＤＮａｓｅ反応液には緩衝剤も含まれる。緩衝剤としては、一般的に用いられる、ＴｒｉｓＨＣｌ、ＨＥＰＥＳ、リン酸バッファーなどを用いることができる。
本発明の方法において、核酸分離精製カートリッジの核酸吸着性多孔性膜でＤＮａｓｅを作用させる工程を設ける場合のＤＮａｓｅ溶液の全液量は、核酸吸着性多孔性膜１ｃｍ²当たり５〜５５０μlで行うことが好ましい。１０〜３５０μlがより好ましい。また、核酸分離精製カートリッジの核酸吸着性多孔性膜でＤＮａｓｅを作用させる工程においてＤＮａｓｅ溶液におけるＤＮａｓｅ濃度（以下、単にＤＮａｓｅ濃度とも言う。）は１０Ｋｕｎｉｔｚ Ｕ／ｍＬ以上１００００Ｋｕｎｉｔｚ Ｕ／ｍＬ以下が好ましく、５０Ｋｕｎｉｔｚ Ｕ／ｍＬ以上５０００Ｋｕｎｉｔｚ Ｕ／ｍＬ以下がより好ましい。なお、ここで用いた活性Ｋｕｎｉｔｚ Ｕは、「ＤＮＡを基質として、２５℃、ｐＨ５．０において反応液１ｍｌのＡ₂₆₀の吸光度を1分間に０．００１増加させるＤＮａｓｅ活性を１Ｋｕｎｉｔｚ Ｕとする」と定義したものである。また、核酸分離精製カートリッジの核酸吸着性多孔性膜でＤＮａｓｅを作用させる工程における時間は、ＤＮＡとＲＮＡを含む核酸混合物溶液中のＤＮＡ量と作用させるＤＮａｓｅ濃度により異なるが５秒〜３６０分が好ましく、３０秒〜１８０分がより好ましい。また、核酸分離精製カートリッジの核酸吸着性多孔性膜でＤＮａｓｅを作用させる工程における温度は４℃以上であればよく、１０〜５０℃が好ましく、反応効率を高めるため高温、例えば５０〜７０℃で行うこともできる。尚、「核酸吸着性多孔性膜でＤＮａｓｅを作用させる」とは、核酸吸着性多孔性膜における、核酸が吸着している部位とＤＮａｓｅを作用させることを意味し、「核酸吸着性多孔性膜で」とは、酸吸着性多孔性膜上に限らず、多孔性膜における孔中や、膜の裏側の孔の出口等も含む。

さらに、ＤＮａｓｅ反応溶液には、核酸吸着性多孔性膜に核酸を保持させるため、周期表第２属元素に属する金属の塩、ナトリウム塩、リチウム塩、カリウム塩などを添加することが出来る。周期表第２属元素に属する金属の塩としてはマグネシウム塩を使用することが好ましく、マグネシウム塩としては塩化マグネシウム、硫酸マグネシウムがより好ま
しい。マグネシウム塩を使用する際は、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウムのどちらか１種を用いてもよく、また２種を用いることも出来る。塩化マグネシウム、硫酸マグネシウムを使用することはＤＮａｓｅ活性の発現と核酸の核酸吸着性多孔性膜への保持の両者の機能を満たすために好ましい。使用する際の濃度としては１０〜５００ｍｍｏｌ／Ｌが好ましく、より好ましくは１０〜２００ｍｍｏｌ／Ｌである。

（３）回収液を核酸吸着性多孔性膜に通過させて、該多孔性膜からＲＮＡを脱着させる工程（回収工程）
以下に（３）回収液を核酸吸着性多孔性膜に通過させて、該多孔性膜からＲＮＡを脱着させる工程について説明する。
回収液は、チューブ、ピペット、又は自動注入装置、もしくはこれらと同じ機能をもつ供給手段を使用して、核酸吸着性多孔性膜を収容した核酸分離精製カートリッジへ供給される。回収液は、核酸分離精製カートリッジの一の開口（核酸混合物溶液を注入した開口）から供給され、該開口に結合された圧力差発生装置（例えばスポイド、注射器、ポンプ、パワーピペットなど）を用いて核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にして核酸吸着性多孔性膜を通過させ、一の開口と異なる開口より排出させることができる。また、回収液を一の開口から供給し、同じ一の開口より排出させることもできる。さらには、核酸分離精製カートリッジの核酸混合物溶液を供給した一の開口と異なる開口より回収液を供給し、排出させることも可能である。中でも、核酸分離精製カートリッジの一の開口から供給し、核酸吸着性多孔性膜を通過させ、一の開口と異なる開口より排出させる方法が、回収効率が優れてより好ましい。

検体から調整した核酸混合物溶液の体積に対して、回収液の体積を調整してＲＮＡの脱着を行うことができる。分離精製されたＲＮＡを含む回収液量、すなわちカートリッジ容器外に排出し回収されるＲＮＡ溶液の量は、そのとき使用する検体量による。一般的によく使われる回収液量は数１０から数１００μｌであるが、検体量が極微量である時や、逆に大量のＲＮＡを分離精製したい場合には回収液量は１μｌから数１０ｍｌの範囲で変える事ができる。

回収液としては好ましくは精製蒸留水、Ｔｒｉｓバッファー、Ｔｒｉｓ／ＥＤＴＡバッファー等が使用できる。また、工程後に回収したＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ポリメラーゼ連鎖反応）に供する場合、ＲＴ−ＰＣＲ反応において用いる緩衝溶液（例えば、ＫＣｌ ７５ｍｍｏｌ／Ｌ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ５０ｍｍｏｌ／Ｌ、ＭｇＣｌ₂ ３．０ｍｍｏｌ／Ｌ、ＤＴＴ １０ｍｍｏｌ／Ｌを最終濃度とする水溶液）を用いることもできる。

回収液のｐＨは、ｐＨ１〜１０であることが好ましい。さらには、ＲＮＡの安定性を考慮すると中性〜酸性であることが好ましく、ｐＨ２〜７であることが好ましい。また特にイオン強度と塩濃度は吸着ＲＮＡの溶出に効果を及ぼす。回収液は、５００ｍｍｏｌ／Ｌ以下のイオン強度であることが好ましい。塩濃度は、０．５ｍｏｌ／Ｌ以下であることが好ましく、さらには、０．０１ｍｍｏｌ／Ｌ以上５０ｍｍｏｌ／Ｌ以下であることが好ましい。こうすることで、ＲＮＡの回収率が向上し、より多くのＲＮＡを回収することができる。

回収液の体積を当初の核酸混合物溶液の体積と比較して少なくすることによって、濃縮されたＲＮＡを含む回収溶液（ＲＮＡ溶液）を得ることができる。好ましくは、(回収液体積)：(核酸混合物溶液体積)＝１：１００〜９９：１００、更に好ましくは、(回収液体積)：(核酸混合物溶液体積)＝１：１０〜９：１０にすることができる。これにより核酸分離精製後工程において濃縮のための操作をすることなく、簡単にＲＮＡを濃縮できる。これらの方法により検体よりもＲＮＡが濃縮されているＲＮＡ溶液を得る方法を提供できる。

また別の態様としては、回収液の体積を当初の核酸混合物溶液よりも多い条件でＲＮＡの脱着を行うことにより、希望の濃度のＲＮＡ溶液を得ることができ、次工程、例えばＲＴ−ＰＣＲなどを行う場合に適した濃度のＲＮＡ溶液を得ることができる。好ましくは、(回収液体積)：(核酸混合物溶液体積)＝１：１〜５０：１、更に好ましくは、(回収液体積)：(核酸混合物溶液体積)＝１：１〜５：１にすることができる。これにより核酸分離精製後に濃度調整をする煩雑さがなくなるというメリットを得られる。更に、十分量の回収液を使用することにより、多孔性膜からのＲＮＡ回収率の増加を図ることができる。

また、目的に応じて回収液の温度を変化させることで簡便にＲＮＡを回収することができる。例えば、回収液の温度を０〜１０℃にして多孔性膜からのＲＮＡの脱着を行うことで、酵素による分解を防止する何らかの試薬や特別な操作を加えることなくＲＮＡ分解酵素の働きを抑制して、ＲＮＡの分解を防ぎ、簡便に、効率よくＲＮＡ溶液を得ることができる。

また、回収液の温度を１０〜３５℃とした場合、一般的な室温でＲＮＡの回収を実施することが出来、複雑な工程を必要とせずにＲＮＡを脱着させて分離精製することができる。

また別の態様としては、回収液の温度を高温、例えば３５〜７０℃することで、多孔性膜からのＲＮＡの脱着を煩雑な操作を経ず簡便に高い回収率で実施することができる。

回収液の注入回数は限定されるものではなく、１回でも複数回でもよい。通常、迅速、簡便にＲＮＡを分離精製する場合は、１回の回収で実施するが、大量のＲＮＡを回収する場合等複数回にわたり回収液を注入してもよい。

回収工程においては、ＲＮＡ溶液をその後の工程に使用できる組成にしておくことが可能である。分離精製されたＲＮＡは、しばしばＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ポリメラーゼチェインリアクション）法が適用される。この場合、分離精製されたＲＮＡ溶液はＲＴ−ＰＣＲ法に適したバッファー液で希釈する必要がある。本方法による回収工程において、回収液にＲＴ−ＰＣＲ法に適したバッファー液を用いることで、その後のＲＴ−ＰＣＲ工程へ簡便、迅速に移行することができる。

また、回収工程において、回収液に、カートリッジから排出して回収後のＲＮＡの分解を防ぐための安定化剤を添加しておくことも可能である。安定化剤としては、抗菌剤、抗カビ剤や核酸分解抑制剤などを添加することができる。核酸分解抑制剤としては、核酸分解酵素の阻害剤が挙げられ、具体的にはＥＤＴＡなどが挙げられる。また別の実施態様として、回収容器にあらかじめ安定化剤を添加しておくこともできる。

回収工程で用いられる回収容器には特に限定はないが、２６０ｎｍの吸収が無い素材で作製された回収容器を用いることができる。この場合、回収したＲＮＡ溶液の濃度を、他の容器に移し替えずに測定できる。２６０ｎｍに吸収のない素材は、例えば石英ガラス等が挙げられるがこれに限定されるものではない。

＜キット＞
以上述べた本発明のＲＮＡ分離精製方法を行うためのカートリッジ、試薬等をキットとすることが出来る。具体的には、該キットには、（ｉ）核酸吸着性多孔性膜を収容した核酸分離精製カートリッジ、並びに（ii）溶血剤、（iii）核酸可溶化試薬、（iv）洗浄液および（v）回収液の試薬が含まれる。

＜自動装置＞
上記の、少なくとも二個の開口を有する容器内に核酸吸着性多孔性膜を収容した核酸分離精製カートリッジと圧力差発生装置を用いて、核酸を含む検体からＲＮＡを分離精製する方法はその含まれる工程を自動で行う自動装置を用いて行うことができる。また、前記のキットの使用を自動で行う自動装置を用いて行うことができる。自動装置により、操作が簡便化および迅速化するだけでなく、作業者の技能によらず一定の水準の、ＲＮＡを得ることが可能になる。

以下に、少なくとも二個の開口を有する容器内に核酸吸着性多孔性膜を収容した核酸分離精製カートリッジと圧力差発生装置を用いて、核酸を含む検体からＲＮＡを分離精製する各工程を自動で行う自動装置の例を示すが、本発明の自動装置はこれに限定されるものではない。

自動装置は、溶液が内部を通過可能な、核酸吸着性多孔性膜を収容した核酸分離精製カートリッジを用い、該核酸分離精製カートリッジにＤＮＡとＲＮＡを含む核酸混合物溶液を注入し加圧して該核酸混合物溶液中の核酸を前記核酸吸着性多孔性膜に吸着させた後、前記核酸分離精製カートリッジに洗浄液を分注し加圧して不純物を除去した後、前記核酸分離精製カートリッジに回収液を分注し核酸吸着性多孔性膜に吸着したＲＮＡを脱着して回収液とともに回収する、分離精製動作を自動的に行う核酸分離生成装置であって、前記核酸分離精製カートリッジ、前記試料液および洗浄液の排出液を収容する廃液容器および前記ＲＮＡを含む回収液（ＲＮＡ溶液）を収容する回収容器を保持する搭載機構と、前記核酸分離精製カートリッジに加圧エアを導入する加圧エア供給機構と、前記核酸分離精製カートリッジに洗浄液および回収液を分注する分注機構とを備えてなることを特徴とするものである。

さらに洗浄工程の途中で前記核酸分離精製カートリッジにＤＮａｓｅを分注して核酸吸着性多孔性膜でＤＮａｓｅを作用させ、加圧してＤＮａｓｅが核酸吸着性多孔性膜内部を通過した後、前記核酸分離精製カートリッジに洗浄液を分注し、加圧して分解されたＤＮＡを除去した後、前記核酸分離精製カートリッジに、回収液を分注し核酸吸着性多孔性膜に吸着したＲＮＡを脱着して回収液とともに回収する、分離精製動作を自動的に行うＲＮＡの選択的分離精製装置であって、前記核酸分離精製カートリッジ、前記核酸混合物溶液残渣、ＤＮａｓｅおよび洗浄液の排出液を収容する廃液容器および前記ＲＮＡを含む回収液を収容する回収容器を保持する搭載機構と、前記核酸分離精製カートリッジに加圧エアを導入する加圧エア供給機構と、前記核酸分離精製カートリッジに洗浄液、ＤＮａｓｅおよび回収液を分注する分注機構とを備えてなることが好適である。

前記搭載機構は、装置本体に搭載されるスタンドと、該スタンドに上下移動可能に支持され前記核酸分離精製カートリッジを保持するカートリッジホルダーと、該カートリッジホルダーの下方で前記核酸分離精製カートリッジに対する位置を交換可能に前記廃液容器および前記回収容器を保持する容器ホルダーとを備えてなるものが好適である。

また、前記加圧エア供給機構は、下端部より加圧エアを噴出するエアノズルと、該エアノズルを支持して前記カートリッジホルダーに保持された前記核酸分離精製カートリッジに対し前記エアノズルを昇降移動させる加圧ヘッドと、該加圧ヘッドに設置され前記搭載機構のラックにおける核酸分離精製カートリッジの位置決めをする位置決め手段とを備えてなるものが好適である。

また、前記分注機構は、前記洗浄液を分注する洗浄液分注ノズルと、前記回収液を分注する回収液分注ノズルと、必要に応じて前記ＤＮａｓｅ分注ノズルを保持し前記搭載機構に保持された核酸分離精製カートリッジ上を順に移動可能なノズル移動台と、洗浄液を収
容した洗浄液ボトルより洗浄液を吸引し前記洗浄液分注ノズルに供給する洗浄液供給ポンプと、回収液を収容した回収液ボトルより回収液を吸引し前記回収液分注ノズルに供給する回収液供給ポンプと、必要に応じてＤＮａｓｅを収容したＤＮａｓｅボトルよりＤＮａｓｅを吸引し前記ＤＮａｓｅ分注ノズルに供給するＤＮａｓｅ供給ポンプと、を備えてなるものが好適である。

核酸分離精製カートリッジ、廃液容器および回収容器を保持する搭載機構と、核酸分離精製カートリッジに加圧エアを導入する加圧エア供給機構と、核酸分離精製カートリッジに洗浄液、回収液および必要に応じてＤＮａｓｅを分注する分注機構とを備えた、例えば前記のような自動装置によれば、核酸吸着性多孔性膜を収容した核酸分離精製カートリッジに核酸を含む試料液を注入加圧し核酸を核酸吸着性多孔性膜に吸着させ、洗浄液を分注して不純物を洗浄排出し、回収液を分注して核酸吸着性多孔性膜に吸着したＲＮＡを脱着して回収するＲＮＡ分離精製工程を自動的に行って、短時間で効率よく核酸混合物溶液中のＲＮＡを自動的に分離精製できる機構をコンパクトに構成することができる。

また、前記搭載機構を、スタンドと、核酸分離精製カートリッジを保持する上下移動可能なカートリッジホルダーと、廃液容器および回収容器を交換可能に保持する容器ホルダーとを備えて構成すると、核酸分離精製カートリッジおよび両容器のセット並びに廃液容器と回収容器の交換が簡易に行える。

また、前記加圧エア供給機構を、エアノズルと、該エアノズルを昇降移動させる加圧ヘッドと、核酸分離精製カートリッジの位置決めをする位置決め手段とを備えて構成すると、簡易な機構で確実な加圧エアの供給が行える。

また、前記分注機構を、洗浄液分注ノズルと、回収液分注ノズルと、核酸分離精製カートリッジ上を順に移動可能なノズル移動台と、洗浄液ボトルより洗浄液を吸引し洗浄液分注ノズルに供給する洗浄液供給ポンプと、回収液ボトルより回収液を吸引し回収液分注ノズルに供給する回収液供給ポンプとを備えて構成すると、簡易な機構で順次洗浄液および回収液の分注が行える。

以下、本発明を実施例により更に具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

［実施例１］
（１）核酸分離精製カートリッジの作製
内径７ｍｍ、核酸吸着性多孔性膜を収容する部分を持ち、かつ、液を８００μｌ保持できる核酸分離精製カートリッジを作製した。

（２）核酸吸着性多孔性膜として、トリアセチルセルロースの多孔性膜を鹸化処理した多孔性膜を使用し、上記（１）で作成した核酸分離精製カートリッジの核酸吸着性多孔性膜収納部に収容した。

（３）溶血剤、核酸可溶化試薬、洗浄液および回収液の調製
下記に示す処方の溶血剤Ａ、核酸可溶化試薬溶液Ａ１、Ａ２、洗浄液Ａおよび回収液Ａを調製した。

（溶血剤Ａ）
塩化アンモニウム １５０ｍｍｏｌ／Ｌ
炭酸水素ナトリウム １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０） ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ

（核酸可溶化試薬Ａ１）
グアニジンチオシアン酸塩（和光純薬社製） ３．５ｍｏｌ／Ｌ
ＢｉｓＴｒｉｓ（同仁化学社製） ０．２５ｍｏｌ／Ｌ
塩酸を用いて、ｐＨ６．５に調製
１．０容量％の２−メルカプトエタノールを核酸可溶化試薬Ａ１使用直前に添加。

（核酸可溶化試薬Ａ２）
Ｔｗｅｅｎ２０（和光純薬社製） １５質量％
ＢｉｓＴｒｉｓ（同仁化学社製） ０．１ｍｏｌ／Ｌ
塩酸を用いて、ｐＨ６．０に調製

（洗浄液Ａ）
Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ（ｐＨ７．５） １０ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化ナトリウム １００ｍｍｏｌ／Ｌ
エタノール ３０容量％

（回収液Ａ）
Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ（ｐＨ６．５） １ｍｍｏｌ／Ｌ

（４）核酸混合物溶液調製
抗凝固剤としてＥＤＴＡ−２Ｎａを使用したヒト全血（白血球数総数が３×１０⁶個、１×１０⁷個、１．５×１０⁷個、３×１０⁷個、４×１０⁷個）を５０ｍｌコニカルチューブに移し、各々全血の５倍容量の溶血剤Ａを添加し、氷上にて１５分インキュベートした。インキュベーション中に２回ボルテックスした。血液懸濁液が透明になったことを確認し、４℃で１０分間、４００×ｇで遠心分離後、上清を完全に除去した。上清を除去した後の容器内に元の全血の２倍容量の溶血剤Ａを添加し、軽く５秒間ボルテックスして細胞を懸濁し、４℃で１０分間、４００×ｇで遠心分離後、上清を完全に除去した。上記で得られた白血球ペレットに、核酸可溶化試薬Ａ１を３５０μｌ添加し、１．５ｍｌマイクロチューブにサンプルを移した。ボルテックスにて１分間撹拌することで白血球を溶解した。ここに核酸可溶化試薬Ａ２を１７５μｌ加え、ボルテックスで１５秒間攪拌した。さらに、９９．５容量％以上特級エタノールを１７５μｌ加え、ボルテックスで１分間攪拌した。

（５）ＲＮＡ分離精製操作
上記（１）及び（２）で作製した核酸吸着性多孔性膜を有する核酸分離精製カートリッジの一の開口に注入し、続いて上記一の開口に圧力差発生装置を結合し、核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態（１６０ｋＰａ）にし、注入した核酸を含む試料溶液を、核酸吸着性多孔性膜に通過させることで、核酸吸着性多孔性膜に接触させ、核酸分離精製カートリッジの他の開口より排出した。続いて、上記核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に、洗浄液Ａを７５０μｌ注入し、上記一の開口に圧力差発生装置を結合し、核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態（１６０ｋＰａ）にし、注入した洗浄液を核酸吸着性多孔性膜に通過させ、他の開口より排出した。同様の操作を３回繰り返す。続いて、上記核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に回収液Ａを５０μｌ注入し、核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に圧力差発生装置を結合して核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態（１６０ｋＰａ）にし、注入した回収液を、核酸吸着性多孔性膜に通過させ、他の開口より排出し、この液を回収した。ＲＮＡ分離精製操作に要した時間は、白血球数いずれの場合も１サンプルあたり５分以内であった。

（６）回収された核酸の収量と純度
実施例１で回収されたＲＮＡの収量と純度（２６０／２８０）を表１に示す。

以上より、簡便に高純度なＲＮＡを白血球から回収することができた。

［実施例２］
（７）核酸分離精製カートリッジの作製
内径７ｍｍ、核酸吸着性多孔性膜を収容する部分を持ち、かつ、液を７ｍｌ保持できる核酸分離精製カートリッジを作製した。

（８）核酸吸着性多孔性膜として、トリアセチルセルロースの多孔性膜を鹸化処理した多孔性膜を使用し、上記（７）で作成した核酸分離精製カートリッジの核酸吸着性多孔性膜収納部に収容した。

（９）溶血剤、核酸可溶化試薬、洗浄液および回収液の調製
実施例１同様に、溶血剤Ａ、核酸可溶化試薬溶液Ａ１、Ａ２、洗浄液Ａおよび回収液Ａを調製した。

（１０）核酸混合物溶液調製
抗凝固剤としてＥＤＴＡ−２Ｎａを使用したヒト全血（白血球数総数が１．５×１０⁷個、３×１０⁷個、６×１０⁷個、８×１０⁷個）を５０ｍｌコニカルチューブに移し、各々全血の５倍容量の溶血剤Ａを添加し、氷上にて１５分インキュベートした。インキュベーション中に２回ボルテックスした。血液懸濁液が透明になったことを確認し、４℃で１０分間、４００×ｇで遠心分離後、上清を完全に除去した。上清を除去した後の容器内に元の全血の２倍容量の溶血剤Ａを添加し、軽く５秒間ボルテックスして細胞を懸濁し、４℃で１０分間、４００×ｇで遠心分離後、上清を完全に除去した。上記で得られた白血球ペレットに、核酸可溶化試薬Ａ１を２ｍｌ添加し、ボルテックスにて１分間撹拌することで白血球を溶解した。ここに核酸可溶化試薬Ａ２を１ｍｌ加え、ボルテックスで１５秒間攪拌した。さらに、９９．５容量％以上特級エタノールを１ｍｌ加え、ボルテックスで１分間攪拌した。

（１１）ＲＮＡ分離精製操作
上記（７）及び（８）で作製した核酸吸着性多孔性膜を有する核酸分離精製カートリッジの一の開口に注入し、続いて上記一の開口に圧力差発生装置を結合し、核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態（１６０ｋＰａ）にし、注入した核酸を含む試料溶液を、核酸吸着性多孔性膜に通過させることで、核酸吸着性多孔性膜に接触させ、核酸分離精製カートリッジの他の開口より排出した。続いて、上記核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に、洗浄液Ａを４．５ｍｌ注入し、上記一の開口に圧力差発生装置を結合し、核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態（１６０ｋＰａ）にし、注入した洗浄液を核酸吸着性多孔性膜に通過させ、他の開口より排出した。同様の操作を３回繰り返す。続いて、上記核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に回収液Ａを５００μｌ注入し、核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に圧力差発生装置を結合して核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態（１６０ｋＰａ）にし、注入した回収液を、核酸吸着性多孔性膜に通過させ、他の開口より排出し、この液を回収した。ＲＮＡ分離精製操作に要した時間は、白血球数いずれの場合も1サンプルあたり８分以内であった。

（１２）回収された核酸の収量と純度
実施例２で回収されたＲＮＡの収量と純度（２６０／２８０）を表２に示す。

以上より、簡便に高純度なＲＮＡを白血球から回収することができた。

［実施例３］
（１３）核酸分離精製カートリッジの作製
内径２０ｍｍ、核酸吸着性多孔性膜を収容する部分を持ち、かつ、液を１０ｍｌ保持できる核酸分離精製カートリッジを作製した。

（１４）核酸吸着性多孔性膜として、トリアセチルセルロースの多孔性膜を鹸化処理した多孔性膜を使用し、上記（１３）で作成した核酸分離精製カートリッジの核酸吸着性多孔性膜収納部に収容した。

（１５）溶血剤、核酸可溶化試薬、洗浄液および回収液の調製
実施例１同様に、溶血剤Ａ、核酸可溶化試薬溶液Ａ１、Ａ２、洗浄液Ａおよび回収液Ａを調製した。

（１６）核酸混合物溶液調製
抗凝固剤としてＥＤＴＡ−２Ｎａを使用したヒト全血（白血球数総数が１×１０⁷個、３×１０⁷個、６×１０⁷個）を５０ｍｌコニカルチューブに移し、各々全血の５倍容量の溶血剤Ａを添加し、氷上にて１５分インキュベートした。インキュベーション中に２回ボルテックスした。血液懸濁液が透明になったことを確認し、４℃で１０分間、４００×ｇで遠心分離後、上清を完全に除去した。上清を除去した後の容器内に元の全血の２倍容量の溶血剤Ａを添加し、軽く５秒間ボルテックスして細胞を懸濁し、４℃で１０分間、４００×ｇで遠心分離後、上清を完全に除去した。上記で得られた白血球ペレットに、核酸可溶化試薬Ａ１を２ｍｌ添加し、ボルテックスにて１分間撹拌することで白血球を溶解した。ここに核酸可溶化試薬Ａ２を１ｍｌ加え、ボルテックスで１５秒間攪拌した。さらに、９９．５容量％以上特級エタノールを１ｍｌ加え、ボルテックスで１分間攪拌した。

（１７）ＲＮＡ分離精製操作
上記（１３）及び（１４）で作製した核酸吸着性多孔性膜を有する核酸分離精製カートリッジの一の開口に注入し、続いて上記一の開口に圧力差発生装置を結合し、核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態（１６０ｋＰａ）にし、注入した核酸を含む試料溶液を、核酸吸着性多孔性膜に通過させることで、核酸吸着性多孔性膜に接触させ、核酸分離精製カートリッジの他の開口より排出した。続いて、上記核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に、洗浄液Ａを４．５ｍｌ注入し、上記一の開口に圧力差発生装置を結合し、核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態（１６０ｋＰａ）にし、注入した洗浄液を核酸吸着性多孔性膜に通過させ、他の開口より排出した。同様の操作を3回繰り返す。続いて、上記核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に回収液Ａを５００μｌ注入し、核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に圧力差発生装置を結合して核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態（１６０ｋＰａ）にし、注入した回収液を、核酸吸着性多孔性膜に通過させ、他の開口より排出し、この液を回収した。ＲＮＡ分離精製操作に要した時間は、白血球数いずれの場合も1サンプルあたり1分半以内であった。

（１８）回収された核酸の収量と純度
実施例３で回収されたＲＮＡの収量と純度（２６０／２８０）を表３に示す。

以上より、簡便に高純度なＲＮＡを白血球から回収することができた。

［実施例４］
（１９）核酸分離精製カートリッジの作製
内径７ｍｍ、核酸吸着性多孔性膜を収容する部分を持ち、かつ、液を８００μｌ保持できる核酸分離精製カートリッジを作製した。

（２０）核酸吸着性多孔性膜として、トリアセチルセルロースの多孔性膜を鹸化処理した多孔性膜を使用し、上記（１９）で作成した核酸分離精製カートリッジの核酸吸着性多孔性膜収納部に収容した。

（２１）溶血剤、核酸可溶化試薬、洗浄液および回収液の調製
ＱＩＡＧＥＮ社製、ＱＩＡａｍｐ ＲＮＡ Ｂｌｏｏｄ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ添付の溶液類を使用した。

（溶血剤） Ｂｕｆｆｅｒ ＥＬ：塩化アンモニウム含有
（核酸可溶化試薬）ＲＬＴ：グアニジンチオシアン酸含有
（洗浄液−１） ＲＷ１
（洗浄液−２） ＲＰＥ（８０容量％ＥｔＯＨを含む）
（回収液） ＲＮａｓｅフリー水

（２２）核酸混合物溶液調製
抗凝固剤としてＥＤＴＡ−２Ｎａを使用したヒト全血（白血球数総数が１×１０⁷個）を５０ｍｌコニカルチューブに移し、全血の５倍容量のＢｕｆｆｅｒＥＬを添加し、氷上にて１５分インキュベートした。インキュベーション中に２回ボルテックスした。血液懸濁液が透明になったことを確認し、４℃で１０分間、４００×ｇで遠心分離後、上清を完全に除去した。上清を除去した後の容器内に元の全血の２倍容量の溶血剤Ａを添加し、軽く５秒間ボルテックスして細胞を懸濁し、４℃で１０分間、４００×ｇで遠心分離後、上清を完全に除去した。上記で得られた白血球ペレットを１．５ｍｌマイクロチューブに移し、ＲＬＴを３５０μｌ添加し、ボルテックスにて１分間撹拌することで白血球を溶解した。ここに７０容量％以上特級エタノールを３５０μｌ加え、ボルテックスで１分間攪拌した。

（２３）ＲＮＡ分離精製操作
上記（１９）及び（２０）で作成した核酸吸着性多孔性膜を有する核酸分離精製カートリッジの一の開口に注入し、続いて上記一の開口に圧力差発生装置を結合し、核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態（１６０ｋＰａ）にし、注入した核酸を含む試料溶液を、核酸吸着性多孔性膜に通過させることで、核酸吸着性多孔性膜に接触させ、核酸分離精製カートリッジの他の開口より排出した。続いて、上記核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に、洗浄液−１を７５０μl注入し、上記一の開口に圧力差発生装置を結合し、核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態（１６０ｋＰａ）にし、注入した洗浄液を核酸吸着性多孔性膜に通過させ、他の開口より排出した。続いて、上記核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に、洗浄液−２を５００μl注入し、上記一の開口に圧力差発生装置を結合し、核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態（１６０ｋＰａ）にし、注入した洗浄液を核酸吸着性多孔性膜に通過させ、他の開口より排出した。同様の操作を２回繰り返す。続いて、上記核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に回収液を５０μｌ注入し、核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に圧力差発生装置を結合して核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態（１６０ｋＰａ）にし、注入した回収液を、核酸吸着性多孔性膜に通過させ、他の開口より排出し、この液を回収した。ＲＮＡ分離精製操作に要した時間は、１分以内であり、実施例１よりもさらに操作時間が短かった。

（２４）回収された核酸の収量と純度
実施例４で回収されたＲＮＡの収量と純度（２６０／２８０）を表４に示す。

以上より、ＱＩＡＧＥＮ社製、ＱＩＡａｍｐ ＲＮＡ Ｂｌｏｏｄ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ添付の溶液類を用いても、簡便に高純度なＲＮＡを白血球から回収することができた。

［実施例５］
（２５）カートリッジ、溶血剤、核酸可溶化試薬、洗浄液および回収液の調製
実施例１同様に、カートリッジを作製し、溶血剤Ａ、核酸可溶化試薬溶液Ａ１、Ａ２、洗浄液Ａおよび回収液Ａを調製した。

（２６）核酸混合物溶液調製
抗凝固剤としてＥＤＴＡ−２Ｎａを使用したヒト全血（白血球数総数が５×１０⁶個、１×１０⁷個）を５０ｍｌコニカルチューブに移し、各々全血の５倍容量の溶血剤Ａを添加し、氷上にて１５分インキュベートした。インキュベーション中に２回ボルテックスした。血液懸濁液が透明になったことを確認し、４℃で１０分間、４００×ｇで遠心分離後、上清を完全に除去した。上清を除去した後の容器内に元の全血の２倍容量の溶血剤Ａを添加し、軽く５秒間ボルテックスして細胞を懸濁し、４℃で１０分間、４００×ｇで遠心分離後、上清を完全に除去した。上記で得られた白血球ペレットに、核酸可溶化試薬Ａ１を３５０μｌ添加し、ボルテックスにて１分間撹拌することで白血球を溶解した。ここに核酸可溶化試薬Ａ２を１７５μｌ加え、ボルテックスで１５秒間攪拌した。さらに、９９．５容量％以上特級エタノールを１７５μｌ加え、ボルテックスで１分間攪拌した。

（２７）ＲＮＡ分離精製操作
上記（２５）で作製した核酸吸着性多孔性膜を有する核酸分離精製カートリッジの一の開口に注入し、続いて上記一の開口に圧力差発生装置を結合し、核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態（１６０ｋＰａ）にし、注入した核酸を含む試料溶液を、核酸吸着性多孔性膜に通過させることで、核酸吸着性多孔性膜に接触させ、核酸分離精製カートリッジの他の開口より排出した。続いて、上記核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に、洗浄液Ａを７５０μｌ注入し、上記一の開口に圧力差発生装置を結合し、核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態（１６０ｋＰａ）にし、注入した洗浄液を核酸吸着性多孔性膜に通過させ、他の開口より排出した。圧力差発生装置を外し、ＤＮａｓｅ溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ社製ＲＱ１ ＲＮａｓｅ−Ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅ ５００Ｋｕｎｉｔｚ Ｕ／Ｌを使用）を膜上に４０μｌ（１０４μｌ／ｃｍ²）アプライし、室温で５分放置した。続いて、先と同様の洗浄を２回行った。続いて、上記核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に回収液Ａを５０μｌ注入し、核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に圧力差発生装置を結合して核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態（１６０ｋＰａ）にし、注入した回収液を、核酸吸着性多孔性膜に通過させ、他の開口より排出し、この液を回収した。ＲＮＡ分離精製操作に要した時間は、白血球数いずれの場合も、ＤＮａｓｅ反応時間も含め、1サンプルあたり６分以内であった。

（２８）回収された核酸の収量と純度
実施例５で回収されたＲＮＡの収量と純度（２６０／２８０）を表５に示す。

（２９）回収された核酸の電気泳動
実施例５で回収されたＲＮＡの電気泳動像を図１に示す。ＤＮａｓｅ処理によりＤＮＡが完全に除去され、高純度なＲＮＡを得ることができた。

［実施例６］
（３０）カートリッジ、溶血剤、核酸可溶化試薬、洗浄液および回収液の調製
実施例１同様に、カートリッジを作製し、溶血剤Ａ、核酸可溶化試薬溶液Ａ１、洗浄液Ａおよび回収液Ａを調製した。

（３１）核酸混合物溶液調製
抗凝固剤としてＥＤＴＡ−２Ｎａを使用したヒト全血（白血球数総数が１．５×１０⁷個）を５０ｍｌコニカルチューブに移し、全血の５倍容量の溶血剤Ａを添加し、氷上にて１５分インキュベートした。インキュベーション中に２回ボルテックスした。血液懸濁液が透明になったことを確認し、４℃で１０分間、４００×ｇで遠心分離後、上清を完全に除去した。上清を除去した後の容器内に元の全血の２倍容量の溶血剤Ａを添加し、軽く５秒間ボルテックスして細胞を懸濁し、４℃で１０分間、４００×ｇで遠心分離後、上清を完全に除去した。上記で得られた白血球ペレットに、核酸可溶化試薬Ａ１を５２０μｌ添加し、ペレットをピペッティングにてほぐした後、ボルテックスにて１分間撹拌することで白血球を溶解した。ここに９９．５容量％以上特級エタノールを１７３μｌ加え、即ち、エタノール濃度２５体積％とし、ボルテックスで１分間攪拌した。また、９９．５容量％以上特級エタノールを１７３μｌ加える替わりに、２２３、２５０、２８０μｌ加える以外は同様にして試料溶液を調製した。即ち、エタノール濃度２５、３０、３２．５、３５体積％とした後、ボルテックスで１分間攪拌した。

（３２）ＲＮＡ分離精製操作
上記（３０）で作成した核酸吸着性多孔性膜を有する核酸分離精製カートリッジの一の開口に注入し、続いて上記一の開口に圧力差発生装置を結合し、核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態（１６０ｋＰａ）にし、注入した核酸を含む試料溶液を、核酸吸着性多孔性膜に通過させることで、核酸吸着性多孔性膜に接触させ、核酸分離精製カートリッジの他の開口より排出した。続いて、上記核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に、洗浄液Ａを７５０μｌ注入し、上記一の開口に圧力差発生装置を結合し、核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態（１６０ｋＰａ）にし、注入した洗浄液を核酸吸着性多孔性膜に通過させ、他の開口より排出した。同様の操作を３回繰り返す。続いて、上記核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に回収液Ａを５０μｌ注入し、核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に圧力差発生装置を結合して核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態（１６０ｋＰａ）にし、注入した回収液を、核酸吸着性多孔性膜に通過させ、他の開口より排出し、この液を回収した。回収を２回繰り返した。ＲＮＡ分離精製操作に要した時間は、白血球数いずれの場合も1サンプルあたり２分以内であった。

（３３）回収された核酸の収量と純度
回収されたＲＮＡの収量と純度（２６０／２８０）を表６に示す。

以上より、いずれの濃度においても簡便に高純度なＲＮＡを白血球から回収することができた。

［実施例７］
（３４）核酸分離精製カートリッジの作製
内径７ｍｍ、核酸吸着性多孔性膜を収容する部分を持ち、かつ、液を８００μｌ保持できる核酸分離精製カートリッジを作製した。

（３５）核酸吸着性多孔性膜として、トリアセチルセルロースの多孔性膜を鹸化処理した多孔性膜を使用し、上記（３４）で作成した核酸分離精製カートリッジの核酸吸着性多孔性膜収納部に３枚重ねて収容した。

（３６）溶血剤、核酸可溶化試薬Ａ１、洗浄液および回収液の調製
カートリッジを作製し、溶血剤Ａ、核酸可溶化試薬溶液Ａ１、洗浄液Ａおよび回収液Ａは実施例１同様に調製した。

（３７）核酸混合物溶液調製
抗凝固剤としてＥＤＴＡ−２Ｎａを使用したヒト全血（白血球数総数が１×１０⁷個）を５０ｍｌコニカルチューブに移し、全血の５倍容量の溶血剤Ａを添加し、氷上にて１５分インキュベートした。インキュベーション中に２回ボルテックスした。血液懸濁液が透明になったことを確認し、４℃で２分間、２０００×ｇで遠心分離後、上清を完全に除去した。上清を除去した後の容器内に元の全血の２倍容量の溶血剤Ａを添加し、軽く５秒間ボルテックスして細胞を懸濁し、４℃で２分間、２０００×ｇで遠心分離後、上清を完全に除去した。上記で得られた白血球ペレットに、核酸可溶化試薬Ａ１を５２０μｌ添加し、ペレットをピペッティングにてほぐした後、ボルテックスにて３０秒間撹拌することで白血球を溶解した。ここに９９．５容量％以上特級エタノールを２５０μｌ加え、即ち、エタノール濃度３２．５体積％とし、ボルテックスで５分間攪拌した。

（３８）ＲＮＡ分離精製操作
上記（３４）及び（３５）で作成した核酸吸着性多孔性膜を有する核酸分離精製カートリッジの一の開口に注入し、続いて上記一の開口に圧力差発生装置を結合し、核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態（１６０ｋＰａ）にし、注入した核酸を含む試料溶液を、核酸吸着性多孔性膜に通過させることで、核酸吸着性多孔性膜に接触させ、核酸分離精製カートリッジの他の開口より排出した。続いて、上記核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に、洗浄液Ａを７５０μｌ注入し、上記一の開口に圧力差発生装置を結合し、核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態（１６０ｋＰａ）にし、注入した洗浄液を核酸吸着性多孔性膜に通過させ、他の開口より排出した。圧力差発生装置を外し、ＤＮａｓｅ溶液（Ｓｉｇｍａ社製ＤＮａｓｅ Ｉ, Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｇｒａｄｅ ５００Ｋｕｎｉｔｚ Ｕ／μＬを使用）を膜上に１２０μｌ（３１２μｌ／ｃｍ²）アプライし、室温で１５分放置した。続いて、先と同様の洗浄を２回行った。続いて、上記核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に回収液Ａを５０μｌ注入し、核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に圧力差発生装置を結合して核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態（１６０ｋＰａ）にし、注入した回収液を、核酸吸着性多孔性膜に通過させ、他の開口より排出し、この液を回収した。ＲＮＡ分離精製操作に要した時間は、白血球数いずれの場合も、ＤＮａｓｅ反応時間を含め、1サンプルあたり１６分半以内であった。

（３９）回収された核酸の収量と純度
実施例７で回収されたＲＮＡの収量と純度（２６０／２８０）を表７に示す。

（４０）回収された核酸の電気泳動
実施例７で回収されたＲＮＡの電気泳動像を図２に示す。ＤＮａｓｅ処理によりＤＮＡが完全に除去され、高純度なＲＮＡを得ることができた。

［実施例８］
（４１）カートリッジ、溶血剤、核酸可溶化試薬Ａ１、洗浄液Ａおよび回収液Ａの調製
実施例７同様に、カートリッジを作製し、溶血剤Ａ、核酸可溶化試薬溶液Ａ１、洗浄液Ａおよび回収液Ａを調製した。

（４２）ＤＮａｓｅ反応溶液の調整
下記に示す処方のＤＮａｓｅ反応溶液Ａ１を調整した。

（ＤＮａｓｅ反応溶液Ａ１ = マグネシウム最終濃度 ２ｍｍｏｌ／Ｌ）
ＤＮａｓｅＩ，ＡｍｐＧｒａｄｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製） ２０Ｕ
１×ＤＮａｓｅＩ ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８．４） ２０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＭｇＣｌ₂ ２ｍｍｏｌ／Ｌ
ＫＣｌ ５０ｍｍｏｌ／Ｌ

（４３）核酸混合物溶液調製
抗凝固剤としてＥＤＴＡ−２Ｎａを使用したヒト全血（白血球数総数が１×１０⁷個、２×１０⁷個、３×１０⁷個）を５０ｍｌコニカルチューブに移し、全血の５倍容量の溶血剤Ａを添加し、氷上にて１５分インキュベートした。インキュベーション中に２回ボルテックスした。血液懸濁液が透明になったことを確認し、４℃で２分間、２０００×ｇで遠心分離後、上清を完全に除去した。上清を除去した後の容器内に元の全血の２倍容量の溶血剤Ａを添加し、軽く５秒間ボルテックスして細胞を懸濁し、４℃で２分間、２０００×ｇで遠心分離後、上清を完全に除去した。上記で得られた白血球ペレットに、核酸可溶化試薬Ａ１を５２０μl添加し、ボルテックスにて３０秒間撹拌することで白血球を溶解した。ここに９９．５容量％以上特級エタノールを２５０μl加え、即ち、エタノール濃度３２．５体積％とし、ボルテックスで３０秒間攪拌した。

（４４）ＲＮＡ分離精製操作
上記（４１）で作成した核酸吸着性多孔膜を有する核酸精製カートリッジの一の開口に注入し、続いて上記一の開口に圧力差発生装置を結合し、核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にし、注入した核酸を含む試料溶液を、核酸吸着性多孔膜に通過させることで、核酸吸着性多孔膜に接触させ、核酸分離精製カートリッジの他の開口より排出した。続いて、上記核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に、洗浄液Ａを７５０μl注入し、上記一の開口に圧力差発生装置を結合し、核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にし、注入した洗浄液を核酸吸着性多孔膜に通過させ、他の開口より排出した。上記一の開口にＤＮａｓｅ溶液Ａ１を４０μｌ注入し、室温で１５分インキュベートした。その後、上記核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に、洗浄液Ａを７５０μl注入し、上記一の開口に圧力差発生装置を結合し、核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にし、注入した洗浄液を核酸吸着性多孔膜に通過させ、他の開口より排出した。同様の操作を２回繰り返した。続いて、上記核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に回収液Ａを５０μｌ注入し、核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に圧力差発生装置を結合して核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にし、注入した回収液を、核酸吸着性多孔膜に通過させ、他の開口より排出し、この液を回収した。ＲＮＡ分離精製操作に要した時間は、白血球数いずれの場合も、ＤＮａｓｅ反応時間を含め、1サンプルあたり１８分以内であった。

（４５）回収された核酸の収量と純度
実施例８で回収されたＲＮＡの収量と純度（２６０／２８０）を表８に示す。

以上より、ＤＮａｓｅ処理によりＤＮＡが完全に除去され、簡便に高純度なＲＮＡを白血球から回収することができた。

［実施例９］
（４６）カートリッジ、溶血剤、核酸可溶化試薬Ａ１、洗浄液Ａおよび回収液Ａの調製
実施例７同様に、カートリッジを作製し、溶血剤Ａ、核酸可溶化試薬溶液Ａ１、洗浄液Ａおよび回収液Ａを調製した。

（４７）ＤＮａｓｅ反応溶液の調整
下記に示す処方のＤＮａｓｅ反応溶液Ａ２を調整した。

（ＤＮａｓｅ反応溶液Ａ２ = マグネシウム最終濃度 １０２ｍｍｏｌ／Ｌ）
ＤＮａｓｅＩ，ＡｍｐＧｒａｄｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製） ２０Ｕ
１×ＤＮａｓｅＩ ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８．４） ２０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＭｇＣｌ₂ ２ｍｍｏｌ／Ｌ
ＫＣｌ ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
１Ｍ ＭｇＣｌ₂ ０．１ｍｏｌ／Ｌ

（４８）核酸混合物溶液調製
抗凝固剤としてＥＤＴＡ−２Ｎａを使用したヒト全血（白血球数総数が１×１０⁷個、２×１０⁷個、３×１０⁷個）を５０ｍｌコニカルチューブに移し、全血の５倍容量の溶血剤Ａを添加し、氷上にて１５分インキュベートした。インキュベーション中に２回ボルテックスした。血液懸濁液が透明になったことを確認し、４℃で２分間、２０００×ｇで遠心分離後、上清を完全に除去した。上清を除去した後の容器内に元の全血の２倍容量の溶血剤Ａを添加し、軽く５秒間ボルテックスして細胞を懸濁し、４℃で２分間、２０００×ｇで遠心分離後、上清を完全に除去した。上記で得られた白血球ペレットに、核酸可溶化試薬Ａ１を５２０μl添加し、ボルテックスにて３０秒間撹拌することで白血球を溶解した。ここに９９．５容量％以上特級エタノールを２５０μl加え、即ち、エタノール濃度３２．５体積％とし、ボルテックスで３０秒間攪拌した。

（４９）ＲＮＡ分離精製操作
上記（４６）で作成した核酸吸着性多孔膜を有する核酸精製カートリッジの一の開口に注入し、続いて上記一の開口に圧力差発生装置を結合し、核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にし、注入した核酸を含む試料溶液を、核酸吸着性多孔膜に通過させることで、核酸吸着性多孔膜に接触させ、核酸分離精製カートリッジの他の開口より排出した。続いて、上記核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に、洗浄液Ａを７５０μl注入し、上記一の開口に圧力差発生装置を結合し、核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にし、注入した洗浄液を核酸吸着性多孔膜に通過させ、他の開口より排出した。上記一の開口にＤＮａｓｅ溶液Ａ２を４０μｌ注入し、室温で１５分インキュベートした。その後、上記核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に、洗浄液Ａを７５０μl注入し、上記一の開口に圧力差発生装置を結合し、核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にし、注入した洗浄液を核酸吸着性多孔膜に通過させ、他の開口より排出した。同様の操作を２回繰り返す。続いて、上記核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に回収液Ａを５０μｌ注入し、核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に圧力差発生装置を結合して核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にし、注入した回収液を、核酸吸着性多孔膜に通過させ、他の開口より排出し、この液を回収した。ＲＮＡ分離精製操作に要した時間は、白血球数いずれの場合も、ＤＮａｓｅ反応時間を含め、1サンプルあたり１７分以内であった。

（５０）回収された核酸の収量と純度
実施例９で回収されたＲＮＡの収量と純度（２６０／２８０）を表９に示す。

以上より、ＤＮａｓｅ処理によりＤＮＡが完全に除去され、簡便に高純度なＲＮＡを白血球から回収することができた。

［実施例１０］
（５１）カートリッジ、溶血剤、核酸可溶化試薬Ａ１、洗浄液Ａおよび回収液Ａの調製
実施例７同様に、カートリッジを作製し、溶血剤Ａ、核酸可溶化試薬溶液Ａ１、洗浄液Ａおよび回収液Ａを調製した。

（５２）ＤＮａｓｅ反応溶液の調整
下記に示す処方のＤＮａｓｅ溶液Ａ３を調整した。

（ＤＮａｓｅ溶液Ａ３ = マグネシウム最終濃度 １０２ｍｍｏｌ／Ｌ）
ＤＮａｓｅＩ，ＡｍｐＧｒａｄｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製） ２０Ｕ
１×ＤＮａｓｅＩ ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８．４） ２０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＭｇＣｌ₂ ２ｍｍｏｌ／Ｌ
ＫＣｌ ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
１Ｍ ＭｇＳＯ₄ ０．１ｍｏｌ／Ｌ

（５３）核酸混合物溶液調製
抗凝固剤としてＥＤＴＡ−２Ｎａを使用したヒト全血（白血球数総数が２×１０⁷個、３×１０⁷個）を５０ｍｌコニカルチューブに移し、全血の５倍容量の溶血剤Ａを添加し、氷上にて１５分インキュベートした。インキュベーション中に２回ボルテックスした。血液懸濁液が透明になったことを確認し、４℃で２分間、２０００×ｇで遠心分離後、上清を完全に除去した。上清を除去した後の容器内に元の全血の２倍容量の溶血剤Ａを添加し、軽く５秒間ボルテックスして細胞を懸濁し、４℃で２分間、２０００×ｇで遠心分離後、上清を完全に除去した。上記で得られた白血球ペレットに、核酸可溶化試薬Ａ１を５２０μl添加し、ボルテックスにて３０秒間撹拌することで白血球を溶解した。ここに９９．５容量％以上特級エタノールを２５０μl加え、即ち、エタノール濃度３２．５体積％とし、ボルテックスで３０秒間攪拌した。

（５４）ＲＮＡ分離精製操作
上記（３４）及び（３５）で作成した核酸吸着性多孔膜を有する核酸精製カートリッジの一の開口に注入し、続いて上記一の開口に圧力差発生装置を結合し、核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にし、注入した核酸を含む試料溶液を、核酸吸着性多孔膜に通過させることで、核酸吸着性多孔膜に接触させ、核酸分離精製カートリッジの他の開口より排出した。続いて、上記核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に、洗浄液Ａを７５０μl注入し、上記一の開口に圧力差発生装置を結合し、核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にし、注入した洗浄液を核酸吸着性多孔膜に通過させ、他の開口より排出した。上記一の開口にＤＮａｓｅ溶液Ａ３を４０μｌ注入し、室温で１５分インキュベートした。その後、上記核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に、洗浄液Ａを７５０μl注入し、上記一の開口に圧力差発生装置を結合し、核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にし、注入した洗浄液を核酸吸着性多孔膜に通過させ、他の開口より排出した。同様の操作を２回繰り返す。続いて、上記核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に回収液Ａを５０μｌ注入し、核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に圧力差発生装置を結合して核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にし、注入した回収液を、核酸吸着性多孔膜に通過させ、他の開口より排出し、この液を回収した。ＲＮＡ分離精製操作に要した時間は、白血球数いずれの場合も、ＤＮａｓｅ反応時間を含め、1サンプルあたり１８分以内であった。

（５５）回収された核酸の収量と純度
実施例１０で回収されたＲＮＡの収量と純度（２６０／２８０）を表１０に示す。

以上より、ＤＮａｓｅ処理によりＤＮＡが完全に除去され、簡便に高純度なＲＮＡを白血球から回収することができた。

本発明の方法に従って分離精製したＲＮＡをアガロースゲル（ＴＡＥ泳動バッファー）電気泳動して得られた写真である。 本発明の方法に従って白血球数総数１×１０⁷個のヒト全血から得られた分離精製したＲＮＡをアガロースゲル（ＴＡＥ泳動バッファー）電気泳動して得られた写真である。

符号の説明

１：白血球数総数５×１０⁶個のヒト全血から得られたＲＮＡ
２：白血球数総数１×１０⁷個のヒト全血から得られたＲＮＡ

３：１ｋｂ ＰＬＵＳ Ｌａｄｄｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）
４、５：白血球数総数１×１０⁷個のヒト全血から得られたＲＮＡ

Claims (8)

1. （１）核酸を含む試料溶液を核酸吸着性多孔性膜に通過させて、該多孔性膜に核酸を吸着させる工程、
   （２）洗浄液を核酸吸着性多孔性膜に通過させて、ＲＮＡが吸着した状態で該多孔性膜を洗浄する工程、及び
   （３）回収液を核酸吸着性多孔性膜に通過させて、該多孔性膜からＲＮＡを脱着させる工程、
   を含有するＲＮＡ分離精製方法において、
   該核酸吸着性多孔性膜がイオン結合が関与しない相互作用で核酸が吸着する多孔性膜であり、且つ、
   核酸を含む試料溶液が、
   （Ｉ）血液および白血球の少なくともいずれかを含み、かつ抗凝固剤を含む検体を容器に注入する工程、
   （ＩＩ）容器に溶血剤を添加した後に３００×ｇ〜３０００×ｇにて遠心分離することにより、白血球ペレットを得る工程、
   （ＩＩＩ）白血球ペレットに核酸可溶化試薬を添加して混合液を得る工程、
   （ＩＶ）混合液に水溶性有機溶媒を添加し、核酸を含む試料溶液を得る工程、
   を含有する試料溶液調製工程で得ることを特徴とするＲＮＡ分離精製方法。
2. 前記溶血剤が、塩化アンモニウム、塩化ナトリウム、シュウ酸アンモニウムおよびサポニンから選ばれる少なくとも一つを含む請求項１に記載のＲＮＡ分離精製方法。
3. （ＩＩ）の工程において、前記溶血剤を添加後、０〜３５℃でインキュベートする請求項１または２に記載のＲＮＡ分離精製方法。
4. 前記核酸可溶化試薬が、カオトロピック塩、核酸安定化剤、界面活性剤、緩衝剤及び消泡剤から選ばれる少なくとも一つを含む請求項１〜３のいずれか一項に記載のＲＮＡ分離精製方法。
5. 前記カオトロピック塩がグアニジン塩である、請求項４に記載のＲＮＡ分離精製方法。
6. 前記核酸安定化剤が還元剤である請求項４又は５に記載のＲＮＡ分離精製方法。
7. 前記界面活性剤がノニオン性界面活性剤を含む、請求項４〜６のいずれか一項に記載のＲＮＡ分離精製方法。
8. 前記核酸を含む試料溶液、前記洗浄液および前記回収液の少なくともいずれかを、加圧状態で核酸吸着性多孔性膜に通過させる、請求項１〜７のいずれか一項に記載のＲＮＡ分離精製方法。