JP2005154416A - 核酸の分離精製方法、核酸分離精製カートリッジ、及び核酸分離精製キット - Google Patents

核酸の分離精製方法、核酸分離精製カートリッジ、及び核酸分離精製キット Download PDF

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Abstract

【課題】 分離性能に優れ、洗浄効率が良く、簡便で、迅速で、自動化および小型化適性に優れ、実質的に同一の分離性能を有するものを大量に生産可能である、多孔性膜を使用した核酸の分離精製方法を提供すること。
【解決手段】 (1)核酸を含む試料溶液を核酸吸着性多孔性膜に通過させて、多孔性膜内に核酸を吸着させる工程、(2)核酸が吸着した多孔性膜を洗浄する工程、及び(3)回収液を用いて、多孔性膜内から核酸を脱着させる工程を含有する核酸の分離精製方法において、該核酸吸着性多孔性膜がイオン結合が実質的に関与しない相互作用で核酸が吸着する多孔性膜であり、且つ、該洗浄工程と該回収工程の間に核酸を吸着した多孔性膜を乾燥させる工程を含まないことを特徴とする核酸の分離精製方法。
【選択図】 なし

Description

本発明は、核酸を分離精製する方法、核酸分離精製カートリッジ、及び核酸分離精製キットに関し、より詳細には、少なくとも二個の開口を有する容器内に核酸吸着性多孔膜を収容した核酸分離精製カートリッジと圧力発生装置とを用いて、核酸を含む検体から核酸を分離精製する方法、該核酸分離精製カートリッジ、及び該核酸分離精製カートリッジを有する核酸分離精製キットに関する。
核酸は、様々な分野で種々の形態で使用されている。例えば、組換え核酸技術の領域においては、核酸をプローブ、ゲノム核酸、およびプラスミド核酸等の形態で用いることを要求する。
診断分野においても、核酸は種々の方法で用いられている。例えば、核酸プローブは、ヒトの病原体の検出および診断に日常的に用いられている。同様に核酸は遺伝障害の検出に用いられている。核酸はまた食品汚染物質の検出にも用いられている。さらに、核酸は遺伝地図の作製からクローニングおよび組換え発現におよぶ種々の理由により、興味ある核酸の位置確認、同定および単離において日常的に用いられている。
多くの場合、核酸は極めて少量でしか入手できず、そして単離および精製操作が煩雑で時間を要する。このしばしば時間を消費する煩雑な操作は核酸の損失に結びつきやすい。血清、尿およびバクテリアのカルチャーから得られた試料の核酸の精製においては、コンタミネーションおよび疑陽性の結果が生じるという危険性も加わる。
広く知られた精製方法の一つに、核酸を二酸化珪素、シリカポリマー、珪酸マグネシウム等の固相に吸着させ、引き続く洗浄、脱着等の操作によって精製する方法がある（例えば、特許文献１）。この方法は、分離性能としては優れているが、簡便性、迅速性、自動化および小型化適性においては十分でなく、同一性能の吸着媒体の工業的大量生産が困難であり、かつ取扱いが不便で、種々の形状に加工しがたい等の問題点がある。
また、簡便かつ効率よく核酸を分離精製する方法の一つとして、固相に核酸を吸着させる溶液及び固相から核酸を脱着させる溶液をそれぞれ用いて、表面に水酸基を有する有機高分子からなる固相に核酸を吸着及び脱着させることによって、核酸を分離精製する方法が報告されている（例えば、特許文献２）。
特公平７−５１０６５号公報 特開２００３−１２８６９１号公報
本発明の目的は、分離性能に優れ、洗浄効率が良く、簡便で、迅速で、自動化および小型化適性に優れ、実質的に同一の分離性能を有するものを大量に生産可能である多孔膜を使用した核酸の分離精製方法、核酸分離精製カートリッジ、及び核酸分離精製キットを提供することである。
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、核酸の分離精製方法において、核酸を多孔性膜に吸着及び脱着させる過程を含むことが有効であることがわかった。さらに、本発明では、核酸の分離精製方法において、該多孔性膜として実質的にイオン結合が関与しない相互作用で核酸が吸着する多孔性膜を用い、且つ多孔膜に吸着した核酸の洗浄に低表面張力の洗浄液を用い、続いて回収することによって、核酸を含む検体から核酸を収率よく、高純度で、しかも簡便かつ迅速に分離精製することができることを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。即ち、本発明は、下記のものである。
１． (1)核酸を含む試料溶液を核酸吸着性多孔性膜に通過させて、該核酸吸着性多孔性膜内に核酸を吸着させる工程、
(2)洗浄液を該核酸吸着性多孔性膜に通過させて、核酸が吸着した状態で該核酸吸着性多孔性膜を洗浄する工程、及び
(3)回収液を、該核酸吸着性多孔性膜に通過させて、該核酸吸着性多孔性膜内から核酸を脱着させる工程
を含有する核酸の分離精製方法において、
該核酸吸着性多孔性膜が、イオン結合が実質的に関与しない相互作用で核酸が吸着する多孔性膜であり、且つ、
該洗浄工程と該回収工程との間に核酸を吸着した核酸吸着性多孔性膜を乾燥させる工程を含まないことを特徴とする核酸の分離精製方法。
２． 前記洗浄液の表面張力が、３．５ｍＮ／ｍ以下である、上記１に記載の核酸の分離精製方法。
３． 前記(1)、(2)及び(3)の各工程において、前記核酸を含む試料溶液、洗浄液又は回収液を、加圧状態で核酸吸着性多孔性膜に通過させる、上記１又は２に記載の核酸の分離精製方法。
４． 前記(1)、(2)及び(3)の各工程において、少なくとも二個の開口を有する容器内に前記核酸吸着性多孔性膜を収容した核酸分離精製カートリッジの一の開口に、核酸を含む試料溶液、洗浄液又は回収液を注入し、該カートリッジの一の開口に結合された圧力差発生装置を用いてカートリッジ内を加圧状態にして、該注入した各液を通過させ、他の開口より排出させる、上記１〜３のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
５． 前記核酸が吸着した核酸吸着性多孔性膜に洗浄液を通過させて、該核酸吸着性多孔性膜を洗浄する回数が、１回である、上記１〜４のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
６． 前記核酸が吸着した核酸吸着性多孔性膜に洗浄液を通過させて、該核酸吸着性多孔性膜を洗浄する操作を、室温で行う、上記１〜５のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
７． 前記核酸吸着性多孔性膜が、多糖構造を有する有機ポリマーからなる多孔性膜である、上記１〜６のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
８． 前記多糖構造を有する有機ポリマーからなる多孔性膜が、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物からなる多孔性膜である、上記７に記載の核酸の分離精製方法。
９． 前記アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物が、トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースとの混合物である、上記８に記載の核酸の分離精製方法。
１０． 前記トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースとの混合比（質量比）が、９９：１〜１：９９である、上記９に記載の核酸の分離精製方法。
１１． 前記アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物が、トリアセチルセルロースとモノアセチルセルロースとの混合物である、上記８に記載の核酸の分離精製方法。
１２． 前記アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物が、トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースとモノアセチルセルロースとの混合物である、上記８に記載の核酸の分離精製方法。
１３． 前記アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物が、ジアセチルセルロースとモノアセチルセルロースとの混合物である、上記８に記載の核酸の分離精製方法。
１４． 前記多糖構造を有する有機ポリマーからなる多孔性膜が、アセチルセルロースを鹸化処理した有機材料からなる多孔性膜である、上記７に記載の核酸の分離精製方法。
１５． 前記アセチルセルロースの鹸化率が、５％以上である、上記１４に記載の核酸の分離精製方法。
１６． 前記アセチルセルロースを鹸化処理した有機材料が、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物を鹸化処理した有機材料である、上記１４に記載の核酸の分離精製方法。
１７． 前記アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物の鹸化率が、５％以上である、上記１６に記載の核酸の分離精製方法。
１８． 前記アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物を鹸化処理した有機材料が、トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースとの混合物の鹸化物である、上記１６または１７に記載の核酸の分離精製方法。
１９． 前記トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースとの混合比（質量比）が、９９：１〜１：９９である、上記１８に記載の核酸の分離精製方法。
２０． 前記アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物を鹸化処理した有機材料が、トリアセチルセルロースとモノアセチルセルロースとの混合物の鹸化物である、上記１６または１７に記載の核酸の分離精製方法。
２１． 前記アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物を鹸化処理した有機材料が、トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースとモノアセチルセルロースとの混合物の鹸化物である、上記１６または１７に記載の核酸の分離精製方法。
２２． 前記アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物を鹸化処理した有機材料が、ジアセチルセルロースとモノアセチルセルロースとの混合物の鹸化物である、上記１６または１７に記載の核酸の分離精製方法。
２３． 前記アセチルセルロースを鹸化処理した有機材料からなる多孔性膜が、鹸化処理後の平均孔径が鹸化処理前より減少している多孔性膜である、上記１４〜２２のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
２４． 前記鹸化処理前の平均孔径に対する鹸化処理後の平均孔径の比が、０．８以下である、上記２３に記載の核酸の分離精製方法。
２５． 前記核酸吸着性多孔膜が再生セルロースである、上記１〜２４のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
２６． 前記核酸吸着性多孔性膜が、親水基を持たない有機材料を処理して親水基を導入した多孔性膜である、上記１〜６のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
２７． 前記親水基を持たない有機材料の親水基の導入処理が、前記親水基を持たない有機材料に、親水基を有するグラフトポリマー鎖を結合する工程を含む、上記２６に記載の核酸の分離精製方法。
２８． 前記核酸吸着性多孔性膜が、親水基を持たない有機材料を親水基を持つ材料でコーティングして親水基を導入した多孔性膜である、上記１〜６のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
２９． 前記親水基を持つ材料が、親水基を有する有機ポリマーである、上記２８に記載の核酸の分離精製方法。
３０． 前記核酸吸着性多孔性膜が、親水基を有する無機材料からなる多孔性膜である、上記１〜６のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
３１． 前記核酸吸着性多孔性膜が、親水基を持たない無機材料を処理して親水基を導入した多孔性膜である、上記１〜６のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
３２． 前記親水基を持たない無機材料の親水基の導入処理が、前記親水基を持たない無機材料に、親水基を有するグラフトポリマー鎖を結合する工程を含む、上記３１に記載の核酸の分離精製方法。
３３． 前記核酸吸着性多孔性膜が、親水基を持たない無機材料を親水基を持つ材料でコーティングして親水基を導入した多孔性膜である、上記１〜６のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
３４． 前記親水基を持つ材料が、親水基を有する有機ポリマーである、上記３３に記載の核酸の分離精製方法。
３５． 前記親水基が水酸基である、上記２６〜３４のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
３６． 前記核酸吸着性多孔性膜が表裏非対称性の多孔性膜である、上記１〜３５のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
３７． 上記１〜３６のいずれかに記載の核酸の分離精製方法を行うための、少なくとも二個の開口を有する容器内に、核酸吸着性多孔性膜を収容した核酸分離精製カートリッジ。
３８． 上記１〜３６のいずれかに記載の核酸の分離精製方法を行うための核酸分離精製キットであって、少なくとも二個の開口を有する容器内に、核酸吸着性多孔性膜を収容した核酸分離精製カートリッジと、少なくとも洗浄液及び回収液を含む試薬と、を有する核酸分離精製キット。
本発明の核酸の分離精製方法によれば、多孔性膜としてイオン結合が関与しない相互作用で核酸が吸着する多孔性膜を用い、且つ多孔膜に吸着した核酸の洗浄を行い、続いて多孔膜の乾燥工程を経ずに核酸を回収することにより、簡便で、迅速に、かつ自動化可能に、核酸を含む検体から核酸を分離精製することができる。さらに、低表面張力の洗浄液を用いることにより分離性能良くすることができる。
本発明の核酸分離精製方法は、
(1)核酸を含む試料溶液を核酸吸着性多孔性膜に通過させて、該多孔性膜内に核酸を吸着させる工程、(2)該核酸吸着性多孔性膜を、核酸が吸着した状態で、洗浄する工程、及び(3)回収液を、該核酸吸着性多孔性膜に通過させて、該多孔性膜内から核酸を脱着させる工程を少なくとも含むものである。
好ましくは、上記(1)、(2)及び(3)の各工程において、核酸を含む試料溶液、洗浄液又は回収液を、加圧状態で核酸吸着性多孔性膜に通過させるものであり、より好ましくは、上記(1)、(2)及び(3)の各工程において、少なくとも二個の開口を有する容器内に該核酸吸着性多孔性膜を収容した核酸分離精製カートリッジの一の開口に、核酸を含む試料溶液、洗浄液又は回収液を注入し、カートリッジの上記一の開口に結合された圧力差発生装置を用いてカートリッジ内を加圧状態にして、該注入した各液を通過させ、他の開口より排出させるものである。核酸を含む試料溶液、洗浄液又は回収液を加圧状態で上記多孔性膜に通過させることにより、装置をコンパクトに自動化することができ、好ましい。加圧は、好ましくは１０〜２００ｋＰａ、より好ましくは４０〜１００ｋＰａの程度で行われる。
なお、本発明の上記核酸分離精製方法は、核酸分離精製カートリッジ、試薬のキット及び核酸分離精製用自動装置を用いることにより、とくに簡易,迅速に行うことができる。
上記の核酸分離精製の工程では、最初の核酸を含む試料液の注入から核酸分離精製カートリッジ外に核酸を得るまでの工程を１０分以内、好適な状況では２分以内で終了することが可能である。また、上記の核酸分離精製の工程では核酸を５０質量％以上、好適な状況では９０質量％以上の収率で得ることが可能である。
また、上記の核酸分離精製の工程では、１ｋｂｐから２００ｋｂｐ、好ましくは２０ｋｂｐから１４０ｋｂｐと広範囲に及ぶ分子量の核酸を回収することができる。すなわち、従来行なわれているガラスフィルターを用いたスピンカラム法に比べて、長鎖の核酸を回収できる。
また、上記の核酸分精製の工程では、紫外可視分光光度計で求めた２６０ｎｍ及び２８０ｎｍの分光吸光度の吸光度比（２６０ｎｍ／２８０ｎｍ）が、ＤＮＡの場合は１．６〜２．０、ＲＮＡの場合は１．８〜２．２となる純度を持つ核酸を回収することができ、不純物混入量の少ない高純度の核酸を定常的に得ることができる。さらには、紫外可視分光光度計での吸光度比（２６０ｎｍ／２８０ｎｍ）がＤＮＡの場合は１．８付近、ＲＮＡの場合は２．０付近となる純度を持つ核酸を回収することができる。
また、上記工程において、圧力差発生装置としては、注射器、ピペッタ、エバポレーター、あるいはペリスタポンプのような加圧が可能なポンプ、或いは、エバポレーター等の減圧可能なもの等が挙げられる。これらの内、手動操作には注射器が、自動操作にはポンプが適している。また、ピペッタは片手操作が容易にできるという利点を有する。好ましくは、圧力差発生装置は、核酸分離精製カートリッジの一の開口に着脱可能に結合されている。
本発明において使用できる検体に制限はないが、例えば診断分野においては、検体として採取された全血、血漿、血清、尿、便、精液、唾液等の体液、あるいは植物（又はその一部）、動物（またはその一部）、細菌、ウイルスなど、あるいはそれらの溶解物およびホモジネートなどの生物材料から調製された溶液が対象となる。
最初にこれらの検体について細胞膜および核膜等を溶解して核酸を可溶化する試薬を含む水溶液（核酸可溶化試薬）で処理する。これにより細胞膜および核膜が溶解されて、核酸が水溶液内に分散し、核酸を含む試料溶液を得る。
細胞膜および核膜を溶解して、核酸を可溶化するためには、例えば、対象となる試料が全血の場合、（1）赤血球の除去、（2）各種タンパク質の除去、及び（3）白血球の溶解及び核膜の溶解が必要となる。（1）赤血球の除去および（2）各種タンパク質の除去は、膜への非特異吸着および多孔性膜の目詰まりを防ぐために、（3）白血球の溶解及び核膜の溶解は、抽出の対象である核酸を可溶化させるためにそれぞれ必要となる。
核酸を含む検体は、単一の核酸を含む検体でもよいし、異なる複数種類の核酸を含む検体でもよい。回収する核酸の種類は、ＤＮＡやＲＮＡ等、特に制限されない。検体の数は一つでも複数であってもよい。回収する核酸の長さも特に限定されず、例えば、数ｂｐ〜数Ｍｂｐの任意の長さの核酸を使用することができる。取扱い上の観点からは、回収する核酸の長さは一般的には、数ｂｐ〜数百ｋｂｐ程度である。本発明の核酸分離精製方法は、従来の簡易的な核酸分離精製方法より比較的長い核酸を迅速に取り出すことができ、好ましくは５０ｋｂｐ以上、より好ましくは７０ｋｂｐ以上の核酸を回収することに用いることがでる。
以下に、細胞膜および核膜を溶解し、核酸を可溶化して、検体から核酸を含む試料溶液を得る工程について説明する。本発明で、細胞膜および核膜を溶解して核酸を可溶化するには、核酸可溶化試薬を用いる。核酸可溶化試薬としては、カオトロピック塩、界面活性剤およびタンパク質分解酵素を含む溶液が挙げられる。
細胞膜および核膜を溶解し、核酸を可溶化して、検体から核酸を含む試料溶液を得る工程としては、(Ｉ)検体を容器に注入する工程、(ＩＩ)上記容器に、カオトロピック塩と界面活性剤を含む核酸可溶化試薬溶液を添加し、検体と核酸可溶化試薬溶液を混合する工程、(ＩＩＩ)上記で得られた混合液をインキュベートする工程、(ＩＶ)インキュベートされた混合液に水溶性有機溶媒を添加する工程を含む工程を挙げることができる。
上記の細胞膜および核膜を溶解し、核酸を可溶化して、検体から核酸を含む試料溶液を得る工程において、検体をホモジナイズ処理することで、自動化処理適性が向上する。ホモジナイズ処理は、例えば、超音波処理、鋭利な突起物を用いる、高速攪拌処理を用いる、微細空隙から押し出す処理、ガラスビーズを用いる処理等で行うことができる。
また、上記の細胞膜および核膜を溶解し、核酸を可溶化して、検体から核酸を含む試料溶液を得る工程において、タンパク質分解酵素を含む核酸可溶化試薬を使用することにより、核酸の回収量及び回収効率が向上し、必要な核酸を含む検体の微量化及び迅速化が可能となる。
タンパク質分解酵素は、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、金属プロテアーゼなどから、少なくとも１つのタンパク質分解酵素を好ましく用いることができる。また、タンパク質分解酵素は、複数種以上のタンパク質分解酵素の混合物も好ましく用いることができる。
セリンプロテアーゼとしては、特に限定されず、例えばプロテアーゼＫなどを好ましく用いることができる。
システインプロテアーゼとしては、特に限定されず、例えばパパイン、カテプシン類などを好ましく用いることができる。
金属プロテアーゼとしては、特に限定されず、例えばカルボキシペプチターゼ等を好ましく用いることができる。
タンパク質分解酵素は、添加時の反応系全容積１ｍｌあたり好ましくは０．００１ＩＵ〜１０ＩＵ、より好ましくは０．０１ＩＵ〜１ＩＵの濃度で用いることができる。
また、タンパク質分解酵素は、核酸分解酵素を含まないタンパク質分解酵素を好ましく用いることができる。また、安定化剤を含んだタンパク質分解酵素を好ましく用いることができる。安定化剤としては、金属イオンを好ましく用いることができる。具体的には、マグネシウムイオンが好ましく、例えば塩化マグネシウムなどの形で添加することができる。タンパク質分解酵素の安定好ましく、例えば塩化マグネシウムなどの形で添加することができる。タンパク質分解酵素の安定化剤を含ませることにより、核酸の回収に必要なタンパク質分解酵素の微量化が可能となり、核酸の回収に必要なコストを低減することができる。タンパク質分解酵素の安定化剤は、反応系全量に対して好ましくは１〜１０００ｍＭ、より好ましくは１０〜１００ｍＭの濃度で含有することが好ましい。
タンパク質分解酵素は、予めカオトロピック塩、界面活性剤等のその他の試薬とともに混合されて１つの試薬として核酸の回収に供されても良い。
また、タンパク質分解酵素は、カオトロピック塩、界面活性剤等のその他の試薬とは個別の２つ以上の試薬として供されても良い。後者の場合、タンパク質分解酵素を含む試薬を先に検体と混合した後に、カオトロピック塩、界面活性剤を含む試薬と混合される。また、カオトロピック塩、界面活性剤を含む試薬を先に混合した後に、タンパク分解酵素を混合してもよい。
また、タンパク質分解酵素を検体または、検体とカオトロピック塩、界面活性剤を含む試薬との混合液に、タンパク質分解酵素保存容器から直接目薬状に滴下させることもできる。この場合、操作を簡便にすることができる。
核酸可溶化試薬は、乾燥された状態で供給されることも好ましい。また、凍結乾燥のように乾燥された状態のタンパク質分解酵素を予め含む容器を用いることができる。上記の、乾燥された状態で供給される核酸可溶化試薬、および乾燥された状態のタンパク質分解酵素を予め含む容器の両方を用いて、核酸を含む試料溶液を得ることもできる。
上記の方法で核酸を含む試料溶液を得る場合、核酸可溶化試薬およびタンパク質分解酵素の保存安定性が良く、核酸収量を変えずに操作を簡便にすることができる。
検体とカオトロピック塩及び／又は界面活性剤を含む核酸可溶化試薬溶液とを混合する方法は、特に限定されない。
混合する際、攪拌装置により３０から３０００ｒｐｍで１秒から３分間混合することが好ましい。これにより、分離精製される核酸収量を増加させることができる。または、転倒混和を５から３０回行うことで混合することも好ましい。また、ピペッティング操作を、１０から５０回行うことによっても混合することができる、この場合、簡便な操作で分離精製される核酸収量を増加させることができる。
検体とカオトロピック塩及び／又は界面活性剤を含む核酸可溶化試薬溶液との混合液を、タンパク質分解酵素の至適温度および反応時間でインキュベートすることにより、分離精製される核酸の収量を増加させることがきる。インキュベーション温度は、通常２０℃〜７０℃、好ましくはタンパク分解酵素の至適温度であり、インキュベーション時間は通常１〜９０分、好ましくはタンパク分解酵素の至適反応時間である。インキュベーション方法は特に限定されず、湯浴や加温器に入れることで行うことができる。
上記の細胞膜および核膜を溶解し、核酸を可溶化して、検体から核酸を含む試料溶液を得る工程において、界面活性剤とカオトロピック塩を含む核酸可溶化試薬溶液は、好ましくはｐＨ５〜１０、より好ましくはｐＨ６〜９、さらに好ましくはｐＨ７〜８のものが用いられる。
また、上記の細胞膜および核膜を溶解し、核酸を可溶化して、検体から核酸を含む試料溶液を得る工程において、カオトロピック塩の核酸可溶化試薬溶液における濃度は、０．５ｍｏｌ／Ｌ以上であることが好ましく、より好ましくは０．５ｍｏｌ／Ｌ〜７ｍｏｌ／Ｌ、さらに好ましくは、２ｍｏｌ／Ｌ〜６ｍｏｌ／Ｌである。上記カオトロピック塩としては、塩酸グアニジンが好ましいが、他のカオトロピック塩（イソチオシアン酸グアニジン、チオシアン酸グアニジン、尿素、イソチオシアン酸ナトリウム、ヨウ化カリウム、ヨウ化ナトリウム）を使用することもできる。また、これらの塩は単独または複数組み合わせて用いてもよい。
また、上記の細胞膜および核膜を溶解し、核酸を可溶化して、検体から核酸を含む試料溶液を得る工程において、検体にカオトロピック塩及び／又はタンパク質分解酵素とともに混合する界面活性剤は、例えば、ノニオン界面活性剤、カチオン界面活性剤、アニオン界面活性剤、両性界面活性剤である。
本発明においてはノニオン界面活性剤を好ましく用いることができる。ノニオン界面活性剤は、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル系界面活性剤、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系界面活性剤、脂肪酸アルカノールアミドを用いることができるが、好ましくは、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系界面活性剤を用いることができる、さらに好ましくは、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系界面活性剤は、ＰＯＥデシルエーテル、ＰＯＥラウリルエーテル、ＰＯＥトリデシルエーテル、ＰＯＥアルキレンデシルエーテル、ＰＯＥソルビタンモノラウレート、ＰＯＥソルビタンモノオレエート、ＰＯＥソルビタンモノステアレート、テトラオレイン酸ポリオキシエチレンソルビット、ＰＯＥアルキルアミン、ＰＯＥアセチレングリコールから選択されるポリオキシエチレンアルキルエーテル系界面活性剤である。
また、カチオン界面活性剤も好ましく用いることができる。さらに好ましくは、カチオン界面活性剤は、セチルトリメチルアンモニウムプロミド、ドデシルトリメチルアンモニウムクロリド、テトラデシルトリメチルアンモニウムクロリド、セチルピリジニウムクロリドから選択されるカチオン界面活性剤である。これらの界面活性剤は、単独または複数組み合わせて用いてもよい。
これら界面活性剤の核酸可溶化試薬溶液における濃度は０．１〜２０質量％であることが好ましい。
また、上記の核酸可溶化試薬溶液は水溶性有機溶媒を含んでいても良い。この水溶性有機溶媒としてはアルコールが好ましい。アルコールは、１級アルコール、２級アルコール、３級アルコールのいずれでも良い。アルコールがメチルアルコール、エチルアルコール、プロピルアルコール及びその異性体、ブチルアルコール及びその異性体を好ましく用いることができる。これらの水溶性有機溶媒は単独または複数組み合わせて用いてもよい。これら水溶性有機溶媒の核酸可溶化試薬溶液における濃度は１〜２０％であることが好ましい。
ＤＮＡなどＲＮＡ以外の核酸を回収する場合、上記の細胞膜および核膜を溶解し、核酸を可溶化して、検体から核酸を含む試料溶液を得る工程において、核酸可溶化試薬溶液にＲＮＡ分解酵素を加えることが好ましい。この場合、回収された核酸に共存するＲＮＡによる干渉を軽減することができる。また、ＤＮＡ分解酵素阻害剤を加えることも好ましい。
一方、ＲＮＡなどＤＮＡ以外の核酸を回収する場合、核酸可溶化試薬溶液にＤＮＡ分解酵素を加えることが好ましい。この場合、回収された核酸に共存するＤＮＡによる干渉を軽減することができる。また、ＲＮＡ分解酵素阻害剤を加えることも好ましい。ＲＮＡ分解酵素阻害剤としては、ＲＮＡ分解酵素を特異的に阻害するものが好ましい。
ＲＮＡ分解酵素は特に限定されず、例えば、リボヌクレアーゼ Ｈ（ＲＮａｓｅ Ｈ）等のＲＮＡ特異的分解酵素を好ましく用いることができる。
ＤＮＡ分解酵素は特に限定されず、例えば、ＤＮａｓｅ Ｉ等のＤＮＡ特異的分解酵素を好ましく用いることができる。
上記の細胞膜および核膜を溶解し、核酸を可溶化して、検体から核酸を含む試料溶液を得る工程において、核酸を含む試料溶液には、消泡剤を含有させることも好ましい。消泡剤としては、シリコン系消泡剤とアルコール系消泡剤の２つの成分が好ましく挙げられ、また、アルコール系消泡剤としては、アセチレングリコール系界面活性剤が好ましい。
消泡剤の具体例としては、シリコン系消泡剤（例えば、シリコーンオイル、ジメチルポリシロキサン、シリコーンエマルジョン、変性ポリシロキサン、シリコーンコンパウンドなど）、アルコール系消泡剤（例えば、アセチレングリコール、ヘプタノール、エチルへキサノール、高級アルコール、ポリオキシアルキレングリコールなど）、エーテル系消泡剤（例えば、ヘプチルセロソルブ、ノニルセロソルブ−３−ヘプチルコルビトールなど）、油脂系消泡剤（例えば、動植物油など）、脂肪酸系消泡剤（例えば、ステアリン酸、オレイン酸、パルミチン酸など）、金属セッケン系消泡剤（例えば、ステアリン酸アルミ、ステアリン酸カルシウムなど）、脂肪酸エステル系消泡剤（例えば、天然ワックス、トリブチルホスフェートなど）、燐酸エステル系消泡剤（例えば、オクチルリン酸ナトリウムなど）、アミン系消泡剤（例えば、ジアミルアミンなど）、アミド系消泡剤（例えば、ステアリン酸アミドなど）、その他の消泡剤（例えば、硫酸第二鉄、ボーキサイトなど）などが挙げられる。特に好ましくは、消泡剤として、シリコン系消泡剤とアルコール系消泡剤の２つの成分を組み合わせて使用することができる。また、アルコール系消泡剤としては、アセチレングリコール系界面活性剤を使用することも好ましい。
上記の細胞膜および核膜を溶解し、核酸を可溶化して、検体から核酸を含む試料溶液を得る工程において、インキュベートされた混合液に添加する水溶性有機溶媒は、アルコールを好ましく用いることができる。アルコールは、１級アルコール、２級アルコール、３級アルコールのいずれでもよく、メチルアルコール、エチルアルコール、プロピルアルコール、ブチルアルコール及びその異性体を好ましく用いることができる。水溶性有機溶媒の核酸を含む試料溶液における最終濃度は、５〜９０質量％であることが好ましい。
また、上記の細胞膜および核膜を溶解し、核酸を可溶化して、検体から核酸を含む試料溶液を得る工程において、得られた核酸を含む試料溶液は、表面張力は５０ｍＮ／ｍ（０．０５Ｊ／ｍ2）以下であることが好ましく、また、粘度は、１〜１００００ｍＰａ・ｓであることが好ましく、比重は、０．８〜１．２であることが好ましい。
以下に、本発明で用いる核酸吸着性多孔性膜および吸着工程について説明する。本発明の核酸吸着性多孔性膜は、溶液が内部を通過可能なものである。ここで「溶液が内部を通過可能」とは、膜の一方の面が接する空間と膜の他方の面が接する空間の間に圧力差を生じさせた場合に、高圧の空間側から低圧の空間側へと、膜の内部を溶液が通過することが可能であることを意味する。または、膜に遠心力を掛けた場合に、遠心力の方向に、膜の内部を溶液が通過することが可能であることを意味する。
本発明の核酸吸着性多孔性膜は、イオン結合が実質的に関与しない相互作用で核酸が吸着する多孔性膜であることを特徴とする。これは、多孔性膜側の使用条件で「イオン化」していないことを意味し、環境の極性を変化させることで、核酸と多孔性膜が引き合うようになると推定される。これにより分離性能に優れ、しかも洗浄効率よく、核酸を単離精製することができる。好ましくは、核酸吸着性多孔性膜は、親水基を有する多孔性膜であり、環境の極性を変化させることで、核酸と多孔性膜の親水基同士が引きあるようになると推定される。ここで、親水基を有する多孔性膜とは、多孔性膜を形成する材料自体が親水基を有する多孔性膜、または多孔性膜を形成する材料を処理もしくはコーティングすることによって親水基を導入した多孔性膜を意味する。
多孔性膜を形成する材料は有機物、無機物のいずれでも良い。核酸吸着性多孔性膜としては、例えば、多孔性膜を形成する材料自体が親水基を有する有機材料である多孔性膜、親水基を持たない有機材料の多孔性膜を処理して親水基を導入した多孔性膜、親水基を持たない有機材料の多孔性膜に対し親水基を有する材料でコーティングして親水基を導入した多孔性膜、多孔性膜を形成する材料自体が親水基を有する無機材料である多孔性膜、親水基を持たない無機材料の多孔性膜を処理して親水基を導入した多孔性膜、親水基を持たない無機材料の多孔性膜に対し親水基を有する材料でコーティングして親水基を導入した多孔性膜等を使用することができるが、加工の容易性から、多孔性膜を形成する材料は有機ポリマーなどの有機材料を用いることが好ましい。
親水基とは、水との相互作用を持つことができる有極性の基（原子団）を指し、核酸の吸着に関与する全ての基（原子団）が当てはまる。親水基としては、水との相互作用の強さが中程度のもの（化学大事典、共立出版株式会社発行、「親水基」の項の「あまり親水性の強くない基」参照）が良く、例えば、水酸基、カルボキシル基、シアノ基、オキシエチレン基などを挙げることができる。親水性基は、好ましくは水酸基である。
水酸基を有する有機材料の多孔性膜としては、ポリヒドロキシエチルアクリル酸、ポリヒドロキシエチルメタアクリル酸、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリオキシエチレン、アセチルセルロース、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物などで、形成された多孔性膜を挙げることができるが、多糖構造を有する有機ポリマーの多孔性膜を好ましく使用することができる。
多糖構造を有する有機ポリマーとしては、セルロース、ヘミセルロース、デキストラン、アガロース、デキストリン、アミロース、アミロペクチン、デンプン、グリコーゲン、プルラン、マンナン、グルコマンナン、リケナン、イソリケナン、ラミナラン、カラギーナン、キシラン、フルクタン、アルギン酸、ヒアルロン酸、コンドロイチン、キチン、キトサン等を好ましく用いることができるが、多糖構造およびその誘導体であれば前記に挙げた材料に限定されることはない。また、前記いずれかの多糖構造のエステル誘導体についても好ましく用いることができる。また、前記いずれかの多糖構造のエステル誘導体の鹸化物についてもさらに好ましく用いることができる。
前記いずれかの多糖構造のエステル誘導体のエステルとしては、カルボン酸エステル、硝酸エステル、硫酸エステル、スルホン酸エステル、リン酸エステル、ホスホン酸エステル、ピロリン酸エステルのいずれか一つ以上から選ばれることが好ましい。また、前記いずれかの多糖構造の、カルボン酸エステル、硝酸エステル、硫酸エステル、スルホン酸エステル、リン酸エステル、ホスホン酸エステル、ピロリン酸エステルの鹸化物についてもさらに好ましく用いることができる。
前記カルボン酸エステルとしては、アルキルカルボニルエステル、アルケニルカルボニルエステル、芳香族カルボニルエステル、芳香族アルキルカルボニルエステルのいずれか一つ以上から選ばれることが好ましい。また、前記いずれかの多糖構造のアルキルカルボニルエステル、アルケニルカルボニルエステル、芳香族カルボニルエステル、芳香族アルキルカルボニルエステルの鹸化物についてもさらに好ましく用いることができる。
前記アルキルカルボニルエステルのエステル基としては、アセチル基、プロピオニル基、ブチロイル基、バレル基、ペプタノイル基、オクタノイル基、デカノイル基、ドデカノイル基、トリデカノイル基、ヘキサデカノイル基、又は、オクタデカノイル基を有するエステル基のうち、いずれか一つ以上から選ばれることが好ましい。また、前記アセチル基、プロピオニル基、ブチロイル基、バレル基、ペプタノイル基、オクタノイル基、デカノイル基、ドデカノイル基、トリデカノイル基、ヘキサデカノイル基、オクタデカノイル基のいずれか一つ以上から選ばれるエステル基を持つ前記いずれかの多糖構造の鹸化物についてもさらに好ましく用いることができる。
前記アルケニルカルボニルエステルのエステル基としては、アクリル基又はメタクリル基を有するエステル基であることが好ましい。また、前記アクリル基、メタクリル基のいずれか一つ以上から選ばれるエステル基を持つ前記いずれかの多糖構造の鹸化物についてもさらに好ましく用いることができる。
前記芳香族カルボニルエステルのエステル基がベンゾイル基又はナフタロイル基を有するエステル基であることが好ましい。また、前記ベンゾイル基、ナフタロイル基の少なくとも一つ以上から選ばれるエステル基を持つ前記いずれかの多糖構造の鹸化物についてもさらに好ましく用いることができる。
前記硝酸エステルとしては、ニトロセルロース、ニトロヘミセルロース、ニトロデキストラン、ニトロアガロース、ニトロデキストリン、ニトロアミロース、ニトロアミロペクチン、ニトログリコーゲン、ニトロプルラン、ニトロマンナン、ニトログルコマンナン、ニトロリケナン、ニトロイソリケナン、ニトロラミナラン、ニトロカラギーナン、ニトロキシラン、ニトロフルクタン、ニトロアルギン酸、ニトロヒアルロン酸、ニトロコンドロイチン、ニトロキチン、ニトロキトサンなどを好ましく用いることができる。
また、前記、ニトロセルロース、ニトロヘミセルロース、ニトロデキストラン、ニトロアガロース、ニトロデキストリン、ニトロアミロース、ニトロアミロペクチン、ニトログリコーゲン、ニトロプルラン、ニトロマンナン、ニトログルコマンナン、ニトロリケナン、ニトロイソリケナン、ニトロラミナラン、ニトロカラギーナン、ニトロキシラン、ニトロフルクタン、ニトロアルギン酸、ニトロヒアルロン酸、ニトロコンドロイチン、ニトロキチン、ニトロキトサンなどの鹸化物についてもさらに好ましく用いることができる。
前記硫酸エステルとしては、セルロース硫酸、ヘミセルロース硫酸、デキストラン硫酸、アガロース硫酸、デキストリン硫酸、アミロース硫酸、アミロペクチン硫酸、グリコーゲン硫酸、プルラン硫酸、マンナン硫酸、グルコマンナン硫酸、リケナン硫酸、イソリケナン硫酸、ラミナラン硫酸、カラギーナン硫酸、キシラン硫酸、フルクタン硫酸、アルギン酸硫酸、ヒアルロン酸硫酸、コンドロイチン硫酸、キチン硫酸、キトサン硫酸などを好ましく用いることができる。また、前記、セルロース硫酸、ヘミセルロース硫酸、デキストラン硫酸、アガロース硫酸、デキストリン硫酸、アミロース硫酸、アミロペクチン硫酸、グリコーゲン硫酸、プルラン硫酸、マンナン硫酸、グルコマンナン硫酸、リケナン硫酸、イソリケナン硫酸、ラミナラン硫酸、カラギーナン硫酸、キシラン硫酸、フルクタン硫酸、アルギン酸硫酸、ヒアルロン酸硫酸、コンドロイチン硫酸、キチン硫酸、キトサン硫酸などの鹸化物についてもさらに好ましく用いることができる。
前記スルホン酸エステルとしては、アルキルスルホン酸エステル、アルケニルスルホン酸エステル、芳香族スルホン酸エステル、芳香族アルキルスルホン酸エステルのいずれか一つ以上から選ばれることが好ましい。また、前記いずれかの多糖構造のアルキルスルホン酸エステル、アルケニルスルホン酸エステル、芳香族スルホン酸エステル、芳香族アルキルスルホン酸エステルの鹸化物についてもさらに好ましく用いることができる。
前記リン酸エステルとしては、セルロースリン酸、ヘミセルロースリン酸、デキストランリン酸、アガロースリン酸、デキストリンリン酸、アミロースリン酸、アミロペクチンリン酸、グリコーゲンリン酸、プルランリン酸、マンナンリン酸、グルコマンナンリン酸、リケナンリン酸、イソリケナンリン酸、ラミナランリン酸、カラギーナンリン酸、キシランリン酸、フルクタンリン酸、アルギン酸リン酸、ヒアルロン酸リン酸、コンドロイチンリン酸、キチンリン酸、キトサンリン酸などを好ましく用いることができる。また、前記、セルロースリン酸、ヘミセルロースリン酸、デキストランリン酸、アガロースリン酸、デキストリンリン酸、アミロースリン酸、アミロペクチンリン酸、グリコーゲンリン酸、プルランリン酸、マンナンリン酸、グルコマンナンリン酸、リケナンリン酸、イソリケナンリン酸、ラミナランリン酸、カラギーナンリン酸、キシランリン酸、フルクタンリン酸、アルギン酸リン酸、ヒアルロン酸リン酸、コンドロイチンリン酸、キチンリン酸、キトサンリン酸などの鹸化物についてもさらに好ましく用いることができる。
前記ホスホン酸エステルとしては、セルロースホスホン酸、ヘミセルロースホスホン酸、デキストランホスホン酸、アガロースホスホン酸、デキストリンホスホン酸、アミロースホスホン酸、アミロペクチンホスホン酸、グリコーゲンホスホン酸、プルランホスホン酸、マンナンホスホン酸、グルコマンナンホスホン酸、リケナンホスホン酸、イソリケナンホスホン酸、ラミナランホスホン酸、カラギーナンホスホン酸、キシランホスホン酸、フルクタンホスホン酸、アルギン酸ホスホン酸、ヒアルロン酸ホスホン酸、コンドロイチンホスホン酸、キチンホスホン酸、キトサンホスホン酸などを好ましく用いることができる。また、前記、セルロースホスホン酸、ヘミセルロースホスホン酸、デキストランホスホン酸、アガロースホスホン酸、デキストリンホスホン酸、アミロースホスホン酸、アミロペクチンホスホン酸、グリコーゲンホスホン酸、プルランホスホン酸、マンナンホスホン酸、グルコマンナンホスホン酸、リケナンホスホン酸、イソリケナンホスホン酸、ラミナランホスホン酸、カラギーナンホスホン酸、キシランホスホン酸、フルクタンホスホン酸、アルギン酸ホスホン酸、ヒアルロン酸ホスホン酸、コンドロイチンホスホン酸、キチンホスホン酸、キトサンホスホン酸などの鹸化物についてもさらに好ましく用いることができる。
前記ピロリン酸エステルとしては、セルロースピロリン酸、ヘミセルロースピロリン酸、デキストランピロリン酸、アガロースピロリン酸、デキストリンピロリン酸、アミロースピロリン酸、アミロペクチンピロリン酸、グリコーゲンピロリン酸、プルランピロリン酸、マンナンピロリン酸、グルコマンナンピロリン酸、リケナンピロリン酸、イソリケナンピロリン酸、ラミナランピロリン酸、カラギーナンピロリン酸、キシランピロリン酸、フルクタンピロリン酸、アルギン酸ピロリン酸、ヒアルロン酸ピロリン酸、コンドロイチンピロリン酸、キチンピロリン酸、キトサンピロリン酸などを好ましく用いることができる。また、前記、セルロースピロリン酸、ヘミセルロースピロリン酸、デキストランピロリン酸、アガロースピロリン酸、デキストリンピロリン酸、アミロースピロリン酸、アミロペクチンピロリン酸、グリコーゲンピロリン酸、プルランピロリン酸、マンナンピロリン酸、グルコマンナンピロリン酸、リケナンピロリン酸、イソリケナンピロリン酸、ラミナランピロリン酸、カラギーナンピロリン酸、キシランピロリン酸、フルクタンピロリン酸、アルギン酸ピロリン酸、ヒアルロン酸ピロリン酸、コンドロイチンピロリン酸、キチンピロリン酸、キトサンピロリン酸などの鹸化物についてもさらに好ましく用いることができる。
前記いずれかの多糖構造のエーテル誘導体としては、メチルセルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシエチルセルロース、カルボキシエチル−カルバモイルエチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルメチルセルロース、シアノエチルセルロース、カルバモイルエチルセルロース等を用いることができるが、これらに限定されることはない。好ましくは、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロースを用いることができる。
前記いずれかの多糖構造の水酸基が、任意の置換度でハロゲン化したものについても好ましく用いることができる。
多糖構造を有する有機ポリマーからなる多孔性膜としては、アセチルセルロースが好ましく、更にアセチル価の異なるアセチルセルロース混合物からなる有機ポリマーの多孔性膜を使用することができる。アセチル価の異なるアセチルセルロース混合物としては、トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースとの混合物、トリアセチルセルロースとモノアセチルセルロースとの混合物、トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースとモノアセチルセルロースとの混合物、ジアセチルセルロースとモノアセチルセルロースとの混合物を好ましく使用することができる。特に、トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースとの混合物を好ましく使用することができる。トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースの混合比（質量比）は、９９：１〜１：９９であることが好ましく、９０：１０〜５０：５０であることがより好ましい。
特に好ましい、アセチルセルロースからなる多孔性膜としては、特開２００３−１２８６９１号公報に記載の、アセチルセルロースの表面鹸化物からなる多孔性膜が挙げられる。アセチルセルロースの表面鹸化物とは、アセチルセルロースまたはアセチル価の異なるアセチルセルロース混合物を鹸化処理したものであり、トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースとの混合物の鹸化物、トリアセチルセルロースとモノアセチルセルロースとの混合物の鹸化物、トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースとモノアセチルセルロースとの混合物の鹸化物、ジアセチルセルロースとモノアセチルセルロースとの混合物の鹸化物も好ましく使用することができる。より好ましくは、トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースとの混合物の鹸化物を使用することである。トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースとの混合物の混合比（質量比）は、９９：１〜１：９９であることが好ましい。更に好ましくは、トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースとの混合物の混合比は、９０：１０〜５０：５０であることである。この場合、鹸化処理の程度（鹸化率）で固相表面の水酸基の量（密度）をコントロールすることができる。核酸の分離効率をあげるためには、水酸基の量（密度）が多い方が好ましい。鹸化処理により得られる多孔性膜の鹸化率（表面鹸化率）が５％以上１００％以下であることが好ましく、１０％以上１００％以下であることが更に好ましい。
また、上記のアセチルセルロースの表面鹸化物からなる核酸吸着性多孔性膜は、鹸化処理の前に比べて鹸化処理の後で、平均孔径が減少している多孔性膜であることが好ましい。鹸化処理の前に対する鹸化処理の後の平均孔径の比が０．８以下の多孔性膜であることが好ましく、０．５以下の多孔性膜であることが更に好ましい。
ここで、鹸化処理とは、アセチルセルロースを鹸化処理液（例えば水酸化ナトリウム水溶液）に接触させることを言う。これにより、鹸化処理液に接触したアセチルセルロースの部分は、再生セルロースとなり水酸基が導入される。こうして作製された再生セルロースは、本来のセルロースとは、結晶状態等の点で異なっている。本発明において多孔性膜として、再生セルロースの多孔性膜を用いることが好ましい。
また、鹸化率を変えるには、水酸化ナトリウムの濃度を変えて鹸化処理を行えば良い。鹸化率は、ＮＭＲ、ＩＲ又はＸＰＳによりにより、容易に測定することができる（例えば、カルボニル基のピーク減少の程度で定めることができる）。
親水基を持たない有機材料の多孔性膜に親水基を導入するには、ポリマー鎖の末端または側鎖に親水基を有するグラフトポリマー鎖を多孔性膜に結合することにより行うことができる。
有機材料の多孔性膜にグラフトポリマー鎖を結合する方法としては、多孔性膜とグラフトポリマー鎖とを化学結合させる方法と、多孔性膜を起点として重合可能な二重結合を有する化合物を重合させグラフトポリマー鎖を形成する２つの方法がある。
まず、多孔性膜とグラフトポリマー鎖とを化学結合にて付着させる方法においては、ポリマー鎖の末端または側鎖に多孔性膜と反応する官能基を有するポリマーを使用し、この官能基と、多孔性膜の官能基とを化学反応させることでグラフトさせることができる。多孔性膜と反応する官能基としては、多孔性膜の官能基と反応し得るものであれば特に限定はないが、例えば、アルコキシシランのようなシランカップリング基、イソシアネート基、アミノ基、水酸基、カルボキシル基、スルホン酸基、リン酸基、エポキシ基、アリル基、メタクリロイル基、アクリロイル基等を挙げることができる。
ポリマー鎖の末端または側鎖に反応性官能基を有するポリマーとして特に有用な化合物は、トリアルコキシシリル基をポリマー末端に有するポリマー、アミノ基をポリマー末端に有するポリマー、カルボキシル基をポリマー末端に有するポリマー、エポキシ基をポリマー末端に有するポリマー、イソシアネート基をポリマー末端に有するポリマーが挙げられる。この時に使用されるポリマーとしては、核酸の吸着に関与する親水基を有するものであれば特に限定はないが、具体的には、ポリヒドロキシエチルアクリル酸、ポリヒドロキシエチルメタアクリル酸及びそれらの塩、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸及びそれらの塩、ポリオキシエチレンなどを挙げることができる。
多孔性膜を基点として重合可能な二重結合を有する化合物を重合させ、グラフトポリマー鎖を形成する方法は、一般的には表面グラフト重合と呼ばれる。表面グラフト重合法とは、プラズマ照射、光照射、加熱などの方法で基材表面上に活性種を与え、多孔性膜と接するように配置された重合可能な二重結合を有する化合物を重合によって多孔性膜と結合させる方法を指す。
基材に結合しているグラフトポリマー鎖を形成するのに有用な化合物は、重合可能な二重結合を有しており、核酸の吸着に関与する親水基を有するという、２つの特性を兼ね備えていることが必要である。これらの化合物としては、分子内に二重結合を有していれば、親水基を有するポリマー、オリゴマー、モノマーのいずれの化合物をも用いることができる。特に有用な化合物は親水基を有するモノマーである。
特に有用な親水基を有するモノマーの具体例としては、次のモノマーを挙げることができる。例えば、２−ヒドロキシエチルアクリレート、２−ヒドロキシエチルメタクリレート、グリセロールモノメタクリレート等の水酸性基含有モノマーを特に好ましく用いることができる。また、アクリル酸、メタアクリル酸等のカルボキシル基含有モノマー、もしくはそのアルカリ金属塩及びアミン塩も好ましく用いることができる。
親水基を持たない有機材料の多孔性膜に親水基を導入する別の方法としては、親水基を有する材料をコーティングすることができる。コーティングに使用する材料は、核酸の吸着に関与する親水基を有するものであれば特に限定はないが、作業の容易さから有機材料のポリマーが好ましい。ポリマーとしては、ポリヒドロキシエチルアクリル酸、ポリヒドロキシエチルメタアクリル酸及びそれらの塩、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸及びそれらの塩、ポリオキシエチレン、アセチルセルロース、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物などを挙げることができるが、多糖構造を有するポリマーが好ましい。
また、親水基を持たない有機材料の多孔性膜に、アセチルセルロースまたは、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物をコーティングした後に、コーティングしたアセチルセルロースまたは、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物を鹸化処理することもできる。この場合、鹸化率が約５％以上であることが好ましい。さらには、鹸化率が約１０％以上であることが好ましい。
親水基を有する無機材料である多孔性膜としては、シリカ化合物を含有する多孔性膜を挙げることができる。シリカ化合物を含有する多孔性膜としては、ガラスフィルターを挙げることができる。また、特許公報第３０５８３４２号に記載されているような、多孔質のシリカ薄膜を挙げることができる。この多孔質のシリカ薄膜とは、二分子膜形成能を有するカチオン型の両親媒性物質の展開液を基板上に展開した後、基板上の液膜から溶媒を除去することによって両親媒性物質の多層二分子膜薄膜を調整し、シリカ化合物を含有する溶液に多層二分子膜薄膜を接触させ、次いで前記多層二分子膜薄膜を抽出除去することで作製することができる。
親水基を持たない無機材料の多孔性膜に親水基を導入する方法としては、多孔性膜とグラフトポリマー鎖とを化学結合させる方法と、分子内に二重結合を有している親水基を有するモノマーを使用して、多孔性膜を起点として、グラフトポリマー鎖を重合する２つの方法がある。
多孔性膜とグラフトポリマー鎖とを化学結合にて付着させる場合は、グラフトポリマー鎖として末端または側鎖に多孔性膜と反応する官能基を有するポリマーを使用し、この官能基と反応する官能基を無機材料に導入し、そこにグラフトポリマーを化学結合させる。また、分子内に二重結合を有している親水基を有するモノマーを使用して、多孔性膜を起点として、グラフトポリマー鎖を重合する場合は、二重結合を有する化合物を重合する際の起点となる官能基を無機材料に導入する。親水基を持つグラフトポリマー、および分子内に二重結合を有している親水基を有するモノマーとしては、上記、親水基を持たない有機材料の多孔性膜とグラフトポリマー鎖とを化学結合させる方法において記載した、親水基を持つグラフトポリマー、および分子内に二重結合を有している親水基を有するモノマーを好ましく使用することができる。
親水基を持たない無機材料の多孔性膜に親水基を導入する別の方法としては、親水基を有する材料をコーティングする方法がある。コーティングに使用する材料は、核酸の吸着に関与する親水基を有するものであれば特に限定はないが、作業の容易さから有機材料のポリマーが好ましい。ポリマーとしては、ポリヒドロキシエチルアクリル酸、ポリヒドロキシエチルメタアクリル酸及びそれらの塩、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸及びそれらの塩、ポリオキシエチレン、アセチルセルロース、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物などを挙げることができる。
また、親水基を持たない無機材料の多孔性膜に、アセチルセルロースまたは、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物をコーティングした後に、コーティングしたアセチルセルロースまたは、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物を鹸化処理することもできる。この場合、鹸化率が約５％以上であることが好ましい。さらには、鹸化率が約１０％以上であることが好ましい。
親水基を持たない無機材料の多孔性膜としては、アルミニウム等の金属、ガラス、セメント、陶磁器等のセラミックス、もしくはニューセラミックス、シリコン、活性炭等を加工して作製した多孔性膜を挙げることができる。
核酸吸着性多孔性膜の厚さは、１０μｍ〜５００μｍであることが好ましい。さらに好ましくは、厚さが５０μｍ〜２５０μｍである。核酸吸着性多孔性膜の洗浄がし易い点で、厚さが薄いほど好ましい。
また、核酸吸着性多孔性膜としては、平均孔径が０．９〜５．０μｍの多孔性膜を用いることができる。更に好ましくは、平均孔径が１．５〜３．５μｍの多孔性膜を用いることができる。これにより、核酸が吸着するのに十分な表面積が得られるとともに、目詰まりし難い。この溶液が内部を通過可能な多孔性膜の平均孔径は、バブルポイント法(ASTMF316-86、JIS K3832準拠)を用いて決定することができる。
核酸吸着性多孔性膜は、表裏対称性の多孔性膜でも表裏非対称性の多孔性膜でもよいが、表裏非対称性の多孔性膜であることが好ましい。ここで、表裏非対称性とは、多孔性膜の一方の面から他方の面へと膜の物理的性質または化学的性質が変化している性質を示す。膜の物理的性質の例としては、平均孔径が挙げられる。また、膜の化学的性質の例としては鹸化度が挙げられる。
平均孔径が表裏非対称性の多孔性膜を本発明で使用する場合は、液の通過する方向に平均孔径が、大→小に変化するようにするのが好ましい。ここで、最大孔径と最小孔径の比が２以上である多孔性膜を用いることが好ましい。さらに好ましくは、最大孔径と最小孔径の比が５以上である。これにより、核酸が吸着するのに十分な表面積が得られるとともに、目詰まりし難い。
また、核酸吸着性多孔性膜としては、空隙率が５０〜９５％である多孔性膜を用いることができる。さらに好ましくは、空隙率が６５〜８０％である多孔性膜を用いることができる。また、溶液が内部を通過可能な核酸吸着性多孔性膜としては、バブルポイントが、０．１〜１０ｋｇｆ／ｃｍ2である多孔性膜を用いることができる。さらに好ましくは、バブルポイントが、０．２〜４ｋｇｆ／ｃｍ2である多孔性膜を用いることができる。
核酸吸着性多孔性膜としては、圧力損失が、０．１〜１００ｋＰａである多孔性膜を用いることが好ましい。これにより、過圧時に均一な圧力が得られる。さらに好ましくは、圧力損失が、０．５〜５０ｋＰａである多孔性膜を用いることができる。ここで、圧力損失とは、膜の厚さ１００μｍあたり、水を通過させるのに必要な最低圧力である。
核酸吸着性多孔性膜としては、また、２５℃で１ｋｇ／ｃｍ2の圧力で水を通過させたときの透水量が、膜１ｃｍ2あたり１分間で１〜５０００ｍＬである多孔性膜を用いることができる。さらに好ましくは、２５℃で１ｋｇ／ｃｍ2の圧力で水を通過させたときの透水量が、膜１ｃｍ2あたり１分間で５〜１０００ｍＬである多孔性膜を用いることができる。
核酸吸着性多孔性膜としては、多孔性膜１ｍｇあたりの核酸の吸着量が０．１μｇ以上である多孔性膜を好ましく使用することができる。さらに好ましくは、多孔性膜1ｍｇあたりの核酸の吸着量が０．９μｇ以上である多孔性膜を用いることができる。
核酸吸着性多孔性膜としては、一辺が５ｍｍの正方形の多孔性膜をトリフルオロ酢酸５ｍＬに浸漬したときに、１時間以内では溶解しないが４８時間以内に溶解するセルロース誘導体からなる多孔性膜を好ましく使用することができる。また、一辺が５ｍｍの正方形の多孔質膜をトリフルオロ酢酸５ｍＬに浸漬したときに１時間以内に溶解するが、ジクロロメタン５ｍＬに浸漬したときには２４時間以内に溶解しないセルロース誘導体からなる多孔性膜を好ましく使用することができる。
核酸吸着性多孔性膜中を、核酸を含む試料溶液を通過させる場合、試料溶液を一方の面から他方の面へと通過させることが、液を多孔性膜へ均一に接触させることができる点で、好ましい。核酸吸着性多孔性膜中を、核酸を含む試料溶液を通過させる場合、試料溶液を核酸吸着性多孔性膜の孔径が大きい側から小さい側に通過させることが、目詰まりし難い点で、好ましい。
核酸を含む試料溶液を核酸吸着性多孔性膜を通過させる場合の流速は、液の多孔性膜への適切な接触時間を得るために、膜の単位面積（ｃｍ2）あたり、２〜１５００μＬ/secであることが好ましい。液の多孔性膜への接触時間が短すぎると十分な分離精製効果が得られず、長すぎると操作性の点から好ましくない。さらに、上記流速は、膜の単位面積（ｃｍ2）あたり、５〜７００μＬ/secであることが好ましい。
また、使用する溶液が内部を通過可能な核酸吸着性多孔性膜は、１枚であってもよいが、複数枚を使用することもできる。複数枚の核酸吸着性多孔性膜は、同一のものであっても、異なるものであって良い。
少なくとも二個の開口を有する容器内に、上記のような溶液が内部を通過可能な核酸吸着性多孔性膜を収容した核酸分離精製カートリッジを好ましく使用することができる。また、少なくとも二個の開口を有する容器内に、上記のような溶液が内部を通過可能な核酸吸着性多孔性膜を複数枚収容した核酸分離精製カートリッジを好ましく使用することができる。この場合、少なくとも二個の開口を有する容器内に収容される複数枚の核酸吸着性多孔性膜は、同一のものであっても、異なるものであって良い。
複数枚の核酸吸着性多孔性膜は、無機材料の核酸吸着性多孔性膜と有機材料の核酸吸着性多孔性膜との組合せであっても良い。例えば、ガラスフィルターと再生セルロースの多孔性膜との組合せを挙げることができる。また、複数枚の核酸吸着性多孔性膜は、無機材料の核酸吸着性多孔性膜と有機材料の核酸非吸着性多孔性膜との組合せであってもよい、例えば、ガラスフィルターと、ナイロンまたはポリスルホンの多孔性膜との組合せを挙げることができる。
上記の各々の溶液が内部を通過可能な核酸吸着性多孔性膜を収容する核酸分離精製カートリッジを用いて、以下の工程で核酸を分離精製することができる。
すなわち、(a)核酸を含む試料溶液を、少なくとも二個の開口を有する容器内に、溶液が内部を通過可能な、核酸吸着性多孔性膜を収容した核酸分離精製カートリッジの一の開口に注入する工程、(b)核酸分離精製カートリッジの他の開口に結合された圧力差発生装置を用いて核酸分離精製カートリッジト内を加圧状態にし、注入した核酸を含む試料溶液を、核酸吸着性多孔性膜を通過させ、核酸分離精製カートリッジの上記他の開口より排出することによって、核酸吸着性多孔性膜内に核酸を吸着させる工程、(c)核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に洗浄液を注入する工程、(d)核酸分離精製カートリッジの上記他の開口に結合された圧力差発生装置を用いて核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にし、注入した洗浄液を、核酸吸着性多孔性膜を通過させ、上記他の開口より排出することによって、核酸吸着性多孔性膜を、核酸が吸着した状態で、洗浄する工程、(e)核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に回収液を注入する工程、(f)核酸分離精製カートリッジの上記他の開口に結合された圧力差発生装置を用いて核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にし、注入した回収液を、核酸吸着性多孔性膜を通過させ、上記他の開口より排出することによって、核酸吸着性多孔性膜内から核酸を脱着させ、核酸分離精製カートリッジ容器外に排出する工程を挙げることができる。
また、上記のような核酸分離精製カートリッジに、少なくとも洗浄液及び回収液を含む複数の試薬を組み合わせて、核酸分離精製キットとすることができる。該試薬には、核酸可溶化試薬、緩衝剤、塩、水溶性有機溶媒等が含まれていてもよい。
以下、洗浄工程について説明する。洗浄を行うことにより、核酸の回収量及び純度が向上し、必要な核酸を含む検体の量を微量とすることができる。また、洗浄や回収操作を自動化することによって、操作を簡便かつ迅速に行うことが可能になる。洗浄工程は、迅速化のためには１回の洗浄で済ませることが好ましい。また、純度がより重要な場合には複数回洗浄を繰り返すことが好ましい。
また、本発明に係る核酸吸着性多孔性膜を利用することで、以下の（１）〜（３）のように洗浄工程を簡素化することができる。（１）洗浄液が核酸吸着性多孔性膜を通過する回数を１回とすることができる、（２）洗浄工程を室温でできる。（３）洗浄後、直ちに回収液をカートリッジに注入することができる。前記（１）、（２）、（３）のすべてを用いることが操作の簡易・迅速化の点で優れているが、いずれか１つもしくは２つでも効果は認められる。従来法においては、洗浄液中に含まれる有機溶媒を迅速に取り除くため、しばしば乾燥工程を必要としたが、本発明に係る核酸吸着性多孔性膜は薄膜であるためにこれを省略できるからである。
洗浄工程における洗浄液の液量は、２μｌ/ｍｍ2以上が好ましい。洗浄液量が多量であれば洗浄効果は向上するが、操作性を保ち、試料の流出を抑止するためには、２００μｌ/ｍｍ2以下が好ましい。
洗浄工程において、洗浄液を核酸吸着性多孔性膜を通過させる場合の流速は、膜の単位面積（ｃｍ2）あたり、２〜１５００μＬ/secであることが好ましく、５〜７００μＬ/secであることがより好ましい。通過速度を下げて時間を掛ければ洗浄がそれだけ十分に行なわれることになるが、核酸の分離精製操作の迅速化も重要であるので上記した範囲が選択される。
洗浄工程において、洗浄液の液温は４〜７０℃であることが好ましい。さらには、洗浄液の液温を室温とすることがより好ましい。
また洗浄工程において、その核酸分離精製カートリッジを器械的な振動や超音波による攪拌を与えながら、または遠心分離により洗浄することもできる。
洗浄工程において、洗浄液には、一般的には核酸分解酵素のような酵素を含ませないが、タンパク質等の夾雑物質を分解する酵素を含ませることができる。また、場合によってはＤＮＡ分解酵素、ＲＮＡ分解酵素などを含ませることもできる。ＤＮＡ分解酵素を含む洗浄液を使用することにより、検体中のＲＮＡのみを選択的に回収することができる。逆に、ＲＮＡ分解酵素を含む洗浄液を使用することにより、検体中のＤＮＡのみを選択的に回収することができる。
洗浄工程において、洗浄液は、水溶性有機溶媒及び/または水溶性塩を含んでいる溶液であることが好ましい。洗浄液は、核酸吸着性多孔性膜に核酸と共に吸着した試料溶液中の不純物を洗い流す機能を有する必要がある。そのためには、核酸吸着性多孔性膜から核酸は脱着させないが不純物は脱着させる組成であることが必要である。この目的には、アルコール等の水溶性有機溶媒が核酸が難溶性であるので、核酸を保持したまま核酸以外の成分を脱着させるのに適している。また、水溶性塩を添加することにより、核酸の吸着効果が高まるので、不要成分の選択的除去作用が向上する。
洗浄液に含まれる水溶性有機溶媒としては、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ｎ−イソプロパノール、ブタノール、アセトンなどを用いることができ、中でもエタノ―ルを用いることが好ましい。洗浄液中に含まれる水溶性有機溶媒の量は、２０〜１００重量％であることが好ましく、４０〜８０重量％であることがより好ましい。
一方、洗浄液に含まれる水溶性塩は、ハロゲン化物の塩であることが好ましく、中でも塩化物が好ましい。また、水溶性塩は、一価または二価のカチオンであることが好ましく、特にアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩が好ましく、中でもナトリウム塩及びカリウム塩が好ましくナトリウム塩が最も好ましい。
水溶性塩が洗浄液中に含まれる場合、その濃度は１０ｍｍｏｌ／Ｌ以上であることが好ましく、その上限は不純物の溶解性を損なわない範囲であれば特に問わないが、１ｍｏｌ／Ｌ以下であることが好ましく、０．１ｍｏｌ／Ｌ以下であることがより好ましい。
とりわけ、水溶性塩が塩化ナトリウムであり、さらには、塩化ナトリウムが２０ｍｍｏｌ／Ｌ以上含まれていることが特に好ましい。
洗浄液は、カオトロッピク物質を含んでいないことが好ましい。それによって、洗浄工程に引き続く回収工程にカオトロピック物質が混入する可能性を減らすことができる。回収工程時に、カオトロピック物質が混入すると、しばしばＰＣＲ反応等の酵素反応を阻害するので、後の酵素反応等を考慮すると洗浄液にカオトロッピク物質を含まないことが理想的である。また、カオトロピック物質は、腐食性で有害であるので、この点でもカオトロピック物質を用いないで済むことは、実験者にとっても試験操作の安全上極めて有利である。
ここで、カオトロピック物質とは、前記したように、尿素、グアニジン塩、イソチアン酸ナトリウム、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウムなどである。
従来、核酸分離精製方法における洗浄工程の際、洗浄液がカートリッジなどの容器に対する濡れ性が高いため、しばしば洗浄液が容器中に残留することになり、洗浄工程に続く回収工程において洗浄液が混入して、このことが核酸の純度の低下や次工程における反応性の低下などの原因となっている。したがって、カートリッジなどの容器を用いて核酸の吸着及び脱着を行う場合、吸着、洗浄時に用いる液、特に洗浄液が、次の工程に影響を及ぼさないように、カートリッジ内に洗浄残液が残留しないことは重要である。
したがって、洗浄工程における洗浄液が次工程の回収液に混入することを防止して、洗浄液のカートリッジ内への残留を最小限に留めるため、洗浄液の表面張力を小さくすることが好ましい。表面張力を小さくすれば洗浄液とカートリッジの濡れ性が向上し、残留する液量を抑えることができる。
上記洗浄工程に用いる洗浄液は、洗浄の迅速化のためには、表面張力を３．５ｍＮ／ｍ（０．００３５Ｊ／ｍ2）以下であることが好ましく、より好ましくは表面張力が３．２ｍＮ／ｍ以下であり、さらに好ましくは２．８ｍＮ／ｍ以下である。低表面張力の洗浄液を用いることによって、多孔性膜内に残留する洗浄液の量を減量できて、洗浄を迅速化することができる。
残液が少ないと洗浄効率が高くなり、１回の洗浄ですませることが可能であり、この点でも核酸の分離精製操作を迅速化できる。
また、洗浄液の表面張力が低いために濡れ性がよいので、洗浄速度が速いことも加わって、核酸が吸着した核酸吸着性多孔性膜の洗浄液による洗浄の終了から回収液をカートリッジに注入するまでの時間も短縮できる。すなわち４０秒以内とすることが可能であり、２０秒以内としてもよく、更には５秒でも実用的な支障をきたさないで操作し得ることもある。
さらに、本発明に係る核酸吸着性多孔性膜と上記の低表面張力洗浄液を用いることによって残液量を低減できるので、洗浄工程から核酸を吸着した多孔性膜を乾燥することなく吸着した核酸を回収する工程に移ることができるので、この点でも操作の簡易化と迅速化が達せられる。
なお、表面張力の調整は、洗浄液の構成成分の種類と濃度によって行なうことができる。例えば、前記した水溶性有機溶媒の種類の選択と添加量の調節、水溶性塩化物の濃度の調節、さらには表面張力を下げるために前記核酸可溶化試験溶液に添加できるとして述べた界面活性剤を少量添加してもよい。
なお、従来の核酸分離精製において、洗浄工程の際、しばしば洗浄液が飛散し他に付着することによって、試料のコンタミネーション（汚染）が起きることが問題となっている。洗浄工程におけるこの種のコンタミネーションは、二個の開口を有する容器内に核酸吸着性多孔性膜を収容した核酸分離精製カートリッジと廃液容器の形状とを工夫することによって抑止することができる。
以下に核酸吸着性多孔性膜から核酸を脱着させて回収する工程について示す。
回収工程において、回収液は、チューブ、ピペット、又は自動注入装置、もしくはこれらと同じ機能をもつ供給手段を使用して、核酸吸着性多孔性膜を装着した核酸分離精製カートリッジへ供給される。回収液は、核酸分離精製カートリッジの一の開口（核酸を含む試料溶液を注入した開口）から供給され、上記一の開口とは異なる開口に結合された圧力差発生装置（例えばスポイド、注射器、真空ポンプ、パワーピペットなど）を用いて核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にして核酸吸着性多孔性膜を通過させ、一の開口と異なる開口より排出させることができる。さらには、回収液を一の開口から供給し、同じ一の開口より排出させることもできる。さらにまた、核酸分離精製カートリッジの核酸を含む試料溶液を供給した一の開口と異なる開口より回収液を供給し、排出させることも可能である。しかしながら、核酸分離精製カートリッジの一の開口から供給し、核酸吸着性多孔性膜を通過させ、一の開口と異なる開口より排出させる方法が回収効率が優れてより好ましい。
検体から調整した核酸を含む試料溶液の体積に対して、回収液の体積を調整して核酸の脱着を行うことができる。分離精製された核酸を含む回収液量は、そのとき使用する検体量による。一般的によく使われる回収液量は数１０から数１００μｌであるが、検体量が極微量である時や、逆に大量の核酸を分離精製したい場合には回収液量は１μｌから数１０ｍｌの範囲で変えることができる。
回収液としては好ましくは精製蒸留水、Ｔｒｉｓ／ＥＤＴＡバッファ等のバッファ水溶液が使用できる。また、回収した核酸をＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）に供する場合、ＰＣＲ反応において用いる緩衝溶液 (例えば、ＫＣｌ ５０ｍｍｏｌ／ｌ、Ｔｒｉｓ−Ｃｌ １０ｍｍｏｌ／ｌ、ＭｇＣｌ2 １．５ｍｍｏｌ／ｌを最終濃度とする水溶液)を用いることもできる。
回収液のｐＨは、ｐＨ２〜１１であることが好ましい。さらには、ｐＨ５〜９であることが好ましい。また特にイオン強度と塩濃度は吸着核酸の溶出に効果を及ぼす。回収液は、２９０ｍｍｏｌ／Ｌ以下のイオン強度であることが好ましく、さらには、９０ｍｍｏｌ／Ｌ以下の塩濃度であることが好ましい。こうすることで、核酸の回収率が向上し、より多くの核酸を回収できることができる。回収される核酸はＤＮＡでもＲＮＡでも、１本鎖でも２本鎖でも、および直鎖状でも環状でも良い。
回収液の体積を当初の核酸を含む試料溶液の体積と比較して少なくすることによって、濃縮された核酸を含む回収液を得ることができる。好ましくは、(回収液体積)：(試料溶液体積)＝１：１００〜９９：１００、更に好ましくは、(回収液体積)：(試料溶液体積)＝１：１０〜９：１０にすることができる。これにより核酸分離精製後工程において濃縮のための操作をすることなく、簡単に核酸を濃縮できる。これらの方法により検体よりも核酸が濃縮されている核酸溶液を得る方法を提供できる。
また別の方法としては、回収液の体積を当初の核酸を含む試料溶液よりも多い条件で核酸の脱着を行うことにより、希望の濃度の核酸を含む回収液を得ることができ、次工程（ＰＣＲなど）に適した濃度の核酸を含む回収液を得ることができる。好ましくは、(回収液体積)：(試料溶液体積)＝１：１〜５０：１、更に好ましくは、(回収液体積)：(試料溶液体積)＝１：１〜５：１にすることができる。これにより核酸分離精製後に濃度調整をする煩雑さがなくなるというメリットを得られる。更に、十分量の回収液を使用することにより、多孔性膜からの核酸回収率の増加を図ることができる。
また、目的に応じて回収液の温度を変化させることで簡便に核酸を回収することができる。例えば、回収液の温度を０〜１０℃にして多孔性膜からの核酸の脱着を行うことで、酵素による分解を防止する何らかの試薬や特別な操作を加えることなく核酸分解酵素の働きを抑制して、核酸の分解を防ぎ、簡便に、効率よく核酸溶液を得ることができる。
また、回収液の温度を１０〜３５℃とした場合、一般的な室温で核酸の回収を実施することができ、複雑な工程を必要とせずに核酸を脱着させて分離精製することができる。
また別の方法としては、回収液の温度を高温、例えば３５〜７０℃することで、多孔性膜からの核酸の脱着を煩雑な操作を経ず簡便に高い回収率で実施することができる。
回収液の注入回数は限定されるものではなく、１回でも複数回でもよい。通常、迅速、簡便に核酸を分離精製する場合は、１回の回収で実施するが、大量の核酸を回収する場合等複数回にわたり回収液を注入することができる。
回収工程においては、核酸の回収液をその後の後工程に使用できる組成にしておくことが可能である。分離精製された核酸は、しばしばＰＣＲ(ポリメラーゼ連鎖反応)法により増幅される。この場合、分離精製された核酸溶液はＰＣＲ法に適した前記の緩衝溶液で希釈することができる。回収液にＰＣＲ法に適した緩衝溶液を用いることで、その後のＰＣＲ工程へ簡便、迅速に移行することができ、好ましい。
また、回収工程において、核酸の回収液に回収した核酸の分解を防ぐための安定化剤を添加しておくことも可能である。安定化剤としては、抗菌剤、抗カヒ゛剤や核酸分解抑制剤などを添加することができる。核酸分解酵素の阻害剤としてはＥＤＴＡなどが上げられる。また別の実施態様として、回収容器にあらかじめ安定化剤を添加しておくこともできる。
また、回収工程で用いられる回収容器には特に限定はないが、２６０ｎｍの吸収が無い素材で作製された回収容器を用いることができる。この場合、回収した核酸溶液の濃度を、他の容器に移し替えずに測定できる。２６０ｎｍに吸収のない素材は、例えば石英ガラス等が上げられるがそれに限定されるものではない。
本発明の核酸分離精製方法では、好ましくは、少なくとも２個の開口を有する容器内に前記核酸吸着性多孔性膜を収容した核酸分離精製カートリッジを用いて核酸の吸着及び脱着を行うことができる。
図１に本発明に係る核酸分離精製カートリッジの一例を示す。図１に示す核酸分離精製カートリッジ１１は、上端に開口１１ｅを有する筒状本体１１ａの底部に核酸吸着性多孔性膜１１ｂが保持され、筒状本体１１ａの下方がロート状に形成され、下端中心部に細管ノズル状の排出部１１ｃが突出形成されている。図１に示す核酸分離精製カートリッジ１１は、筒状本体１１ａは上部と下部に分割され嵌着する構造となっている。
この核酸分離精製カートリッジ１１を用いて核酸の分離・精製を行うには、上端の開口１１ｅより前述の試料溶液、洗浄液、回収液を注入し、開口１１ｅ又は排出部１１ｃに圧力差発生装置を接続して筒状本体１１ａ内部を加圧状態又は減圧状態にして、各液を核酸吸着性多孔性膜１１ｂを通して、排出部１１ｃより核酸を排出することで行うことができる。
核酸分離精製カートリッジの容器の材料に特別な限定はなく、核酸吸着性多孔性膜を収容でき、かつ少なくとも２個の開口を設けることができればよい。製造の容易性からプラスチックが好ましい。例えば、ポリスチレン、ポリメタアクリル酸エステル、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、ナイロン、ポリカーボネート等の透明あるいは不透明のプラ スチックを用いるのが好ましい。また、生分解性の材料も好ましく使用することができる。
前記容器に収容される核酸吸着性多孔性膜の形状にも特別な限定は無く、円形、正方形、長方形、楕円、膜の場合には筒状、巻物状、あるいは表面に水酸基を有する有機高分子をコーティングしたビーズ等、任意の形状で良いが、製造適性の点からは、円、正方形、円筒状、巻物状等の対称性の高い形状又はビーズが好ましい。
容器の内容積は処理すべき試料溶液の量によって決めることが好ましく、通常、収容される核酸吸着性多孔性膜の体積で表す。即ち、厚さが約１ｍｍ以下（例えば、５０〜５００μｍ程度）で、直径が約２ｍｍ〜２０ｍｍの固相を１枚〜６枚程度収容する大きさとすることが好ましい。
また、核酸吸着性多孔性膜の容器に接する側の端面は、試料溶液等が通過しない程度に、容器の内壁面に密着させることが好ましい。
少なくとも２個の開口を有する容器の、核酸吸着性多孔性膜から見て、試料溶液等の入り口に使用される開口に対する側（容器内の核酸吸着性多孔性膜から開口側）は、容器の内壁に密着させずに空間を設け、試料溶液等が核酸吸着性多孔性膜の全面にできるだけ均等に拡散する構造にすることが好ましい。
核酸分離精製カートリッジとして、個々の核酸分離精製カートリッジを識別する手段を備えている核酸分離精製カートリッジを使用することができる。個々の核酸分離精製カートリッジを識別する手段としては、バーコード、磁気テープなどが挙げられる。
また、少なくとも二個の開口を有する容器内から核酸吸着性多孔性膜を容易に取り出すことが可能になっている構造を有した核酸分離精製カートリッジを使用することもできる。
［実施例１］
（１）核酸精製カートリッジの作製
内径７ｍｍ、核酸吸着性多孔性膜を収容する部分を持つ核酸分離精製カートリッジ用容器をハイインパクトポリスチレンで作製した。アセチル価の異なる２種のアセチルセルロースの混合物の核酸吸着性多孔性膜として、トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースの混合比が６：４の多孔性膜（膜厚＝７０μｍ、平均孔径＝１．２μｍ）を、核酸分離精製カートリッジ用容器の核酸吸着性多孔性膜を収容する部分に収容し、核酸分離精製カートリッジを作製した。
（２）ＲＮＡ可溶化試薬及び洗浄液の調製
表１に示す処方のＲＮＡ可溶化試薬溶液及び洗浄液を調製した。洗浄液の表面張力は、２５℃において３．０ｍＮ／ｍであった。
（３）核酸分離精製操作
ガン化人骨髄細胞（ＨＬ６０）培養液から細胞中の核酸の分離精製操作を下記の手順で行った。すなわち、この培養液を細胞数が１×１０6個になるよう採取し、５分間遠心分離操作を行い、細胞を沈殿させ上澄みを除き、細胞を得た。上記ＨＬ６０細胞（１×１０6個）にＲＮＡ可溶化試薬溶液２００μｌを添加して攪拌し、続いてエタノール２００μｌとプロテアーゼＫ（ＳＩＧＭＡ製）溶液２０μｌを添加して６０℃で１０分間インキュベートした。インキュベート後、エタノール２００μｌを加え、攪拌して、ＲＮＡを含む試料溶液を作製した。
該ＲＮＡを含む試料溶液を、上記（１）で作製した、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物の核酸吸着性多孔性膜を備えた、核酸分離精製カートリッジの一の開口に注入し、続いて上記一の開口に圧力発生装置（パワーピペット）を結合し、核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にし、注入した該ＲＮＡを含む試料溶液を、上記核酸吸着性多孔性膜に通過させることにより、上記核酸吸着性多孔性膜に接触させ、核酸分離精製カートリッジの他の開口より排出した。
続いて、上記核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に洗浄液を５００μＬ注入し、上記核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に圧力発生装置を結合し、核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にし、注入した洗浄液を、上記核酸吸着性多孔性膜に通過させ、他の開口より排出した。
続いて、上記核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に回収液を２００μＬ注入し、上記核酸分離精製カートリッジの上記一の開口に圧力発生装置を結合して、核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にし、注入した回収液を、上記核酸吸着性多孔性膜に通過させ、他の開口より排出し、この液を回収した。
（４）ＲＮＡの分離精製の確認
回収液を用いてアガロースゲル電気泳動を行った。その結果を図２に示す。図２は、実施例で回収された核酸試料とサイズマーカーλＨＩＮＤIIIを電気泳動して得られた図である（条件：ライフテクノロジー製、１質量％アガロース、１００V,３０分）。図２の結果からわかるように、アセチル価のことなるアセチルセルロースの混合物からなる核酸吸着性多孔性膜を備えた核酸分離精製カートリッジと、加圧装置を用いて、ＲＮＡを回収効率よく分離精製できる。
また、実施例１で得られた核酸の精製度を２６０ｎｍと２８０ｎｍの分光吸光度の比（A260/A280と記す）で示す。
表に示された核酸の精製度は、きわめて高いものであり、約５分の簡易な操作と装置とによって高純度核酸試料を得ることができた。
なお、実施例１における洗浄工程において、洗浄時間を２０秒ずつ続けて２回行なった以外は、実施例１と全く同じ操作を行い、実施例１と同じ方法で評価した核酸の分離精製結果は、実質的に実施例１と同等の純度（核酸の分離精製度）であり、本実施例の条件では、洗浄時間が２０秒で十分であり、かつ洗浄を２回繰り返す必要もないことが示された。したがって、本発明の方法によって簡易かつ迅速に核酸の精製が可能なことが示された。
本発明の核酸分離精製カートリッジの一例を示す斜視図である。 実施例で回収された核酸試料とサイズマーカーλＨＩＮＤIIIを電気泳動して得られた図である。
符号の説明
１１ 核酸分離精製カートリッジ
１１ｂ 核酸吸着性多孔性膜
１１ｃ 排出部（他方の開口）
１１ｅ 開口（一方の開口）

Claims (38)

  1. (1)核酸を含む試料溶液を核酸吸着性多孔性膜に通過させて、該核酸吸着性多孔性膜内に核酸を吸着させる工程、
    (2)洗浄液を該核酸吸着性多孔性膜に通過させて、核酸が吸着した状態で該核酸吸着性多孔性膜を洗浄する工程、及び
    (3)回収液を、該核酸吸着性多孔性膜に通過させて、該核酸吸着性多孔性膜内から核酸を脱着させる工程
    を含有する核酸の分離精製方法において、
    該核酸吸着性多孔性膜が、イオン結合が実質的に関与しない相互作用で核酸が吸着する多孔性膜であり、且つ、
    該洗浄工程と該回収工程との間に核酸を吸着した核酸吸着性多孔性膜を乾燥させる工程を含まないことを特徴とする核酸の分離精製方法。
  2. 前記洗浄液の表面張力が、３．５ｍＮ／ｍ以下である、請求項１に記載の核酸の分離精製方法。
  3. 前記(1)、(2)及び(3)の各工程において、前記核酸を含む試料溶液、洗浄液又は回収液を、加圧状態で核酸吸着性多孔性膜に通過させる、請求項１又は２に記載の核酸の分離精製方法。
  4. 前記(1)、(2)及び(3)の各工程において、少なくとも二個の開口を有する容器内に前記核酸吸着性多孔性膜を収容した核酸分離精製カートリッジの一の開口に、核酸を含む試料溶液、洗浄液又は回収液を注入し、該カートリッジの一の開口に結合された圧力差発生装置を用いてカートリッジ内を加圧状態にして、該注入した各液を通過させ、他の開口より排出させる、請求項１〜３のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
  5. 前記核酸が吸着した核酸吸着性多孔性膜に洗浄液を通過させて、該核酸吸着性多孔性膜を洗浄する回数が、１回である、請求項１〜４のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
  6. 前記核酸が吸着した核酸吸着性多孔性膜に洗浄液を通過させて、該核酸吸着性多孔性膜を洗浄する操作を、室温で行う、請求項１〜５のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
  7. 前記核酸吸着性多孔性膜が、多糖構造を有する有機ポリマーからなる多孔性膜である、請求項１〜６のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
  8. 前記多糖構造を有する有機ポリマーからなる多孔性膜が、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物からなる多孔性膜である、請求項７に記載の核酸の分離精製方法。
  9. 前記アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物が、トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースとの混合物である、請求項８に記載の核酸の分離精製方法。
  10. 前記トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースとの混合比（質量比）が、９９：１〜１：９９である、請求項９に記載の核酸の分離精製方法。
  11. 前記アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物が、トリアセチルセルロースとモノアセチルセルロースとの混合物である、請求項８に記載の核酸の分離精製方法。
  12. 前記アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物が、トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースとモノアセチルセルロースとの混合物である、請求項８に記載の核酸の分離精製方法。
  13. 前記アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物が、ジアセチルセルロースとモノアセチルセルロースとの混合物である、請求項８に記載の核酸の分離精製方法。
  14. 前記多糖構造を有する有機ポリマーからなる多孔性膜が、アセチルセルロースを鹸化処理した有機材料からなる多孔性膜である、請求項７に記載の核酸の分離精製方法。
  15. 前記アセチルセルロースの鹸化率が、５％以上である、請求項１４に記載の核酸の分離精製方法。
  16. 前記アセチルセルロースを鹸化処理した有機材料が、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物を鹸化処理した有機材料である、請求項１４に記載の核酸の分離精製方法。
  17. 前記アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物の鹸化率が、５％以上である、請求項１６に記載の核酸の分離精製方法。
  18. 前記アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物を鹸化処理した有機材料が、トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースとの混合物の鹸化物である、請求項１６または１７に記載の核酸の分離精製方法。
  19. 前記トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースとの混合比（質量比）が、９９：１〜１：９９である、請求項１８に記載の核酸の分離精製方法。
  20. 前記アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物を鹸化処理した有機材料が、トリアセチルセルロースとモノアセチルセルロースとの混合物の鹸化物である、請求項１６または１７に記載の核酸の分離精製方法。
  21. 前記アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物を鹸化処理した有機材料が、トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースとモノアセチルセルロースとの混合物の鹸化物である、請求項１６または１７に記載の核酸の分離精製方法。
  22. 前記アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物を鹸化処理した有機材料が、ジアセチルセルロースとモノアセチルセルロースとの混合物の鹸化物である、請求項１６または１７に記載の核酸の分離精製方法。
  23. 前記アセチルセルロースを鹸化処理した有機材料からなる多孔性膜が、鹸化処理後の平均孔径が鹸化処理前より減少している多孔性膜である、請求項１４〜２２のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
  24. 前記鹸化処理前の平均孔径に対する鹸化処理後の平均孔径の比が、０．８以下である、請求項２３に記載の核酸の分離精製方法。
  25. 前記核酸吸着性多孔膜が再生セルロースである、請求項１〜２４のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
  26. 前記核酸吸着性多孔性膜が、親水基を持たない有機材料を処理して親水基を導入した多孔性膜である、請求項１〜６のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
  27. 前記親水基を持たない有機材料の親水基の導入処理が、前記親水基を持たない有機材料に、親水基を有するグラフトポリマー鎖を結合する工程を含む、請求項２６に記載の核酸の分離精製方法。
  28. 前記核酸吸着性多孔性膜が、親水基を持たない有機材料を親水基を持つ材料でコーティングして親水基を導入した多孔性膜である、請求項１〜６のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
  29. 前記親水基を持つ材料が、親水基を有する有機ポリマーである、請求項２８に記載の核酸の分離精製方法。
  30. 前記核酸吸着性多孔性膜が、親水基を有する無機材料からなる多孔性膜である、請求項１〜６のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
  31. 前記核酸吸着性多孔性膜が、親水基を持たない無機材料を処理して親水基を導入した多孔性膜である、請求項１〜６のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
  32. 前記親水基を持たない無機材料の親水基の導入処理が、前記親水基を持たない無機材料に、親水基を有するグラフトポリマー鎖を結合する工程を含む、請求項３１に記載の核酸の分離精製方法。
  33. 前記核酸吸着性多孔性膜が、親水基を持たない無機材料を親水基を持つ材料でコーティングして親水基を導入した多孔性膜である、請求項１〜６のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
  34. 前記親水基を持つ材料が、親水基を有する有機ポリマーである、請求項３３に記載の核酸の分離精製方法。
  35. 前記親水基が水酸基である、請求項２６〜３４のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
  36. 前記核酸吸着性多孔性膜が表裏非対称性の多孔性膜である、請求項１〜３５のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
  37. 請求項１〜３６のいずれかに記載の核酸の分離精製方法を行うための、少なくとも二個の開口を有する容器内に、核酸吸着性多孔性膜を収容した核酸分離精製カートリッジ。
  38. 請求項１〜３６のいずれかに記載の核酸の分離精製方法を行うための核酸分離精製キットであって、少なくとも二個の開口を有する容器内に、核酸吸着性多孔性膜を収容した核酸分離精製カートリッジと、少なくとも洗浄液及び回収液を含む試薬と、を有する核酸分離精製キット。
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