CN104203272A - 复合抗原序列及疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及复合抗原，其包含具有来源于一种或多种病原体的多种抗原表位的邻接的氨基酸序列的肽，所述复合抗原在哺乳动物中诱导针对由所述一种或多种病原体的感染是保护性的免疫应答。此外，本发明涉及包含复合抗原的疫苗并涉及用于治疗和预防感染的方法。

Description

复合抗原序列及疫苗
相关申请的引用
本申请要求2012年1月26日提交的相同标题的美国临时申请号61/591,113的优先权，其完整地通过引用并入。
背景
1 发明领域
本发明涉及由多种表位构成的复合抗原，并涉及用本发明的复合抗原产生免疫应答的工具和方法。本发明还涉及用于开发新型疫苗的包含来源于多种病原体的复合抗原序列的组合物并涉及开发的疫苗。
2 背景描述
微生物和病毒病原体是动物中传染病的主要来源。病原体及其宿主经常以无尽的竞争来适应彼此，以存活并繁殖。某些病原体在感染哺乳动物宿主并存活于暴露在宿主免疫应答中已取得极大成功，甚至超过数年或数十年的时期。非常成功的哺乳动物病原体的一个实例是流感病毒。
流感病毒是主要侵袭人和其他脊椎动物的传染性呼吸疾病（通常称为流行性感冒）的病原体。流感是高度传染性的并且是自从远古时期就侵袭人类的急性呼吸疾病。将传染表征为复发性每年性流行病和周期性主要的世界范围内的大流行病。流感病毒感染可以导致轻度至重度疾病，并甚至可以导致死亡。在美国每年平均有5-20%的人口患有流感，并且多于200,000人由于并发症而入院治疗，且超过36,000人死亡。由于高度的疾病相关的发病率和死亡率，流感的直接和间接社会经济影响是巨大的。在上个世纪发生了四次大流行病，一共导致了全世界数千万的死亡。
流感病毒经咳嗽或喷嚏从宿主向宿主传播。空气播散飞沫是个体间主要的传播载体。在人中，病毒通常直接在人与人之间传播，尽管人也可能由于与携带病毒的表面间接接触而被感染。受感染的成人在疾病的原发症状发生前少至一天开始对其他人是有传染性的。因此，这些人在之后长达5天或更多天仍有传染性。不复杂的流感病通常其特征在于体质和呼吸症状的突然发生，包括发热、肌痛、头痛、不适、干咳、咽喉痛、鼻炎或这些症状的一种或多种的组合。
目前，致病性流感病毒的传播在动物群体中通过接种和/或用一种或多种抗病毒化合物治疗来控制。含有灭活的流感病毒或简单流感抗原的疫苗目前在世界范围内使用，并且尤其促进用于高风险群体诸如婴儿、老年人、无足够的健康护理的人和无免疫应答的个体。大部分所有用于疫苗使用的病毒在能繁殖的(fertile)母鸡卵中繁殖，通过化学方法灭活，并纯化抗原。疫苗通常是三价的，含有代表性流感A病毒（H1N1和H3N2）和流感B毒株。世界卫生组织（WHO）定期更新特定毒株，其靶向针对被认为会是最流行的并由此最大化全世界效力的那些的疫苗开发。在大流行病期间的时期，更新的流感疫苗准备上市销售前，通常需要8个月或更长。历史上，病毒大流行病在4-6个月内传播到大部分洲，并且未来的病毒大流行病可能由于增加的国际旅行而传播得甚至更快。在第一波任何未来广泛传播的爆发或大流行病期间由常规方法制备的有效疫苗将无法获得或者非常短缺可能是不可避免的。
大流行的流感可能并且的确会在任何时候出现。尽管下一次流感大流行病的严重性无法准确预测，但建模研究暗示大流行病对美国的影响和世界整体而言将是重大的。在缺少任何控制手段（接种或药物）的情况下，已估计在美国“中等程度”的大流行病会导致：89,000-207,000人死亡；314,000-734,000人入院治疗；1800万-4200万人门诊病人就诊；和另外的2000万-4700万人患病。根据疾病控制和预防中心（the Centers for Disease Control and Prevention (CDC)）(Atlanta, GA, USA)，15-35%的美国人口会受到流感大流行病的影响，并且经济影响能够在大约710亿美元至1670亿美元的范围内。
能够产生保护性免疫应答的疫苗已经在上半个世纪中产生。这些包括全病毒疫苗、裂解病毒疫苗(split-virus vaccine)、和表面抗原疫苗和活减毒病毒疫苗。尽管任何这些疫苗类型的制剂能够产生全身性免疫应答，但活减毒病毒疫苗具有还能够刺激呼吸道中局部粘膜免疫的优点。
随着不同流感毒株的持续出现（或再次出现），持续开发出新型流感疫苗。由于流感病毒间的快速突变率，已非常困难且有时不可能来以足够时间鉴定出现的病毒毒株的抗原部分以开发合适的疫苗。因此，新出现的或再次出现的病毒毒株的多肽和多核苷酸（尤其是抗原基因的序列）是高度需要的。
流感通常由两个属的流感病毒的感染导致：甲型流行性感冒病毒属(Influenzavirus A)和乙型流行性感冒病毒属(Influenzavirus B)。第三个属的流感病毒丙型流行性感冒病毒属(Influenzavirus C)作为单一种丙型流感病毒(influenza C virus)存在，其仅导致易感的哺乳动物中不严重的普通感冒样症状。甲型流感病毒(influenza A virus)和乙型流感病毒(influenza B virus)的感染通常在易感的哺乳动物的上呼吸道的粘膜表面处开始。病毒复制主要限于上呼吸道，但可以扩展到下呼吸道，并导致可能是致命的支气管肺炎。
特别是甲型流感病毒具有许多不同的血清型。目前，在甲型流感病毒内存在HA（参与病毒与细胞结合的血细胞凝集抗原）的16种已知变异和NA（参与病毒释放的神经氨酸酶抗原）的9种已知变异，因此产生基于单独地这两种蛋白内的变异的甲型流感病毒的144种可能的“HN”血清型。认为在任何给定时间时这些组合的仅一小部分在易感人群内传播。一旦新型流感毒株或血清型出现并散播，历史模式是它在易感人群内变得确定，并随后流动或“传播”许多年，导致流感的季节性流行病。
正粘病毒科(Orthomyxoviridae Family)目前包含流感病毒的三个属：甲型流行性感冒病毒属、乙型流行性感冒病毒属和丙型流行性感冒病毒属。这些属的每一种包含流感病毒的单一种：属甲型流行性感冒病毒属由单一种甲型流感病毒组成，其包括目前在人中传播的所有流感病毒毒株，包括例如但不限于 和H10N7血清型。示例性的甲型流感病毒毒株包括但不限于
和，以及其衍生物、变体和同源物。
属乙型流行性感冒病毒属由单一种乙型流感病毒组成，其中目前仅存在一个已知的血清型。乙型流感病毒几乎唯一地是人病原体，但比甲型流感毒株明显更不常见，且遗传多样性更低。由于该有限的遗传多样性，大部分人在早期年龄时获得某一程度的乙型流感病毒的免疫；然而，病毒的突变频率足够高以防止大部分人的持久性免疫，但没有高至足以允许乙型流感病毒在人群间的大流行性传染。示例性的乙型流感病毒血清型包括但不限于
和以及其衍生物、变体和同源物。
属丙型流行性感冒病毒属由表示为丙型流感病毒的单一种组成，其中目前仅存在一个已知的血清型。已知该血清型感染灵长类动物和猪，并且虽然丙型流感病毒的感染是罕见的，但所导致的疾病却可能是严重的。然而，由于其在具有亲密接触的人中的快速传播性，丙型流感病毒的流行病在暴露的群体中并非不常见。
来自这些毒株每一种的多核苷酸和多肽序列包含在National Center for Biotechnology Information (National Library of Medicine, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA)的公开可获的数据库中，并且病毒原种可以获自美国典型培养物保藏中心（American Type Culture Collection） (Manassas, VA, USA)，或者另外是公开可获的。
人流感病毒通常指在人中可传播的流感病毒血清型。存在仅三种已知的近期在人中广泛传播的甲型流感病毒HN血清型：H1N1、H2N2和H3N2。许多人已获得了对这些亚型的至少某些水平的免疫。然而，已知所有流感病毒频繁地突变和改变。已知流感病毒感染水禽和猪，并在形成新亚型的繁殖地(breeding ground)的那些宿主间传播，并且毒株与人群分开。由于许多血清型（并尤其是新出现的亚型）在人群中具有零或低患病率，因此在人群中存在很少或不存在针对它们的天然免疫。这样的群体被称为对此类血清型是“未接种的(naïve)”。因此，可以预期流感病毒随时间适应以产生一种或多种高强毒株，其将传染并在未接种的人中灾难性散播，如在主流刊物中已广泛报道的。
例如，已报道高强毒株H5N1亚型（公开地称为禽流感病毒）已充分突变而变得可从禽类宿主向人传播。由于该亚型在过去已被限定于感染禽类群体，因此在人群体中存在极少或不存在感染的遗留(legacy of infection)来已产生免疫。因此，预期人群体对H5N1是高度易感的。
迄今为止，H5N1血清型似乎尚未充分突变以在人与人之间有效传播。尽管如此，由于流感病毒不断适应，因此存在这一忧虑，即将出现H5N1病毒或另一种强毒流感毒株或血清型，其将能够感染人并在人与人之间容易地散播。通常已暗示如果H5N1病毒会获得在人与人之间容易地传播的能力，则世界范围的疾病爆发（即，大流行病）可能开始，导致数百万的死亡。
每年的流感爆发作为“抗原漂移”的结果发生。抗原漂移由在宿主群里中传播的病毒亚型内病毒蛋白的抗原（即，免疫刺激性）部分中的突变引起，其改变了宿主识别并针对传染病毒有效防御的能力，甚至当病毒在群体中已传播若干年时。减少宿主群体中现存的免疫的抗原漂移通常在所谓的免疫显性抗原或区域内发生。免疫显性抗原是属于最容易且最快速地由宿主免疫系统识别的病原体的那些抗原，并且因此，是针对入侵性病原体的绝大部分免疫应答的原因。通常，免疫显性抗原存在于大部分暴露到环境的病原体的区域内，即，在病原体的外表面上或在病原体突出的部分上，并因此更容易地接近宿主免疫系统。
在流感的情况中，免疫显性HA和NA蛋白从病毒颗粒的中心壳体突出，并因此它们趋于与宿主的内部环境最强烈地相互作用，并控制宿主免疫应答。在微生物基因组中发生保护微生物免于宿主免疫系统的突变，这些突变最容易地发现会影响免疫显性抗原。
相反，非免疫显性抗原是这样的抗原，其能够产生宿主免疫应答，但仅占全部免疫应答的少量。认为发生这一点是因为非免疫显性抗原至少部分地避开宿主免疫系，如同在位于微生物表面的裂隙或褶皱中或者被微生物的突出部分所环绕的抗原的情况下。在流感的情况下，出现在壳体表面附近的非免疫显性抗原通过从表面上突出的免疫显性HA和NA突起（spikes）而避开宿主免疫系统。非抗原显性抗原区域在响应宿主免疫压力时趋于比免疫显性抗原显示出更低的突变。
当病毒中存在意外或突然的、主要的改变时，发生抗原漂移。抗原漂移通常由出现病毒表面上HA和/或NA蛋白的新组合（即，产生新的流感亚型）来导致。新型甲型流感病毒亚型（对其世界上大部分人群是未接种的）的出现是朝向大流行病的第一步。如果新型流感亚型还具有在人与人之间容易地传播的能力，则可以预期全面爆发的大流行病，其导致传染数百万人的全球性流感爆发。
CDC和世界上疾病预防的领导机关建议预防流感的单一最佳方法是通过每年的接种。然而，常规接种通常靶向HA和NA抗原，并且在预防疾病上既非普遍保护性的也非100％有效的。抗原漂移阻止流感疫苗成为普遍保护性的，或阻止其在许多年保持有效性。常规疫苗的无效性还可能是（部分地）由于抗原漂移和由免疫系统最通常识别的HA和NA蛋白的抗原部分（即，免疫显性抗原）内产生的变异。结果是，由于流感不断地改进其对目前治疗的抗性，因此许多人可能发现他们对于流感病毒易感，却无可用的有效治疗方法。这种情况尤其涉及关于H5N1病毒，其是高强毒的，但是对其目前却没有广泛可用的商品化疫苗来免疫易感人群。
目前，由于每年出现新毒株，流感疫苗每年重新配制，并通常诱导有限的免疫。此外，为了实现保护性免疫应答，一些疫苗用高剂量抗原施用。对于H5N1疫苗尤其是这样。此外，如同在自然中发现表位，流感疫苗（包括H5N1疫苗）通常以相同次序(in the same order)呈现该表位，通常呈现为全病毒蛋白；因此，需要相对大量蛋白来产生有效疫苗。结果是，每一施用包括与剂量量相关的增加的成本，并且存在制造足够剂量以接种普通公众的增加的困难。此外，使用更大的蛋白提高了受体宿主中不期望的免疫应答的风险。
因此，施用提供针对广大范围的不同毒株和/或病原体的变异的感染的保护的疫苗和针对多种病原体是有效的疫苗，将是有利的。还将有利的是，施用单一或有限数目的接种（所述接种将提供在不同病原体的选择中的有效保护）和能够在具有有限的免疫系统功能的那些个体中是有效的疫苗。此类疫苗将可用于治疗许多个体和群体，并可用于补充(compliment)常规疫苗，所有这些均为尽可能多的个体提供针对群体中现有的以及新的和出现的病原体的广泛保护。
发明概述
本发明提供了新型且有用的组合物，以及用于产生免疫应答的工具和方法。具体而言，本发明提供了从一种或多种病原体的多个抗原区开发的疫苗和方法。
本发明的一个实施方案涉及包含具有来源于一种或多种病原体的多个抗原表位的邻接的氨基酸序列的肽的复合抗原，其在哺乳动物中诱导针对由该一种或多种病原体的感染是保护性的免疫应答。优选地，所述多种表位包含一种或多种复合表位。优选地，所述复合表位包含多种抗原表位，包含同一表位的一个或多个重复、不同表位的一个或多个重复、复合表位的一个或多个重复、或其组合。还优选地，所述复合抗原的至少一个表位的氨基酸序列天然不存在。复合抗原可用于治疗或优选预防与一种或多种病原体相关的感染和疾病，所述病原体包括但不限于病毒、细菌、寄生物、酵母、真菌、或其组合。优选地，所述病原体是流感病毒，并且所述一种或多种抗原表位是以下的氨基酸序列：M1、M2、HA、NA、PB1、或PB2蛋白、或其组合。示例性的复合序列包括但不限于SEQ ID NOs 4、5、8、19、20、52、53、56和54以及SEQ ID NO 16、65、66、67、70和73。
本发明的另一个实施方案涉及包含这样的氨基酸序列的复合抗原，所述氨基酸序列含有在多个保守区的表位序列之间相同的氨基酸和在多个保守区的表位序列之间不同的氨基酸。优选地，氨基酸序列具有式An1BCAn2，其中A代表在多个保守区的表位序列之间相同的氨基酸，B和C代表在多个保守区的表位序列之间不同的氨基酸，其中A、B和C是天然存在的氨基酸，N1和N2总计少于25，并且B和C氨基酸的数目少于3。示例性的复合序列包括但不限于SEQ ID NO.6、7、21、22、54、55、58或59。优选地，复合抗原包含来源于同一病原体的多个血清型的肽序列的多个保守区。优选地，所述病原体是流感病毒。
本发明的另一个实施方案涉及与本发明的复合抗原特异性反应的抗体。
本发明的另一个实施方案涉及编码本发明的复合抗原的多核苷酸。
本发明的另一个实施方案涉及在哺乳动物中产生免疫应答的方法，其包括向所述哺乳动物施用本发明的复合抗原。优选地，产生的免疫应答对于一种或多种病原体的多种不同毒株、血清型或种类是保护性的。
本发明的另一个实施方案涉及包含本发明的复合抗原的疫苗。优选地，复合抗原具有式An1BCAn2，其中A代表在多个保守区的表位序列之间相同的氨基酸，B和C代表在多个保守区的表位序列之间不同的氨基酸，其中A、B和C是天然存在的氨基酸，N1和N2总计少于25，并且B和C氨基酸的数目少于3。
本发明的其他实施方案和优点部分地在其后的说明书中描述，并且部分地，可以从该说明书中是显而易见的，或者可以从本发明的实践中知道。
附图描述
图1 H3N2流感病毒(Wuhan)的肽（或Pep）3、6、9、10和11的ELISA抗血清效价的概述。
图2 用H3N2流感病毒(Wuhan 1:40)的不同肽免疫小鼠的抗血清平均OD。
图3 用Pep6免疫后抗血清(1:100)对病毒和肽的平均OD。
图4 用Pep 9免疫的小鼠对以不同稀释度的H1N1 (Caledonia)病毒的抗血清效价。
图5 Pep 9对Wuhan包被(A)和(C)和Caledonia包被(B)和(D)的新鲜的(A)和(C)和固定的(B)和(D)的结合的比较。
图6 来自用在Wuhan和Caledonia的固定的相比于新鲜的包被上俘获的Pep 9免疫的小鼠的抗血清效价。
图7 用Pep 11免疫的小鼠对以不同稀释度的H5N1的抗血清效价。
图8 每一序列的另外的序列信息和相关信息（图8-1至8-6）。
发明描述
接种和疫苗通常是避免感染和防止使衰弱且危险的病原体的传播的最佳机制。关于病毒感染和许多细菌感染，接种通常是唯一有效的选项，这是由于治疗选项很少且可用的那些仅提供有限的功效。常规接种需要推理的理解或病原体的现有抗原区的一般鉴定。病原体自身繁殖，并且从热杀死的或另外方式减毒的微生物开发合适的疫苗。或者，鉴定在施用后会产生保护性免疫应答的抗原或抗原集合。关于预防由某些细菌和病毒的感染，对疫苗的需求尤其紧迫。许多细菌和尤其某些病毒不断地突变，经常使针对之前的或起始的细菌或病毒开发的疫苗针对出现的新毒株无效。结果是，针对感染的疫苗每年重新配制，并常常以相当高的剂量施用。制造成本高，并且施用疫苗对患者产生非常多并发症及相关风险。
已经令人惊奇地发现可以从本发明的复合抗原中产生有效疫苗。复合抗原是含有或者来源于病原体的多种抗原区的抗原。本发明的复合抗原可以含有一个表位，其代表两种或多种表位的保守区的组合（例如，如本文概述的复合表位），或来源于一种或多种来源（例如，病毒颗粒、寄生物、细菌、真菌、细胞）的多个免疫应答区。这些免疫区是氨基酸序列或表位，其代表在病原体的那些抗原区或其他抗原（其与感染或疾病相关，或重要的是与刺激免疫系统以提供针对病原体的保护相关）处发现的序列。
本发明的一个实施方案涉及复合抗原。本发明的复合抗原包含自然界中不存在的非天然存在氨基酸序列并且是另外人工构建的。复合抗原的每一序列包含多个病原体的免疫应答区或表位，将其人工排列，优选沿单一氨基酸序列。所述多个可以含有来自一个或多个病原体的多个相同表位（尽管不以天然发生次序），或多个许多种不同表位。表位可以与病原体的已知免疫区相同，或者与之前并不存在并因而是人工构建的完全新的构建体相同。优选地，本发明的复合抗原包括杀伤T细胞（TC或CTL）应答、辅助T细胞(TH)应答和在接种的哺乳动物中的特异性抗体产生。
“复合”抗原是工程化的、人工创造的抗原，其从两个或多个组成表位构成，从而使所得的复合抗原具有不同于或者附加有各个组分表位的物理和/或化学特性。优选的复合抗原，当暴露于哺乳动物的免疫系统时，能够同时产生对复合物的每一种组成表位的免疫应答，并优选地至大于各个组分表位的程度（例如，如从对鉴定的病原体的细胞或体液应答中可测量的）。此外，复合抗原当用作疫苗和针对每一种组成表位时，提供在患者中产生保护性免疫应答的附加功能。优选地，所述复合物具有提供不仅针对组分来源于其的病原体而且还有相关病原体的保护的额外功能。这些相关的致病生物可以是同一种的生物的毒株或血清型，或同一属的生物的不同种，或仅由相同表位而相关的完全不同的生物。
本发明的另一个实施方案涉及分离的表位。分离的表位是获自或源自当施用于哺乳动物时引起强力的(robust)免疫应答的病原体的蛋白或肽的区域。优选地，强力应答为哺乳动物提供针对从暴露于病原体发生的疾病的免疫保护。分离的表位的优选实例是复合表位，其是从两种或多种不同的但另外是相关的病原体的两个或多个高度保守的（尽管不相同）氨基酸序列的组合人工产生的表位。所述病原体可以是相同类型，但不同毒株、血清型、或物种或其他相关。复合表位包含在相关表位之间相同的保守区，并且还包含不同的可变区。代表两个保守的但不同序列的组合的复合表位的序列可以如下所示：
表位1的序列
表位2的序列
复合表位
其中，“A”代表两个高度保守表位之间相同的氨基酸，“B”和“C”代表两个表位之间分别不同的氨基酸，“A”、“B”和“C”的每一个可以是任何氨基酸和任何数目的氨基酸。优选地，保守区在可变氨基酸的每一侧包含约20个或更少的氨基酸，优选约15个或更少，优选约10个或更少，优选约8个或更少，优选约6个或更少，并且更优选约4个或更少。优选地，在两个相似但不相同的保守区之间的氨基酸是5个或更少，优选4个或更少，优选3个或更少，优选2个或更少，并且更优选仅1个。
“复合表位”类似于复合抗原，是工程化的、人工创造的单一表位，其从两个或多个组成表位构成，从而使所得的复合表位具有不同于或者附加有组分表位的物理和/或化学特性。优选的复合表位，当暴露于哺乳动物的免疫系统时，能够同时产生对复合物的每一种组成表位的免疫应答，并优选地至比通过各个组分表位单独实现的更大的程度。此外，复合表位当用作疫苗和针对每一种组成表位时，提供在患者中产生保护性免疫应答的附加功能。优选地，所述复合物具有提供不仅针对组分来源于其的病原体而且还有相关病原体的保护的额外功能。这些相关的致病生物可以是同一种的生物的毒株或血清型，或同一属的生物的不同种，或仅由相同表位而相关的完全不同的生物。
本发明的复合表位是完全人工分子，其不另外存在于自然界中，并且对其免疫系统从未另外暴露过。优选地，组合为复合表位的这些保守的免疫区代表在相关病原体之间高度保守的蛋白和/或多肽的免疫应答区。尽管疫苗可以开发自单一复合表位，但在许多情况下，最有效的疫苗可以开发自多个、不同的复合表位。
因此，本发明的复合抗原可以包含一个或多个复合表位和/或一个或多个已知表位以提供有效的疫苗。尽管复合抗原可以包含单一复合表位，但复合抗原不会包含仅单一已知表位。优选地，用复合抗原、或复合抗原的组接种实现的免疫应答提供了针对由所述复合抗原的序列来源于其中的原始毒株导致的感染的保护，并且还提供了针对其他毒株、血清型和/或物种（其共享一个或多个复合抗原中表示的通用保守区）的免疫保护。因此，用复合抗原接种实现的所得的免疫应答比常规单一抗原接种可实现的针对多种毒株、血清型和物种或另外相关的病原体具有更广泛保护性的，而无论在病原体进化中是否可能发生抗原漂移。优选地，从本发明的复合抗原开发的疫苗避免了重复的或每年的接种的任何需要、相关的并发症和制造费用、以及对患者升高的风险。这些疫苗可用于治疗个体和群体，由此预防感染、死亡和大流行病，并可用于补充(compliment)常规疫苗。
如本文所讨论，复合抗原优选包含具有来源于一个或多个复合表位、一个或多个复合表位加一个或多个已知表位、或多个已知表位（其可以是相同的或不同的）的序列的氨基酸的单链。表位序列可以连续重复和沿复合序列不间断的或在其他序列中散布开的（所述序列可以是作为间隔序列或编码肽的序列（共同间隔序列）的一个或几个氨基酸），并且可以是非免疫原性的或免疫原性的，并且能够在哺乳动物中诱导细胞（T细胞）或体液（B细胞）免疫应答。来自不相关微生物的肽序列可以组合入单一复合抗原。例如，所选的免疫应答肽的病毒序列可以由选自其他的微生物的保守序列或表位分散开，所述微生物诸如例如细菌，诸如肺炎链球菌（S. pneumococcus）、铜绿假单胞菌（P. auriginosa）或金黄色葡萄球菌（S. aureus）。优选表位可以从其选择的优选的病毒蛋白包括但不限于流感病毒蛋白PspA、PspC、HA、NA、M2e、流感嗜血杆菌(H. influenza)蛋白D和凝固酶。
复合抗原的表位可以是任何序列和大小，但优选由天然氨基酸构成，并且长度多于5个但小于35个氨基酸，优选少于30个，优选长度5-25个氨基酸，优选长度8-20个氨基酸，并且更优选长度5-15个氨基酸。复合抗原优选包含任何数目的复合的和/或其他表位。针对特定病原体、病原体家族、或病原体组的复合抗原的表位的最有效数目可以由本领域技术人员从本申请的公开内容并使用常规测试程序来确定。复合抗原可以有效地具有一个表位，优选2个或更多个，3个或更多个，4个或更多个，5个或更多个或更多。任选地，复合抗原可以包括表位之间一个或多个间隔序列，其可以是来源于相同或来源于一种或多种不同病原体的抗原区的序列，或者用作免疫引发剂或另外提供对免疫系统的加强的序列。该加强可以从氨基酸序列产生，所述氨基酸序列已知直接或作为佐剂刺激免疫系统。在一个优选的实施方案中，用于产生针对流感病毒的免疫应答的复合抗原包含HA和/或NA蛋白的表位，和/或来源于流感病毒的不同血清型的相似保守区的新表位。还优选的是这样的复合抗原，其包含结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）和破伤风梭菌（Clostridium tetani）的蛋白的表位，和/或来源于这些细菌的不同血清型的相似保守区的新表位。
本发明的另一个实施方案涉及一个或多个表位的邻接的序列，其可以包含在天然不存在且必须人工构建的序列中来自于一种或多种病原体的的复合的和/或已知的表位。优选地，本发明的邻接的序列包含一个或多个复合表位，其是对于多种病原体是相同的表位的保守区的序列加在两个保守区之间不同的那些氨基酸的组合。例如，在两种病原体含有区别仅在于单个氨基酸的相似保守区的情况下，复合序列将包括保守区氨基酸和如本文讨论的两个区域之间不同的每一个氨基酸。
还优选的是本发明的复合抗原包含多个重复的表位，并且任选地，用每一表位之间或环绕其的接头区缀合的表位，和相同的或不同的多个表位。优选的接头包括相同或不同病原体的抗原区的氨基酸序列，或有助于生成免疫应答的氨基酸序列。优选的实例包括但不限于细菌诸如但不限于结核病(tuberculosis)和病毒诸如但不限于流感的多种抗原区的任一种。还优选的是复合抗原包含产生T细胞应答、B细胞应答或两种并结合对病原体的特异性应答的表位。
本发明的另一个实施方案涉及用本发明的复合抗原免疫动物。获自经免疫的动物的抗血清对复合抗原来源于其的病原体是有反应性的。因此本发明的另一个实施方案是获自经免疫的动物的抗血清，其可以进一步纯化用于测试或治疗性用于向另一哺乳动物施用，并由此提供针对来自一种或多种病原体的感染的保护。还优选的是获得的抗血清提供广泛的保护，不仅仅针对复合抗原来源的病原体，而且还针对可以是不同毒株、血清型或甚至物种的另外的病原体。
本发明的另一个实施方案是由复合抗原构成的疫苗或从本发明的复合抗原开发的抗血清。优选地，本发明的疫苗对于病原体由于抗原漂移的抗原性变化更不敏感，其降低或消除每年或重复接种以维持患者群体针对从新病毒分离株感染的潜在爆发的保护的需要。此外，本发明的疫苗通常并有利地提供在其制造和施用（部分由于重复施用的本质上降低的需求）上增加的安全性考虑，相对长的贮存期（部分由于将由于毒株特异性漂移和漂变(strain-specific shift and drift)而重新配制的需要降到最低），以高特异性将免疫应答靶向特定微生物表位的能力，和制备对于多种病原体（其每一种可以是同一病原体不同的但是已知的毒株或物种）有效的单一疫苗的能力。本发明包括抗原和抗体组合物，制备此类组合物的方法，和它们用于防止、治疗、处理和/或预防感染的方法。本文公开的组合物以及使用它们的方法，发现在使用免疫原性组合物和优于本领域中目前可用的常规治疗的方法的病毒、细菌、寄生物和/或真菌致病和感染的治疗和预防中的特定用途。
本发明的另一个实施方案涉及在选定的哺乳动物群体中预防或控制感染，诸如例如病毒、寄生物、真菌或细菌感染的爆发，优选但不限于流感病毒和/或结核病细菌感染的方法。该方法包括至少这样的步骤：向群体的易感或处于风险中的成员提供免疫有效量的一种或多种公开的免疫原性或疫苗组合物，以足以预防、降低、减少、减轻、控制或延迟此类感染在一般群体中的爆发的次数。
本发明的另一个实施方案涉及在有其需要的哺乳动物中产生针对感染（例如由流感病毒）的保护性免疫应答的方法。此类方法通常包括这样的步骤：向有其需要的哺乳动物提供免疫有效量的一种或多种本文公开的免疫原性组合物，在足以产生针对传染性生物的一种或多种物种、毒株、或血清型的此类保护性免疫应答的条件下并以足以产生其的次数。此外，本发明还提供向哺乳动物中至少第一细胞、组织、器官或器官系统施用预防性抗病毒或抗微生物组合物的方法，其通常涉及向此类哺乳动物提供预防上有效量的至少一种如本文公开的第一免疫原性组合物。
本发明的另一个实施方案涉及免疫原性组合物，其包含具有一个或多个重复的肽序列、或此类肽序列（其在相同或不同病原体中的多种蛋白之间是保守的）的片段、变体或衍生物的本发明的复合抗原。复合序列来源于其的保守区可以在相同病原体或不同病原体的亚类中是保守的。优选的病原体包括但不限于细菌、病毒、寄生物、真菌和病毒。
本发明的复合抗原还可以获自或衍生自细菌序列，诸如例如以下的蛋白和/或多肽的多个或组合的表位，例如但不限于：链球菌属（Streptococcus）、假单胞菌属（Pseudomonas）、分枝杆菌属（Mycobacterium）诸如结核分枝杆菌（M. tuberculosis）、志贺氏菌属（Shigella）、弯曲杆菌属（Campylobacter）、沙门氏菌属（Salmonella）、流感嗜血杆菌（Haemophilus influenza）、肺炎嗜衣原体（Chlamydophila pneumonia）、白喉棒杆菌（Corynebacterium diphtheriae）、破伤风梭菌（Clostridium tetani）、肺炎支原体（Mycoplasma pneumonia）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、粘膜炎莫拉菌（Moraxella catarrhalis）、嗜肺军团菌（Legionella pneumophila）、百日咳杆菌（Bordetella pertussis）、大肠杆菌（Escherichia coli）诸如大肠杆菌0157，和上述任何的保守区的多种或组合的表位(epitomes)。序列可以获自或来源自的示例性寄生物包括但不限于疟原虫属（Plasmodium）诸如恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）和锥虫属（Trypanosoma）。示例性真菌包括但不限于烟曲霉（Aspergillus fumigatus）或黄曲霉（Aspergillus flavus）。示例性病毒包括但不限于沙粒病毒、布亚病毒、冠形病毒、纤丝病毒、嗜肝DNA病毒、疱疹病毒、正黏病毒、细小病毒、小核糖核酸病毒(picornaviruses)、乳头瘤病毒、呼肠孤病毒、逆转录病毒、杆状病毒和披膜病毒。优选地，病毒表位获自或来源自流感病毒（例如副黏病毒）的序列。
在另一个优选的实施方案中，复合抗原包含来源于流感病毒亚型（例如具有改变的HA或NA组成的流感病毒，诸如H1N1、H5N1、H3N2和H2N2）的保守区。NA或HA上保守区的表位还可以赋予交叉亚型免疫。作为实例，NA(N1)上的保守表位可以赋予对H5N1和H1N1增强的免疫。关于在亚类中甲型流感亚型和/或毒株中的相似或同系的化合物，优选存在至少约80％、更优选至少约90％、更优选至少约95％相同，更优选至少约96％相同，更优选至少约97％相同，更优选至少约98％相同，更优选至少约99％相同，和甚至更优选100％相同（非变体）。优选地，在复合抗原内的至少一个肽序列对于至少两个病毒颗粒，优选流感颗粒的同源蛋白（例如蛋白亚基）也是保守的。流感病毒的蛋白包括例如在病毒结构中表达的蛋白，诸如HA、NA、蛋白聚合酶(PB1、PB2、PA)、基质蛋白(M1、M2)和核蛋白(“NP”)。优选地，保守的肽序列在M1、M2、HA、NA的至少两个或多个，或一种或多种聚合酶蛋白上是保守的。
在优选的实例中，H5N1流感病毒的M1和M2蛋白中所选序列对应于在其他H5N1颗粒中发现的M1和M2蛋白，并且对应于在H3N2流感病毒的M1和M2蛋白中的相同序列。此外，尽管HA和NA蛋白具有高可变区，来自HA和NA的保守序列在许多流感毒株和许多亚型中被发现（例如，HA和NA序列在H5N1和H1N1中是保守的）。在本发明优选的实施方案中，复合序列来源于单一流感病毒亚型和更优选至少两种流感病毒亚型（例如甲型流感病毒的亚型）中的变体或毒株（表达基本上相同的HA和NA蛋白的病毒分离株，但其中HA和NA蛋白氨基酸序列显示一些微小漂变）内呈现的保守序列。
在另一个实施方案中，本发明提供复合肽或多肽，其包括至少一种表位抗原，所述表位抗原包含一个或多个重复出现的表位序列（其每一个在在流感病毒毒株或血清型的群体中保守的多种同源蛋白间是保守的），和药学上可接受的载体。在示例性的复合抗原中，至少一种表位序列重复至少一次，优选至少两次，更优选至少三次。在其他实施方案中，所述至少一种表位序列重复四次或更多次。优选地，复合序列与至少两种传播的病毒分离株的同源蛋白亚基中的序列相同。在每一个实施方案中，组合物可以包括药学上可接受的载体。
在另外优选的实施方案中，复合肽序列包括来源于流感病毒的基因组（即RNA）区段7的序列，而在更优选的实施方案中，序列包括至少部分的M1和M2蛋白。在其他优选的实施方案中，复合序列包括表达自编码HA或NA蛋白的基因组区段的序列。此类序列受亚型漂变的影响更小，且对感染有更广泛的保护性。
在另外的实施方案中，复合抗原包括一种或多种T细胞刺激性表位，诸如白喉类毒素、破伤风类毒素、多糖、脂蛋白、或其的衍生物或任何组合（包括其的片段或变体）。通常，复合抗原的至少一个重复序列包含于作为T细胞刺激性表位的相同分子内。在基于蛋白的T细胞刺激性表位的情况下，复合抗原的至少一个重复序列可以包含在作为T细胞刺激性表位的相同多肽内，可以与其缀合，或可以以其他方式相连。优选地，将至少一个重复的序列整合入本发明的复合抗原中的一种或多种T细胞刺激性表位内或其侧。
在另外的实施方案中，复合抗原（具有或不具有相连的T细胞刺激性表位）可以包括一种或多种多糖或其部分。在优选的实施方案中，复合抗原的至少一个序列与一种或多种多糖缀合。在其他的实施方案中，一种或多种多糖与复合抗原的其他部分缀合。本发明的某些实施方案选自多肽疫苗、蛋白-多糖缀合疫苗、或其组合。
本发明的复合抗原可以通过体外化学合成、固相蛋白合成、和体外（无细胞）蛋白翻译来合成，或者重组工程化并表达在细菌细胞、真菌、昆虫细胞、哺乳动物细胞、病毒颗粒、酵母等中。
优选的复合抗原包括至少一种以下元件：至少一条重复的复合序列；至少一个T细胞表位；至少一种多糖；至少一种多核苷酸；至少一种结构组分；或其组合。至少一种结构组分可以包括以下的一种或多种：至少一个结构区段；至少一个糖结合部分；至少一个核苷酸结合部分；至少一个蛋白结合部分；至少一个酶部分；或其组合。本发明包括制备免疫原性组合物，优选药物组合物，更优选疫苗的方法，其中本发明的靶抗原伴随药学上可接受的稀释剂、赋形剂、或载体，并可以与大部分任何佐剂使用。
在本发明的上下文内，相对少量的保守或中性取代（例如1或2个）可以在本文公开的复合抗原的序列或表位序列内进行，而不会明显改变对所述肽的免疫应答。在一些情况下，在具体肽中的一个或多个氨基酸的取代可以实际上用于增强或另外改进肽在哺乳动物中引发免疫或T细胞应答的能力，所述哺乳动物已被提供有包含修饰的肽、或编码所述肽的多核苷酸的组合物。合适的取代通常可以使用计算机程序来鉴定，并且此类取代的作用可以基于用抗血清和/或T细胞的经修饰的肽的反应性来确定。因此，在某些优选的实施方案中，用于公开的诊断和治疗方法的肽可以包含其中一个或多个氨基酸残基由一个或多个替换氨基酸所取代的一级氨基酸序列，从而使经修饰的肽与抗原特异性抗血清和/或T细胞系或克隆反应的能力不明显低于未经修饰的肽的。
如上所述，优选的肽变体是含有一个或多个保守取代的那些。“保守取代”是这样的取代，其中将氨基酸取代为另一个具有相似特性的氨基酸，从而使肽化学领域的技术人员将预期所述肽的二级结构和亲水性质没有明显改变。氨基酸取代通常可以基于残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲性质中的相似性来进行。例如，带负电荷氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电荷氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；并且有不带电极性头基具有相似亲水性值的氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸；甘氨酸和丙氨酸；天冬酰胺和谷氨酰胺；和丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。代表保守改变的氨基酸取代的实例包括：（1）一个或多个Ala、Pro、Gly、Glu、Asp、Gln、Asn、Ser、或Thr残基用来自相同组的一个或多个残基替换；（2）一个或多个Cys、Ser、Tyr或Thr残基用来自相同组的一个或多个残基替换；（3）一个或多个Val、Ile、Leu、Met、Ala或Phe残基用来自相同组的一个或多个残基替换；（4）一个或多个Lys、Arg、或His残基用来自相同组的一个或多个残基替换；和（5）一个或多个Phe、Tyr、Trp或His残基用来自相同组的一个或多个残基替换。变体可以还或者可替代地包含非保守改变，例如，通过用来自组（2）、组（3）、组（4）或组（5）的氨基酸残基取代来自组（1）的氨基酸残基之一。变体可以还（或可替代地）例如通过缺失或添加氨基酸（其对于肽的免疫原性、二级结构和亲水性质具有最小影响）来修饰。
表位可以在复合序列中相对于彼此以任何顺序排列。两个或多个表位序列之间的间隔氨基酸数目可以是任何实际范围，包括例如在相邻表位之间从1个或2个氨基酸至3、4、5、6、7、8、9或甚至10个或更多个氨基酸。
本发明的另一个实施方案涉及多核苷酸，其包括编码本发明的复合序列的DNA、RNA和PNA。这些多核苷酸可以是单链的（编码或反义）或双链的，并可以是DNA（基因组、cDNA或合成的）或RNA分子。另外的编码或非编码序列可以（但不必须）存在于本发明的多核苷酸内，并且多核苷酸可以（但不必须）与其他分子和/或支持材料连接。如本领域普通技术人员将理解的，作为遗传密码简并性的结果，存在许多编码给定的一级氨基酸序列的核苷酸序列。这些多核苷酸中的一些与任何天然基因的核苷酸序列具有最小同源性。尽管如此，由于密码子选择中的差异而不同的多核苷酸由本发明具体考虑。编码免疫原性肽的多核苷酸通常可用于体外或体内产生肽。任何多核苷酸可以进一步修饰以增加体内稳定性。可能的修饰包括但不限于在5'和/或3'端添加侧翼序列；在骨架中使用硫代磷酸酯或2'-o-甲基而非磷酸二酯酶键；和/或包括非传统碱基诸如肌苷、Q 核苷(queosine)和怀丁苷，以及乙酰基-甲基、硫代-或其他修饰形式的腺嘌呤、胞苷、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和尿苷。
本发明的另一个实施方案包括针对流感接种个体的方法，其包括向需要流感接种的患者施用治疗上或预防上有效量的流感疫苗，所述流感疫苗包括包含一种或多种重复出现的复合的或其他序列（其每一种在多种流感病毒颗粒中的多种同源蛋白间是保守的）的复合抗原，和药学上可接受的载体，以在患者中提供可检测的针对流感的免疫应答。
本发明的另一个实施方案涉及编码本发明的复合抗原的核苷酸或DNA疫苗。本发明的DNA疫苗包含复合抗原的基因序列，加上提供在细胞中复合抗原的表达的其他必需序列。通过用遗传工程化的DNA注射哺乳动物，复合抗原在细胞中或优选在细胞上产生，其由哺乳动物的免疫系统识别并由此产生针对复合抗原和因此对病原体的体液或细胞应答。DNA疫苗具有相对于常规疫苗的许多优点，包括在哺乳动物中诱导更普遍的和完全的免疫应答的能力。因此，DNA疫苗可以用于针对由病毒、细菌、和寄生物来源的许多不同的致病生物以及某些肿瘤引起的疾病来保护哺乳动物。
DNA疫苗通常包含所含有的细菌DNA，其编码包含在载体或质粒中的复合抗原，所述载体或质粒已被遗传修饰以将复合抗原序列转录并翻译为来源于病原体的具体蛋白序列。通过实例，疫苗DNA注射入身体的细胞中，其中细胞机(cellular machinery)转录并翻译DNA为复合抗原。非天然的并且不能由哺乳动物免疫系统所识别的复合抗原由细胞处理并且处理后的蛋白（优选表位）展示在细胞表面。识别这些复合抗原为外源物后，哺乳动物的免疫系统产生保护哺乳动物免受感染的合适的免疫应答。此外，本发明的DNA疫苗优选对目标哺乳动物细胞（诸如但不限于小鼠或人细胞）中的表达进行密码子优化。在优选的实施方案中，密码子优化涉及对于具体细胞类型选择期望的密码子选择偏好（在编码DNA中同义密码子出现的频率）从而期望的肽序列被表达。
本发明的另一个实施方案涉及在药学上可接受的组合物中的治疗性和预防性药剂，其用于向细胞或动物单独地或与一种或多种预防和/或治疗的其他药征(modalities)组合施用。本发明的治疗性和预防性药剂包括复合抗原、复合表位、含有复合抗原和表位的组合物、复合序列、本发明的DNA疫苗、本发明的抗体、和/或对本发明的复合抗原引发或暴露的T细胞。药学上可接受的赋形剂和载体溶液的配制对于本领域普通技术人员是熟知的，如同对于在多种治疗方案中使用本文描述的具体组合物的合适的给药和治疗方案的开发。
免疫原性组合物的量和施用此类免疫原性组合物所需的时机将在具有本教导的益处的普通技术人员的范围内。治疗上有效的、药学上有效的、和/或预防上有效的量的公开的免疫原性组合物的施用可以通过单次施用（诸如例如递送药剂的足量的单次注射）来实现，以向接受此类程序的患者提供期望的益处。或者，在某些情况下，可以期望在相对短的、或甚至相对延长的时期上提供多次、或连续的免疫原性组合物的施用，如同通过医疗从业者监视此类组合物向所选的个体施用可以确定。
本发明的免疫原性组合物和疫苗优选以与剂量制剂相容的方式，并以如将是预防上或治疗上有效的并优选是免疫原性的这样的量来施用。待施用的量依赖于待治疗的个体，包括例如患者免疫系统产生免疫应答的能力，和期望的保护的程度。合适的剂量范围可以在每次接种几百微克(µg)活性成分的数量级上，并优选范围为约0.1 µg-2000 µg (甚至更高量，诸如例如也考虑在约1 mg至约10 mg的范围)，诸如在0.5 µg-1000 µg的范围，优选在约1 µg至约500 µg的范围，并尤其在约10 µg至约100 µg的范围。初始施用和加强注射的合适方案还是可变的，但一般为初始施用，随后为任选的但优选后续接种或其他周期性施用。
在某些实施方案中，剂量将由约1 µg至约1 mg总蛋白或目标抗原的范围组成。在一个示例性实施方案中，疫苗剂量范围为约0.1 µg至约10 mg。然而，基于递送的肽的量，技术人员可以优选调整剂量。在任一种情况下，这些范围仅仅是本领域普通技术人员可以根据常规给药技术从其偏离的指导方针。精确剂量可以通过评估在合适宿主中产生的缀合物的免疫原性来确定，从而使免疫上有效的剂量被递送。免疫上有效的剂量是这样的剂量，其刺激患者的免疫系统以建立针对免疫原性组合物或疫苗的免疫应答。优选地，获得由微生物感染引起的针对疾病的足以提供长期保护的免疫记忆的水平。本发明的免疫原性组合物或疫苗优选与佐剂配制。“长期”优选表示超过至少约6个月的时期，超过至少约1年，超过至少约2-5年，或甚至少约2年至约10年或更长。
本发明的另一个实施方案涉及对如本文描述的复合抗原及其保守变体特异性的抗体。对这些多肽特异性的抗体例如用于诊断和治疗目的，其例如与目标多肽的活性、分布和表达相关。本发明的抗体可以是类IgG、IgM、IgA、IgD或IgE，并且包括但不限于多克隆抗体、单克隆抗体、多链或单链抗体，包括单链Fv (sFv或scFv)抗体（其中可变重链和可变轻链连接到一起（直接或经肽接头）以形成连续多肽），和人源化或嵌合抗体。
本发明的复合肽的特异性抗体可以通过本领域熟知的方法产生。此类抗体可以包括但不限于多克隆、单克隆、嵌合、人源化、单链、Fab片段和通过Fab表达文库产生的片段。产生多克隆和单克隆抗体的大量方法对于本领域技术人员是已知的，并可以适合于产生对本发明的和/或由本发明的多核苷酸序列编码的多肽特异性的抗体(参见例如, Coligan Current Protocols in Immunology Wiley/Greene, NY; Paul (编辑) (1991); (1998) Fundamental Immunology Fourth Edition, Lippincott-Raven, Lippincott Williams & Wilkins; Harlow和Lane (1989) Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, NY, USA; Stites等(编辑)Basic and Clinical Immunology (第4版) Lange Medical Publications, Los Altos, CA, USA及其中引用的参考文献; Goding, Monoclonal Antibodies:Principles and Practice (第2版) Academic Press, New York, NY, USA; 1986; 和Kohler和Milstein (1975)。
以下实施例说明了本发明的实施方案，但不应该视为限制本发明的范围。
实施例
序列
以下是示例性序列的列表。这些序列包括复合序列以及可以组合以形成本发明的复合序列的目标序列。　
下划线序列：
起始密码子和终止密码子
Afl II 限制性位点(NEB缓冲液4)
注意：在终止和Afl II RE之间多个T间隔序列
Apa I 限制性位点(NEB缓冲液4)
注意：在起始和Apa I RE之间的间隔序列是Kozak最小翻译起始位点。　
粗体序列：
粗体和下划线的HA 1序列(SEQ ID NO 72)
粗体的HA2序列(SEQ ID NO 73
粗体和下划线的NA1序列 (SEQ ID NO 74)
图1显示如通过用Pep 6、Pep 9、Pep 10或Pep 11接种的小鼠的ELISA测定的效价。如可见的，用Pep 9、Pep 10或Pep 11接种提供了对天然抗原的通常强应答和小鼠中的最高效价。
图2显示用来源于流感的Wuhan毒株(H3N2)的肽免疫的小鼠的血清的平均OD值。结果表明相比于未接种的小鼠(Balb/c库)和用Pep 3接种的小鼠，Pep 10和Pep 11提供明显的免疫应答。
图3显示用Pep 6免疫后的抗血清（以1:100效价）的平均OD值。如可见的，Pep 6抗血清与H1N1和H3N2两种病毒强烈反应。
图4显示当与以不同稀释度的流感毒株Caledonia病毒(H1N1)反应时用Pep 9免疫的小鼠的抗血清效价。如所见，Pep 9与整个病毒强烈反应。
图5显示四幅图(A-D)，其每一幅描绘Pep 9血清对四种底物之一的吸光度：(A) 新鲜的Wuhan病毒；(B) 固定的Wuhan病毒；(C) 新鲜的Caledonia病毒；和(D) 固定的Caledonia病毒。如所示，Pep 9血清与测试的所有底物强烈反应。
图6显示当俘获有新鲜的或固定的Wuhan的底物或Caledonia病毒底物时用Pep 9免疫的小鼠的效价。再次，Pep 9抗血清与每一种强烈反应，并且对测试的抗血清的许多种观察到的结合的量在新鲜的和固定的之间是相似的。
图7显示当用H5N1底物的多种稀释度俘获时用Pep 11免疫的小鼠的抗血清效价。如可见的，用测试的两种血清均观察到结合。
构建了复合抗原，其含有来自甲型流感病毒（几个亚型包括人H1、H3和高致病性(high-path)H5）的血凝素和神经氨酸酶的之前确定的保守表面蛋白表位。还包括来自结核分枝杆菌的HspX和85a的蛋白区段。这些表达的蛋白杂合构建体包括以下：NH2+----HspX-HA1-HA2-NA1-85a-----COO-
其中，HspX是来自结核分支杆菌HspX蛋白的20个氨基酸；HA1是7个氨基酸的高度保守的甲型流感血凝素蛋白的杂合区；HA2是7个氨基酸的高度保守的甲型流感血凝素蛋白的杂合区；NA1是8个氨基酸的高度保守的甲型流感神经氨酸酶蛋白的杂合区；并且85a是来自结核分枝杆菌的85 kD 85a蛋白的294个氨基酸。成熟的对应蛋白序列是SEQ ID NO 70的336个氨基酸序列。
使用pVAX1 (Invitrogen Inc, Cat#V260-20)通过重组方法构建复合抗原疫苗。简述之，合成对应于SEQ ID 70的单链（ss）DNA聚合物。ssDNA序列还包括：1）用于直接插入到pVAX1克隆载体的5' ApaI限制性内切核酸酶识别位点和3' Afl II限制性位点，2）在5'端的ATT最小Kozak翻译起始序列，3）ATG起始密码子，和4）3' TAG终止(termination)（终止(stop)）密码子。核苷酸序列以其整体将由SEQ ID NO 71的1038个核苷酸组成。
将该单链核苷酸序列用作模板来通过聚合酶链反应生成双链扩增子。按照PCR扩增，将扩增子进行限制性内切核酸酶消化，连接至pVAX1并使用标准转化和筛选方法用卡那霉素选择转化入大肠杆菌细菌中。含有重组插入片段的质粒在过夜培养物中生长，并使用已知的质粒提取方法纯化。将重组pVAX1质粒的浓缩物进行DNA测序并用于小鼠中的下游转染实验。
图8-1至8-6列出了极大量序列，其包括多种目标基因序列的保守的或另外靶向的区域，和本发明的复合序列。
本发明的其他实施方案和用途对于本领域技术人员从考虑说明书和实施本文公开的本发明中将是显而易见的。本文引用的所用参考，包括所有出版物、美国和外国专利和专利申请，均明确地且完整地通过引用并入。术语包括（无论何处使用）旨在包括术语由……组成和基本上由……组成。此外，术语包括(comprising)、包括(including)和包含(containing)不旨在是限制性的。旨在将本说明书和实施例仅考虑为示例性的，具有由随后的权利要求表明的本发明的真正范围和精神。

Claims (20)

1.复合抗原，其包含具有来源于一种或多种病原体的多种抗原表位的邻接的氨基酸序列的肽，所述复合抗原在哺乳动物中诱导针对由所述一种或多种病原体的感染是保护性的免疫应答。
2.权利要求1的复合抗原，其中所述多种表位包括一个或多个复合表位。
3.权利要求1的复合抗原，其中所述氨基酸序列的氨基酸是天然氨基酸。
4.权利要求1的复合抗原，其中所述多种抗原表位包含同一表位的一个或多个重复、不同表位的一个或多个重复、一个或多个复合表位、或其组合。
5.权利要求1的复合抗原，其中至少一个表位的氨基酸序列天然不存在。
6.权利要求1的复合抗原，其中所述一种或多种病原体是病毒、细菌、寄生物、酵母、真菌、或其组合。
7.权利要求1的复合抗原，其中所述一种或多种病原体是流感病毒，并且一种或多种抗原表位是以下的氨基酸序列：M1、M2、HA、NA、PB1、或PB2蛋白、或其组合。
8.权利要求7的复合抗原，其中所述表位包含SEQ ID NOs 4、5、8、19、20、52、53、56或54。
9.权利要求8的复合抗原，其包含SEQ ID NO 16、65、66、67、70或77。
10.复合抗原，其包含这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列含有在多个保守区的表位序列之间相同的氨基酸和在多个保守区的表位序列之间不同的氨基酸。
11.权利要求10的复合抗原，其中所述氨基酸序列具有式An1BCAn2，其中A代表在多个保守区的表位序列之间相同的氨基酸，B和C代表在多个保守区的表位序列之间不同的氨基酸，其中A、B和C是天然存在的氨基酸，N1和N2总计少于25，并且B和C氨基酸的数目少于3。
12.权利要求11的复合抗原，其包含SEQ ID NO.6、7、21、22、54、55、58或59。
13.权利要求11的复合抗原，其中所述多个保守区来源于同一病原体的多个血清型。
14.权利要求13的复合抗原，其中所述同一病原体是流感病毒。
15.抗体，其对于权利要求1的复合抗原是特异性有活性的。
16.重组多核苷酸，其编码权利要求1的复合抗原。
17.在哺乳动物中产生免疫应答的方法，其包括向所述哺乳动物施用权利要求1的复合抗原。
18.权利要求17的方法，其中产生的免疫应答针对一种或多种病原体的多种不同毒株、血清型或物种是保护性的。
19.疫苗，其包含权利要求1或11的复合抗原。
20.DNA疫苗，其编码权利要求1的复合抗原。
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