KR20200122533A - H5 인플루엔자를 치료 또는 예방하기 위한 펩타이드 및 이를 암호화하는 코돈 최적화 서열, 및 이를 이용한 백신 - Google Patents

H5 인플루엔자를 치료 또는 예방하기 위한 펩타이드 및 이를 암호화하는 코돈 최적화 서열, 및 이를 이용한 백신 Download PDF

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Abstract

본 발명은 H5 인플루엔자를 치료 또는 예방하기 위한 용도의 펩타이드, 이를 암호화하며 코돈 최적화된 항원 발현 서열, 항원 서열을 포함하는 벡터 및 백신에 관한 것으로, 펩타이드는 다양한 계통군에 속하는 H5 바이러스에 대해 교차 계통군 면역 반응을 나타내며, 항원 발현 서열은 면역화 대상에 최적화되어 있다.

Description

H5 인플루엔자를 치료 또는 예방하기 위한 펩타이드 및 이를 암호화하는 코돈 최적화 서열, 및 이를 이용한 백신{PEPTIDES, CODON OPTIMIZED SEQUENCE ENCODING THE SAME FOR TREATING OR PREVENTING OF H5 INFLUENZA, AND VACCINE USING THEREOF}
본 발명은 H5 인플루엔자를 치료 또는 예방하기 위한 펩타이드 및 이를 암호화하는 코돈 최적화 서열, 및 이를 이용한 백신에 관한 것이다.
조류 인플루엔자(AI) 바이러스는 Orthomyxoviridae 과(科, Family), A형 Influenza virus 속(屬, Genus)으로 분류되며, negative sense RNA 바이러스로서 서로 다른 8개의 RNA 분절(segment)로 구성되어 있다. RNA 분절들은 혈구응집소(hemagglutinin, HA)와 뉴라미니다제(neuraminidase, NA)의 표면항원 유전자와 M, NP, PB2 등 6개의 내부 유전자(internal gene)로 나뉘어진다. HA 및 NA 유전자는 감염 대상 숙주의 특이성과 관련되어 있다. HA 유전자는 조류 인플루엔자 바이러스의 병원성과 관련이 있으며 HA 단백질 분절 부위에 특정한 병원성 관련 유전자 배열을 나타내면 고병원성을 나타낸다.
A형 AI 바이러스는 바이러스 표면에 존재하는 혈구응집소(HA)의 특성에 따라 H1부터 H16까지 16종의 아형(subtype)으로 분류되며, 뉴라미니다제(NA) 효소가 나타내는 표면 단백질의 특성에 따라 N1부터 N9까지 9종의 아형으로 구분된다. 따라서 H형과 N형을 조합할 경우, A형 인플루엔자 바이러스는 이론적으로 총 144종(=16×9)의 아형이 존재하게 된다.
AI 바이러스 아형마다 감염될 수 있는 숙주의 차이가 있다. 예를 들어, 조류는 144종의 아형 모두가 감염될 수 있고, 돼지는 H1 및 H3형이 주로 감염된다. 사람은 주로 H1, H2, 및 H3 아형에 감염되었지만, 최근에는 사람에 감염될 수 있는 HA 아형이 확대되어 H5, H7 및 H9형도 감염되고 있다. 또한 동일한 아형의 바이러스라도 유전자 변이에 의해 병원성 등의 특성이 달라질 수 있다.
서로 다른 두 아형의 AI 바이러스가 동일 개체에 동시 감염되면 복제과정에서 바이러스 유전자간의 유전자 재편성(genetic reassortment)으로 항원성의 대변이(antigenic shift)가 일어날 수 있다. 과거 3차례에 걸친 독감의 대유행(pandemic)은 모두 대변이가 원인인 것으로 생각되고 있다. 다른 2종의 AI 바이러스간에 유전자 재편성이 일어나면, 이론적으로 서로 다른 256종의 유전자 배열을 갖는 AI 바이러스가 출현할 수 있다.
그러므로 사람 인플루엔자 백신은 그 해에 유행할 것으로 예상되는 바이러스의 아형 또는 계통군(clade)을 미리 예측하고 백신을 제작해야 한다. 바이러스의 유전자 변이가 잦기 때문에, 매년 새로운 백신을 제작해야 하며, 실제 유행하는 바이러스가 백신 제작 시 사용한 아형 또는 계통군과 일치하지 않으면 효과를 보기 어려운 문제가 있다.
대한민국 공개공보 10-2010-0096164 (2010.09.01)
새로운 치료제: DNA 치료백신(VGX-6150), 2014 대한간학회 춘계 single topic symposium, 25-33
본 발명의 실시 예에 따르면, 서로 다른 계통군에 속하는 H5 바이러스에 교차 계통군 면역 반응을 일으킬 수 있는 펩타이드를 제공한다.
본 발명의 실시 예에 따르면, 서로 다른 계통군에 속하는 H5 바이러스에 교차 계통군 면역 반응을 일으킬 수 있는 펩타이드의 용도를 제공한다.
본 발명의 실시 예에 따르면 면역화 대상에서 발현이 최적화되고, 다양한 계통군의 인플루엔자 바이러스에 면역 반응을 일으킬 수 있는 항원 발현 서열을 제공한다.
본 발명의 실시 예에 따르면 한국에서 유행할 수 있는 고병원성 조류 인플루엔자에 대해 높은 면역 반응을 일으킬 수 있는 항원 발현 서열을 제공한다.
본 발명의 실시 예에 따르면 코돈 최적화되어 면역화 대상에서 높은 면역화 효과를 나타내고, 교차 계통군 면역 반응을 일으킬 수 있는 항원 발현 서열이 포함된 벡터를 제공한다.
본 발명의 실시 예에 따르면 코돈 최적화되어 면역화 대상에서 높은 면역화 효과를 나타내고, 교차 계통군 면역 반응을 일으킬 수 있는 항원 발현 서열이 포함된 유전자 백신을 제공한다.
본 발명의 실시 예에 따르면, H5 인플루엔자에 대한 치료 또는 예방에 이용되고, 서열번호 1 내지 3으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 서열로 이루어지는 펩타이드를 제공한다.
상기 H5 인플루엔자는 계통군 2 및 계통군 2의 하위 계통군일 수 있다.
상기 H5 인플루엔자는 계통군 2.2, 계통군 2.2의 하위 계통군, 계통군 2.3, 및 계통군 2.3의 하위 계통군일 수 있다.
본 발명의 실시 예에 따르면, 상기 펩타이드를 암호화하는 염기 서열로서, H5 인플루엔자에 대한 치료 또는 예방에 이용되고, 서열번호 4; 서열번호 5; 서열번호 6; 서열번호 4와 90% 이상 동일성을 가지는 서열; 서열번호 5와 90% 이상 동일성을 가지는 서열; 및 서열번호 6과 90% 이상 동일성을 가지는 서열로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 서열로 이루어지고, 코돈 최적화된 항원 발현 서열을 제공한다.
상기 H5 인플루엔자는 계통군 2 및 계통군 2의 하위 계통군일 수 있다.
상기 H5 인플루엔자는 계통군 2.2, 계통군 2.2의 하위 계통군, 계통군 2.3, 및 계통군 2.3의 하위 계통군일 수 있다.
상기 코돈 최적화는 포유동물에 대해 최적화된 것일 수 있다.
상기 포유동물은 인간일 수 있다.
본 발명의 실시 예에 따르면 상기 항원 발현 서열 중 적어도 하나의 염기 서열을 ORF(open reading frame) 서열로서 포함하는 벡터를 제공한다.
상기 벡터는 상기 ORF 서열의 5’방향에 위치하는 5’UTR(untranslated region) 서열; 및 상기 ORF 서열의 3’방향에 위치하는 3’UTR 서열을 더 포함할 수 있다.
상기 5’UTR 서열은 서열번호 7 내지 9로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 서열로 이루어질 수 있고, 상기 3’UTR 서열은 서열번호 10 내지 12로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 서열로 이루어질 수 있다.
상기 벡터는 상기 5’UTR 서열 및 상기 ORF 서열 사이에 위치하는 신호 서열; 및 상기 코돈 최적화된 보존 서열과 상기 3’UTR 서열 사이에 위치하는 막횡단 도메인 서열을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 실시 예에 따르면 상기 벡터에 의해 형질전환된 세포를 제공한다.
본 발명의 실시 예에 따르면 상기 벡터를 포함하는 면역화용 조성물을 제공한다.
본 발명의 실시 예에 따른 펩타이드는, 다양한 계통군에 속하는 H5 바이러스에 대해 교차 계통군 면역 반응을 나타내므로 인플루엔자 면역화 용도로 사용될 수 있다.
본 발명의 실시 예에 따른 항원 발현 서열은, 계통군에 공통되는 염기 서열로 구성되었으므로 유전자 백신으로 이용되면 다양한 계통군에 면역 반응을 일으킬 수 있다.
본 발명의 실시 예에 따른 항원 발현 서열은 한국(South Korea)에서 유행한 고병원성 H5 바이러스의 염기 서열을 분석하여 얻은 보존 서열을 기초로 하므로 한국에서 유행할 수 있는 변형된 조류 인플루엔자 바이러스에 대해 면역 효과가 높을 수 있다.
본 발명의 실시 예에 따른 벡터는 코돈 최적화된 항원 발현 서열을 포함하므로 유전자 백신으로 이용되면 면역 반응이 높을 수 있다.
본 발명의 실시 예에 따른 벡터는 보존 서열을 코돈 최적화한 항원 발현 서열을 포함하므로 유전자 백신으로 이용되면 교차 계통군 면역 반응을 할 수 있다.
본 발명의 실시 예에 따른 벡터는 유전자 백신으로 이용되면 한국에서 유행할 수 있는 변형된 조류 인플루엔자 바이러스에 대해 면역 효과를 가질 수 있다.
본 발명의 실시 예에 따른 유전자 백신은 코돈 최적화된 항원 발현 서열을 포함하므로 면역 반응이 원활할 수 있다.
본 발명의 실시 예에 따른 유전자 백신은 한국에서 유행할 수 있는 변형된 조류 인플루엔자 바이러스에 대해 면역 효과를 가질 수 있다.
본 발명의 실시 예에 따른 유전자 백신은 다양한 계통군의 인플루엔자 바이러스에 대해 면역 효과를 가질 수 있다.
도 1 내지 도 3은 2012년부터 2018년까지 한국에서 유행한 고병원성 H5 조류 인플루엔자 바이러스의 계통 분석 결과를 도시한 것이다. 상기 도 1은 2012년부터 2018년까지의 기간을 분석한 것이고, 상기 도 2는 2014년부터 2018년까지의 기간을 분석한 것이고, 상기 도 3은 2016년부터 2018년까지의 기간을 분석한 것이다.
도 4는 본 발명의 실시 예에 따른, 계통군 2.2.1.2, 계통군 2.3.2.1, 및 계통군 2.3.4.4 각각의 HA 유전자의 보존 염기 서열 데이터 베이스를 구축한 예를 도시한 것이다.
도 5는 본 발명의 실시 예에 따른 pGX1 플라스미드 제조 단계를 도시한 것이다.
도 6은 본 발명의 실시 예에 따른 pGX10 플라스미드 제조 단계를 도시한 것이다.
도 7은 본 발명의 실시 예에 따른 pGX10/tPAco PA 6His 플라스미드 제조 단계를 도시한 것이다.
도 8은 본 발명의 실시 예에 따른 pGX10/tPAco HA(2.2.1.2) 플라스미드 제조 단계를 도시한 것이다.
도 9는 본 발명의 실시 예에 따른 DNA 백신을 주사한 마우스 군으로부터 얻은 혈청 및 clade 2.2 항원으로 실시한 HI 분석 결과를 도시한 것이다.
도 10은 본 발명의 실시 예에 따른 DNA 백신을 주사한 마우스 군으로부터 얻은 혈청 및 clade 2.2 항원으로 실시한 MN 분석 결과를 도시한 것이다.
도 11은 본 발명의 실시 예에 따른 DNA 백신을 주사한 마우스 군으로부터 얻은 혈청 및 clade 2.3.2 항원으로 실시한 HI 분석 결과를 도시한 것이다.
도 12는 본 발명의 실시 예에 따른 DNA 백신을 주사한 마우스 군으로부터 얻은 혈청 및 clade 2.3.2 항원으로 실시한 MN 분석 결과를 도시한 것이다.
도 13은 본 발명의 실시 예에 따른 DNA 백신을 주사한 마우스 군으로부터 얻은 혈청 및 clade 2.3.4.4 항원으로 실시한 HI 분석 결과를 도시한 것이다.
도 14는 본 발명의 실시 예에 따른 DNA 백신을 주사한 마우스 군으로부터 얻은 혈청 및 clade 2.3.4.4 항원으로 실시한 MN 분석 결과를 도시한 것이다.
도 15는 본 발명의 실시 예에 따른 DNA 백신을 주사한 마우스 군에 계통군(clade) 2.3.4.4의 H5 조류 인플루엔자 바이러스를 감염(공격 접종)시키고 체중 변화를 관찰한 결과를 도시한 것이다.
도 16는 본 발명의 실시 예에 따른 DNA 백신을 주사한 마우스 군에 계통군(clade) 2.3.4.4의 H5 조류 인플루엔자 바이러스를 감염(공격 접종)시키고 체중 변화를 관찰한 결과를 도시한 것이다.
도 17는 본 발명의 실시 예에 따른 DNA 백신을 주사한 마우스 군에 계통군(clade) 2.3.4.4의 H5 조류 인플루엔자 바이러스를 감염(공격 접종)시키고 체중 변화를 관찰한 결과를 도시한 것이다.
도 18은 상기 도 15, 상기 도 16, 및 상기 도 17의 결과를 종합하여 도시한 것이다.
도 19는 상기 도 15, 상기 도 16, 및 상기 도 17에서 계통군(clade) 2.3.4.4의 H5 조류 인플루엔자 바이러스에 감염된 마우스들의 생존률을 도시한 것이다
본 발명의 실시 예에 따르면, H5 인플루엔자에 대한 치료 또는 예방에 이용되고, 서열번호 1 내지 3으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 서열로 이루어지는 펩타이드를 제공한다.
상기 치료 또는 예방은 면역화 또는 면역 반응에 의한 것일 수 있다.
H5는 인플루엔자 바이러스의 주요 단백질 중 하나인 헤마글루티닌(HA)의 여러 아형 중 하나이다. H5 아형은 계통군(clade)으로 세분화된다. 계통군의 정의 및 분류는 본 발명의 기술분야의 통상 기술자에게 잘 알려져 있으며, WHO/OIE/FAO H5N1 Evolution Working Group을 참조하여 이해될 수 있다. 계통군은 0 내지 9번의 제 1 차 계통군으로 분류되어 있다. 제 1 차 계통군은 계통군의 정의에 의해 다시 제 2 차 계통군으로 분류될 수 있다. 제 2 차 계통군은 계통군의 정의에 의해 다시 제 3 차 계통군으로 분류될 수 있다. 예를 들면 계통군 2는 계통군 2.1 또는 계통군 2.2로 분류될 수 있고, 계통군 2.2는 다시 계통군 2.2.1 또는 계통군 2.2.2로 분류될 수 있다. 하위 계통군은 특정 계통군으로부터 세분화되는 낮은 차원의 계통군들을 지칭한다.
상기 펩타이드는 계통군 2 및 계통군 2의 하위 계통군에 속하는 H5 인플루엔자의 치료 또는 예방에 이용될 수 있다. 상기 펩타이드는 계통군 2의 하위 계통군에 대해 교차 계통군 면역 반응을 나타낼 수 있다. 상기 펩타이드는 계통군 2에 속하는 여러 하위 계통군의 H5 인플루엔자 바이러스에 대해 면역 반응을 나타낼 수 있다.
상기 펩타이드는 계통군 2.2, 계통군 2.2의 하위 계통군, 계통군 2.3 및 계통군 2.3의 하위 계통군에 속하는 H5 인플루엔자의 치료 또는 예방에 이용될 수 있다. 상기 펩타이드는 계통군 2.2 및 계통군 2.3에 대해 교차 계통군 면역 반응을 나타낼 수 있다. 상기 펩타이드는 계통군 2.2의 하위 계통군 및 계통군 2.3의 하위 계통군에 대해 교차 계통군 면역 반응을 나타낼 수 있다.
상기 펩타이드는 계통군 2.2.1, 계통군 2.2.1의 하위 계통군, 계통군 2.3.2, 계통군 2.3.2의 하위 계통군, 계통군 2.3.4, 및 계통군 2.3.4의 하위 계통군에 속하는 H5 인플루엔자의 치료 또는 예방에 이용될 수 있다. 상기 펩타이드는 계통군 2.2.1, 계통군 2.3.2, 및 계통군 2.3.4에 대해 교차 계통군 면역 반응을 나타낼 수 있다. 상기 펩타이드는 계통군 2.2.1의 하위 계통군, 2, 계통군 2.3.2의 하위 계통군, 및 계통군 2.3.4의 하위 계통군에 대해 교차 계통군 면역 반응을 나타낼 수 있다.
상기 펩타이드는 계통군 2, 계통군 2.2, 계통군 2.3, 계통군 2.2.1, 계통군 2.2.1.2, 계통군 2.3.2, 계통군 2.3.2.1, 계통군 2.3.4, 및 계통군 2.3.4.4로 이루어진 군에서 적어도 어느 하나에 속하는 H5 인플루엔자의 치료 또는 예방에 이용될 수 있다. 상기 펩타이드는 계통군 2, 계통군 2.2, 계통군 2.3, 계통군 2.2.1, 계통군 2.2.1.2, 계통군 2.3.2, 계통군 2.3.2.1, 계통군 2.3.4, 및 계통군 2.3.4.4로 이루어진 군에 속하는 H5 인플루엔자에 대한 교차 계통군 면역 반응을 나타낼 수 있다. 상기 펩타이드는 계통군 2, 계통군 2.2, 계통군 2.3, 계통군 2.2.1, 계통군 2.2.1.2, 계통군 2.3.2, 계통군 2.3.2.1, 계통군 2.3.4, 및 계통군 2.3.4.4로 이루어진 군에 속하는 여러 하위 계통군의 H5 인플루엔자 바이러스에 대해 교차 계통군 면역 반응을 나타낼 수 있다.
교차 계통군 면역 반응은 특정 아형의 특정 계통군(clade) 바이러스에만 면역 반응을 일으키는 것이 아닌, 서로 다른 아형의 바이러스에 면역 반응을 일으키거나, 또는 특정 아형의 서로 다른 계통군 바이러스에 면역 반응을 일으키는 것을 말한다. 교차 계통군(cross clade) 면역 반응은 교차 계통군 보호성 면역 반응으로 지칭될 수 있다. 면역 반응은 세포 반응, 체액 반응, 또는 세포 반응 및 체액 반응 모두일 수 있다.
본 발명의 실시 예에 따르면, 상기 펩타이드를 암호화하는 염기 서열로서, H5 인플루엔자에 대한 치료 또는 예방에 이용되고, 서열번호 4; 서열번호 5; 서열번호 6; 서열번호 4와 90% 이상 동일성을 가지는 서열; 서열번호 5와 90% 이상 동일성을 가지는 서열; 및 서열번호 6과 90% 이상 동일성을 가지는 서열로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 서열로 이루어지고, 코돈 최적화된 항원 발현 서열을 제공한다.
코돈 최적화는 발현 대상에 맞추어 코딩 서열에 존재하는 1개 이상의 코돈을 동일한 아미노산에 대한 코돈으로 치환함으로써 코딩 서열의 발현을 증가시키거나, 단백질의 폴딩이 적절하게 이루어지도록 최적화된 서열을 말한다. 상기 코돈 최적화는 포유동물에 대한 것일 수 있고, 예를 들면 인간에 대한 것일 수 있다.
상기 서열번호 4는 계통군 2.2.1.2의 HA 보존 염기 서열을 추출하고 코돈 최적화한 것이다. 서열번호 5는 계통군 2.3.2.1의 HA 보존 염기 서열을 추출하고 코돈 최적화한 것이다. 서열번호 6은 계통군 2.3.4.4의 HA 보존 염기 서열을 추출하고 코돈 최적화한 것이다. 본 발명의 실시 예에 따른 서열번호 4 내지 서열번호 6의 염기 서열은 HA 인플루엔자의 치료 또는 예방에 이용되는 경우, 동일한 단백질을 암호화하는 다른 염기 서열을 이용하는 것보다 면역 효과가 우수할 수 있고, 이는 코돈 최적화에 따른 항원의 발현량 증가에 의한 것일 수 있다.
상기 항원 발현 서열은 서열번호 4로 이루어지거나, 또는 서열번호 4와 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 동일성을 가지는 염기 서열로 이루어질 수 있다.
상기 항원 발현 서열은 서열번호 5로 이루어지거나, 또는 서열번호 5와 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 동일성을 가지는 염기 서열로 이루어질 수 있다.
상기 항원 발현 서열은 서열번호 6으로 이루어지거나, 또는 서열번호 6과 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 동일성을 가지는 염기 서열로 이루어질 수 있다.
서열 동일성은 본 발명이 속하는 기술분야에서 공지되어 있으며, 공지된 프로그램을 이용하여 확인할 수 있다. 서열 동일성을 확인하기 위한 유용한 알고리즘은 Blast 알고리즘일 수 있다.
본 발명의 실시 예에 따른 항원 발현 서열은 H5 인플루엔자의 치료 또는 예방에 이용될 수 있다. 상기 H5 인플루엔자는 계통군 2 및 계통군 2의 하위 계통군일 수 있다. 상기 H5 인플루엔자는 계통군 2.2, 계통군 2.2의 하위 계통군, 계통군 2.3, 및 계통군 2.3의 하위 계통군일 수 있다. 상기 H5 인플루엔자는 계통군 2.2.1, 계통군 2.2.1의 하위 계통군, 계통군 2.3.2, 계통군 2.3.2의 하위 계통군, 계통군 2.3.4, 및 계통군 2.3.4의 하위 계통군일 수 있다. 상기 H5 인플루엔자는 계통군 2, 계통군 2.2, 계통군 2.3, 계통군 2.2.1, 계통군 2.2.1.2, 계통군 2.3.2, 계통군 2.3.2.1, 계통군 2.3.4, 및 계통군 2.3.4.4으로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나의 계통군 및 그의 하위 계통군일 수 있다.
상기 포유동물은 설치류 또는 영장류일 수 있고, 상세하게는 인간일 수 있다.
본 발명의 실시 예에 따르면 상기 항원 발현 서열 중 적어도 하나의 염기 서열을 ORF(open reading frame) 서열로서 포함하는 벡터를 제공한다.
항원 발현 서열에 대한 설명은 상술한 내용과 동일하다.
상기 벡터는 서로 다른 세포 유형에서 모두 적용이 가능한 셔틀 벡터일 수 있다. 셔틀 벡터는 예를 들면 진핵생물과 원핵생물, 또는 대장균과 포유류에서 증식할 수 있는 벡터일 수 있다.
상기 벡터는 상기 항원 발현 서열 중 어느 하나의 염기 서열을 ORF 서열로서 포함할 수 있다.
상기 벡터는 상기 ORF 서열의 5’방향에 위치하는 5’UTR 서열; 및 상기 ORF 서열의 3’방향에 위치하는 3’UTR 서열을 더 포함할 수 있다. 예를 들면, 5’UTR 서열의 3’말단은 ORF 서열의 5’말단과 직접 연결되거나, 또는 5’UTR 서열의 3’말단과 ORF 서열의 5’말단 사이에 다른 염기 서열을 매개로 결합될 수 있다. 또 다른 예를 들면, 3’UTR 서열의 5’말단은 ORF 서열의 3’말단과 직접 연결되거나, 또는 3’UTR 서열의 5’말단과 ORF 서열의 3’말단 사이에 다른 염기 서열을 매개로 결합될 수 있다.
상기 5’UTR 서열은 서열번호 7 내지 9으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 서열로 이루어질 수 있고, 상기 3’UTR 서열은 서열번호 10 내지 12로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 서열로 이루어질 수 있다.
UTR(Untranslated Region)은 비번역 지역, 또는 NTR(Non-Translated Region)으로 지칭될 수 있으며, 단백질로 번역되지 않는 염기 서열을 의미한다. UTR은 ORF 서열이 암호화하는 단백질의 발현량에 영향을 미칠 수 있다. 서열번호 7 내지 9로 이루어진 군에서 선택되는 5’UTR 서열은 본 발명의 실시 예에 따른 항원 발현 서열 또는 ORF 서열이 암호화하는 단백질 또는 펩타이드의 발현량을 증가시킬 수 있다. 서열번호 10 내지 12로 이루어진 군에서 선택되는 3’UTR 서열은 본 발명의 실시 예에 따른 항원 발현 서열 또는 ORF 서열이 암호화하는 단백질 또는 펩타이드의 발현량을 증가시킬 수 있다. 상기 발현량 증가는 면역화 대상의 생체 내에서 일어나는 것일 수 있고, 예를 들면 포유동물의 세포 또는 인간 세포에서 일어나는 것일 수 있다.
상기 벡터는 상기 5’UTR 및 상기 ORF 서열 사이에 위치하는 신호 서열; 및 상기 코돈 최적화된 보존 서열과 상기 3’UTR 서열 사이에 위치하는 막횡단 도메인 서열을 더 포함할 수 있다.
신호 서열(signal sequence)는 시그널 펩타이드(signal peptide)를 암호화하는 염기 서열을 의미한다. 상기 신호 서열의 5’말단은 상기 5’UTR 서열의 3’말단과 직접 연결될 수 있고, 상기 신호 서열의 3’말단은 상기 항원 발현 서열의 5’말단과 직접 연결될 수 있다.
상기 막횡단 도메인 서열의 5’말단은 상기 항원 발현 서열의 3’ 말단과 직접 연결될 수 있고, 상기 막횡단 도메인 서열의 3’말단은 상기 3’UTR 서열의 5’말단과 직접 연결될 수 있다. 상기 막횡단(Transmembrane) 도메인 서열은 세포질(Cytoplasmic) 도메인을 암호화하는 서열을 더 포함할 수 있다
상기 벡터는 면역화 대상의 생체 내에서 항원 발현 서열이 암호화하는 단백질의 발현량을 증가시키기 위한 프로모터 서열을 더 포함할 수 있다.
상기 벡터는 개시코돈, 종지코돈, 인핸서 또는 폴리아데닐화 신호를 더 포함할 수 있다.
상기 벡터는 5’에서 3’방향으로 5’UTR 서열, 신호 서열, 항원 발현 서열, 막횡단 및 세포질 도메인 서열, 및 3’UTR서열이 직접 연결된 서열을 포함할 수 있다. 예를 들면 상기 벡터는 서열번호 17 내지 19의 염기 서열 중 어느 하나를 포함할 수 있다.
상기 벡터는 플라스미드 또는 바이러스 벡터일 수 있다.
본 발명의 실시 예에 따르면 상기 벡터에 의해 형질전환된 세포를 제공한다. 세포는 상기 벡터의 복제를 허용하는 세포일 수 있다.
본 발명의 실시 예에 따르면 상기 벡터를 포함하는 면역화용 조성물을 제공한다. 상기 면역화용 조성물은 서로 다른 항원 발현 서열을 포함하는 여러 종류의 벡터를 포함할 수 있고, 또는 복수의 항원 발현 서열을 포함하는 벡터를 포함할 수 있다. 상기 면역화용 조성물은 예를 들면 DNA 백신 또는 RNA 백신일 수 있다. 예를 들면 H5 인플루엔자용 DNA 백신은 상기 벡터를 플라스미드 형태로서 포함할 수 있다. 상기 면역화용 조성물은 면역화 대상의 생체로 전달되어 면역원성 물질을 생성하고 면역화 대상에 면역 반응을 일으킬 수 있다. 면역 반응은 세포 반응, 체액 반응, 또는 세포 반응 및 체액 반응 모두일 수 있다. 상기 면역화용 조성물은 벡터 및 용매를 포함할 수 있다. 면역화용 조성물에서 벡터의 농도는 0.01 내지 10 ㎍/㎕, 0.05 내지 10 ㎍/㎕, 0.1 내지 10 ㎍/㎕, 0.01 내지 5 ㎍/㎕, 0.05 내지 5 ㎍/㎕, 0.1 내지 5 ㎍/㎕, 0.01 내지 1 ㎍/㎕, 0.05 내지 1 ㎍/㎕, 0.1 내지 1 ㎍/㎕, 0.01 내지 0.5 ㎍/㎕, 0.05 내지 0.5 ㎍/㎕, 또는 0.1 내지 0.5 ㎍/㎕일 수 있다. 면역화용 조성물은 면역화 대상에 주사 후 전기 천공하는 방식으로 사용될 수 있다.
이하 본 발명의 실시 예를 통하여 보다 자세히 설명한다. 그러나 이들 실시 예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명이 하기 실시 예로 한정되는 것은 아니다.
<실시 예 1: 한국에서 유행하고 있는 H5Nx 바이러스들의 clade에 대한 데이터베이스 구축>
IRD(Influenza Research Database, https://www.fludb.org)로부터 2012년부터 2018년까지 전 세계적으로 유행한 H5Nx 인플루엔자 바이러스 염기 서열을 확보하였다. 확보된 염기서열들을 세 개의 연도 범위(2012-2018, 2014-2018, 2016-2018)로 분류하고 계통 분석(phylogenetic tree 분석)을 진행하였다. 계통 분석 결과를 토대로 전 세계적으로 유행한 H5Nx 계통수(clade)에 대한 데이터베이스를 구축하였다(도 1 내지 도 3 참조). 구축된 데이터베이스를 분석한 결과 계통군(clade) 2.2.1.2, 2.3.2.1, 2.3.4.4의 AI 바이러스가 주로 유행하는 것으로 확인되었다.
<실시 예 2: 계통군 2.2.1.2, 2.3.2.1, 및 2.3.4.4 HA 유전자 각각의 보존(consensus) 염기 서열 데이터베이스 구축>
계통군 2.2.1.2, 2.3.2.1, 및 2.3.4.4 각각의 HA 유전자 서열 정보를 취합하고, CLC Work bench 프로그램을 사용하여 각각의 계통군 HA 유전자의 보존된 염기 서열 데이터베이스를 구축하였다(도 4 참조).
<실시 예 3: 보존(consensus) 서열 데이터베이스의 코돈 최적화(codon optimization) 진행>
실시 예 2의 보존 염기 서열들을 인간의 코돈에 맞게 최적화를 진행하였다. 코돈 최적화된 서열은 하기 표 1과 같다. pUC57 벡터에 상기 코돈 최적화된 보존 서열을 삽입하였다
계통군 염기 서열 서열 목록
2.2.1.2 gaccagatctgcatcggctaccacgccaacaacagcaccgaacaggtggacaccatcatggaaaaaaacgtgaccgtgacacacgcccaggacatcctggaaaagacccacaacggcaagctgtgcaacctggacggcgtgaagcctctgatcctgagagactgttctgtggccggatggctgctgggcaaccctatgtgtgacgagttcctgaacgtgcccgagtggtcctacatcgtcgagaagatcaaccccgccaacgacctgtgctaccccggcaacttcaacgactacgaggaactgaagcacctcctgagcagaatcaaccactttgagaagatccagatcatccccaaggactcttggagcgaccatgaggccagcggagtcagctctgcatgtccataccagggcagaagcagcttcttcagaaacgtcgtgtggctgaccaagaagaacgacgcttaccccaccatcaagaagtcctacaacaacaccaatcaagaggacctgctggtgctgtggggcatccaccatcctaacgatgccgccgagcagaccagactgtaccagaatcctaccacctacatcagcgtgggcaccagcacactgaaccagagactggtgcctaagatcgccaccagatccaaagtgaacggccagagcggcaggatggaatttttctggaccatcctgaagtctaacgacgccatcaacttcgagagcaacggcaactttatcgcccctgagaacgcctacaagatcgtgaagaagggcgacagcacaatcatgaagtctgagctggaatactccaactgcaacaccaagtgtcagacccctatcggcgctatcaacagcagcatgcccttccacaacatccatcctctgaccatcggcgagtgccccaaatatgtgaagtccaaccgcctggtgctggccaccggactgagaaattctccacagggcgagaagcgcagaaagaagagaggcctgtttggcgctatcgccggctttatcgaaggcggctggcaaggcatggtggacggatggtacggataccaccacagcaacgagcaaggctctggctacgccgccgacaaagagtctacacagagggctatcgatggcgtgaccaacaaagtgaatagcatcatcgacaagatgaacacccagttcgaggccgtgggcagagagttcaacaacctggaaagaaggatcgagaacctgaacaagaaaatggaagatggcttcctggacgtgtggacctacaacgctgagctgctggtcctgatggaaaacgagagaaccctggacttccacgactccaacgtgaagaacctgtacgacaaagtgcggctgcagctgagagacaacgccaaagaactcggcaacggctgcttcgagttctaccacagatgcgacaacgagtgcatggaaagcgtgcggaacggcacctacgactaccctcagtacagcgaggaagccagactgaagagagaagagatcagcgga 서열번호 4
2.3.2.1 gaccacatctgcatcggctaccacgccaacaacagcaccgaacaggtggacaccatcatggaaaaaaacgtgaccgtgacacacgcccaggacatcctggaaaagacccacaacggcaagctgtgcgacctgaacggcgtgaagcctctgatcctgaaggactgttctgtggccggatggctgctgggcaaccctctgtgtgacgagttcaccaacgtgcccgagtggtcctacatcgtcgagaaggctaaccccgccaacgacctgtgttaccccggcaacttcaacgactacgaggaactgaagcacctcctgagcagaatcaaccacttcgagaagatccagatcatccccaaggactcttggagcgatcacgaagccagcctgggagtgtctgctgcctgtagctaccagggcaacagcagcttcttcagaaacgtcgtgtggctgatcaagaaggacaacgcttaccccaccattaagaagggctacaacaacaccaaccgcgaggacctgctgatcctgtggggaatccaccatcctaacgacgaggccgagcagaccagactgtaccagaatcctaccacctacatcagcatcggaaccagcacactgaaccagagactggtgcccaagatcgccaccagaagcaagatcaacggccagagcggcagaatcgacttcttctggaccatcctgaagccaaacgacgccatccactttgagagcaacggcaactttatcgcccctgagtacgcctacaagatcgtgaagaagggcgacagcacaatcatgagaagcgaggtggaatacggcaactgcaacaccaggtgtcagacccctatcggcgccatcaactccagcatgcccttccacaacatccatcctctgaccatcggcgagtgccccaaatacgtgaagtccaacaagctggtgctggccaccggcctgagaaactctccacagcgcgagcgcagaagaaagagaggcctgtttggcgctatcgccggctttatcgaaggcggctggcaaggcatggtggacggatggtacggataccaccacagcaacgagcaaggctctggctacgccgccgacaaagagagcacacagaaagccatcgacggcgtgaccaacaaagtgaacagcatcatcgacaagatgaacacccagttcgaggccgtgggcagagagttcaacaacctggaaagaaggatcgagaacctgaacaagaaaatggaagatggcttcctggacgtgtggacctacaacgctgagctgctggtcctgatggaaaacgagagaaccctggacttccacgactccaacgtgaagaacctgtacgacaaagtgcggctgcagctgaaggataacgccaaagaactcggcaacggctgcttcgagttctaccacaagtgcaacaacgagtgcatggaaagcgtgcggaacggcacctacgactaccctcagtacagcgaggaagccagactgaagagagaagagatcagcgga 서열번호 5
2.3.4.4 gaccagatctgcatcggctaccacgccaacaacagcaccaaacaggtggacaccatcatggaaaaaaacgtgaccgtgacacacgcccaggacatcctggaaaagacccacaacggcaagctgtgcgacctgaacggcgtgaagcctctgatcctgaaggactgttctgtggccggatggctgctgggcaaccctatgtgtgacgagttcatcagagtgcccgagtggtcctacatcgtggaaagagctaaccccgccaacgacctgtgctaccctggcacactgaacgactacgaggaactgaagcacctcctgagcagaatcaaccacttcgagaaaaccctgatcatccccaagagcagctggcccaaccacgagacatctctgggagtgtctgccgcatgtccataccagggcgctcccagcttcttcagaaacgtcgtgtggctgatcaagaagaacgacgcttaccccaccatcaagatcagctacaacaacaccaaccgcgaggacctgctgatcctgtggggaatccaccactctaacaacgccgccgagcagaccaacctgtacaagaaccctgacacctacgtgtccgtgggcacaagcaccctgaaccagagactggtgcccaagatcgccaccagatctcaagtgaacggccagaggggcagaatggacttcttctggaccatcctgaagcctaacgacgccatccactttgagagcaacggcaactttatcgcccctgagtacgcctacaagatcgtgaagaagggcgacagcacaatcatgaagtccgagatggaatacggccactgcaacaccaagtgtcagacccctatcggcgccatcaactccagcatgcccttccacaacatccatcctctgaccatcggcgagtgccccaaatacgtgaagtccaacaagctggtgctggccaccggcctgagaaactctccactgagagagcgcagaagaaagcggggcctgtttggcgctatcgccggctttattgaaggcggctggcaaggcatggtggacggatggtacggctatcaccacagcaacgagcaaggctctggctacgccgctgacaaagagagcacccagaaagccatcgacggcgtgaccaacaaagtgaacagcatcatcgacaagatgaacacccagttcgaggccgtgggcagagagttcaacaacctggaaagaaggatcgagaacctcaacaagaaaatggaagatggcttcctggacgtgtggacctacaacgctgagctgctggtcctgatggaaaacgagagaaccctggacttccacgacagcaacgtgaagaacctgtacgacaaagtgcggctgcagctgagagacaacgccaaagaactcggcaacggctgcttcgagttctaccacaagtgcgacaacgagtgcatggaaagcgtgcggaacggcacctacgactaccccaagtacagcgaggaagccagactgaagagagaagagatcagcgga 서열번호 6
<실시 예 4: 코돈 최적화된 보존(consensus) 서열을 포함하는 벡터 제작>
1. 벡터 pTV3 제조
도 5를 참조하여 pTV3 벡터의 제조 과정을 설명한다. pMT2 (Sambrook, et al., Molecular cloning 2nd Ed., vol 3: 16.20; Kaufman RJ, et al., Mol. Cell Biol. 9,946-958, (1989)) 2 ug을 HpaI 및 NheI 제한효소로 잘라내고 클레노우(Klenow) 단편 (New England Biolabs)(5 unit)과 최종 100 μM이 되도록 dNTP(Takara)를 넣은 후 25℃에서 30분 처리하여 평활말단(blunt end)을 만들었다. 아가로즈겔 전기영동한 후 0.7kb 단편 (VAI 전체와 SV40 polyA 일부를 포함)을 벡터 pTV2 (Lee, et al., J. Virol., 72,8430-36, (1998))의 SV40 polyA 부분의 독특한 HpaI 부위에 삽입 접합하여 5.3kb의 벡터 pTV3을 제조하였다.
2. 벡터 pGX-1의 제조
도 5를 참조하여 pGX-1 벡터의 제조 과정을 설명한다. 상기 제작된 벡터 pTV3을 주형으로 하여 하기 표 2의 CMV5 및 VA3 프라이머로 중합효소 연쇄반응(PCR)하고 PCR 산물 (2.0kb)을 NruI 제한 효소로 절단하였다. 제한효소의 처리 방법은 상술한 HpaI를 사용한 방법과 동일하다.
CMV5 5'-TCG CGA CCC GGG CGA CGG CCA GTG AAT TGT ACC G-3' (Sense)
VA3 5'-TCG CGA GGC GCG CCA CGA GCC GCC GCG CCT GGA AGG-3' (Antisense)
Zero5 5'-AAT ATT GTC GAC TTC AGA AGA ACT CGT CAA GAA G-3' (Sense)
Zero3 5'-AAT ATT GGG CCC GAA CAT GTG AGC AAA AGG CCA G-3' (Antisense)
또한, 벡터 pZero-2 (Invtrogen)을 주형으로 하여 상기 표 2의 Zero5 및 Zero3 프라이머로 앞에 기재된 PCR 증폭 방법으로 증폭시키고 그 증폭된 산물을 SspI으로 분해시킨 다음 DNA 단편 (1.8kb)을 위의 PCR 단편 (2.0kb)과 연결하여 3.8kb의 벡터 pGX-1을 제조하였다.
3. 벡터 pGX-10의 제조
도 6을 참조하여 pGX-10 벡터의 제조 과정을 설명한다. 벡터 pGX-1을 제한효소 XbaI 및 SalI으로 자른 후, 두 개의 절편 중 큰 크기 (3.1kb)의 DNA를 상기 DNA 절편의 접합 및 대장균의 형질전환 방법에서와 같이 분리하였다. 벡터 pGL3-Enhancer (Promega)를 제한효소 XbaI 및 SalI으로 잘라서 생성되는 두 개의 절편 중 작은 절편 (0.5kb)을 위와 같은 방법으로 분리하였다. 두 분리된 절편을 결합하여 벡터 pGX-10을 얻었다
4. pGX-10/tPAco PA 6His 제조
도 7을 참조하여 pGX-10/tPAco PA 6His 플라스미드를 제조하는 과정을 설명한다. pGX-10/tPAco HA는 편의를 위해 pGX-10/tPA HA로 지칭될 수 있다. 상기 pGX-10 벡터의 KpnI 사이트를 아이소스키조머(isoschizomer) 제한효소인 Asp718로 잘라 선형 단편으로 만든 뒤, 클레노우(Klenow) 효소를 이용하여 평활말단(blunt end)을 만들었다. 이후 정제한 DNA를 self-ligation 하여 KpnI 사이트가 제거된 pGX-10을 제조하였다.
진핵세포에 코돈 최적화된 tissue plasminogen activator의 리더 서열(tPAco), 인플루엔자 PA (CY147539.1) 유전자 ORF 전장, 6His tag 서열이 포함된 DNA를 합성하였다. 합성한 DNA를 EcoRI, XhoI 제한효소를 이용하여 약 2.2kb 단편을 분리하였다. 상기 KpnI 사이트가 제거된 pGX-10 벡터를 EcoRI, XhoI 제한효소를 이용하여 절단하고(약 3.6kb 단편을 분리), 상기 2.2kb 단편과 ligation 하여 pGX-10/tPAco PA 6His 벡터를 제조하였다.
5. pGX-10/HA 백신 플라스미드 제조
도 8을 참조하여 pGX-10/HA 백신 플라스미드를 제조하는 방법을 설명한다. 상기 실시 예 3에서 제조한 인플루엔자 바이러스 clade 2.2.1.2, 2.3.2.1, 또는 2.3.4.4 HA 서열(코돈 최적화된 보존 서열)이 삽입된 pUC57 벡터를 준비하였다. HA 서열 중에서 신호 서열부터 막투과(TM) 도메인까지의 범위에 해당하는 약 1.5kb 서열을 하기 표 3의 프라이머를 이용하여 중합효소 연쇄반응(PCR)으로 증폭하였다. 증폭된 산물을 NheI, XhoI 제한효소로 절단하여 약 1.5kb 크기의 단편을 얻었다.
2.2.1.2 HA Sense ATCTAAGCTAGCGACCAGATCTGCATCGGC
2.2.1.2 HA Antisense ATCTAACTCGAGTTATCCGCTGATCTCTTCTCT
2.3.2.1 HA Sense ATCTAAGCTAGCGACCACATCTGCATCGGC
2.3.2.1 HA Antisense ATCTAACTCGAGTTATCCGCTGATCTCTTCTCT
2.3.4.4 HA Sense ATCTAAGCTAGCGACCAGATCTGCATCGGC
2.3.4.4 HA Antisense ATCTAACTCGAGTTATCCGCTGATCTCTTCTCT
상기 pGX-10/tPAco PA 6His를 NheI과 XhoI 제한효소로 절단하여 약 3.68kb 크기의 단편을 얻었다.
상기 약 1.5kb 크기의 단편 및 pGX-10/tPAco PA 6His 절편을 ligase로 결합하여 pGX-10/tPA HA(2.2.1.2)를 제조하였다. pGX-10/tPA HA (2.3.2.1), pGX-10/tPA HA (2.3.4.4)도 상기 pGX-10/tPA HA(2.2.1.2)와 같은 방법으로 제조하였다.
하기 표 4를 참조하면 pGX-10/tPA HA(2.2.1.2), pGX-10/tPA HA (2.3.2.1), 및 pGX-10/tPA HA (2.3.4.4)의 서열은 5’UTR(untranslated region), Signal peptide, 코돈 최적화된 보존서열, 막횡단 부위, 세포질 도메인 서열(Transmembrane + cytoplasmic domain), 및 3’UTR 순서로 연결된 염기 서열을 포함한다.
5’UTR Signal peptide Codon optimizing consensus region TM+cytoplasmic domain 3’UTR
pGX-10/tPA HA(2.2.1.2) 서열번호 7 서열번호 13 서열번호 4 서열번호 14 서열번호 10
pGX-10/tPA HA(2.3.2.1) 서열번호 8 서열번호 13 서열번호 5 서열번호 15 서열번호 11
pGX-10/tPA HA(2.3.4.4) 서열번호 9 서열번호 13 서열번호 6 서열번호 16 서열번호 12
pGX-10/tPA HA(2.2.1.2), pGX-10/tPA HA (2.3.2.1), 및 pGX-10/tPA HA (2.3.4.4)에 포함된 5’UTR, signal peptide, HA, TM+Cytoplasmic, 및 3’UTR 서열은 하기 표 5와 같다.
pGX-10/tPA HA(2.2.1.2) 5’UTR:
AGCAAAAGCAGGGGTTCAATTTGTCAAA

Signal peptide:
ATGGAAAAGATCGTGCTGCTGCTGGCCATCGTGTCCATCGTGAAGTCC

HA: GACCAGATCTGCATCGGCTACCACGCCAACAACAGCACCGAACAGGTGGACACCATCATGGAAAAAAACGTGACCGTGACACACGCCCAGGACATCCTGGAAAAGACCCACAACGGCAAGCTGTGCAACCTGGACGGCGTGAAGCCTCTGATCCTGAGAGACTGTTCTGTGGCCGGATGGCTGCTGGGCAACCCTATGTGTGACGAGTTCCTGAACGTGCCCGAGTGGTCCTACATCGTCGAGAAGATCAACCCCGCCAACGACCTGTGCTACCCCGGCAACTTCAACGACTACGAGGAACTGAAGCACCTCCTGAGCAGAATCAACCACTTTGAGAAGATCCAGATCATCCCCAAGGACTCTTGGAGCGACCATGAGGCCAGCGGAGTCAGCTCTGCATGTCCATACCAGGGCAGAAGCAGCTTCTTCAGAAACGTCGTGTGGCTGACCAAGAAGAACGACGCTTACCCCACCATCAAGAAGTCCTACAACAACACCAATCAAGAGGACCTGCTGGTGCTGTGGGGCATCCACCATCCTAACGATGCCGCCGAGCAGACCAGACTGTACCAGAATCCTACCACCTACATCAGCGTGGGCACCAGCACACTGAACCAGAGACTGGTGCCTAAGATCGCCACCAGATCCAAAGTGAACGGCCAGAGCGGCAGGATGGAATTTTTCTGGACCATCCTGAAGTCTAACGACGCCATCAACTTCGAGAGCAACGGCAACTTTATCGCCCCTGAGAACGCCTACAAGATCGTGAAGAAGGGCGACAGCACAATCATGAAGTCTGAGCTGGAATACTCCAACTGCAACACCAAGTGTCAGACCCCTATCGGCGCTATCAACAGCAGCATGCCCTTCCACAACATCCATCCTCTGACCATCGGCGAGTGCCCCAAATATGTGAAGTCCAACCGCCTGGTGCTGGCCACCGGACTGAGAAATTCTCCACAGGGCGAGAAGCGCAGAAAGAAGAGAGGCCTGTTTGGCGCTATCGCCGGCTTTATCGAAGGCGGCTGGCAAGGCATGGTGGACGGATGGTACGGATACCACCACAGCAACGAGCAAGGCTCTGGCTACGCCGCCGACAAAGAGTCTACACAGAGGGCTATCGATGGCGTGACCAACAAAGTGAATAGCATCATCGACAAGATGAACACCCAGTTCGAGGCCGTGGGCAGAGAGTTCAACAACCTGGAAAGAAGGATCGAGAACCTGAACAAGAAAATGGAAGATGGCTTCCTGGACGTGTGGACCTACAACGCTGAGCTGCTGGTCCTGATGGAAAACGAGAGAACCCTGGACTTCCACGACTCCAACGTGAAGAACCTGTACGACAAAGTGCGGCTGCAGCTGAGAGACAACGCCAAAGAACTCGGCAACGGCTGCTTCGAGTTCTACCACAGATGCGACAACGAGTGCATGGAAAGCGTGCGGAACGGCACCTACGACTACCCTCAGTACAGCGAGGAAGCCAGACTGAAGAGAGAAGAGATCAGCGGA

TM+Cytoplasmic domains:
GTGAAGCTGGAATCCATCGGCACATACCAGATCCTGAGCATCTACAGCACCGTGGCCTCTTCTCTGGCCCTGGCTATTATGGTGGCTGGCCTGAGCCTGTGGATGTGCTCTAACGGCAGCCTGCAGTGCAGAATCTGCATCTAA

3’UTR:
ATTTGTGAGTTCAAATTGTAGTTAAAAACACCCTTGTTTCTACT
pGX-10/tPA HA(2.3.2.1) 5’UTR:
AGCAAAAGCAGGGGTTCACTCTGTCAAA

Signal Peptide:
ATGGAAAAGATCGTGCTGCTGTTCGCCACCATCAGCCTGGTCAAGAGC

HA:
GACCACATCTGCATCGGCTACCACGCCAACAACAGCACCGAACAGGTGGACACCATCATGGAAAAAAACGTGACCGTGACACACGCCCAGGACATCCTGGAAAAGACCCACAACGGCAAGCTGTGCGACCTGAACGGCGTGAAGCCTCTGATCCTGAAGGACTGTTCTGTGGCCGGATGGCTGCTGGGCAACCCTCTGTGTGACGAGTTCACCAACGTGCCCGAGTGGTCCTACATCGTCGAGAAGGCTAACCCCGCCAACGACCTGTGTTACCCCGGCAACTTCAACGACTACGAGGAACTGAAGCACCTCCTGAGCAGAATCAACCACTTCGAGAAGATCCAGATCATCCCCAAGGACTCTTGGAGCGATCACGAAGCCAGCCTGGGAGTGTCTGCTGCCTGTAGCTACCAGGGCAACAGCAGCTTCTTCAGAAACGTCGTGTGGCTGATCAAGAAGGACAACGCTTACCCCACCATTAAGAAGGGCTACAACAACACCAACCGCGAGGACCTGCTGATCCTGTGGGGAATCCACCATCCTAACGACGAGGCCGAGCAGACCAGACTGTACCAGAATCCTACCACCTACATCAGCATCGGAACCAGCACACTGAACCAGAGACTGGTGCCCAAGATCGCCACCAGAAGCAAGATCAACGGCCAGAGCGGCAGAATCGACTTCTTCTGGACCATCCTGAAGCCAAACGACGCCATCCACTTTGAGAGCAACGGCAACTTTATCGCCCCTGAGTACGCCTACAAGATCGTGAAGAAGGGCGACAGCACAATCATGAGAAGCGAGGTGGAATACGGCAACTGCAACACCAGGTGTCAGACCCCTATCGGCGCCATCAACTCCAGCATGCCCTTCCACAACATCCATCCTCTGACCATCGGCGAGTGCCCCAAATACGTGAAGTCCAACAAGCTGGTGCTGGCCACCGGCCTGAGAAACTCTCCACAGCGCGAGCGCAGAAGAAAGAGAGGCCTGTTTGGCGCTATCGCCGGCTTTATCGAAGGCGGCTGGCAAGGCATGGTGGACGGATGGTACGGATACCACCACAGCAACGAGCAAGGCTCTGGCTACGCCGCCGACAAAGAGAGCACACAGAAAGCCATCGACGGCGTGACCAACAAAGTGAACAGCATCATCGACAAGATGAACACCCAGTTCGAGGCCGTGGGCAGAGAGTTCAACAACCTGGAAAGAAGGATCGAGAACCTGAACAAGAAAATGGAAGATGGCTTCCTGGACGTGTGGACCTACAACGCTGAGCTGCTGGTCCTGATGGAAAACGAGAGAACCCTGGACTTCCACGACTCCAACGTGAAGAACCTGTACGACAAAGTGCGGCTGCAGCTGAAGGATAACGCCAAAGAACTCGGCAACGGCTGCTTCGAGTTCTACCACAAGTGCAACAACGAGTGCATGGAAAGCGTGCGGAACGGCACCTACGACTACCCTCAGTACAGCGAGGAAGCCAGACTGAAGAGAGAAGAGATCAGCGGA

TM+Cytoplasmic Domains:
GTGAAGCTGGAATCCATCGGCATCTACCAGATCCTGAGCATCTACAGCACCGTGGCCTCTTCTCTGGTCCTGGCTATCATGATGGCCGGCCTGTCTCTGTGGATGTGCAGCAACGGAAGCCTGCAGTGCAGAATCTGCATCTAA

3’UTR:
GTTTGTGAATTCAGATTGTAGTTAAAAACACCCTTGTTTCTACT
pGX-10/tPA HA(2.3.4.4) 5’UTR:
AGCAAAAGCAGGGGTTCAATTTGTCAAA

Signal Peptide:
ATGGAAAAGATCGTGCTGCTGCTGGCCGTGGTGTCCCTGGTCAAAAGC

HA:
GACCAGATCTGCATCGGCTACCACGCCAACAACAGCACCAAACAGGTGGACACCATCATGGAAAAAAACGTGACCGTGACACACGCCCAGGACATCCTGGAAAAGACCCACAACGGCAAGCTGTGCGACCTGAACGGCGTGAAGCCTCTGATCCTGAAGGACTGTTCTGTGGCCGGATGGCTGCTGGGCAACCCTATGTGTGACGAGTTCATCAGAGTGCCCGAGTGGTCCTACATCGTGGAAAGAGCTAACCCCGCCAACGACCTGTGCTACCCTGGCACACTGAACGACTACGAGGAACTGAAGCACCTCCTGAGCAGAATCAACCACTTCGAGAAAACCCTGATCATCCCCAAGAGCAGCTGGCCCAACCACGAGACATCTCTGGGAGTGTCTGCCGCATGTCCATACCAGGGCGCTCCCAGCTTCTTCAGAAACGTCGTGTGGCTGATCAAGAAGAACGACGCTTACCCCACCATCAAGATCAGCTACAACAACACCAACCGCGAGGACCTGCTGATCCTGTGGGGAATCCACCACTCTAACAACGCCGCCGAGCAGACCAACCTGTACAAGAACCCTGACACCTACGTGTCCGTGGGCACAAGCACCCTGAACCAGAGACTGGTGCCCAAGATCGCCACCAGATCTCAAGTGAACGGCCAGAGGGGCAGAATGGACTTCTTCTGGACCATCCTGAAGCCTAACGACGCCATCCACTTTGAGAGCAACGGCAACTTTATCGCCCCTGAGTACGCCTACAAGATCGTGAAGAAGGGCGACAGCACAATCATGAAGTCCGAGATGGAATACGGCCACTGCAACACCAAGTGTCAGACCCCTATCGGCGCCATCAACTCCAGCATGCCCTTCCACAACATCCATCCTCTGACCATCGGCGAGTGCCCCAAATACGTGAAGTCCAACAAGCTGGTGCTGGCCACCGGCCTGAGAAACTCTCCACTGAGAGAGCGCAGAAGAAAGCGGGGCCTGTTTGGCGCTATCGCCGGCTTTATTGAAGGCGGCTGGCAAGGCATGGTGGACGGATGGTACGGCTATCACCACAGCAACGAGCAAGGCTCTGGCTACGCCGCTGACAAAGAGAGCACCCAGAAAGCCATCGACGGCGTGACCAACAAAGTGAACAGCATCATCGACAAGATGAACACCCAGTTCGAGGCCGTGGGCAGAGAGTTCAACAACCTGGAAAGAAGGATCGAGAACCTCAACAAGAAAATGGAAGATGGCTTCCTGGACGTGTGGACCTACAACGCTGAGCTGCTGGTCCTGATGGAAAACGAGAGAACCCTGGACTTCCACGACAGCAACGTGAAGAACCTGTACGACAAAGTGCGGCTGCAGCTGAGAGACAACGCCAAAGAACTCGGCAACGGCTGCTTCGAGTTCTACCACAAGTGCGACAACGAGTGCATGGAAAGCGTGCGGAACGGCACCTACGACTACCCCAAGTACAGCGAGGAAGCCAGACTGAAGAGAGAAGAGATCAGCGGA

TM+Cytoplasmic Domains:
GTGAAGCTGGAATCCATCGGCACATACCAGATCCTGAGCATCTACAGCACCGTGGCCTCTTCTCTGGCCCTGGCTATCATTGTGGCTGGCCTGAGCCTGTGGATGTGCAGCAATGGCAGCCTGCAGTGCAGAATCTGCATCTAA

3’UTR:
ATTTGTGAGTTCAAATTGTAGTTAAAAACACCCTTGTTTCTACT
<실험 예 1: DNA 백신 접종 및 항혈청 제작>
마우스들을 G1 내지 G6의 6개 군으로 나누고, 각각의 마우스군에 실시 예 4에서 제작한 벡터 pGX-10/tPA HA(2.2.1.2), pGX-10/tPA HA(2.3.2.1), 및 pGX-10/tPA HA(2.3.4.4)를 투여하였다(하기 표 6 참조).
마우스군 투여 물질
G1 Empty vector(Negative control)
G2 pGX-10/tPA HA(2.2.1.2)
G3 pGX-10/tPA HA(2.3.2.1)
G4 pGX-10/tPA HA(2.3.4.4)
G5 3가 백신(pGX-10/tPA HA(2.2.1.2), pGX-10/tPA H (2.3.2.1), 및 pGX-10/tPA HA(2.3.4.4) 포함)
G6 H5N8 HA 염기서열 DNA 백신 (W468, 서열번호 20)
상기 실시 예 4의 벡터를 1x PBS에 0.2 ㎍/㎕ 농도로 희석하여 C57bl/6J 8주령 암컷 생쥐의 왼쪽 대퇴부 안쪽 근육에 50 ㎕(10 ㎍ DNA)만큼 주사하였다. 주사 직후 전기 천공기에 연결된 전극을 주사 부위 양쪽에 동시에 꽂은 후, 50 V의 전압을 가하여 전기 자극을 수행하였다.
마우스 군들을 안정시킨 후, 마우스 의 안와 정맥으로부터 혈액을 채취하여 항혈청을 분리하였다. 분리된 항혈청은 후술하는 HI/MN 분석에 이용되었다
<실험 예 2: clade 2.2 H5N1 항원(W149)에 대한 HI/MN 분석 결과>
W149 백신주(서열번호 21)는 계통군(Clade) 2.2 H5N1 항원으로서 2006년 국내 야생철새에서 분리한 바이러스의 HA 및 NA 유전자를 이용하여 백신주로 만든 것이다.
HI/MN 분석에 사용된 RDE 처리된 혈청(Serum)은 RDE(Receptor Destroying Enzyme, Seiken, Japan)과 혈청을 부피를 기준으로 3:1로 혼합하고(예: 150 ㎕:50 ㎕), 혼합물을 37℃에서 18 내지 20시간 효소 반응(incubation)시키고, 56℃에서 30분간 가열하여 효소 불활성화(inactivation)하고, 부피 기준 6배의 PBS(1X)를 혼합하여 준비하였다.
HI 분석(Hemagglutination Inhibition Assay)은 다음과 같은 방법으로 실시하였다. 96 Well U-Bottom plate에 25 ㎕의 PBS를 투입하고, PBS가 담긴 well에 RDE 처리된 혈청 25 ㎕를 투입하여 2배 단계로 희석한다. 4 내지 8 HAU(Hemagglutinin Unit)으로 맞춘 Virus(Antigen)를 웰의 행마다 HAU 별로 구별하여 각각 25 ㎕만큼 투입하고 37℃에서 30 내지 40분간 정치(incubation)시켰다. 각 well에 0.5% RBC(chicken) 50 ㎕를 넣어주고, 30 내지 40분간 정치(incubation)시킨 후 titer를 확인하였다.
도 9는 G1 내지 G6 로부터 얻은 항혈청에 대해 W149 백신주를 처리하고 HI 분석(Hemagglutination inhibition assay)한 결과를 도시한 것이다. 도 9를 참조하면, pGX-10/tPA HA(2.2.1.2)를 접종한 마우스군(G2)에서 얻은 혈청이 가장 높은 항체가를 나타냄을 알 수 있었다.
MN(Micro Neutralization Assay) 분석은 다음과 같은 방법으로 실시하였다. 96 well plate의 각 well에 1.5X106 cells/ml의 MDCK cell을 투입하고, 18 내지 22시간 배양 후 약 80% 정도의 monolayer cell을 확인하였다. 불활성화(56℃에서 30분 처리)시킨 혈청을 90 ㎕의 diluent(MEM, 1% BSA, 1% antibiotics)가 분주된 96 well plate의 첫번째 열의 well에 10 ㎕씩 투입하였다. 첫번째 열의 well에서 50 ㎕를 취해 다음 열의 well로 2배씩 희석을 실시하고, 100TCID 50/ml의 인플루엔자 바이러스 50 ㎕를 첨가한 후 37℃, 5%의 CO2 조건에서 1 시간 동안 배양하였다. 배양 후 바이러스 혈청 혼합액을 감염시키고 37℃, 5%의 CO2 조건에서 배양 후 CPE를 관찰하고 HA test를 수행하여 바이러스 역가를 결정하였다.
도 10은 G1 내지 G6 로부터 얻은 항혈청에 대해 W149 백신주를 처리한 MN(Micro-neutralization) 분석 결과를 도시한 것이다. 도 10을 참조하면 pGX-10/tPA HA(2.2.1.2)를 접종한 마우스군(G2)에서 얻은 혈청이 가장 높은 항체가를 나타냄을 알 수 있었다.
또한 도 9 및 도 10을 참조하면, pGX-10/tPA HA(2.3.2.1)을 접종한 마우스군(G3)에서 얻은 혈청 또한 유의미한 중화항체가를 나타냄을 알 수 있었다.
상기 HI 분석 및 MN 분석 결과, 계통군 2.2.1.2의 코돈 최적화된 보존 서열을 포함하는 pGX-10/tPA HA(2.2.1.2)가 계통군 2.2에 대해서 교차 계통군 면역 반응을 나타냄을 알 수 있었다. 또한 계통군 2.3.2.1의 코돈 최적화된 보존 서열을 포함하는 pGX-10/tPA HA(2.3.2.1)가 계통군 2.2에 대해서 교차 계통군 면역 반응을 나타냄을 알 수 있었다.
<실험 예 3: clade 2.3.2 H5N1 항원(W401)에 대한 HI/MN 분석 결과>
계통군(clade) 2.3.2 H5N1 항원(서열번호 23)은 2008년 한국(south korea)의 야생 철새에서 분리한 바이러스의 HA 및 NA 유전자를 이용하여 백신주로 만든 것으로서, W401 백신주(서열번호 22)로 지칭될 수 있다.
도 5는 G1 내지 G6 로부터 얻은 항혈청에 대해 W401 백신주를 처리한 HI(Hemagglutination inhibition assay) 분석 결과를 도시한 것이다. 실험 방법은 W401 백신주를 처리한 것을 제외하고 상기 실험 예 2와 동일하게 진행하였다. 도 5를 참조하면, pGX-10/tPA HA(2.3.2.1)를 접종한 마우스군(G3)에서 얻은 혈청이 가장 높은 항체가를 나타냄을 알 수 있었다.
도 6은 G1 내지 G6 로부터 얻은 항혈청에 대해 W401 백신주를 처리한 MN(Micro-neutralization) 분석 결과를 도시한 것이다. 실험 방법은 W401 백신주를 처리한 것을 제외하면 상기 실시 예 2와 동일하게 진행하였다. 도 6을 참조하면 pGX-10/tPA HA(2.3.2.1)를 접종한 마우스군(G3)에서 얻은 혈청이 가장 높은 항체가를 나타냄을 알 수 있었고, HI 분석보다 MN 분석에서 더욱 유의미한 중화항체가를 나타내었다.
상기 HI 분석 및 MN 분석 결과, 계통군 2.3.2.1의 코돈 최적화된 보존 서열을 포함하는 pGX-10/tPA HA(2.3.2.1)가 계통군 2.3.2에 대해서 교차 계통군 면역 반응을 나타냄을 알 수 있었다.
<실험 예 4: clade 2.3.4.4 H5N6 항원(WHO 개발 백신주)에 대한 HI/MN 분석 결과>
계통군(clade) 2.3.4.4 H5N6 항원은 H5Nx 바이러스에 의한 범유행(Pandemic)을 대비하여 WHO에서 개발한 백신주로서, 이하 WHO 백신주로 지칭될 수 있다.
도 7은 G1 내지 G6 로부터 얻은 항혈청에 대해 WHO 백신주를 처리한 HI(Hemagglutination inhibition assay) 분석 결과를 도시한 것이다. 실험 방법은 상기 WHO 백신주를 처리한 것을 제외하고 상기 실험 예 2와 동일하게 진행하였다. 도 7을 참조하면, pGX-10/tPA HA(2.3.4.4)를 접종한 마우스군(G4)에서 얻은 혈청이 가장 높은 항체가를 나타냄을 알 수 있었다.
도 8은 G1 내지 G6 로부터 얻은 항혈청에 대해 상기 WHO 백신주를 처리한 MN(Micro-neutralization) 분석 결과를 도시한 것이다. 실험 방법은 상기 WHO 백신주를 처리한 것을 제외하면 상기 실험 예 2와 동일하게 진행하였다. 도 8을 참조하면 pGX-10/tPA HA(2.3.4.4)를 접종한 마우스군(G4)에서 얻은 혈청이 가장 높은 항체가를 나타냄을 알 수 있었다.
상기 HI 분석 및 MN 분석 결과, 계통군 2.3.4.4의 코돈 최적화된 보존 서열을 포함하는 pGX-10/tPA HA(2.3.4.4)가 계통군 2.3.4.4에 대해서 면역 반응을 나타냄을 알 수 있었다.
<실험 예 5: 마우스 생존 시험>
마우스를 6개 그룹으로 나누어 하기 표 7에 따라 백터를 투여하였다. 벡터의 주입은 실험 예 1과 동일한 방법으로 하였다.
Group 1(G1)(N.C.) pGX-10 (10 ㎍)
Group 2(G2) pGX-10/HA (2.2.1.2) (10 ㎍)
Group 3(G3) pGX-10/HA (2.3.2.1) (10 ㎍)
Group 4(G4) pGX-10/HA (2.3.4.4) (10 ㎍)
Group 5(G5) pGX-10/HA (2.2.1.2)(10 ㎍) + pGX-10/HA (2.2.1.2)(10 ㎍) + pGX-10/HA (2.2.1.2) (10 ㎍), 총 30 ㎍
Group 6(G6)(P.C.) maH5N8(10LD50) clade 2.3.4.4 바이러스 사백신(inactivated vaccine)
마우스 생존 시험은 상기 표 7의 그룹들에 대해 하기 표 8의 실험 일정으로 진행하였다.
1주차(Day 0) 1차 백신 투여
3주차(Day 21) 2차 백신 투여
5주차(Day 35) maH5N8(10LD50) clade 2.3.4.4 바이러스 접종
7주차(Day 49) 5주차 이후로 2주간 마우스의 체중 변화 및 생존률 관찰
도 15는 상기 표 8의 일정에 따라 진행한 생존 실험에서, G1, G2, 및 G6의 마우스의 체중 변화를 비교한 것이다.
도 16은 상기 표 8의 일정에 따라 진행한 생존 실험에서, G1, G3, 및 G6의 마우스의 체중 변화를 비교한 것이다.
도 17은 상기 표 8의 일정에 따라 진행한 생존 실험에서, G1, G4, G5 및 G6의 마우스의 체중 변화를 비교한 것이다.
도 18은 상기 표 8의 일정에 따라 진행한 생존 실험에서, 상기 도 15 내지 상기 도 17의 결과를 합한 것이다.
도 19는 상기 표 7의 마우스 그룹들이 계통군 2.3.4.4의 바이러스에 감염 후 생존률을 나타낸 것이다.
상기 도 15 및 도 19를 참조하면, pGX-10/HA (2.2.1.2)를 접종한 G2 마우스들은 체중이 일시적으로 감소하였고, 생존률이 약 70% 였다. 백신을 접종하지 않은 G1과 비교하면, pGX-10/HA (2.2.1.2) 벡터는 계통군 2.3.4.4 H5 인플루엔자 바이러스에 대해 교차 계통군 면역 반응(partial cross clade protection)을 나타냄을 알 수 있다.
상기 도 16 및 도 19를 참조하면, pGX-10/HA (2.3.2.1)를 접종한 G3 마우스들은 체중이 일시적으로 감소하였고, 생존률이 80% 이상이었다. 백신을 접종하지 않은 G1와 G2를 비교하면, pGX-10/HA (2.3.2.1) 벡터는 계통군 2.3.4.4 H5 인플루엔자 바이러스에 대해 교차 계통군 면역 반응(partial cross clade protection)을 나타냄을 알 수 있다.
상기 도 17 및 도 19를 참조하면, pGX-10/HA (2.3.4.4)를 접종한 G4 마우스들은 체중 감소가 거의 없고 생존률이 100% 였다. pGX-10/HA (2.2.1.2), pGX-10/HA (2.3.2.1), 및 pGX-10/HA (2.3.4.4) 벡터가 모두 포함된 3가 백신을 접종한 G5는 약간의 체중 감소가 관찰되었으나 유의미한 차이라고 평가되기는 어렵고, 생존률은 100% 였다. 이는 감염된 바이러스와 접종된 벡터의 계통군이 일치하기 때문이며, 우수한 방어 효능을 나타낸 것으로 평가할 수 있다.
<110> Chungbuk National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> PEPTIDES, CODON OPTIMIZED SEQUENCE ENCODING THE SAME FOR TREATING OR PREVENTING OF H5 INFLUENZA, AND VACCINE USING THEREOF <130> DP-2019-0021-KR <160> 23 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 567 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Extracellular HA amino acid sequence of 2.2.1.2 <400> 1 Met Glu Lys Ile Val Leu Leu Leu Ala Ile Val Ser Ile Val Lys Ser 1 5 10 15 Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Glu Gln Val 20 25 30 Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ala Gln Asp Ile 35 40 45 Leu Glu Lys Thr His Asn Gly Lys Leu Cys Asn Leu Asp Gly Val Lys 50 55 60 Pro Leu Ile Leu Arg Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn 65 70 75 80 Pro Met Cys Asp Glu Phe Leu Asn Val Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Val 85 90 95 Glu Lys Ile Asn Pro Ala Asn Asp Leu Cys Tyr Pro Gly Asn Phe Asn 100 105 110 Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Leu Ser Arg Ile Asn His Phe Glu 115 120 125 Lys Ile Gln Ile Ile Pro Lys Asp Ser Trp Ser Asp His Glu Ala Ser 130 135 140 Gly Val Ser Ser Ala Cys Pro Tyr Gln Gly Arg Ser Ser Phe Phe Arg 145 150 155 160 Asn Val Val Trp Leu Thr Lys Lys Asn Asp Ala Tyr Pro Thr Ile Lys 165 170 175 Lys Ser Tyr Asn Asn Thr Asn Gln Glu Asp Leu Leu Val Leu Trp Gly 180 185 190 Ile His His Pro Asn Asp Ala Ala Glu Gln Thr Arg Leu Tyr Gln Asn 195 200 205 Pro Thr Thr Tyr Ile Ser Val Gly Thr Ser Thr Leu Asn Gln Arg Leu 210 215 220 Val Pro Lys Ile Ala Thr Arg Ser Lys Val Asn Gly Gln Ser Gly Arg 225 230 235 240 Met Glu Phe Phe Trp Thr Ile Leu Lys Ser Asn Asp Ala Ile Asn Phe 245 250 255 Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Asn Ala Tyr Lys Ile Val 260 265 270 Lys Lys Gly Asp Ser Thr Ile Met Lys Ser Glu Leu Glu Tyr Ser Asn 275 280 285 Cys Asn Thr Lys Cys Gln Thr Pro Ile Gly Ala Ile Asn Ser Ser Met 290 295 300 Pro Phe His Asn Ile His Pro Leu Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys Tyr 305 310 315 320 Val Lys Ser Asn Arg Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Ser Pro 325 330 335 Gln Gly Glu Lys Arg Arg Lys Lys Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala 340 345 350 Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Gln Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly 355 360 365 Tyr His His Ser Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Lys Glu 370 375 380 Ser Thr Gln Arg Ala Ile Asp Gly Val Thr Asn Lys Val Asn Ser Ile 385 390 395 400 Ile Asp Lys Met Asn Thr Gln Phe Glu Ala Val Gly Arg Glu Phe Asn 405 410 415 Asn Leu Glu Arg Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Met Glu Asp Gly 420 425 430 Phe Leu Asp Val Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Met Glu 435 440 445 Asn Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr 450 455 460 Asp Lys Val Arg Leu Gln Leu Arg Asp Asn Ala Lys Glu Leu Gly Asn 465 470 475 480 Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Arg Cys Asp Asn Glu Cys Met Glu Ser 485 490 495 Val Arg Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Gln Tyr Ser Glu Glu Ala Arg 500 505 510 Leu Lys Arg Glu Glu Ile Ser Gly Val Lys Leu Glu Ser Ile Gly Thr 515 520 525 Tyr Gln Ile Leu Ser Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Ala Leu 530 535 540 Ala Ile Met Val Ala Gly Leu Ser Leu Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser 545 550 555 560 Leu Gln Cys Arg Ile Cys Ile 565 <210> 2 <211> 567 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Extracellular HA amino acid sequence of 2.3.2.1 <400> 2 Met Glu Lys Ile Val Leu Leu Phe Ala Thr Ile Ser Leu Val Lys Ser 1 5 10 15 Asp His Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Glu Gln Val 20 25 30 Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ala Gln Asp Ile 35 40 45 Leu Glu Lys Thr His Asn Gly Lys Leu Cys Asp Leu Asn Gly Val Lys 50 55 60 Pro Leu Ile Leu Lys Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn 65 70 75 80 Pro Leu Cys Asp Glu Phe Thr Asn Val Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Val 85 90 95 Glu Lys Ala Asn Pro Ala Asn Asp Leu Cys Tyr Pro Gly Asn Phe Asn 100 105 110 Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Leu Ser Arg Ile Asn His Phe Glu 115 120 125 Lys Ile Gln Ile Ile Pro Lys Asp Ser Trp Ser Asp His Glu Ala Ser 130 135 140 Leu Gly Val Ser Ala Ala Cys Ser Tyr Gln Gly Asn Ser Ser Phe Phe 145 150 155 160 Arg Asn Val Val Trp Leu Ile Lys Lys Asp Asn Ala Tyr Pro Thr Ile 165 170 175 Lys Lys Gly Tyr Asn Asn Thr Asn Arg Glu Asp Leu Leu Ile Leu Trp 180 185 190 Gly Ile His His Pro Asn Asp Glu Ala Glu Gln Thr Arg Leu Tyr Gln 195 200 205 Asn Pro Thr Thr Tyr Ile Ser Ile Gly Thr Ser Thr Leu Asn Gln Arg 210 215 220 Leu Val Pro Lys Ile Ala Thr Arg Ser Lys Ile Asn Gly Gln Ser Gly 225 230 235 240 Arg Ile Asp Phe Phe Trp Thr Ile Leu Lys Pro Asn Asp Ala Ile His 245 250 255 Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys Ile 260 265 270 Val Lys Lys Gly Asp Ser Thr Ile Met Arg Ser Glu Val Glu Tyr Gly 275 280 285 Asn Cys Asn Thr Arg Cys Gln Thr Pro Ile Gly Ala Ile Asn Ser Ser 290 295 300 Met Pro Phe His Asn Ile His Pro Leu Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys 305 310 315 320 Tyr Val Lys Ser Asn Lys Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Ser 325 330 335 Pro Gln Arg Glu Arg Arg Arg Lys Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala 340 345 350 Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Gln Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly 355 360 365 Tyr His His Ser Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Lys Glu 370 375 380 Ser Thr Gln Lys Ala Ile Asp Gly Val Thr Asn Lys Val Asn Ser Ile 385 390 395 400 Ile Asp Lys Met Asn Thr Gln Phe Glu Ala Val Gly Arg Glu Phe Asn 405 410 415 Asn Leu Glu Arg Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Met Glu Asp Gly 420 425 430 Phe Leu Asp Val Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Met Glu 435 440 445 Asn Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr 450 455 460 Asp Lys Val Arg Leu Gln Leu Lys Asp Asn Ala Lys Glu Leu Gly Asn 465 470 475 480 Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asn Asn Glu Cys Met Glu Ser 485 490 495 Val Arg Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Gln Tyr Ser Glu Glu Ala Arg 500 505 510 Leu Lys Arg Glu Glu Ile Ser Gly Val Lys Leu Glu Ser Ile Gly Ile 515 520 525 Tyr Gln Ile Leu Ser Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Val Leu 530 535 540 Ala Ile Met Met Ala Gly Leu Ser Leu Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser 545 550 555 560 Leu Gln Cys Arg Ile Cys Ile 565 <210> 3 <211> 567 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Extracellular HA amino acid sequence of 2.3.4.4 <400> 3 Met Glu Lys Ile Val Leu Leu Leu Ala Val Val Ser Leu Val Lys Ser 1 5 10 15 Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Lys Gln Val 20 25 30 Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ala Gln Asp Ile 35 40 45 Leu Glu Lys Thr His Asn Gly Lys Leu Cys Asp Leu Asn Gly Val Lys 50 55 60 Pro Leu Ile Leu Lys Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn 65 70 75 80 Pro Met Cys Asp Glu Phe Ile Arg Val Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Val 85 90 95 Glu Arg Ala Asn Pro Ala Asn Asp Leu Cys Tyr Pro Gly Thr Leu Asn 100 105 110 Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Leu Ser Arg Ile Asn His Phe Glu 115 120 125 Lys Thr Leu Ile Ile Pro Lys Ser Ser Trp Pro Asn His Glu Thr Ser 130 135 140 Leu Gly Val Ser Ala Ala Cys Pro Tyr Gln Gly Ala Pro Ser Phe Phe 145 150 155 160 Arg Asn Val Val Trp Leu Ile Lys Lys Asn Asp Ala Tyr Pro Thr Ile 165 170 175 Lys Ile Ser Tyr Asn Asn Thr Asn Arg Glu Asp Leu Leu Ile Leu Trp 180 185 190 Gly Ile His His Ser Asn Asn Ala Ala Glu Gln Thr Asn Leu Tyr Lys 195 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agcgcagaaa gaagagaggc ctgtttggcg ctatcgccgg ctttatcgaa 1020 ggcggctggc aaggcatggt ggacggatgg tacggatacc accacagcaa cgagcaaggc 1080 tctggctacg ccgccgacaa agagtctaca cagagggcta tcgatggcgt gaccaacaaa 1140 gtgaatagca tcatcgacaa gatgaacacc cagttcgagg ccgtgggcag agagttcaac 1200 aacctggaaa gaaggatcga gaacctgaac aagaaaatgg aagatggctt cctggacgtg 1260 tggacctaca acgctgagct gctggtcctg atggaaaacg agagaaccct ggacttccac 1320 gactccaacg tgaagaacct gtacgacaaa gtgcggctgc agctgagaga caacgccaaa 1380 gaactcggca acggctgctt cgagttctac cacagatgcg acaacgagtg catggaaagc 1440 gtgcggaacg gcacctacga ctaccctcag tacagcgagg aagccagact gaagagagaa 1500 gagatcagcg ga 1512 <210> 5 <211> 1512 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Extracellular HA nucleotide sequence of 2.3.2.1 <400> 5 gaccacatct gcatcggcta ccacgccaac aacagcaccg aacaggtgga caccatcatg 60 gaaaaaaacg tgaccgtgac acacgcccag gacatcctgg aaaagaccca caacggcaag 120 ctgtgcgacc tgaacggcgt gaagcctctg atcctgaagg actgttctgt ggccggatgg 180 ctgctgggca accctctgtg tgacgagttc accaacgtgc ccgagtggtc ctacatcgtc 240 gagaaggcta accccgccaa cgacctgtgt taccccggca acttcaacga ctacgaggaa 300 ctgaagcacc tcctgagcag aatcaaccac ttcgagaaga tccagatcat ccccaaggac 360 tcttggagcg atcacgaagc cagcctggga gtgtctgctg cctgtagcta ccagggcaac 420 agcagcttct tcagaaacgt cgtgtggctg atcaagaagg acaacgctta ccccaccatt 480 aagaagggct acaacaacac caaccgcgag gacctgctga tcctgtgggg aatccaccat 540 cctaacgacg aggccgagca gaccagactg taccagaatc ctaccaccta catcagcatc 600 ggaaccagca cactgaacca gagactggtg cccaagatcg ccaccagaag caagatcaac 660 ggccagagcg gcagaatcga cttcttctgg accatcctga agccaaacga cgccatccac 720 tttgagagca acggcaactt tatcgcccct gagtacgcct acaagatcgt gaagaagggc 780 gacagcacaa tcatgagaag cgaggtggaa tacggcaact gcaacaccag gtgtcagacc 840 cctatcggcg ccatcaactc cagcatgccc ttccacaaca tccatcctct gaccatcggc 900 gagtgcccca aatacgtgaa gtccaacaag ctggtgctgg ccaccggcct gagaaactct 960 ccacagcgcg agcgcagaag aaagagaggc ctgtttggcg ctatcgccgg ctttatcgaa 1020 ggcggctggc aaggcatggt ggacggatgg tacggatacc accacagcaa cgagcaaggc 1080 tctggctacg ccgccgacaa agagagcaca cagaaagcca tcgacggcgt gaccaacaaa 1140 gtgaacagca tcatcgacaa gatgaacacc cagttcgagg ccgtgggcag agagttcaac 1200 aacctggaaa gaaggatcga gaacctgaac aagaaaatgg aagatggctt cctggacgtg 1260 tggacctaca acgctgagct gctggtcctg atggaaaacg agagaaccct ggacttccac 1320 gactccaacg tgaagaacct gtacgacaaa gtgcggctgc agctgaagga taacgccaaa 1380 gaactcggca acggctgctt cgagttctac cacaagtgca acaacgagtg catggaaagc 1440 gtgcggaacg gcacctacga ctaccctcag tacagcgagg aagccagact gaagagagaa 1500 gagatcagcg ga 1512 <210> 6 <211> 1512 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Extracellular HA nucleotide sequence of 2.3.4.4 <400> 6 gaccagatct gcatcggcta ccacgccaac aacagcacca aacaggtgga caccatcatg 60 gaaaaaaacg tgaccgtgac acacgcccag gacatcctgg aaaagaccca caacggcaag 120 ctgtgcgacc tgaacggcgt gaagcctctg atcctgaagg actgttctgt ggccggatgg 180 ctgctgggca accctatgtg tgacgagttc atcagagtgc ccgagtggtc ctacatcgtg 240 gaaagagcta accccgccaa cgacctgtgc taccctggca cactgaacga ctacgaggaa 300 ctgaagcacc tcctgagcag aatcaaccac ttcgagaaaa ccctgatcat ccccaagagc 360 agctggccca accacgagac atctctggga gtgtctgccg catgtccata ccagggcgct 420 cccagcttct tcagaaacgt cgtgtggctg atcaagaaga acgacgctta ccccaccatc 480 aagatcagct acaacaacac caaccgcgag gacctgctga tcctgtgggg aatccaccac 540 tctaacaacg ccgccgagca gaccaacctg tacaagaacc ctgacaccta cgtgtccgtg 600 ggcacaagca ccctgaacca gagactggtg cccaagatcg ccaccagatc tcaagtgaac 660 ggccagaggg gcagaatgga cttcttctgg accatcctga agcctaacga cgccatccac 720 tttgagagca acggcaactt tatcgcccct gagtacgcct acaagatcgt gaagaagggc 780 gacagcacaa tcatgaagtc cgagatggaa tacggccact gcaacaccaa gtgtcagacc 840 cctatcggcg ccatcaactc cagcatgccc ttccacaaca tccatcctct gaccatcggc 900 gagtgcccca aatacgtgaa gtccaacaag ctggtgctgg ccaccggcct gagaaactct 960 ccactgagag agcgcagaag aaagcggggc ctgtttggcg ctatcgccgg ctttattgaa 1020 ggcggctggc aaggcatggt ggacggatgg tacggctatc accacagcaa cgagcaaggc 1080 tctggctacg ccgctgacaa agagagcacc cagaaagcca tcgacggcgt gaccaacaaa 1140 gtgaacagca tcatcgacaa gatgaacacc cagttcgagg ccgtgggcag agagttcaac 1200 aacctggaaa gaaggatcga gaacctcaac aagaaaatgg aagatggctt cctggacgtg 1260 tggacctaca acgctgagct gctggtcctg atggaaaacg agagaaccct ggacttccac 1320 gacagcaacg tgaagaacct gtacgacaaa gtgcggctgc agctgagaga caacgccaaa 1380 gaactcggca acggctgctt cgagttctac cacaagtgcg acaacgagtg catggaaagc 1440 gtgcggaacg gcacctacga ctaccccaag tacagcgagg aagccagact gaagagagaa 1500 gagatcagcg ga 1512 <210> 7 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5' UTR nucleotide sequence of 2.2.1.2 <400> 7 agcaaaagca ggggttcaat ttgtcaaa 28 <210> 8 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5' UTR nucleotide sequence of 2.3.2.1 <400> 8 agcaaaagca ggggttcact ctgtcaaa 28 <210> 9 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5' UTR nucleotide sequence of 2.3.4.4 <400> 9 agcaaaagca ggggttcaat ttgtcaaa 28 <210> 10 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' UTR nucleotide sequence of 2.2.1.2 <400> 10 atttgtgagt tcaaattgta gttaaaaaca cccttgtttc tact 44 <210> 11 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' UTR nucleotide sequence of 2.3.2.1 <400> 11 gtttgtgaat tcagattgta gttaaaaaca cccttgtttc tact 44 <210> 12 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' UTR nucleotide sequence of 2.3.4.4 <400> 12 atttgtgagt tcaaattgta gttaaaaaca cccttgtttc tact 44 <210> 13 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Signal peptide <400> 13 atggaaaaga tcgtgctgct gctggccatc gtgtccatcg tgaagtcc 48 <210> 14 <211> 144 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TM+Cytoplasmic domains nucleotide sequence of 2.2.1.2 <400> 14 gtgaagctgg aatccatcgg cacataccag atcctgagca tctacagcac cgtggcctct 60 tctctggccc tggctattat ggtggctggc ctgagcctgt ggatgtgctc taacggcagc 120 ctgcagtgca gaatctgcat ctaa 144 <210> 15 <211> 144 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TM+Cytoplasmic domains nucleotide sequence of 2.3.2.1 <400> 15 gtgaagctgg aatccatcgg catctaccag atcctgagca tctacagcac cgtggcctct 60 tctctggtcc tggctatcat gatggccggc ctgtctctgt ggatgtgcag caacggaagc 120 ctgcagtgca gaatctgcat ctaa 144 <210> 16 <211> 144 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TM+Cytoplasmic domains nucleotide sequence of 2.3.4.4 <400> 16 gtgaagctgg aatccatcgg cacataccag atcctgagca tctacagcac cgtggcctct 60 tctctggccc tggctatcat tgtggctggc ctgagcctgt ggatgtgcag caatggcagc 120 ctgcagtgca gaatctgcat ctaa 144 <210> 17 <211> 1776 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of 2.2.1.2 <400> 17 agcaaaagca ggggttcaat ttgtcaaaat ggaaaagatc gtgctgctgc tggccatcgt 60 gtccatcgtg aagtccgacc agatctgcat cggctaccac gccaacaaca gcaccgaaca 120 ggtggacacc atcatggaaa aaaacgtgac cgtgacacac gcccaggaca tcctggaaaa 180 gacccacaac ggcaagctgt gcaacctgga cggcgtgaag cctctgatcc tgagagactg 240 ttctgtggcc ggatggctgc tgggcaaccc tatgtgtgac gagttcctga acgtgcccga 300 gtggtcctac atcgtcgaga agatcaaccc cgccaacgac ctgtgctacc ccggcaactt 360 caacgactac gaggaactga agcacctcct gagcagaatc aaccactttg agaagatcca 420 gatcatcccc aaggactctt ggagcgacca tgaggccagc ggagtcagct ctgcatgtcc 480 ataccagggc agaagcagct tcttcagaaa cgtcgtgtgg ctgaccaaga agaacgacgc 540 ttaccccacc atcaagaagt cctacaacaa caccaatcaa gaggacctgc tggtgctgtg 600 gggcatccac catcctaacg atgccgccga gcagaccaga ctgtaccaga atcctaccac 660 ctacatcagc gtgggcacca gcacactgaa ccagagactg gtgcctaaga tcgccaccag 720 atccaaagtg aacggccaga gcggcaggat ggaatttttc tggaccatcc tgaagtctaa 780 cgacgccatc aacttcgaga gcaacggcaa ctttatcgcc cctgagaacg cctacaagat 840 cgtgaagaag ggcgacagca caatcatgaa gtctgagctg gaatactcca actgcaacac 900 caagtgtcag acccctatcg gcgctatcaa cagcagcatg cccttccaca acatccatcc 960 tctgaccatc ggcgagtgcc ccaaatatgt gaagtccaac cgcctggtgc tggccaccgg 1020 actgagaaat tctccacagg gcgagaagcg cagaaagaag agaggcctgt ttggcgctat 1080 cgccggcttt atcgaaggcg gctggcaagg catggtggac ggatggtacg gataccacca 1140 cagcaacgag caaggctctg gctacgccgc cgacaaagag tctacacaga gggctatcga 1200 tggcgtgacc aacaaagtga atagcatcat cgacaagatg aacacccagt tcgaggccgt 1260 gggcagagag ttcaacaacc tggaaagaag gatcgagaac ctgaacaaga aaatggaaga 1320 tggcttcctg gacgtgtgga cctacaacgc tgagctgctg gtcctgatgg aaaacgagag 1380 aaccctggac ttccacgact ccaacgtgaa gaacctgtac gacaaagtgc ggctgcagct 1440 gagagacaac gccaaagaac tcggcaacgg ctgcttcgag ttctaccaca gatgcgacaa 1500 cgagtgcatg gaaagcgtgc ggaacggcac ctacgactac cctcagtaca gcgaggaagc 1560 cagactgaag agagaagaga tcagcggagt gaagctggaa tccatcggca cataccagat 1620 cctgagcatc tacagcaccg tggcctcttc tctggccctg gctattatgg tggctggcct 1680 gagcctgtgg atgtgctcta acggcagcct gcagtgcaga atctgcatct aaatttgtga 1740 gttcaaattg tagttaaaaa cacccttgtt tctact 1776 <210> 18 <211> 1776 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of 2.3.2.1 <400> 18 agcaaaagca ggggttcact ctgtcaaaat ggaaaagatc gtgctgctgt tcgccaccat 60 cagcctggtc aagagcgacc acatctgcat cggctaccac gccaacaaca gcaccgaaca 120 ggtggacacc atcatggaaa aaaacgtgac cgtgacacac gcccaggaca tcctggaaaa 180 gacccacaac ggcaagctgt gcgacctgaa cggcgtgaag cctctgatcc tgaaggactg 240 ttctgtggcc ggatggctgc tgggcaaccc tctgtgtgac gagttcacca acgtgcccga 300 gtggtcctac atcgtcgaga aggctaaccc cgccaacgac ctgtgttacc ccggcaactt 360 caacgactac gaggaactga agcacctcct gagcagaatc aaccacttcg agaagatcca 420 gatcatcccc aaggactctt ggagcgatca cgaagccagc ctgggagtgt ctgctgcctg 480 tagctaccag ggcaacagca gcttcttcag aaacgtcgtg tggctgatca agaaggacaa 540 cgcttacccc accattaaga agggctacaa caacaccaac cgcgaggacc tgctgatcct 600 gtggggaatc caccatccta acgacgaggc cgagcagacc agactgtacc agaatcctac 660 cacctacatc agcatcggaa ccagcacact gaaccagaga ctggtgccca agatcgccac 720 cagaagcaag atcaacggcc agagcggcag aatcgacttc ttctggacca tcctgaagcc 780 aaacgacgcc atccactttg agagcaacgg caactttatc gcccctgagt acgcctacaa 840 gatcgtgaag aagggcgaca gcacaatcat gagaagcgag gtggaatacg gcaactgcaa 900 caccaggtgt cagaccccta tcggcgccat caactccagc atgcccttcc acaacatcca 960 tcctctgacc atcggcgagt gccccaaata cgtgaagtcc aacaagctgg tgctggccac 1020 cggcctgaga aactctccac agcgcgagcg cagaagaaag agaggcctgt ttggcgctat 1080 cgccggcttt atcgaaggcg gctggcaagg catggtggac ggatggtacg gataccacca 1140 cagcaacgag caaggctctg gctacgccgc cgacaaagag agcacacaga aagccatcga 1200 cggcgtgacc aacaaagtga acagcatcat cgacaagatg aacacccagt tcgaggccgt 1260 gggcagagag ttcaacaacc tggaaagaag gatcgagaac ctgaacaaga aaatggaaga 1320 tggcttcctg gacgtgtgga cctacaacgc tgagctgctg gtcctgatgg aaaacgagag 1380 aaccctggac ttccacgact ccaacgtgaa gaacctgtac gacaaagtgc ggctgcagct 1440 gaaggataac gccaaagaac tcggcaacgg ctgcttcgag ttctaccaca agtgcaacaa 1500 cgagtgcatg gaaagcgtgc ggaacggcac ctacgactac cctcagtaca gcgaggaagc 1560 cagactgaag agagaagaga tcagcggagt gaagctggaa tccatcggca tctaccagat 1620 cctgagcatc tacagcaccg tggcctcttc tctggtcctg gctatcatga tggccggcct 1680 gtctctgtgg atgtgcagca acggaagcct gcagtgcaga atctgcatct aagtttgtga 1740 attcagattg tagttaaaaa cacccttgtt tctact 1776 <210> 19 <211> 1776 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of 2.3.4.4 <400> 19 agcaaaagca ggggttcaat ttgtcaaaat ggaaaagatc gtgctgctgc tggccgtggt 60 gtccctggtc aaaagcgacc agatctgcat cggctaccac gccaacaaca gcaccaaaca 120 ggtggacacc atcatggaaa aaaacgtgac cgtgacacac gcccaggaca tcctggaaaa 180 gacccacaac ggcaagctgt gcgacctgaa cggcgtgaag cctctgatcc tgaaggactg 240 ttctgtggcc ggatggctgc tgggcaaccc tatgtgtgac gagttcatca gagtgcccga 300 gtggtcctac atcgtggaaa gagctaaccc cgccaacgac ctgtgctacc ctggcacact 360 gaacgactac gaggaactga agcacctcct gagcagaatc aaccacttcg agaaaaccct 420 gatcatcccc aagagcagct ggcccaacca cgagacatct ctgggagtgt ctgccgcatg 480 tccataccag ggcgctccca gcttcttcag aaacgtcgtg tggctgatca agaagaacga 540 cgcttacccc accatcaaga tcagctacaa caacaccaac cgcgaggacc tgctgatcct 600 gtggggaatc caccactcta acaacgccgc cgagcagacc aacctgtaca agaaccctga 660 cacctacgtg tccgtgggca caagcaccct gaaccagaga ctggtgccca agatcgccac 720 cagatctcaa gtgaacggcc agaggggcag aatggacttc ttctggacca tcctgaagcc 780 taacgacgcc atccactttg agagcaacgg caactttatc gcccctgagt acgcctacaa 840 gatcgtgaag aagggcgaca gcacaatcat gaagtccgag atggaatacg gccactgcaa 900 caccaagtgt cagaccccta tcggcgccat caactccagc atgcccttcc acaacatcca 960 tcctctgacc atcggcgagt gccccaaata cgtgaagtcc aacaagctgg tgctggccac 1020 cggcctgaga aactctccac tgagagagcg cagaagaaag cggggcctgt ttggcgctat 1080 cgccggcttt attgaaggcg gctggcaagg catggtggac ggatggtacg gctatcacca 1140 cagcaacgag caaggctctg gctacgccgc tgacaaagag agcacccaga aagccatcga 1200 cggcgtgacc aacaaagtga acagcatcat cgacaagatg aacacccagt tcgaggccgt 1260 gggcagagag ttcaacaacc tggaaagaag gatcgagaac ctcaacaaga aaatggaaga 1320 tggcttcctg gacgtgtgga cctacaacgc tgagctgctg gtcctgatgg aaaacgagag 1380 aaccctggac ttccacgaca gcaacgtgaa gaacctgtac gacaaagtgc ggctgcagct 1440 gagagacaac gccaaagaac tcggcaacgg ctgcttcgag ttctaccaca agtgcgacaa 1500 cgagtgcatg gaaagcgtgc ggaacggcac ctacgactac cccaagtaca gcgaggaagc 1560 cagactgaag agagaagaga tcagcggagt gaagctggaa tccatcggca cataccagat 1620 cctgagcatc tacagcaccg tggcctcttc tctggccctg gctatcattg tggctggcct 1680 gagcctgtgg atgtgcagca atggcagcct gcagtgcaga atctgcatct aaatttgtga 1740 gttcaaattg tagttaaaaa cacccttgtt tctact 1776 <210> 20 <211> 1704 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of W468 HA <400> 20 atggagaaaa tagtgcttct tcttgcagtg gttagccttg ttaaaagtga tcagatttgc 60 attggttacc atgcaaacaa ctcaacaaag caggttgaca cgataatgga aaagaacgtc 120 actgttacac atgctcaaga catactggaa aagacacaca acggaaagct ctgcgatctt 180 aatggagtga agcccctgat tctaaaggat tgtagcgtag ctgggtggct ccttggaaat 240 ccaatgtgcg acgagttcat cagggtgccg gaatggtctt acatcgtgga gagggctaac 300 ccagccaacg acctctgtta cccagggacc ctcaaggact atgaggaact gaaacaccta 360 ttgagcagaa taaatcattt tgagaaaact ctgatcatcc ccaagagttc ttggcccaat 420 catgaaacat cattaggggt gagcgcagca tgtccatacc agggagcatc ctcattttac 480 agaaatgtgg tatggctcat caaaaagaac gatgcatacc cgacaataga gataagctac 540 aataatacca atcgggaaga tcttttgata ctatggggga ttcatcattc caacaatgca 600 gcagagcaga caaatctcta taaaaaccca gacacttatg tttccgttgg gacatcaaca 660 ttaaaccaga gattggtgcc aaaaatagct actagatccc aagtaaatgg gcaacgtgga 720 agaatggatt tcttctggac aattttaaaa ccgaatgatg caatccactt tgagagtaat 780 ggaaatttca ttgctccaga atatgcatac aagattgtca agaaagggga ctcaacaatt 840 atgaaaagtg aagtggaata tggccactgc aacaccaaat gtcaaactcc aataggggcg 900 ataaactcta gcatgccatt ccacaatata caccctctca ccatcgggga atgccccaaa 960 tacgtgaagt caaacaaatt agtccttgcg actgggctca gaaatagtcc tctaagagag 1020 agaagaagaa aaagaggact atttggagct atagcaggat ttatagaggg aggatggcag 1080 ggaatggtag acggttggta tggataccac catagcaatg agcaggggag tgggtacgct 1140 gcagacaaag aatccaccca aaaggcaata gatggagtta ccaataaggt caactcaatc 1200 attgacaaaa tgaacactca atttgaggcc gttggaaggg aatttaataa cttagaaagg 1260 agaatagaga atttaaacaa gaaaatggaa gacggattcc tagatgtctg gacttataat 1320 gctgaacttt tagttctcat ggaaaatgag agaactctag atttccatga ctcaaatgtc 1380 aagaaccttt acgacaaagt ccgattacag cttagggata atgcaaagga gctgggtaat 1440 ggttgtttcg agttctatca caaatgtgat aacgaatgta tggaaagcgt aagaaatggg 1500 acgtatgact accctaagta ttcagaagaa gcagggttaa aaagagaaga aataagcggg 1560 gtgaaattag aatcaatagg aacttaccaa atactatcaa tttattcaac agtggcaagt 1620 tccctagcac tggcaatcat agtggctggt ctatctttat ggatgtgctc taatgggtcg 1680 ttacaatgca gaatttgcat ctaa 1704 <210> 21 <211> 1695 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of W149 HA <400> 21 atggagaaaa tagtgcttct tcttgcaata atcagtcttg ttaaaagtga tcagatttgc 60 attggttacc atgcaaacaa ctcgacagag caggttgaca caataatgga aaagaacgtc 120 actgttacac acgcccaaga catactggaa aagacacaca acgggaagct ctgcgatcta 180 gacggagtga agcctctaat tttaaaagat tgtagtgtag ctggatggct cctcgggaat 240 ccaatgtgtg acgaattcct caatgtgccg gaatggtctt acatagtgga gaagatcaat 300 ccagccaatg acctctgtta cccagggaat ttcaacgact atgaagaact gaaacaccta 360 ttgagcagaa taaaccattt tgagaaaatt cagatcatcc ccaaaagttc ttggtcagat 420 catgaagcct catcaggggt gagctcagca tgtccatacc agggaagatc ctcctttttt 480 agaaatgtgg tatggcttat caaaaagaac gatgcatacc caacaataaa gagaagttac 540 aataatacca accaagaaga tcttttggtt ctgtggggga ttcaccatcc aaatgatgcg 600 gcagaacaga caaggctcta tcaaaaccca accacctata tttccgttgg gacatcaaca 660 ctaaaccaga gattggtacc aaaaatagct actagatcca aggtaaacgg gcaaagtgga 720 aggatggagt tcttttggac aattttaaaa ccgaatgatg caataaattt tgagagtaat 780 ggaaatttca ttgctccaga aaatgcatac aaaattgtca agaaagggga ctcaacaatc 840 atgaaaagtg aattggaata tggtaactgc aacaccaagt gtcaaactcc aataggggcg 900 ataaactcta gtatgccatt ccacaacatc caccctctca ccatcgggga atgtcccaaa 960 tatgtgaaat caaacagatt agtccttgcg actgggctca gaaatagccc tcaaagagag 1020 aaaagaggac tatttggagc tatagcaggt tttatagagg gaggatggca gggaatggta 1080 gatggttggt atggatacca ccatagcaac gagcagggga gtgggtacgc tgcagacaaa 1140 gaatccactc aaaaggcaat agatggagtc accaataaag tcaactcgat cattgacaaa 1200 atgaacactc aatttgaggc cgttggaagg gaatttaata acttagaaag gagaatagag 1260 aatttaaaca agaagatgga agacggattt ctagatgtct ggacttataa tgctgaactt 1320 ctggttctca tggaaaatga gagaactcta gactttcatg actcaaatgt caagaacctt 1380 tacgacaagg tccgactaca gcttagggat aatgcaaagg agcttggtaa cggttgtttc 1440 gagttctatc acagatgtga taatgaatgt atggaaagtg taagaaacgg aacgtatgac 1500 tacccgcagt attcagaaga atcaagatta aaaagagagg aaataagtgg agtaaaattg 1560 gaatcaatag gaacttatca aatactgtca atttattcaa cagtggcgag ctccctagca 1620 ctggcaatca tggtggctgg tctatcttta tggatgtgtt ccaatggatc gttacaatgc 1680 agaatttgca tttaa 1695 <210> 22 <211> 1704 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of W401 HA <400> 22 atggagaaaa tagtgcttct ctttacaaca atcagccttg ttaaaagcga tcatatttgc 60 attggttatc atgcaaataa ctcgacagag caggttgaca caataatgga aaagaacgtt 120 actgttacac atgcccaaga catactggaa aagacacaca acgggaagct ctgcgatcta 180 aatggagtga agcctctgat tttaaaagat tgtagtgtag cgggatggct cctcggaaac 240 ccattgtgtg acgaattcat caatgtgcca gaatggtctt acatagtaga gaaggccaag 300 ccagccaatg acctctgtta cccagggaat ttcaacgatt atgaagaatt gaaacaccta 360 ttgagcagga taaaccattt tgagaaaata cagatcatcc ccaaagactc ttggtcagaa 420 catgaagcct cattgggggt gagcgcagca tgttcatacc agggaaattc ctccttcttc 480 agaaatgtgg tatggcttat caaaaaggac aatgcatacc caacaataaa gaaaggctac 540 aataatacca accaagaaga tctcttggta ctgtggggga ttcaccatcc taatgatgag 600 gcagagcaga caaggctcta tcaaaaccca accacctata tttccattgg gacatcaaca 660 ctaaaccaga gattggtacc aaaaatagcc actagatcca aaataaacgg gcaaagtggc 720 aggatagatt tcttctggac aattttaaaa ccgaatgatg caatccactt cgagagtaat 780 ggaaatttca ttgctccaga atatgcatac aaaattgtca agaaaggaga ctccacaatt 840 atgaaaagtg aagtggaata tggtaactgc aacaccaggt gtcagactcc gataggggcg 900 ataaactcta gtatgccatt ccacaacata caccctctca ccatcggaga atgtcccaaa 960 tatgtgaaat caaacaaatt agtccttgcg actgggctca gaaatagtcc tcaaagagag 1020 agaagaagaa aaagaggact gtttggagct atagcaggtt ttatagaggg aggatggcag 1080 ggaatggtag atggttggta tgggtaccat cacagcaatg agcaggggag tgggtacgct 1140 gcagacaaag aatctactca aaaggcaata gacggagtca ccaataaggt caactcgatc 1200 attgacaaaa tgaacactca gtttgaggcc gtaggaaggg aatttaataa cttagagagg 1260 agaatagaga atttaaacaa gaagatggaa gacggattcc tagatgtttg gacttataat 1320 gctgaacttc tggttctcat ggaaaatgag agaactctag atttccatga ctcaaatgtc 1380 aagaaccttt acgataaggt cagactacag cttaaggata atgcaaaaga gttgggtaac 1440 ggttgtttcg agttctatca caaatgtaat aatgaatgta tggaaagtgt aagaaacgga 1500 acgtatgact acccgcagta ttcagaagaa gcaagactaa aaagagagga aataagtgga 1560 gtaaaattgg aatcaatagg aatctaccaa atactgtcaa tttattcaac agtggcgagt 1620 tccctagtgc tggcaatcat gatggctggt ctgtctttat ggatgtgttc caacggatcg 1680 ttacagtgca gaatttgcat ttaa 1704 <210> 23 <211> 1695 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of 2.3.4.4 H5N6 <400> 23 atggagaaaa tagtgcttct tcttgcaata gttagccttg ttaaaggtga tcagatttgc 60 attggttacc atgcaaacaa ctcgacggag caggttgaca cgataatgga aaagaacgtc 120 actgttacac atgcccaaga catactggaa aagacacaca atggaaagct ctgcgattta 180 aatggagtga agcctctgat tttaaaggat tgtagtgtag ctggatggct tctcggaaac 240 ccaatgtgcg acgaattcat cagggtgccg gaatggtctt acatagtaga aagggctaac 300 ccagccaatg acctctgtta cccagggaac ctcaatgatt atgaagaact gaaacaccta 360 ttgagcagaa taaatcattt tgagaaaatt ctgatcatcc ccaagagttc ttggaccaat 420 catgaaacat cattaggggt gagcgcagca tgcccatacc agggaacgcc ctcctttttc 480 agaaatgtgg tatggcttat caaaaagaac gatgcatacc ccacaataaa aataagctac 540 aataatacca atcaggaaga tctgttgata ctgtgggggg ttcaccattc caacaatgca 600 gcagagcaga cgaacctcta taaaaaccca accacctata tttccgttgg gacatcaaca 660 ttaaaccaga gattggtacc aaaaatagct actagatccc aagtgaacgg acagcgtgga 720 agaatggatt tcttctggac aattctaaaa ccgaatgatg caatccactt cgagagtaat 780 ggaaatttca ttgctccaga atatgcatac aaaattgtca agaaagggga ctcaacaatt 840 atgaaaagtg aaatggaata tggccactgc aacaccaaat gtcaaactcc aataggggcg 900 ataaactcta gtatgccatt tcacaatata caccctctca ccatcgggga atgccccaaa 960 tacgtgaaat caaacaaatt agtccttgcg actgggctca gaaatagtcc tctacgagag 1020 acgcgaggac tatttggagc tatagcaggg tttatagagg gaggatggca gggaatggta 1080 gatggctggt atgggtacca ccatagcaat gagcagggga gtgggtacgc tgcagacaaa 1140 gaatccaccc aaaaggctat agatggagtt accaataagg tcaactcgat tattgacaaa 1200 atgaacactc aatttgaggc cgttggaagg gaatttaata acttagaaag gagaatagag 1260 aatttaaaca agaaaatgga agacggattc ctagatgtct ggacttataa tgctgaactt 1320 ctagttctca tggaaaatga gagaactcta gatttccatg actcaaatgt caagaacctt 1380 tacgataaag tccgactaca gcttagggac aatgcaaagg aactgggtaa tggttgtttt 1440 gagttctatc acaaatgtga taataaatgt atggaaagtg taagaaatgg gacatatgac 1500 tacccgcaat attcagaaga agcaagatta aaaagagaag aaataagcgg agtgaaatta 1560 gagtcaatag gaacttacca aatactgtca atttattcaa cagtggcgag ttccctagca 1620 ctggcaatca tagtggctgg tttatcttta tggatgtgct ccaatgggtc gttgcagtgc 1680 agaatttgca tttaa 1695

Claims (11)

  1. H5 인플루엔자에 대한 치료 또는 예방에 이용되고,
    서열번호 1 내지 3으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 서열로 이루어지는,
    펩타이드.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 H5 인플루엔자는 계통군 2 및 계통군 2의 하위 계통군인,
    펩타이드.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 H5 인플루엔자는 계통군 2.2, 계통군 2.2의 하위 계통군, 계통군 2.3, 및 계통군 2.3의 하위 계통군인,
    펩타이드.
  4. 제 1 항의 펩타이드를 암호화하는 염기 서열로서,
    H5 인플루엔자에 대한 치료 또는 예방에 이용되고,
    서열번호 4; 서열번호 5; 서열번호 6; 서열번호 4와 90% 이상 동일성을 가지는 서열; 서열번호 5와 90% 이상 동일성을 가지는 서열; 및 서열번호 6과 90% 이상 동일성을 가지는 서열로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 서열로 이루어지고,
    코돈 최적화된,
    항원 발현 서열.
  5. 제 4 항에 있어서,
    상기 상기 H5 인플루엔자는 계통군 2 및 계통군 2의 하위 계통군인,
    항원 발현 서열.
  6. 제 4 항에 있어서,
    상기 H5 인플루엔자는 계통군 2.2, 계통군 2.2의 하위 계통군, 계통군 2.3, 및 계통군 2.3의 하위 계통군인,
    항원 발현 서열.
  7. 제 4 항의 항원 발현 서열 중 적어도 하나의 염기 서열을 ORF(open reading frame) 서열로서 포함하는,
    벡터.
  8. 제 7 항에 있어서,
    상기 ORF 서열의 5’방향에 위치하는 5’UTR 서열; 및
    상기 ORF 서열의 3’방향에 위치하는 3’UTR 서열을 더 포함하고,
    상기 5’UTR 서열은 서열번호 7 내지 9으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 서열로 이루어지고,
    상기 3’UTR 서열은 서열번호 10 내지 12로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 서열로 이루어지는,
    벡터.
  9. 제 8 항에 있어서,
    상기 5’UTR 서열 및 상기 ORF 서열 사이에 위치하는 신호 서열; 및
    상기 코돈 최적화된 보존 서열과 상기 3’UTR 서열 사이에 위치하는 막횡단 도메인 서열을 더 포함하는,
    벡터.
  10. 제 7 항의 벡터에 의해 형질전환된 세포.
  11. 제 7 항의 벡터를 포함하는 면역화용 조성물.
KR1020190045329A 2019-04-18 2019-04-18 H5 인플루엔자를 치료 또는 예방하기 위한 펩타이드 및 이를 암호화하는 코돈 최적화 서열, 및 이를 이용한 백신 KR102326037B1 (ko)

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