CN107530417A - H1n1流感的计算优化的广泛反应性抗原的协同共同给药 - Google Patents

Abstract

本发明提供计算优化的H1N1流感血凝素(HA)多肽的共同给药(例如，免疫原性合剂组合物和/或引发‑加强方案)。优化的H1N1流感血凝素(HA)多肽的共同给药促进病毒感染的协同中和，并对多样化和多种H1N1流感病毒毒株(包括季节性和大流行毒株二者)提供改进的保护性免疫(例如，广泛反应性免疫反应)。

Description

H1N1流感的计算优化的广泛反应性抗原的协同共同给药

相关申请的交叉引用

本申请要求2014年12月19日提交的美国临时专利申请号62/094,772的权益，并依赖于其提交日期，所述专利申请的整体公开内容通过引用结合到本文中。

序列表

本申请包含序列表，其以ASCII格式电子提交并通过引用以其整体由此结合。所述ASCII副本，创建于2015年12月16日，名称为0171.0005-PCT_SL.txt，和大小为20,224字节。

背景

流感由病毒引起，所述病毒主要攻击上呼吸道——鼻、喉和支气管，和极少地还攻击肺。感染通常持续约一周。特征为突然发作高热、肌痛、头痛和严重不适，非生产性咳嗽，咽喉痛和鼻炎。大多数人在1-2周内恢复，不需要任何医学治疗。然而，在非常年幼、中年以上和患有医学病况(例如肺病、糖尿病、癌症、肾脏或心脏问题)的人中，流感产生严重风险。在这些人中，感染可导致潜在疾病的严重并发症，肺炎和死亡。认为每年在全世界，年度流感流行导致300万至500万例严重疾病，和250,000至500,000例死亡。

流感病毒是正粘病毒科的成员。存在三种亚型的流感病毒，称为流感A、流感B和流感C。流感病毒体包含分段的负义RNA基因组，其编码以下蛋白：血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)、基质(Ml)、质子离子通道蛋白(M2)、核蛋白(NP)、聚合酶碱性蛋白1 (PBl)、聚合酶碱性蛋白2 (PB2)、聚合酶酸性蛋白(PA)和非结构蛋白2 (NS2)。HA、NA、Ml和M2是膜相关蛋白，而NP、PBl、PB2、PA和NS2是核衣壳相关蛋白。Ml蛋白是流感颗粒中最丰富的蛋白。HA和NA蛋白是被膜糖蛋白，负责病毒附着和病毒颗粒侵入细胞。特别是，HA使流感病毒结合至在其膜的表面结构上包含唾液酸的细胞。

HA和NA蛋白是用于病毒中和和保护性免疫的主要免疫显性表位的来源，这使得它们成为预防性流感疫苗的重要组分。流感病毒的遗传组成允许频繁的较小遗传变化，称为抗原漂移。因此，流感的主要抗原(特别是HA)的氨基酸序列在各类型、亚型和毒株中是高度可变的。为此原因，目前的季节性流感疫苗需要每1-3年进行修正，以解决HA和NA蛋白中的突变(抗原漂移)。目前疫苗途径的另一限制是在疫苗中使用的流感毒株是关于即将到来的流感季的流行流感毒株，根据当局的最佳猜测，由WHO/CDC选择的。时常地，猜测不准确和疫苗毒株不匹配季节性流感毒株，限制了季节性疫苗的有效性。季节性疫苗也未经设计以提供针对可由抗原转变所致的大流行毒株的保护。此外，如名字所提示的，季节性疫苗必须每年给予。

流感的大流行爆发由病原性和可传播的病毒的出现引起，对该病毒，人群是免疫幼稚的。因为病毒是新的，因此人群对其具有很少至没有免疫力。在全世界，病毒在人与人之间快速传播。在上个世纪，流感A病毒已经历三次重要的遗传变化，主要在其H-组分中，导致全球大流行和在疾病和死亡两个方面的大代价。最恶劣的大流行是“西班牙流感”，其影响了大部分的世界人口，和被认为在1918-1919年已经杀死了至少4千万人。更近一些，两次其它的流感A大流行在1957年(“亚洲流感”)和1968年(“香港流感”)发生，在全球导致显著的发病率和死亡率。与当前的流感流行形成对比，这些大流行也在健康的年轻人中涉及严重的结果，虽然未达到例如“西班牙流感”的显著规模(其中死亡率在健康的年轻人中最高)。最近，从猪至人直接传播的新流感亚型A (H1N1)的有限爆发在2009年在墨西哥发生，并且在越来越多的国家被检出。目前，与猪-来源的H1N1流感病毒有关的死亡率显示类似于季节性流感毒株的死亡率。然而，增加猪-来源的H1N1流感的监测和检测可使死亡率更高。由于抗原漂移，和甚至更明显的改变(称为抗原转变)，大流行流感抗原(例如，大流行毒株的HA氨基酸序列)是高度不可预测的。因此，在传统上疫苗直到大流行后期才可获得。

对于可通过针对多个流感毒株，包括季节性和大流行毒株二者提供较广泛的保护，更好地解决当前的抗原漂移、抗原转变和病毒错配的问题的流感疫苗，存在未满足的需求。对于提供较长的持续免疫的流感疫苗，特别是不必须每年给予的疫苗，也存在未满足的需求。

概述

本发明特别提供计算优化的H1N1流感血凝素(HA)多肽的共同给药(即，引发-加强组合或组合物合剂)，所述多肽当提供给免疫系统时可引发针对季节性和大流行H1N1流感毒株二者的广泛中和抗体。不受任何特定理论的束缚，认为每个单独的多肽引发不同的抗体组，其结合HA分子的不同的抗原区；但当共同给予(作为合剂或作为引发-加强方案的一部分)时，它们引发识别差异HA头表位的抗体，其协同地中和病毒感染和提供对多个H1N1流感病毒毒株的改进的保护性免疫(例如，针对季节性和大流行毒株二者的广泛反应性免疫反应)和/或更长的持续免疫。优化的HA多肽通过一系列HA蛋白比对，和随后根据数千个人和猪H1N1流感分离株产生共有序列进行开发。在具体的实施方案中，保护性免疫跨越在至少持续5、6、7、8、9、11、12、15、20年等期间来源的H1N1毒株。

本文提供了免疫原性组合物，其包含至少两种重组H1N1流感血凝素(HA)多肽的组合，其中所述组合包含第一重组、优化的H1N1流感HA多肽，其包含与SEQ ID NO: 1具有至少98%, 98.5%, 99%或99.5%同一性的氨基酸序列(P1)；和第二重组、优化的H1N1流感HA多肽，其包含选自以下的氨基酸序列：1) 与SEQ ID NO: 2具有至少99%或99.5%同一性的氨基酸序列(X6)，2) 与SEQ ID NO: 3具有至少99%或99.5%同一性的氨基酸序列(X3)，和3) 与SEQID NO: 4具有至少96%, 96.5%, 97%, 97.5%, 98%, 98.5%, 99%或99.5%同一性的氨基酸序列(X1)。

本文还提供了至少两种重组H1N1流感血凝素(HA)多肽的免疫原性组合物，其中所述组合包含第一重组、优化的H1N1流感HA多肽，其包含与SEQ ID NO: 1的残基2-566具有至少98%, 98.5%, 99%或99.5%同一性的氨基酸序列；和第二重组、优化的H1N1流感HA多肽，其包含选自以下的氨基酸序列：1) 与SEQ ID NO: 2的残基2-565具有至少99%或99.5%同一性的氨基酸序列，2) 与SEQ ID NO: 3的残基2-566具有至少99%或99.5%同一性的氨基酸序列，和3) 与SEQ ID NO: 4的残基2-566具有至少96%, 96.5%, 97%, 97.5%, 98%, 98.5%,99%或99.5%同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本文所述的组合物包含(i) 第一重组、优化的H1N1流感HA多肽，其包含SEQ ID NO: 1与具有至少98%, 98.5%, 99%或99.5%同一性的氨基酸序列，和(ii) 第二重组、优化的H1N1流感HA多肽，其包含与SEQ ID NO: 2具有至少99或99.5%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，组合物包含至少两种不同的重组、优化的H1N1流感HA多肽，其中相对于SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2，所述多肽的氨基酸序列包含不超过两个或不超过一个置换。在一些实施方案中，第一和/或第二重组、优化的H1N1流感HA多肽缺少N-末端甲硫氨酸残基。在一些实施方案中，本文所述的组合物包含(i) 第一重组、优化的H1N1流感HA多肽，其包含SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 1的残基2-566的氨基酸序列，和(ii)第二重组、优化的H1N1流感HA多肽，其包含SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 2的残基2-565的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本文所述的组合物包含(i) 第一重组、优化的H1N1流感HA多肽，其包含与SEQ ID NO: 1具有至少98%, 98.5%, 99%或99.5%同一性的氨基酸序列，和(ii) 第二重组、优化的H1N1流感HA多肽，其包含与SEQ ID NO: 3具有至少99%或99.5%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，组合物包含至少两种不同的重组、优化的H1N1流感HA多肽，其中相对于SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 3，多肽的氨基酸序列包含不超过两个或不超过一个置换。在一些实施方案中，重组H1N1流感HA多肽缺少N-末端甲硫氨酸残基。在一些实施方案中，本文所述的组合物包含(i) 第一重组、优化的H1N1流感HA多肽，其包含SEQ IDNO: 1或SEQ ID NO: 1的残基2-566的氨基酸序列；和(ii) 第二重组、优化的H1N1流感HA多肽，其包含SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 3的残基2-566的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本文所述的组合物包含(i) 第一重组、优化的H1N1流感HA多肽，其包含与SEQ ID NO: 1具有至少98%, 98.5%, 99%或99.5%同一性的氨基酸序列，和(ii) 第二重组、优化的H1N1流感HA多肽，其包含与SEQ ID NO: 4具有至少96%, 96.5%,97%, 97.5%, 98%, 98.5%, 99%或99.5%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，组合物包含至少两种不同的重组、优化的H1N1流感HA多肽，其中相对于SEQ ID NO: 1或SEQ IDNO: 4，多肽的氨基酸序列包含不超过两个或不超过一个置换。在一些实施方案中，重组、优化的H1N1流感HA多肽缺少N-末端甲硫氨酸残基。在一些实施方案中，本文所述的组合物包含(i) 第一重组、优化的H1N1流感HA多肽，其包含SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 1的残基2-566的氨基酸序列；和(ii) 第二重组、优化的H1N1流感HA多肽，其包含SEQ ID NO: 4或SEQID NO: 4的残基2-566的氨基酸序列。

在一些实施方案中，组合物包含重组H1N1流感HA多肽的组合，所述组合由包含与SEQ ID NO: 1的残基2-566具有至少98%, 98.5%, 99%或99.5%同一性的氨基酸序列的第一重组、优化的H1N1流感HA多肽和包含与SEQ ID NO: 2的残基2-565具有至少99%或至少99.5%同一性的氨基酸序列的第二重组、优化的流感HA多肽组成。在一些实施方案中，组合物包含重组H1N1流感HA多肽的组合，所述组合由包含与SEQ ID NO: 1的残基2-566具有至少98%, 98.5%, 99%或99.5%同一性的氨基酸序列的第一重组、优化的流感HA多肽和包含与SEQ ID NO: 3的氨基酸2-566具有至少99%或至少99.5%同一性的氨基酸序列的第二重组、优化的流感HA多肽组成。在一些实施方案中，组合物包含重组H1N1流感HA多肽的组合，其由包含与SEQ ID NO: 1的残基2-566具有至少98%, 98.5%, 99%或99.5%同一性的氨基酸序列的第一重组、优化的流感HA多肽和包含与SEQ ID NO: 4的氨基酸2-566具有至少96%,96.5%, 97%, 97.5%, 98%, 98.5%, 99%或99.5%同一性的氨基酸序列的第二重组、优化的流感HA多肽组成。在一些实施方案中，本文所述的组合物由以下组成：(i) 第一重组、优化的H1N1流感HA多肽，其包含SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 1的残基2-566的氨基酸序列；和(ii) 第二重组、优化的H1N1流感HA多肽，其包含SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 2的残基2-565的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文所述的组合物包含(i) 第一重组、优化的H1N1流感HA多肽，其包含SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 1的残基2-566的氨基酸序列；和(ii) 第二重组、优化的H1N1流感HA多肽，其包含SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 3的残基2-566的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文所述的组合物包含(i) 第一重组、优化的H1N1流感HA多肽，其包含SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 1的残基2-566的氨基酸序列；和(ii) 第二重组、优化的H1N1流感HA多肽，其包含SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 4的残基2-566的氨基酸序列。

本公开内容还提供了编码重组H1N1流感HA多肽的分离的核酸分子和载体。进一步提供了包含这样的载体的分离的细胞。还提供了重组流感病毒，其包含本文所述的计算优化的重组HA多肽。

还提供了包含本文公开的优化的HA多肽的流感病毒-样颗粒(VLP)、灭活的流感病毒或病毒体和融合蛋白，所述单个HA多肽的VLP和病毒/病毒体和融合蛋白可混合或组合成上述合剂。

进一步提供了包括在药学上可接受的载体中的本文所述的优化的流感HA多肽、融合蛋白、病毒/病毒体或VLP的合剂的组合物。本公开内容还提供了通过给予所公开的HA多肽、融合蛋白、病毒或VLP的合剂的免疫原性组合物，在受试者中针对流感病毒引发免疫反应的方法。

还提供了共同给予受试者本文公开的优化的H1N1流感HA多肽的方法。在某些实施方案中，方法包括通过给予受试者一种或多种包含本文公开的优化的H1N1流感HA多肽的组合或合剂的组合物，针对H1N1流感病毒免疫受试者。进一步提供了通过给予受试者包含本文所述的第一优化的H1N1流感HA多肽的引发疫苗，接着给予包含本文所述的第二优化的H1N1流感HA多肽的加强疫苗，针对H1N1流感病毒免疫受试者的方法，其中第二优化的H1N1流感HA多肽不同于第一优化的H1N1流感HA多肽。在一些实施方案中，引发疫苗是活的减毒流感病毒(例如，温度敏感性病毒)。在某些实施方案中，引发疫苗包含与SEQ ID NO: 1具有至少98%同一性的重组、优化的H1N1流感HA多肽(即，P1)，和加强疫苗包含与SEQ ID NO: 2具有至少99%同一性、与SEQ ID NO: 3具有至少99%同一性或与SEQ ID NO: 4具有至少96%同一性的重组、优化的H1N1流感HA多肽(例如，X6、X3或X1)。在其它实施方案中，引发疫苗可包含与SEQ ID NO: 2具有至少99%同一性的重组、优化的H1N1流感HA多肽，和加强疫苗包含与SEQ ID NO: 1具有至少98%同一性、与SEQ ID NO: 3具有至少99%同一性或与SEQ ID NO:4具有至少96%同一性的重组、优化的H1N1流感HA多肽。在其它实施方案中，引发疫苗可包含与SEQ ID NO: 3具有至少99%同一性的重组、优化的H1N1流感HA多肽，和加强疫苗包含与SEQ ID NO: 1具有至少98%同一性、与SEQ ID NO: 2具有至少99%同一性或与SEQ ID NO: 4具有至少96%同一性的重组、优化的H1N1流感HA多肽。

根据参照附图进行的以下详细描述，本发明的前述和其它目标、特征和优势将更加显而易见。

附图简述

本文包括的附图，其包含以下图表，仅为说明的目的而非限制。

图1A-L显示使用COBRA VLP疫苗以引发-加强方案，通过小鼠的接种疫苗诱导的血细胞凝集-抑制(HAI)血清抗体效价。对于用以下指定的COBRA VLP疫苗的引发-加强方案接种的各组小鼠，HAI效价针对一小组17种H1N1流感病毒测定。条柱表示来自在第56天收集的抗血清的几何平均效价(+ S.E.M.)。水平虚线表示对应于1:40的HAI抗体效价的log 2值。

图2A-D显示通过用COBRA VLP疫苗合剂对小鼠接种疫苗而诱导的血细胞凝集-抑制(HAI)血清抗体效价。对于每组接种一种以下COBRA VLP疫苗合剂的小鼠，测定针对一小组17种H1N1流感病毒的HAI效价：X1/X3、X1/X6或X3/X6 (A); P1/X6、P1/X3或P1/X1 (B);X1/X6/P1 (C)或以P1/X3 VLP疫苗的合剂引发，接着以P1/X6 VLP疫苗的合剂加强(D)。条柱表示来自在第56天收集的抗血清的几何平均效价(+ S.E.M.)。

图3A-C显示通过用COBRA VLP疫苗的引发-加强方案(A和B)或合剂(C)接种的小鼠的H1N1流感病毒攻击引起的%重量减轻。在第0和4周用各疫苗加佐剂(AFO3或Imject明矾)接种的BALB/c小鼠(11只小鼠/组)用1X10⁶ pfu的H1N1分离株A/California/07/2009 (CA/09)感染。在14天观察期内，每日监测小鼠的重量减轻。在感染后第2天处死3只小鼠，和在第3天处死另外3只，以评价肺效价，由此对于整个14天，记录5只小鼠的重量。

图4A-B显示用COBRA VLP引发加强方案(A)或COBRA VLP合剂(B)接种的小鼠(感染后第3天)的病毒肺效价。

图5A-F显示用以下引发加强方案接种的幼稚雪貂的病毒肺效价：无引发感染和P1VLP或CA09 VLP加强(A); A/Singapore6/1986引发感染和P1 VLP或CA09 VLP加强(B); A/Brisbane/59/2007引发感染和P1 VLP或CA09 VLP加强(C); A/California/07/09引发感染和P1 VLP或CA09 VLP加强(D); COBRA P1引发感染和P1 VLP或CA09 VLP加强(E);COBRA X3引发感染和P1 VLP或CA09 VLP加强(F)。针对X轴上所列的H1病毒小组评价HAI效价。

定义

为了更容易地理解本发明，下文首先定义某些术语。以下术语和其它术语的另外的定义在整个说明书中阐明。

如本说明书和随附权利要求中所用的，单数形式"一个"、"一种"和"所述"包括复数参考，除非上下文另外清楚地指明。因此例如，对"方法"的提及包括一种或多种方法，和/或本文所述的和/或本领域技术人员在阅读本公开内容时将显而易见的类型的步骤，等等。

佐剂：如本文所用的，术语“佐剂”是指非特异性增强对抗原的免疫反应的物质或媒介。佐剂可包括矿物质的悬浮液(明矾、铝盐、氢氧化铝或磷酸盐)，抗原吸附于其上；或油包水乳液，其中抗原溶液在矿物油中乳化(例如，弗氏不完全佐剂)，有时包括杀灭的分支杆菌(弗氏完全佐剂)以进一步增强抗原性。免疫刺激性寡核苷酸(例如，包括CpG基序的那些)也可用作佐剂(例如，参见美国专利号6,194,388; 6,207,646; 6,214,806; 6,218,371;6,239,116; 6,339,068; 6,406,705和6,429,199)。佐剂还包括生物分子，例如脂质和共刺激性分子。实例性的生物佐剂包括AS04 (Didierlaurent, A.M. et al, J. Immunol.,2009, 183: 6186-6197), IL-2, RANTES, GM-CSF, TNF-α, IFN-γ, G-CSF, LFA-3,CD72, B7-1, B7-2, OX-40L和41 BBL。

给予：如本文所用的，“给予”受试者组合物意指提供、施用或引起组合物与受试者接触。给予可通过多种途径中的任一种实现，例如局部、口服、皮下、肌内、腹膜内、静脉内、鞘内和皮内。

抗体：如本文所用的，术语“抗体”是指包括足够赋予与特定靶抗原的特异性结合的标准免疫球蛋白序列元件的多肽。在一些实施方案中，如本文所用的，术语“抗体”还指一个或多个“抗体片段”，其包括完整抗体的一部分，例如，抗体的抗原-结合或可变区。“抗体片段”的实例包括Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段；三链抗体；四链抗体；线性抗体；单链抗体分子；和自抗体片段形成的多特异性抗体中包括的包含CDR的部分。本领域技术人员将理解，术语“抗体片段”不暗示和不限于任何具体的产生方式。抗体片段可通过使用任何合适的方法产生，包括但不限于完整抗体裂解、化学合成、重组产生等。如本领域已知的，天然产生的完整抗体为大约150 kD四聚体，包含两个相同的重链多肽(各自约50 kD)和两个相同的轻链多肽(各自约25 kD)，其彼此缔合成通常称为“Y-形”的结构。每个重链包含至少四个结构域(各自约110个氨基酸长) – 氨基端的可变(VH)结构域(位于Y结构的尖端)，接着三个恒定结构域：C_H1、C_H2和羧基端的C_H3 (位于Y的茎干的底部)。称为“转换区(switch)”的短的区域连接重链可变区和恒定区。“铰链区”将C_H2和C_H3结构域连接至抗体的剩余部分。在完整抗体中，该铰链区中的两个二硫键将两个重链多肽彼此连接。每个轻链包含两个结构域 – 氨基端的可变(V_L)结构域，接着羧基端的恒定(C_L)结构域，彼此通过另一个“转换区”分开。完整抗体四聚体包含两个重链-轻链二聚体，其中重链和轻链通过单个二硫键彼此连接；两个另外的二硫键将重链铰链区彼此连接，使得二聚体彼此连接，和形成四聚体。天然产生的抗体还被糖基化，通常在C_H2结构域上。天然抗体的每个结构域具有特征为呈扁平的反向平行β桶的“免疫球蛋白折叠”的结构，其自彼此相对组装的两个β折叠片(例如，3-、4-或5-链折叠片)形成。每个可变结构域包含三个称为“互补决定区”的高变环(CDR1、CDR2和CDR3)和四个略微不变的“框架”区(FR1、FR2、FR3和FR4)。当天然抗体折叠时，FR区形成提供结构域的结构框架的β折叠片，和来自重链和轻链二者的CDR环区在三维空间中集合在一起，使得它们产生位于Y结构的尖端的单一高变的抗原结合位点。在抗体多肽链中的氨基酸序列比较已定义了两个轻链(κ和λ)类型、数个重链(例如，μ, γ, α, ε, δ)类型和某些重链亚类(α1, α2, γ1, γ2, γ3和γ4)。抗体类型(IgA [包括IgA1, IgA2]、IgD、IgE、IgG [包括IgG1, IgG2, IgG3, IgG4]、IgM)根据使用的重链序列的类型进行定义。为本发明的目的，在某些实施方案中，包括天然抗体中存在的足够的免疫球蛋白结构域序列的任何多肽或多肽的复合物可被称为和/或用作“抗体”，无论这样的多肽是天然产生的(例如，通过对抗原起反应的生物体产生)，还是通过重组工程改造、化学合成或其它人工系统或方法产生的。在一些实施方案中，抗体是单克隆的；在一些实施方案中，抗体是多克隆的。在一些实施方案中，抗体具有小鼠、兔、灵长类动物或人抗体特有的恒定区序列。在一些实施方案中，抗体序列元件是人源化的、灵长类动物化的、嵌合的等，如本领域已知的。此外，如本文所用的术语“抗体”将理解为包括(除非另外说明，或从上下文清楚)，在合适的实施方案中可涉及任何本领域已知或开发的构建体或形式，其以可选方式呈现而具有抗体结构和功能特征。例如，在一些实施方案中，该术语可涉及双特异性抗体或其它多特异性抗体(例如，zybodies等)、Small Modular ImmunoPharmaceuticals (“SMIPs™”)、单链抗体、骆驼抗体和/或抗体片段。在一些实施方案中，抗体可缺少在天然产生时将会具有的共价修饰(例如，连接聚糖)。在一些实施方案中，抗体可包含共价修饰(例如，连接聚糖、有效负载[例如，可检测部分、治疗部分、催化部分等]或其它附属基团[例如，聚乙二醇等])。

抗原：如本文所用的，术语“抗原”是指引发免疫反应的试剂；和/或(ii) 当暴露于或给予生物体时，通过T细胞受体结合的试剂(例如，当由MHC分子呈递时)或结合抗体(例如，由B细胞产生)的试剂。在一些实施方案中，在生物体中抗原引发体液反应(例如，包括产生抗原-特异性抗体)；备选地或另外，在一些实施方案中，在生物体中抗原引发细胞反应(例如，涉及T-细胞，其受体与抗原特异性相互作用)。本领域技术人员将理解，特定的抗原可在目标生物(例如，小鼠、兔、灵长类动物、人)的一个或数个成员中，而非在目标生物物种的所有成员中引发免疫反应。在一些实施方案中，抗原在目标生物物种的至少约25%, 30%,35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%,94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%的成员中引发免疫反应。在一些实施方案中，抗原结合至抗体和/或T细胞受体，和在生物体中可能诱导或可能不诱导特定的生理反应。在一些实施方案中，例如，抗原可体外结合至抗体和/或T细胞受体，无论这样的相互作用是否在体内发生。在一些实施方案中，抗原与特定的体液或细胞免疫的产物(包括通过异源免疫源诱导的那些)相互作用。在公开的组合物和方法的一些实施方案中，流感HA H1N1蛋白是抗原。

大约：如本文所用的术语“大约”或“约”，在应用于一个或多个目标值时，是指类似于所述参考值的值。在某些实施方案中，术语“大约”或“约”是指落入在所述参考值的任一方向(大于或小于)上25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%,9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%或更少内的值的范围，除非另外说明或从上下文另外明显(这样的值超过可能值的100%的情况除外)。

结合：将理解，如本文所用的术语“结合”通常是指两个或更多个部分之间的非-共价缔合。“直接”结合包括在实体或部分之间的物理接触；间接结合包括通过与一个或多个中间实体物理接触的物理相互作用。在两个或更多个实体之间的结合可在各种情况的任一种下进行评价 – 包括其中在分离的情况下或在较复杂的系统的情况下研究相互作用实体或部分(例如，共价或以其它方式与载体实体缔合和/或在生物系统或细胞中)。

载体：如本文所用的术语“载体”是指组合物与其一起给予的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介。在一些实例性的实施方案中，载体可包括无菌液体，例如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的油，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。在一些实施方案中，载体是或包括一个或多个固体组分。

共同给予：如本文所用的，“共同给予”是指给予受试者至少两种不同的优化的流感HA蛋白。在一些实施方案中，至少两种优化的流感HA蛋白可作为组合或合剂被同时给予。在一些实施方案中，第一和第二优化的流感HA蛋白可被序贯给予(例如，第一优化的流感HA蛋白作为引发疫苗给予，接着给予作为加强疫苗的第二优化的流感HA蛋白)，其中第一优化的流感HA蛋白不同于第二优化的流感HA蛋白。

密码子优化的：如本文所用的，“密码子优化的”核酸序列是指这样的核酸序列，其已被改变，使得核酸序列的翻译和得到的蛋白的表达对特定的表达系统优化而被改进。“密码子优化的”核酸序列编码与“密码子优化的”核酸序列所依据的未优化的亲本序列相同的蛋白。例如，核酸序列可以被“密码子优化”用于在哺乳动物细胞(例如，CHO细胞、人细胞、小鼠细胞等)、细菌细胞(例如，大肠杆菌)、昆虫细胞、酵母细胞或植物细胞中表达。

可比较的：如本文所用的，术语“可比较的”是指两种或更多种试剂、实体、情况、条件组等，它们可能彼此不同，但足够类似以允许在其之间进行比较，使得可根据观察到的差异或相似性合理地得出结论。本领域普通技术人员将理解，在上下文中，在任何给定的情况下对认为是可比较的两种或更多种这样的试剂、实体、情况、条件组等需要的一致性程度。

测定：本文所述的许多方法包括“测定”的步骤。本领域普通技术人员在阅读本说明书时将理解，这样的“测定”可利用本领域技术人员可获得的各种技术的任何一种，包括例如本文明确提及的具体技术。在一些实施方案中，测定包括处理物理样品。在一些实施方案中，测定包括考虑和/或处理数据或信息，例如利用计算机或适合进行相关分析的其它处理单元。在一些实施方案中，测定包括从来源接收相关信息和/或材料。在一些实施方案中，测定包括比较样品或实体与可比较的参比的一个或多个特征。

表位：如本文所用的，术语“表位”包括由免疫球蛋白(例如，抗体或受体)结合组分整体或部分地特异性识别的任何部分。在一些实施方案中，表位包含抗原上的多个化学原子或基团。在一些实施方案中，当抗原呈现相关的三维构象时，这样的化学原子或基团是表面暴露的。在一些实施方案中，当抗原呈现这样的构象时，这样的化学原子或基团在空间上彼此物理接近。在一些实施方案中，当抗原呈现可选构象(例如，被线性化)时，至少一些这样的化学原子或基团彼此物理分离。

赋形剂：如本文所用的，术语“赋形剂”是指可包括在药物组合物中例如以提供或促进需要的稠度或稳定效果的非治疗剂。合适的药物赋形剂包括例如，淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、稻米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸纳、单硬脂酸甘油酯、滑石粉、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙二醇、水、乙醇等。

表达：术语“表达”，当在本文中涉及核酸而使用时，是指一个或多个以下事件：(1)产生DNA模板的RNA转录物(例如，通过转录)；(2) 加工RNA转录物(例如，通过剪接、编辑、5’帽形成和/或3’末端形成)；(3) 翻译RNA为多肽；和/或(4) 多肽的翻译后修饰。

融合蛋白：如本文所用的，术语“融合蛋白”是指由自编码两种不同的(例如，异源)蛋白的至少一部分的核酸序列工程改造的核酸序列编码的蛋白。技术人员毫无疑义地知道，为了产生融合蛋白，核酸序列经连接，以致得到的读出不包含内部终止密码子。在一些实施方案中，本文所述的融合蛋白包括流感HA多肽或其片段。

H1N1 HA多肽：“H1N1 HA多肽”，当该术语在本文中使用时是氨基酸序列包括H1N1特有的并区分H1N1与其它HA亚型的至少一个序列元件的HA多肽。代表性的序列元件可通过比对进行测定。

宿主：术语“宿主”在本文用于指其中存在目的多肽的系统(例如，细胞、生物体等)。在一些实施方案中，宿主是对特定感染剂的感染易感的系统。在一些实施方案中，宿主是表达特定目的多肽的系统。

宿主细胞：如本文所用的，词语“宿主细胞”是指外源DNA (重组或其它)所引入的细胞。例如，宿主细胞可用于通过标准重组技术产生本文所述的优化的流感血凝素多肽。技术人员在阅读本公开内容时将理解，这样的术语不仅指特定的受试细胞，而且指这样的细胞的子代。因为由于突变或环境影响导致而可在随后数代中发生某些修饰，这样的子代事实上可能与亲代细胞不相同，但仍包括在如本文所用的术语"宿主细胞"的范围内。在一些实施方案中，宿主细胞包括适合于表达外源DNA (例如，重组核酸序列)的任何原核和真核细胞。实例性的细胞包括原核生物和真核生物的那些(单细胞或多细胞)、细菌细胞(例如，大肠杆菌、芽孢杆菌、链霉菌等的菌株)、分支杆菌细胞、真菌细胞、酵母细胞(例如，酿酒酵母、稷酒酵母、巴斯德毕赤酵母、甲醇毕赤酵母等)、植物细胞、昆虫细胞(例如，SF-9、SF-21、杆状病毒-感染的昆虫细胞、粉纹夜蛾等)、非人动物细胞、人细胞或融合细胞，例如杂交瘤或四源杂交瘤。在一些实施方案中，细胞是人、猴、猿、仓鼠、大鼠或小鼠细胞。在一些实施方案中，细胞是真核的，和选自以下细胞：CHO (例如，CHO K1, DXB-11 CHO, Veggie-CHO)、COS (例如，COS-7)、视网膜细胞、Vero、CV1、肾脏(例如，HEK293, 293 EBNA, MSR 293,MDCK, HaK, BHK)、HeLa、HepG2、WI38、MRC 5、Colo205、HB 8065、HL-60 (例如，BHK21)、Jurkat、Daudi、A431 (表皮)、CV-1、U937、3T3、L细胞、C127细胞、SP2/0、NS-0、MMT 060562、Sertoli细胞、BRL 3A细胞、HT1080细胞、骨髓瘤细胞、肿瘤细胞和源自前述细胞的细胞系。在一些实施方案中，细胞包含一个或多个病毒基因，例如，表达病毒基因的视网膜细胞(例如，PER.C6™细胞)。

免疫反应：如本文所用的，术语“免疫反应”是指免疫系统的细胞，例如B细胞、T细胞、树突细胞、巨噬细胞或多形核细胞对刺激例如抗原或疫苗的反应。免疫反应可包括参与宿主防御反应的身体的任何细胞，包括例如分泌干扰素或细胞因子的上皮细胞。免疫反应包括但不限于，先天性和/或适应性免疫反应。如本文所用的，保护性免疫反应是指保护受试者免于感染(预防感染或预防与感染有关的疾病发生)的免疫反应。测量免疫反应的方法是本领域众所周知的，和包括例如，测量淋巴细胞(例如B或T细胞)的增殖和/或活性、细胞因子或趋化因子的分泌、炎症、抗体产生等。

免疫源：如本文所用的，术语“免疫源”是指能够在合适的条件下刺激免疫反应，例如在动物中产生抗体或T细胞反应的化合物、组合物或物质，包括注射给动物或动物内吸收的组合物。如本文所用的，“免疫原性组合物”是包含免疫源(例如HA多肽)的可给予的组合物。“免疫原性组合物”包括例如，疫苗。如本文所用的，“免疫”意指通过例如接种疫苗，使受试者经保护免于感染性疾病。

体外：如本文所用的，术语“体外”是指在人工环境中，例如，在试管或反应容器中，在细胞培养中等，而非在多细胞生物体内发生的事件。

体内：如本文所用的，术语“体内”是指在多细胞生物体，例如人和非人动物内发生的事件。在基于细胞的系统的情况下，该术语可用于指在活细胞(相对于例如体外系统)内发生的事件。

流感疫苗：如本文所用的，术语“流感疫苗”或“疫苗”是指能够刺激免疫反应的免疫原性组合物，其经给予用于预防、阻止、改善或治疗流感病毒感染。流感疫苗可包括例如，减毒或杀灭流感病毒、其亚单位制剂(即，裂解-灭活的疫苗)、病毒-样颗粒(VLP)和/或抗原多肽(例如，本文所述的计算优化的血凝素)或源自它们的DNA，或这样的免疫原性材料的任何重组形式。本文所述的流感疫苗可任选地包含一种或多种佐剂。

分离的：如本文所用的，术语“分离的”是指以下的物质和/或实体：(1) 已与当初始产生(无论是天然和/或实验环境下)时其伴随的至少一些组分分离，和/或(2) 通过人工设计、产生、制备和/或制造。分离的物质和/或实体可与它们初始伴随的约10%, 约20%, 约30%, 约40%, 约50%, 约60%, 约70%, 约80%, 约90%, 约91%, 约92%, 约93%, 约94%, 约95%, 约96%, 约97%, 约98%, 约99%或超过约99%的其它组分分离。在一些实施方案中，分离的试剂是约80%, 约85%, 约90%, 约91%, 约92%, 约93%, 约94%, 约95%, 约96%, 约97%, 约98%, 约99%或超过约99%纯的。如本文所用的，如果物质基本上不含其它组分，则是“纯的”。在一些实施方案中，如本领域技术人员将理解的，物质在已与某些其它组分，例如一种或多种载体或赋形剂(例如，缓冲液、溶剂、水等)组合后，可仍被视为“分离的”或甚至“纯的”；在这样的实施方案中，在不包括这样的载体或赋形剂的情况下计算物质的百分比分离或纯度。仅给出一个实例，在一些实施方案中，天然存在的生物聚合物例如多肽或多核苷酸被视为是“分离的”，当a) 根据其起源或来源，与在自然中在天然状态下伴随其的一些或所有组分不关联；b) 基本上不含与在自然中产生其的物种相同的物种的其它多肽或核酸；c) 通过不属于在自然中产生其的物种的细胞或其它表达系统表达，或以其它方式与来自不属于在自然中产生其的物种的细胞或其它表达系统的组分关联。因此，例如，在一些实施方案中，化学合成的或在不同于自然中产生其的细胞系统的细胞系统中合成的多肽被视为"分离的"多肽。备选地或另外地，在一些实施方案中，在已与a) 天然与其关联；和/或b)当初始产生时与其关联的其它组分分离的方面来说，已经受一种或多种纯化技术的多肽可被视为“分离的”多肽。

核酸：如本文所用的，词语“核酸”在其最广泛的意义上是指被掺入或可被掺入寡核苷酸链的任何化合物和/或物质。在一些实施方案中，核酸是通过磷酸二酯键被掺入或可被掺入寡核苷酸链的化合物和/或物质。从上下文清楚的是，在一些实施方案中，“核酸”是指单个核酸残基(例如，核苷酸和/或核苷)；在一些实施方案中，“核酸”是指包含单个核酸残基的寡核苷酸链。在一些实施方案中，“核酸”是或包含RNA；在一些实施方案中，“核酸”是或包含DNA。在一些实施方案中，核酸是一个或多个天然核酸残基，包含一个或多个天然核酸残基或由其组成。在一些实施方案中，核酸是一个或多个核酸类似物，包含一个或多个核酸类似物或由其组成。在一些实施方案中，核酸类似物不同于核酸之处在于其不利用磷酸二酯骨架。例如，在一些实施方案中，核酸是一个或多个“肽核酸”，包含一个或多个“肽核酸”或由其组成，所述“肽核酸”是本领域已知的，和在骨架中具有肽键而非磷酸二酯键，被认为在本发明的范围内。备选地或另外，在一些实施方案中，核酸具有一个或多个硫代磷酸酯和/或5’-N-亚氨基磷酸酯键，而非磷酸二酯键。在一些实施方案中，核酸是一个或多个天然核苷(例如，腺苷、胸苷、鸟苷、胞苷、尿苷、脱氧腺苷、脱氧胸苷、脱氧鸟苷和脱氧胞苷)，包含一个或多个天然核苷或由其组成。在一些实施方案中，核酸是一个或多个核苷类似物(例如，2-氨基腺苷、2-硫代胸苷、肌苷、吡咯并-嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、C-5丙炔基-胞苷、C-5丙炔基-尿苷、2-氨基腺苷、C5-溴尿苷、C5-氟尿苷、C5-碘尿苷、C5-丙炔基-尿苷、C5-丙炔基-胞苷、C5-甲基胞苷、2-氨基腺苷、7-脱氮腺苷、7-脱氮鸟苷、8-氧代腺苷、8-氧代鸟苷、O(6)-甲基鸟嘌呤、2-硫代胞苷、甲基化碱基、嵌入碱基和其组合)，包含一个或多个核苷类似物或由其组成。在一些实施方案中，与天然核酸中的那些相比，核酸包含一个或多个修饰的糖(例如，2’-氟核糖、核糖、2’-脱氧核糖、阿拉伯糖和己糖)。在一些实施方案中，核酸具有编码功能性基因产物例如RNA或蛋白的核苷酸序列。在一些实施方案中，核酸包括一个或多个内含子。在一些实施方案中，核酸通过自天然来源分离、根据互补模板(体内或体外)通过聚合的酶促合成、在重组细胞或系统中复制和化学合成中的一种或多种制备。在一些实施方案中，核酸长度是至少3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45,50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160,170, 180, 190, 20, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475,500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000或更多个残基。在一些实施方案中，核酸是单链的；在一些实施方案中，核酸是双链的。在一些实施方案中，核酸具有包含编码多肽或与编码多肽的序列互补的至少一个元件的核苷酸序列。在一些实施方案中，核酸具有酶促活性。

优化的流感HA蛋白：如本文所用的，"优化的流感HA蛋白"、“优化的H1N1流感HA多肽”或“计算优化的”是指通过人H1N1流感病毒分离株或人和猪H1N1流感病毒分离株(描述于例如，Ross, T.M等人的国际公布WO2013/148164和美国公布US2014/0147459，其通过引用以其整体结合到本文中)的序列比对产生的非天然存在的HA蛋白共有序列。编码优化的HA蛋白的核苷酸序列通过密码子优化和RNA优化(例如增加RNA稳定性)，被进一步优化以在哺乳动物细胞中表达。本文公开的(和本文作为SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ IDNO: 3和SEQ ID NO: 4阐述的)优化的流感HA蛋白也被称为"COBRA" (计算-优化的广泛反应性抗原)序列。优化的HA多肽经设计以在受试者中引发广泛反应性免疫反应。它们的氨基酸序列由人设计，和/或它们的存在和产生需要人的作用。例如，本文所述的计算优化的HA多肽具有不同于在天然流感分离株中存在的HA多肽的氨基酸序列的氨基酸序列。在本公开内容的情况下，"广泛反应性"是指蛋白序列在受试者中引发免疫反应，其足以抑制、中和或防止广泛的H1N1流感病毒(例如，在特定亚型内的大多数或所有的流感病毒)的感染。优化的H1N1流感HA蛋白的共同给予能够针对大流行和季节性H1N1流感毒株二者引发免疫反应，例如保护性免疫反应。

可操作连接：如本文所用的，词语“可操作连接”是指其中描述的组分处于允许它们以它们预期的方式发挥功能的关系中的并置。控制序列"可操作连接"至编码序列，以这样的方式连接，使得编码序列的表达在与控制序列相容的条件下实现。"可操作连接"的序列包括与目的基因邻近的表达控制序列和反向或隔开一段距离起作用以控制目的基因的表达控制序列二者。如本文所用的术语"表达控制序列"是指实现它们所连接的编码序列的表达和加工所必需的多核苷酸序列。表达控制序列包括合适的转录起始、终止、启动子和增强子序列；有效的RNA加工信号，例如剪接和多腺苷酸化信号；稳定细胞质mRNA的序列；增强翻译效率的序列(即，Kozak共有序列)；增强蛋白稳定性的序列；和需要时，增强蛋白分泌的序列。这样的控制序列的性质根据宿主生物体而不同。例如，在原核生物中，这样的控制序列通常包括启动子、核糖体结合位点和转录终止序列，而在真核生物中，通常这样的控制序列包括启动子和转录终止序列。术语"控制序列"意欲包括其存在是表达和加工所必需的组分，和也可包括其存在是有利的另外组分，例如前导序列和融合配偶体序列。

爆发：如本文所用的，流感病毒“爆发”是指在给定年中来自单个国家内的病毒分离株的合集。

大流行毒株：“大流行”流感毒株是已导致或有能力导致人群的大流行感染的流感毒株。在一些实施方案中，大流行毒株已导致大流行感染。在一些实施方案中，这样的大流行感染包括在多个地区间的流行性感染；在一些实施方案中，大流行感染包括在彼此分开(例如，通过山脉、水体、作为不同大陆的一部分等等)以致感染通常不在它们之间传播的地区间的感染。在一些实施方案中，大流行毒株是A/California/07/2009 H1N1。

药学上可接受的媒介：本公开内容中使用的药学上可接受的载体(媒介)是常规的。E. W. Martin的Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co.,Easton, PA, 第15版(1975)描述了适合于一种或多种治疗组合物，例如一种或多种流感疫苗和另外的药剂的药物递送的组合物和制剂。一般而言，载体的性质依赖于使用的具体给药方式。例如，胃肠外制剂通常包含可注射液体，其包括药学上和生理学上可接受的液体，例如水、生理盐水、平衡盐溶液、葡萄糖水溶液、甘油等作为媒介。对于固体组合物(例如，粉剂、丸剂、片剂或胶囊形式)，常规的无毒固体载体可包括例如，药用级的甘露醇、乳糖、淀粉或硬脂酸镁。除了生物学中性载体之外，待给予的药物组合物还可包含较少量的无毒辅助物质，例如湿润剂或乳化剂、防腐剂和pH缓冲剂等，例如乙酸钠或脱水山梨糖醇单月桂酸酯。

多肽：“多肽”，一般而言，是一串通过肽键彼此连接的至少2个氨基酸。在一些实施方案中，多肽可包括至少3-5个氨基酸，其通过至少一个肽键彼此连接。本领域普通技术人员将理解，多肽有时任选地包括“非天然”氨基酸或仍然能够整合至多肽链的其它实体。在一些实施方案中，术语“多肽”用于指特定功能类型的多肽，例如HA多肽等。在一些实施方案中，可用的多肽(例如，本文所述的计算优化的H1 HA多肽)可包含亲本多肽的片段(例如，表位)或由其组成。在一些实施方案中，可用的多肽可包含多个(例如，2、3、4个等)片段(例如，表位)或由其组成，相对于目的多肽中存在的其它片段，其各自以不同的空间排列存在于相同的亲本多肽中(例如，在亲本中直接连接的片段可以在目的多肽中空间分离，或反之亦然，和/或片段可以与亲本不同的顺序存在于目的多肽中)，使得目的多肽是其亲本多肽的衍生物。或者，在一些实施方案中，可用的多肽可包含多个(例如，2、3、4个等)片段(例如，表位)或由其组成，其各自存在于与目的多肽不同的亲本多肽中(例如，来源于不同的亲本多肽的片段，和/或片段可以与亲本多肽不同的顺序存在于目的多肽中)，使得目的多肽是其亲本多肽的衍生物。

预防：术语“预防”，如本文所用的，是指预防、避免疾病表现、延迟发作和/或降低特定疾病、病症或病况(例如，感染，例如流感病毒感染)的一个或多个症状的频率和/或严重性。在一些实施方案中，预防基于群体进行评价，以致如果在对疾病、病症或病况易感的群体中在疾病、病症或病况的一个或多个症状的发生、频率和/或强度方面观察到统计学显著降低，则试剂被认为“预防”特定疾病、病症或病况。

纯的：如本文所用的，如果试剂或实体基本上不含其它组分，则其是“纯的”。例如，包含超过约90%的特定试剂或实体的制剂通常被认为是纯的制剂。在一些实施方案中，试剂或实体是至少91%, 至少92%, 至少93%, 至少94%, 至少95%, 至少96%, 至少97%, 至少98%或至少99%纯的。

重组：如本文所用的，术语“重组”意欲指通过重组方式设计、工程改造、制备、表达、产生或分离的多肽(例如，本文所述的HA多肽)，例如使用转染至宿主细胞的重组表达载体表达的多肽、自重组的组合多肽文库分离的多肽，或通过任何其它方式(包括剪接多个选择的序列元件)制备、表达、产生或分离的多肽。在一些实施方案中，一个或多个这样的选择序列元件天然存在。在一些实施方案中，一个或多个这样的选择序列元件用计算机设计。在一些实施方案中，一个或多个这样的选择序列元件自已知序列元件的诱变(例如，体内或体 外)产生，例如来自天然或合成来源。在一些实施方案中，一个或多个这样的选择序列元件自并非天然存在于相同多肽的多个(例如，2或更多个)已知序列元件的组合产生(例如，来自两个单独的H1 HA多肽的2个表位)。

参比：术语“参比”在文本中通常用于描述目的试剂、个体、群体、样品、序列或值所比较的标准或对照试剂、个体、群体、样品、序列或值。在一些实施方案中，与目的试剂、个体、群体、样品、序列或值的测试或测定基本上同时测试和/或测定参比试剂、个体、群体、样品、序列或值。在一些实施方案中，参比试剂、个体、群体、样品、序列或值是历史参比，其任选地在实体介质中具体化。通常，本领域技术人员将理解，在与用于测定或表征目的试剂、个体、群体、样品、序列或值的那些可比较的条件下测定或表征参比试剂、个体、群体、样品、序列或值。

季节性毒株：“季节性”流感毒株是已引起或有能力引起人群的季节性感染(例如，每年一次的流行病)的流感毒株。在一些实施方案中，季节性毒株已引起季节性感染。

序列同一性：氨基酸或核酸序列之间的相似性根据序列之间的相似性表示，另外称为序列同一性。序列同一性通常按照百分比同一性(或相似性或同源性)测量；百分比越高，两个序列的相似性越大。当使用标准方法比对时，给定的基因或蛋白的同源物或变体将具有相对高程度的序列同一性。用于比较的序列比对方法是本领域众所周知的。各种程序和比对算法描述于：Smith和Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482, 1981; Needleman和Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970; Pearson和Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci.U.S.A. 85:2444, 1988; Higgins和Sharp, Gene 73:237-244, 1988; Higgins和Sharp,CABIOS 5:151-153, 1989; Corpet et al., Nucleic Acids Research 16:10881-10890,1988;和Pearson和Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2444, 1988. Altschulet al., Nature Genet. 6:119-129, 1994。NCBI Basic Local Alignment Search Tool(BLAST^TM) (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990)可获自数个来源，包括National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, Md.)和互联网，与序列分析程序blastp, blastn, blastx, tblastn和tblastx结合使用。

受试者：如本文所用的，术语“受试者”意指任何哺乳动物，包括小鼠、雪貂和人。在本发明的某些实施方案中，受试者是成年、青年或幼年。在一些实施方案中，使用术语“个体”或“患者”，其意欲与“受试者”可互换。本发明还预期共同给予优化的H1N1流感HA蛋白至猪和/或对猪进行所述方法。

基本上：如本文所用的，术语“基本上”是指显示目的特征或性质的全部或接近全部的范围或程度的定性情况。生物学领域的普通技术人员将理解，生物学和化学现象很少(如果发生的话)达到完全和/或进行完全，或实现或避免绝对结果。因此术语“基本上”在本文用于捕获在许多生物学和化学现象中固有的完全性的潜在缺少。

转化：如本文所用的，是指外源DNA引入宿主细胞的任何过程。转化可在天然或人工条件下使用本领域众所周知的各种方法发生。转化可依赖于任何已知的方法以将外源核酸序列插入原核或真核宿主细胞。在一些实施方案中，具体的转化方法根据转化的宿主细胞进行选择和可包括但不限于，病毒感染、电穿孔、交配、脂质转染。在一些实施方案中，"转化的"细胞被稳定地转化，是因为插入的DNA能够作为自主复制质粒或作为宿主染色体的一部分复制。在一些实施方案中，转化的细胞在有限的时间内瞬时表达引入的核酸。

接种疫苗：如本文所用的，术语“接种疫苗”是指给予组合物(特别是共同给予本文所公开的计算优化的H1N1 HA多肽的两种或更多种)意图产生例如对引起疾病的试剂，例如流感的免疫反应。接种疫苗可在暴露于引起疾病的试剂和/或一个或多个症状发生之前、期间和/或之后给予，和在一些实施方案中，在暴露于试剂之前、期间和/或紧接之后给予。疫苗可引发预防性(阻止性)和治疗性反应二者。给予方法根据疫苗而变，但可包括接种、摄取、吸入或其它给予形式。接种可通过多种途径的任何一种递送，包括胃肠外，例如静脉内、皮下或肌内。疫苗可与佐剂一起给予以加强免疫反应。在一些实施方案中，接种疫苗包括接种组合物的在时间上合适分开的多次给予。

载体：如本文所用的，术语“载体”是指能够运输它已连接的另一种核酸的核酸分子。一种类型的载体是"质粒"，其指环状双链DNA环，其中可连接另外的DNA区段。另一类型的载体是病毒载体，其中另外的DNA区段可连接至病毒基因组。某些载体能够在它们引入的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和游离型哺乳动物载体)。其它载体(例如，非游离型哺乳动物载体)可在引入宿主细胞时整合至宿主细胞的基因组，和从而与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导它们有效连接的基因的表达。这样的载体在文本中被称为"表达载体"。

病毒样颗粒(VLP)：如本文所用的，词语“病毒样颗粒”或“VLP”是指类似于病毒但缺少任何病毒遗传物质，因此无传染性的颗粒。“病毒样颗粒”或“VLP”可通过在各种细胞培养系统中异源表达产生，所述系统包括哺乳动物细胞系、昆虫细胞系、酵母和植物细胞。此外，VLP可通过本领域已知的方法纯化。在一些实施方案中，本文所述的流感VLP包含血凝素(HA)多肽和神经氨酸酶(NA)多肽。在一些实施方案中，本文所述的流感VLP包含HA多肽、NA多肽和/或病毒结构多肽(例如，流感结构蛋白，例如流感M1)。在某些实施方案中，本文所述的流感VLP包含HA多肽、NA多肽和/或M1多肽。在一些实施方案中，本文所述的流感VLP包含HA多肽、NA多肽和/或HIV gag多肽。技术人员知道，其它病毒结构蛋白可用作本文所例举的那些的备选方案。流感VLP可通过用编码HA和NA蛋白，和任选HIV gag蛋白的质粒转染宿主细胞(例如，哺乳动物细胞)产生。在孵育转染的细胞合适的时间以允许蛋白表达(例如大约72小时)后，VLP可自细胞培养上清液分离。在一些实施方案中，本文所述的流感VLP通过在哺乳动物细胞(例如，人细胞)中瞬时转染产生。在一些实施方案中，流感VLP通过使用一种或多种测定法进行分析。仅给出几个实例，流感VLP可针对血凝素活性、动态光散射和通过蛋白染色的血凝素含量定量进行分析。在阅读本公开内容时，其它测定法对技术人员而言是显而易见的。

某些实施方案的详细描述

标准技术可用于重组DNA、寡核苷酸合成和组织培养和转化(例如，电穿孔、脂质转染)。酶反应和纯化技术可根据制造商的说明书或按本领域通常实行的或按本文所述的进行。前述技术和程序可通常根据本领域众所周知的和如在本说明书全文中引用和论述的各种一般性和较特定的参考书中所述的常规方法进行。参见例如，Sambrook et al. MolecularCloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor, N.Y. (1989))，其通过引用结合到本文中用于任何目的。

共同给予H1N1血凝素计算优化的广泛反应性抗原(COBRA)

流感A病毒属于正粘病毒科。根据它们的血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)蛋白将它们分类为16个HA亚型(H1-H16)和9个NA亚型(N1-N9)。HA蛋白在介导病毒与细胞受体的结合和病毒与内体膜的融合中起重要作用。NA蛋白通过从细胞和病毒HA和NA蛋白除去唾液酸，促进病毒自感染细胞的释放。由于抗原漂移和较少见地，抗原转变，主要的流感抗原，特别是HA的氨基酸序列在组、亚型和毒株间高度可变。本文公开了通过针对广谱的H1N1流感毒株，包括季节性和大流行毒株二者产生通用的广泛反应性的保护性消毒免疫，克服H1N1抗原多样性的挑战的流感疫苗。

本文公开的实施方案依赖于使用多轮共有序列产生的抗原设计方法，称为计算优化的广泛反应性抗原(COBRA)。该方法经设计以解决H1N1 HA内的多样性和使用全球监测工作以产生具有在该抗原多样性多肽内引发增加宽度的抗体反应的潜力的疫苗。数种H1N1HA计算优化的抗原(COBRA)根据选择的自1918-2012年分离的H1N1病毒被设计，所述病毒包括1) 来自1933-2011年的人和猪流感毒株(P1)，2) 来自1999-2012年的人流感毒株(X6)，3) 来自1978-2008年的人流感毒株(X3)，和4) 来自1918-2012年的人流感毒株。

本文提供了H1N1 COBRA HA的共同给予，其拓展了在受试者中针对不同的H1N1流感毒株，包括季节性和大流行H1N1毒株二者的抗体反应的宽度。本发明的共同给予包括H1N1 COBRA HA蛋白的新组合或合剂，以及H1N1 COBRA HA蛋白的引发-加强给予。

本文所述的组合物包含不匹配天然存在的毒株的H1N1亚型的优化血凝素分子的组合或合剂。与任一分子可单独提供的相比，以组合的形式，这些分子协同起作用以对天然存在的H1N1毒株(季节性和大流行二者)提供较宽的覆盖。本文所述的组合/合剂的协同性是经验上可验证的。例如，如随附的实施例中所述，各COBRA HA蛋白在病毒-样颗粒(VLP)上表达和作为疫苗免疫源纯化。将H1N1 COBRA HA VLP的合剂给予小鼠和测量对跨越几十年的流感毒株小组的体液免疫反应。某些季节性H1N1 COBRA HA VLP的共同给予对某些流感毒株的抗体反应具有拮抗作用。加入大流行H1N1 COBRA VLP至合剂引发对大流行流感毒株的强的抗体反应，但同时令人惊讶地拓展对测试的季节性流感毒株的抗体反应的宽度。根据使用的COBRA的组合和给予次序，在引发-加强方案中H1N1 COBRA VLP的共同给予引发针对H1N1流感毒株的广泛反应性HAI活性。季节性H1N1 COBRA VLP的共同给予导致很少或没有针对大流行H1N1毒株或历史H1N1毒株(1934-1957年)的活性。组合大流行P1 COBRA VLP与季节性COBRA VLP导致针对大流行H1N1毒株的强的抗体活性和在某些情况下，协同地拓展针对季节性流感毒株的抗体反应的宽度。用P1 COBRA VLP引发通常引发比用P1 COBRAVLP加强更高的HIA效价。在其它情况下，改变给予次序具有拮抗作用。总之，发现证实，共同给予大流行H1N1 COBRA和季节性H1N1 COBRA协同地拓展针对历史流感病毒小组的免疫反应的宽度，和在引发-加强方案中给予H1N1 COBRA的次序是重要的。

用于本发明实施方案的具体的优化HA多肽的氨基酸序列在本文中作为SEQ IDNO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3和SEQ ID NO: 4阐明。

表1

之前已经描述了关于这些分子的设计和产生的细节，特别是在国际公布WO2013/148164和美国公布2014/0147459中，其通过引用以其整体结合到本文中。优化的大流行H1N1 HA多肽通过一系列HA蛋白比对，和随后根据在1933-2011年分离的156个人流感毒株和49个猪H1N1流感毒株产生共有序列来开发。优化的季节性X6 H1N1 HA多肽通过一系列HA蛋白比对，和随后根据在1999-2012年分离的1273个人流感毒株产生共有序列来开发。优化的季节性X3 H1N1 HA多肽通过一系列HA蛋白比对，和随后根据在1978-2008中分离的1204个人流感毒株产生共有序列来开发。优化的季节性X1 H1N1 HA多肽通过一系列HA蛋白比对，和随后根据在1918-2012年分离的1448个人流感毒株产生共有序列来开发。

本文提供了优化的重组流感HA多肽的非天然存在的变体。在某些实施方案中，重组、优化的流感HA多肽包含与SEQ ID NO: 1具有至少98%, 98.5%, 99%或99.5%同一性的氨基酸序列。还提供了重组、优化的流感HA多肽，其包含与SEQ ID NO: 2具有至少99%或99.5%同一性的氨基酸序列。还提供了重组、优化的流感HA多肽，其包含与SEQ ID NO: 3具有至少99%或99.5%同一性的氨基酸序列。还提供了重组、优化的流感HA多肽，其包含与SEQ ID NO:4具有至少96%, 96.5%, 97%, 97.5%, 98%, 98.5%, 99%或99.5%同一性的氨基酸序列。

在另一个实施方案中，重组、优化的流感HA多肽包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO:1的残基2-566具有至少98%, 98.5%, 99%或99.5%同一性。在另一个实施方案中，重组、优化的流感HA多肽包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO: 2的残基2-565具有至少99%或99.5%同一性。在又一个实施方案中，重组、优化的流感HA多肽包含与SEQ ID NO: 3的残基2-566具有至少99%或99.5%同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，重组、优化的流感HA多肽包含与SEQ ID NO: 4的残基2-566具有至少96%, 96.5%, 97%, 97.5%, 98%, 98.5%, 99%或99.5%同一性的氨基酸序列。

在其它实施方案中，优化的流感HA多肽的氨基酸序列包含(i) 相对于SEQ ID NO:1，不超过8, 不超过7, 不超过6, 不超过5, 不超过4, 不超过3, 不超过2或不超过1个氨基酸置换；(ii) 相对于SEQ ID NO: 2，不超过6, 不超过5, 不超过4, 不超过3, 不超过2或不超过1个氨基酸置换; (iii) 相对于SEQ ID NO: 3，不超过6, 不超过5, 不超过4, 不超过3, 不超过2或不超过1个氨基酸置换; (iv) 相对于SEQ ID NO: 4，不超过10, 不超过9, 不超过8, 不超过7, 不超过6, 不超过5, 不超过4, 不超过3, 不超过2或不超过1个氨基酸置换。

在一些实施方案中，优化的流感HA多肽包含SEQ ID NO: 1的残基2-566、SEQ IDNO: 2的残基2-565、SEQ ID NO: 3的残基2-566或SEQ ID NO: 4的残基2-566的氨基酸序列或由其组成。在其它实施方案中，优化的流感HA多肽包含SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2,SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 4的氨基酸序列或由其组成。

进一步提供了编码本文所公开的重组流感HA多肽的分离的核酸分子。在一些实施方案中，核酸分子经密码子-优化以在哺乳动物细胞中表达。核酸分子任选地对RNA稳定性进一步优化。

在一个实施方案中，核酸分子包含编码SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 1的残基2-566的氨基酸序列的核酸序列。在另一个实施方案中，核酸分子包含编码SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 2的残基2-565的氨基酸序列的核酸序列。在另一个实施方案中，核酸分子包含编码SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 3的残基2-566的氨基酸序列的核酸序列。在另一个实施方案中，核酸分子包含编码SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 4的残基2-566的氨基酸序列的核酸序列。由核酸分子编码的优化的流感HA多肽、包含核酸分子的载体和包含公开的载体的宿主细胞也在本文中提供。

根据本发明的核酸分子的表达可通过第二核酸序列调节，使得所述分子在用重组DNA分子转化的宿主中表达。例如，本发明的核酸分子的表达可通过启动子和/或增强子元件控制，它们是本领域已知的。

通过本领域已知的方法将本发明的核酸构建体插入表达载体或病毒载体，和核酸分子可操作连接至表达控制序列。

将包含核酸分子的表达载体转化至合适的宿主细胞，以允许产生由核酸构建体编码的蛋白。实例性的宿主细胞包括原核生物(例如，大肠杆菌)和真核生物(例如，COS, 293或CHO细胞)。用表达载体转化的宿主细胞在允许产生本发明的优化的HA多肽的条件下生长，接着回收优化的HA多肽。

本公开内容还提供了包含编码重组的HA多肽的核酸分子的载体。载体可以是用于表达HA多肽的任何合适的载体，例如哺乳动物表达载体。在具体的实例中，载体是pTR600表达载体(美国专利申请公开号2002/0106798, 通过引用结合到本文中; Ross et ah, NatImmunol. 1(2): 102-103, 2000; Green et al., Vaccine 20:242-248, 2001)。在一些实例中，载体包括可操作连接至编码HA多肽的核酸序列的启动子。在具体的实例中，启动子是CMV启动子。

本公开内容还提供了包含本文所述的一种或多种优化的流感HA多肽(例如，表1中出现的HA多肽)的融合蛋白。

本文提供了包含具有优化的氨基酸序列的重组H1N1流感HA多肽的组合的组合物(即，合剂)，用于引发针对H1N1流感的广泛反应性免疫反应。在一些实施方案中，本文所述的组合物包含(i) 包含与SEQ ID NO: 1具有至少98%、98.5%、99%或99.5%同一性的氨基酸序列的第一优化的流感HA多肽，和(ii) 包含与SEQ ID NO: 2具有至少99%或至少99.5%同一性的氨基酸序列的第二优化的流感HA多肽。在具体的实施方案中，与SEQ ID NO: 1具有至少98%、98.5%、99%或99.5%同一性的第一优化的流感HA多肽的氨基酸序列缺少N-末端甲硫氨酸残基。在具体的实施方案中，与SEQ ID NO: 2具有至少99%或至少99.5%同一性的第二优化的流感HA多肽的氨基酸序列缺少N-末端甲硫氨酸残基。在一些实施方案中，合剂包含第一优化的流感HA多肽，其包含与SEQ ID NO: 1的残基2-566具有至少98%、98.5%、99%或99.5%同一性的氨基酸序列；和第二优化的流感HA多肽，其包含与SEQ ID NO: 2的残基2-565具有至少99%或至少99.5%同一性的氨基酸序列。在具体的实例中，第一和第二优化的流感HA多肽的氨基酸序列分别包含SEQ ID NO: 1的残基2-566和SEQ ID NO: 2的残基2-565的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，合剂包含第一优化的流感HA多肽，其包含与SEQ ID NO: 1的残基2-566具有至少99.5%同一性的氨基酸序列；和第二优化的流感HA多肽，其包含与SEQ ID NO: 3的残基2-565具有至少99.5%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，组合物中的优化的流感HA多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2,SEQ ID NO: 1的残基2-566或SEQ ID NO: 2的残基2-565具有至少95%, 至少95.5%, 至少96%, 至少96.5%, 至少97%, 至少97.5%, 至少98%, 至少98.5%, 至少99%, 至少99.5%,至少99.6%, 至少99.7%, 至少99.8%或至少99.9%同一性。在一些实施方案中，组合物中的优化的流感HA多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 1的残基2-566或SEQ ID NO: 2的残基2-565为100%同源的。在一些实施方案中，组合物包含至少两种不同的优化的流感HA多肽，其中相对于SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2，多肽的氨基酸序列包含不超过两个或不超过一个置换。

在一些实施方案中，本文所述的组合物包含(i) 第一优化的流感HA多肽，其包含与SEQ ID NO: 1具有至少98%, 98.5%, 99%或99.5%同一性的氨基酸序列；和(ii) 第二优化的流感HA多肽，其包含与SEQ ID NO: 3具有至少99%或99.5%同一性的氨基酸序列。在具体的实施方案中，与SEQ ID NO: 1具有至少98%, 98.5%, 99%或99.5%同一性的第一优化的流感HA多肽的氨基酸序列缺少N-末端甲硫氨酸残基。在具体的实施方案中，与SEQ ID NO:3具有至少99%或99.5%同一性的第二优化的流感HA多肽的氨基酸序列缺少N-末端甲硫氨酸残基。在具体的实施方案中，第一优化的流感HA多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO: 1的残基2-566具有至少98%, 98.5%, 99%或99.5%同一性。在具体的实施方案中，第二优化的流感HA多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO: 3的残基2-566具有至少99%或99.5%同一性。在具体的实施方案中，第一优化的流感HA多肽的氨基酸序列包含SEQ ID NO: 1的残基2-566或由其组成。在具体的实施方案中，第二优化的流感HA多肽的氨基酸序列包含SEQ ID NO: 3的残基2-566或由其组成。在一些实施方案中，组合物中的优化的流感HA多肽的氨基酸序列与SEQID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 1的残基2-566或SEQ ID NO: 3的残基2-566具有至少95%, 至少95.5%, 至少96%, 至少96.5%, 至少97%, 至少97.5%, 至少98%, 至少98.5%, 至少99%, 至少99.5%, 至少99.6%, 至少99.7%, 至少99.8%或至少99.9%同一性。在一些实施方案中，组合物中的优化的流感HA多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO: 1, SEQ IDNO: 3, SEQ ID NO: 1的残基2-566或SEQ ID NO: 3的残基2-566是100%同源的。在一些实施方案中，组合物包含至少两种不同的优化的流感HA多肽，其中相对于SEQ ID NO: 1或SEQID NO: 3，多肽的氨基酸序列包含不超过两个或不超过一个置换。

在一些实施方案中，本文所述的组合物包含(i) 第一优化的流感HA多肽，其包含与SEQ ID NO: 1具有至少98%, 98.5%, 99%或99.5%同一性的氨基酸序列；和(ii) 第二优化的流感HA多肽，其包含与SEQ ID NO: 4具有至少96%, 96.5%, 97%, 97.5%, 98%,98.5%, 99%或99.5%同一性的氨基酸序列。在具体的实施方案中，与SEQ ID NO: 1具有至少98%, 98.5%, 99%或99.5%同一性的第一优化的流感HA多肽的氨基酸序列缺少N-末端甲硫氨酸残基。在具体的实施方案中，与SEQ ID NO: 4具有至少99%或99.5%同一性的第二优化的流感HA多肽的氨基酸序列缺少N-末端甲硫氨酸残基。在具体的实施方案中，第一优化的流感HA多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO: 1的残基2-566具有至少98%, 98.5%, 99%或99.5%同一性。在具体的实施方案中，第二优化的流感HA多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO: 4的残基2-566具有至少99%或99.5%同一性。在具体的实施方案中，第一优化的流感HA多肽的氨基酸序列包含SEQ ID NO: 1的残基2-566或由其组成。在具体的实施方案中，第二优化的流感HA多肽的氨基酸序列包含SEQ ID NO: 4的残基2-566或由其组成。在一些实施方案中，组合物中的优化的流感HA多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 1的残基2-566或SEQ ID NO: 4的残基2-566具有至少95%, 至少95.5%, 至少96%, 至少96.5%, 至少97%, 至少97.5%, 至少98%, 至少98.5%, 至少99%, 至少99.5%, 至少99.6%,至少99.7%, 至少99.8%或至少99.9%同一性。在一些实施方案中，组合物中的优化的流感HA多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 1的残基2-566或SEQ IDNO: 4的残基2-566是100%同源的。在一些实施方案中，组合物包含至少两种不同的优化的流感HA多肽，其中相对于SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 4，多肽的氨基酸序列包含不超过两个或不超过一个置换。

在一些实施方案中，本文所述的组合物包含(i) 第一优化的流感HA多肽，其包含与SEQ ID NO: 2具有至少99%或至少99.5%同一性的氨基酸序列，和(ii) 第二优化的流感HA多肽，其包含与SEQ ID NO: 3具有至少99%或99.5%同一性的氨基酸序列。在具体的实施方案中，与SEQ ID NO: 2具有至少99%或至少99.5%同一性的第一优化的流感HA多肽的氨基酸序列缺少N-末端甲硫氨酸残基。在具体的实施方案中，与SEQ ID NO: 3具有至少99%或99.5%同一性的第二优化的流感HA多肽的氨基酸序列缺少N-末端甲硫氨酸残基。在具体的实施方案中，第一优化的流感HA多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO: 2的残基2-565具有至少99%或至少99.5%同一性。在具体的实施方案中，第二优化的流感HA多肽的氨基酸序列与SEQID NO: 3的残基2-566具有至少99%或99.5%同一性。在具体的实施方案中，第一优化的流感HA多肽的氨基酸序列包含SEQ ID NO: 2的残基2-565或由其组成。在具体的实施方案中，第二优化的流感HA多肽的氨基酸序列包含SEQ ID NO: 3的残基2-566或由其组成。在一些实施方案中，组合物中的优化的流感HA多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3,SEQ ID NO: 2的残基2-565或SEQ ID NO: 3的残基2-566具有至少95%, 至少95.5%, 至少96%, 至少96.5%, 至少97%, 至少97.5%, 至少98%, 至少98.5%, 至少99%, 至少99.5%,至少99.6%, 至少99.7%, 至少99.8%或至少99.9%同一性。在一些实施方案中，组合物中的优化的流感HA多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 2的残基2-565或SEQ ID NO: 3的残基2-566是100%同源的。在一些实施方案中，组合物包含至少两种不同的优化的流感HA多肽，其中相对于SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 3，多肽的氨基酸序列包含不超过两个或不超过一个置换。

在一些实施方案中，本文所述的组合物包含(i) 第一优化的流感HA多肽，其包含与SEQ ID NO: 2具有至少99%或至少99.5%同一性的氨基酸序列，和(ii) 第二优化的流感HA多肽，其包含与SEQ ID NO: 4具有至少96%, 96.5%, 97%, 97.5%, 98%, 98.5%, 99%或99.5%同一性的氨基酸序列。在具体的实施方案中，与SEQ ID NO: 2具有至少99%或至少99.5%同一性的第一优化的流感HA多肽的氨基酸序列缺少N-末端甲硫氨酸残基。在具体的实施方案中，与SEQ ID NO: 4具有至少96%, 96.5%, 97%, 97.5%, 98%, 98.5%, 99%或99.5%同一性的第二优化的流感HA多肽的氨基酸序列缺少N-末端甲硫氨酸残基。在具体的实施方案中，第一优化的流感HA多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO: 2的残基2-565具有至少99%或至少99.5%同一性。在具体的实施方案中，第二优化的流感HA多肽的氨基酸序列与SEQID NO: 4的残基2-566具有至少99%或99.5%同一性。在具体的实施方案中，第一优化的流感HA多肽的氨基酸序列包含SEQ ID NO: 2的残基2-565或由其组成。在具体的实施方案中，第二优化的流感HA多肽的氨基酸序列包含SEQ ID NO: 4的残基2-566或由其组成。在一些实施方案中，组合物中的优化的流感HA多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4,SEQ ID NO: 2的残基2-565或SEQ ID NO: 4的残基2-566具有至少95%, 至少95.5%, 至少96%, 至少96.5%, 至少97%, 至少97.5%, 至少98%, 至少98.5%, 至少99%, 至少99.5%,至少99.6%, 至少99.7%, 至少99.8%或至少99.9%同一性。在一些实施方案中，组合物中的优化的流感HA多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 2的残基2-565或SEQ ID NO: 4的残基2-566是100%同源的。在一些实施方案中，组合物包含至少两种不同的优化的流感HA多肽，其中相对于SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 4，多肽的氨基酸序列包含不超过两个或不超过一个置换。

在一些实施方案中，本文所述的组合物包含(i) 第一优化的流感HA多肽，其包含与SEQ ID NO: 3具有至少99%或99.5%同一性的氨基酸序列，和(ii) 第二优化的流感HA多肽，其包含与SEQ ID NO: 4具有至少96%, 96.5%, 97%, 97.5%, 98%, 98.5%, 99%或99.5%同一性的氨基酸序列。在具体的实施方案中，与SEQ ID NO: 3具有至少99%或99.5%同一性的第一优化的流感HA多肽的氨基酸序列缺少N-末端甲硫氨酸残基。在具体的实施方案中，与SEQ ID NO: 4具有至少96%, 96.5%, 97%, 97.5%, 98%, 98.5%, 99%或99.5%同一性的第二优化的流感HA多肽的氨基酸序列缺少N-末端甲硫氨酸残基。在具体的实施方案中，第一优化的流感HA多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO: 3的残基2-566具有至少99%或99.5%同一性。在具体的实施方案中，第二优化的流感HA多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO: 4的残基2-566具有至少99%或99.5%同一性。在具体的实施方案中，第一优化的流感HA多肽的氨基酸序列包含SEQ ID NO: 3的残基2-566或由其组成。在具体的实施方案中，第二优化的流感HA多肽的氨基酸序列包含SEQ ID NO: 4的残基2-566或由其组成。在一些实施方案中，组合物中的优化的流感HA多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 3的残基2-566或SEQ ID NO: 4的残基2-566具有至少95%, 至少95.5%, 至少96%, 至少96.5%,至少97%, 至少97.5%, 至少98%, 至少98.5%, 至少99%, 至少99.5%, 至少99.6%, 至少99.7%, 至少99.8%或至少99.9%同一性。在一些实施方案中，组合物中的优化的流感HA多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 3的残基2-566或SEQ ID NO:4的残基2-566是100%同源的。在一些实施方案中，组合物包含至少两种不同的优化的流感HA多肽，其中相对于SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 4，多肽的氨基酸序列包含不超过两个或不超过一个置换。

优化的HA多肽可在不同的基于真核的表达系统中表达/产生，包括微藻(例如Schizochytrium sp.；参见例如，Bayne, A-C.V. et al., PLOS ONE, 8(4):e61790,April 2013)，基于植物的系统(例如，烟草植物；参见例如，Jul-Larsen, A., et al., Hum Vaccin Immunother., 8(5):653-61, 2012)，酵母(参见例如，Athmaram, T.N. et al.,Virol J., 8:524, 2011)和真菌(参见例如，Allgaier, S. et al., Biologicals, 37:128-32, 2009)。本发明还包括基于细菌的表达系统(参见例如，Davis, A.R. et al.,Gene, 21:273-284, 1983)。这些出版物通过引用以其整体结合到本文中。

本发明的计算优化的HA多肽可通过本领域已知的任何技术纯化，包括常规的离子交换色谱、疏水相互作用色谱、反相色谱和/或凝胶过滤。本发明的计算优化的HA多肽也可在自真核或原核细胞分泌后，自条件培养基回收。

流感病毒-样颗粒(VLP)

在一些实施方案中，本发明提供流感病毒-样颗粒(VLP)和其组合，其包含本文所述的一种或多种计算优化的H1N1流感HA多肽(或其免疫原性片段) (例如，表1中出现的HA多肽)。在一些实施方案中，流感VLP通常由HA、NA和病毒结构(例如，HIV gag)蛋白构成。流感VLP的产生是本领域已知的，和对技术人员而言在阅读本公开内容时是显而易见的。例如，流感VLP可通过用编码HA、NA和HIV gag蛋白的质粒转染宿主细胞产生。仅提供一个实例，合适的宿主细胞包括人细胞(例如，HEK293T)。在孵育转染的细胞合适的时间以允许蛋白表达(例如大约72小时)后，VLP可自细胞培养上清液分离。在一些实施方案中，本文公开的流感VLP可用作流感疫苗以引发针对H1N1流感病毒的广泛中和免疫反应。

完整流感病毒

还提供了包含本文所述的一种或多种计算优化的重组HA多肽(或其免疫原性片段或片段)的完整的重组流感病毒。重组流感病毒可通过基于质粒的反求遗传学(参见例如，Neumann, G. et la., Reverse Genetics of Influenza Viruses, Methods Mol Biol.,2012, 865:193-206；通过引用结合到本文中)和基于卵的技术产生；例如，包含本文所述的计算优化的H1 HA多肽、来自H1N1流感毒株的野生型NA多肽和来自供体病毒(例如，流感A/Puerto Rico/8/34 (PR8))的内部蛋白基因的骨架(在卵中提供高收率)的重组病毒。例如，编码高生长的流感A/Puerto Rico/8/34 (PR8)供体病毒的内部蛋白的6种质粒可与编码本文所述的计算优化的H1N1 HA多肽和野生型神经氨酸酶(NA)糖蛋白的两种质粒共转染至合格的哺乳动物细胞(例如，Vero细胞)，接着分离重组病毒。包含来自PR8病毒的内部蛋白基因的重组病毒可用于制备活的减毒和/或灭活的流感病毒疫苗(参见例如，Fodor, E. etal. Rescue of influenza A virus from Recombinant DNA. J. Virol., 1999, 73,9679-9682; 通过引用结合到本文中)。

有可能将本文所述的计算优化的H1N1 HA多肽掺入活的减毒流感病毒。活的减毒病毒可引发长持续和宽泛的免疫(体液和细胞)反应，其代表了天然存在的瞬时感染，特别是在免疫系统未完全发育的年轻受试者中。例如，活的减毒流感疫苗可使用来自传播病毒的NA基因和减毒、温度敏感性、冷适应的病毒骨架上的计算优化的H1N1 HA序列产生(例如，具有来自减毒供体病毒例如A/Ann Arbor/6/60的6个内部基因区段的6:2重配株，其赋予温度敏感性和冷适应的表型并且毒力是减弱的)。这种骨架防止在高于一定温度(例如，33℃)的温度下复制，从而将复制限于上呼吸道而非下呼吸道。制备和使用这样的活的减毒、温度敏感性(即冷适应的)流感病毒的方法是本领域众所周知的。参见例如，Molecular Basis of Live-Attenuated Influenza Virus, PloS One., 2013, 8(3):e60413; Sridhar etal., Influenza Vaccination Strategies: Comparing Inactivated and Live Attenuated Influenza Vaccines, 2015, Vaccines, 2015, 3(2):373-89。

不同的重组流感病毒，各自包含本文公开的不同的重组HA多肽，可单独产生，然后组合成组合/合剂。重组流感病毒组合/合剂可用作流感疫苗以针对H1N1流感病毒，包括人和猪H1N1流感病毒引发保护性免疫反应；例如，它们可作为活的减毒或裂解的灭活疫苗的组分给予。

因此，在一些实施方案中，本发明提供灭活的H1N1流感疫苗，其包含本文所述的计算优化的H1N1流感HA多肽(或其免疫原性片段)的组合或合剂(例如，表1中出现的HA多肽的合剂)，其中疫苗包含三种类型的抗原制备物之一：灭活的完整病毒；子-病毒体，其中纯化的病毒颗粒被去垢剂或其它试剂破坏以稳定脂质被膜(“裂解”疫苗)；或纯化的HA多肽(“亚单位”疫苗)。在一些实施方案中，病毒可通过用甲醛、β-丙内酯、醚、含去垢剂(例如TWEEN-80^®)的醚、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)和Triton N101、脱氧胆酸钠和三(正丁基)磷酸酯处理被灭活。灭活可在尿囊液(来自卵中产生的病毒)的澄清之后或之前发生；病毒体通过离心分离和纯化(Nicholson et al., eds., 1998, Textbook of Influenza, BlackwellScience, Malden, MA; 通过引用结合到本文中)。为了评价疫苗的效力，可使用单辐射免疫扩散(SRD)试验(Schild et al., 1975, Bull. World Health Organ., 52:43-50 &223-31; Mostow et al., 1975, J. Clin. Microbiol., 2:531; 这两者通过引用结合到本文中)。

在一些实施方案中，用于疫苗的流感病毒在卵(例如含胚鸡卵)中生长，在该情况下收获的材料是尿囊液。备选地或另外，流感病毒或优化的血凝素多肽可自使用组织培养以生长病毒的任何方法产生。用于生长病毒或以其它方式重组产生优化的血凝素多肽的合适的细胞基质包括例如，犬肾细胞例如MDCK或来自MDCK的克隆的细胞，MDCK-样细胞，猴肾细胞例如AGMK细胞，包括Vero细胞，作为连续细胞系培养的上皮细胞，293T细胞，BK-21细胞，CV-1细胞或适合于产生流感病毒的任何其它哺乳动物细胞类型(包括上气道上皮细胞)用于疫苗目的，其可容易获自市售来源(例如，ATCC, Rockville, Md.)。合适的细胞基质还包括人细胞例如MRC-5细胞。合适的细胞基质不限于细胞系；例如还包括原代细胞，例如鸡胚成纤维细胞。

免疫原性组合物

本文还提供了免疫原性组合物(例如，疫苗)，其包含本文所述的计算优化的H1N1流感HA多肽(或其免疫原性片段)的组合或合剂(例如，表1中出现的HA多肽的合剂)，或包含优化的流感HA蛋白的融合蛋白或VLP或裂解或灭活的病毒。在一些实施方案中，组合物进一步包含药学上可接受的载体。

在一些实施方案中，根据本发明的疫苗进一步包含一种或多种佐剂。例如，明矾、铝盐(Baylor et al., 2002, Vaccine, 20:S18; 通过引用结合到本文中)和单磷酰基脂质A (MPL; Ribi et al., 1986, Immunology and Immunopharmacology of Bacteria Endotoxins, Plenum Publ. Corp., NY, p.407; 通过引用结合到本文中)可用作人疫苗的佐剂。备选地或另外，新化合物目前正在测试作为人疫苗的佐剂，例如：MF59 (参见例如，Ott et al., “MF59—Design and Evaluation of a Safe and Potent Adjuvant for Human Vaccines” in Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (Powell,M. F. and Newman, M. J. eds.) Plenum Press, New York, 1995, pp. 277-296; 通过引用结合到本文中)；CpG寡脱氧核苷酸(ODN)佐剂，例如CPG 7909 (Cooper et al., 2004,Vaccine, 22:3136; 通过引用结合到本文中)；单磷酰基脂质A (MPL)佐剂和包括AS04的脂质A模拟物(Didierlaurent, A.M. et al, J. Immunol., 2009, 183: 6186-6197; 通过引用结合到本文中)，单磷酰基脂质A (MPL, GSK)和吡喃葡糖基脂质A GLA (ImmuneDesign Corporation, IDC)；AF03 (Klucker, M.F. et al, J. Pharm Sci., 2012, 101:4490-4500; 通过引用结合到本文中)；TLR-3配体聚肌苷酸：聚胞苷酸[poly(I:C)]；TLR9佐剂，例如IC31 (Riedl, K. et al., Vaccine, 2008, 26: 3461-3468; 通过引用结合到本文中)；咪唑并喹啉(双环有机分子，用作TLR-7/8激动剂)，例如咪喹莫特(R837)或瑞喹莫德(R848)；皂苷类，例如QS21 (Ghochikyan et al., 2006, Vaccine, 24:2275; 通过引用结合到本文中)，ISCOMATRIX佐剂(Duewell, P., et al., J. Immunol, 2011, 187: 55-63;通过引用结合到本文中)和Matrix-M™ (Novavax)。

另外，本领域已知一些佐剂增强流感疫苗的免疫原性，例如聚[二(羧基合苯氧基)磷腈] (PCCP; Payne et al., 1998, Vaccine, 16:92; 通过引用结合到本文中)、干扰素-γ (Cao et al., 1992, Vaccine, 10:238; 通过引用结合到本文中)、嵌段共聚物P1205 (CRL1005; Katz et al., 2000, Vaccine,. 18:2177; 通过引用结合到本文中)、干扰素-2 (IL-2; Mbwuike et al., 1990, Vaccine, 8:347; 通过引用结合到本文中)和聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA; Kreuter et al., 1981, J. Pharm. Sci., 70:367; 通过引用结合到本文中)。

一般而言，免疫原性组合物包括一种或多种惰性剂，例如无菌的生物相容性载体，包括但不限于无菌水、盐水、缓冲盐水或葡萄糖溶液。备选地或另外，组合物可包含各种添加剂的任一种，例如稳定剂、缓冲剂、赋形剂(例如，糖、氨基酸等)或防腐剂。具体的实施方案中使用的药学上可接受的载体包括但不限于，盐水、缓冲盐水、葡萄糖、水、甘油、乙醇和其组合。在一些实施方案中，载体和组合物是无菌的，和制剂适合于给药方式。在一些实施方案中，免疫原性组合物包含较少量的湿润剂或乳化剂，或pH缓冲剂。在一些实施方案中，药物组合物是液体溶液、混悬液、乳液、片剂、丸剂、胶囊、缓释制剂或粉剂。口服制剂可包括标准载体，例如药用级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素和碳酸镁。可使用任何常见的药用载体，例如无菌盐水溶液或芝麻油。介质还可包含常规的药物辅助材料，例如调整渗透压的药学上可接受的盐、缓冲剂、防腐剂等。可用于本文提供的组合物和方法的其它介质是生理盐水和芝麻油。

在一些实施方案中，免疫原性组合物经配制用于皮内注射、鼻内给予或肌内注射。在一些实施方案中，注射物作为液体溶液或混悬液、适合于在注射前的液体中的溶液或混悬液的固体形式或作为乳液，以常规形式制备。在一些实施方案中，注射溶液和混悬液自无菌粉末、颗粒制备。通过这些途径给药的药剂的配制和制备的一般考虑可见于例如，Remington’s Pharmaceutical Sciences, 19^th ed., Mack Publishing Co., Easton,PA, 1995; 通过引用结合到本文中。目前，口服或经鼻喷雾或气溶胶途径(例如，通过吸入)最常用于递送治疗剂直接至肺和呼吸系统。在一些实施方案中，根据本发明的组合物使用递送计量剂量的组合物(例如，优化的HA多肽)的装置给予。用于递送本文所述的皮内药物组合物的合适的装置包括短的针头装置，例如，描述于美国专利号4,886,499, 美国专利号5,190,521, 美国专利号5,328,483, 美国专利号5,527,288, 美国专利号4,270,537, 美国专利号5,015,235, 美国专利号5,141,496, 美国专利号5,417,662 (全都通过引用结合到本文中)中的那些。皮内组合物还可通过限制针头有效侵入皮肤的长度的装置给予，例如描述于WO1999/34850中的那些，通过引用结合到本文中，和其功能等价物。还合适的是喷射注射装置，其通过液体喷射注射器或通过穿刺角质层并产生达到真皮的射流的针头，递送液体疫苗至真皮。喷射注射装置描述于例如，美国专利号5,480,381, 美国专利号5,599,302, 美国专利号5,334,144, 美国专利号5,993,412, 美国专利号5,649,912, 美国专利号5,569,189, 美国专利号5,704,911, 美国专利号5,383,851, 美国专利号5,893,397,美国专利号5,466,220, 美国专利号5,339,163, 美国专利号5,312,335, 美国专利号5,503,627, 美国专利号5,064,413, 美国专利号5,520,639, 美国专利号4,596,556, 美国专利号4,790,824, 美国专利号4,941,880, 美国专利号4,940,460, WO1997/37705和WO1997/13537 (全都通过引用结合到本文中)。还合适的是弹射粉末/颗粒递送装置，其使用压缩气体以加速粉末形式的疫苗通过皮肤外层至真皮。另外，常规的注射器可用于皮内给予的经典曼托试验方法。

用于胃肠外给予的制剂包括无菌水性或非水性溶液、混悬液和乳液。非水性溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油例如橄榄油和可注射有机酯例如油酸乙酯。水性载体包括水、醇性/水性溶液、乳液或混悬液，包括盐水和缓冲介质。胃肠外媒介包括氯化钠溶液、林格葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳酸盐林格溶液或固定油。静脉内媒介包括液体和营养素补充剂、电解质补充剂(例如根据林格葡萄糖的那些)等。防腐剂和其它添加剂也可存在，例如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。

一些组合物有可能作为药学上可接受的酸或碱加成盐给予，其通过与无机酸例如盐酸、氢溴酸、高氯酸、硝酸、硫氰酸、硫酸和磷酸，和有机酸例如甲酸、乙酸、丙酸、乙醇酸、乳酸、丙酮酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸和富马酸反应形成，或通过与无机碱例如氢氧化钠、氢氧化铵、氢氧化钾和有机碱例如单-、二-、三烷基和芳基胺和取代的乙醇胺反应形成。

共同给予优化的H1N1流感HA多肽以引发免疫反应

进一步提供了本文所述的共同给予(例如，免疫原性合剂组合物或引发-加强方案)在预防性或治疗性治疗H1N1流感感染中的用途和方法；例如，通过共同给予本文所公开的优化的H1N1流感HA多肽、包含优化的H1N1流感HA多肽的VLP、融合蛋白、灭活的流感病毒(例如，裂解灭活的)或活的减毒流感病毒(例如，温度敏感性病毒) (例如，表1中出现的HA多肽的合剂)，在受试者中产生或引发对流感病毒的免疫反应的方法。在某些实施方案中，优化的H1N1流感HA多肽作为组合或合剂(即，同时)被共同给予至受试者。在其它实施方案中，优化的H1N1流感HA多肽序贯地作为单个多肽或作为合剂被共同给予。例如，在受试者中引发免疫反应的某些方法包括给予受试者包含本文所述的第一优化的H1N1流感HA多肽的第一引发疫苗，接着给予包含本文所述的第二优化的H1N1流感HA多肽的第二加强疫苗，其中第二优化的H1N1流感HA多肽不同于第一优化的H1N1流感HA多肽。在一些实施方案中，第一引发疫苗包括包含第一优化的H1N1流感HA多肽的活的减毒病毒(例如，温度敏感性病毒)，和第二加强疫苗包含第二优化的H1N1流感HA多肽，例如包含第二优化的H1N1流感HA多肽的VLP。

在一些实施方案中，HA蛋白、HA融合蛋白、VLP或病毒可使用任何合适的给予途径，例如肌内、鼻内或口服给予。在一些实施方案中，HA蛋白、融合蛋白、VLP或病毒作为进一步包含药学上可接受的载体和/或佐剂的组合物给予。

本文所述的组合物的用途和方法可包括选择需要治疗的受试者(例如，人受试者)。包含优化的流感HA多肽的组合物可在发生H1N1流感感染的一个或多个症状之前或之后给予。给予可以是系统的或局部的。即，在一些实施方案中，本文所述的组合物可预防性给予以防止H1N1流感感染或改善潜在的H1N1流感感染的症状。在一些实施方案中，如果受试者将接触已知或怀疑已感染了大流行流感病毒的其它个体或家畜(例如猪)和/或如果受试者将位于其中H1N1流感感染是已知的或认为是流行或地方流行的场所的话，则受试者处于H1N1流感病毒感染的风险中。在一些实施方案中，将组合物给予认为患有H1N1流感感染的受试者，或受试者显示通常与流感感染有关的一个或多个症状。在一些实施方案中，受试者已知或认为已暴露于H1N1流感病毒。在一些实施方案中，如果受试者已知或认为已暴露于流感病毒的话，则认为受试者处于H1N1流感感染的风险中或对H1N1流感感染易感。在一些实施方案中，如果受试者已接触已知或怀疑已感染了大流行流感病毒的其它个体或家畜(例如，猪)和/或如果受试者位于或已位于其中H1N1流感感染是已知的或被认为是流行或地方流行的场所的话，则受试者已知或认为已暴露于H1N1流感病毒。

根据本发明的免疫原性组合物可以适合实现所需结果的任何剂量给予。在一些实施方案中，所需结果是针对广谱的H1N1流感毒株，包括季节性和大流行毒株二者，诱导持续的适应性免疫反应。在一些实施方案中，所需结果是降低强度、严重性和/或频率，和/或延迟流感感染的一个或多个症状的发生。需要的剂量可在受试者之间改变，这取决于受试者的物种、年龄、体重和一般状况，治疗的感染的严重性、使用的具体组合物和其给药方式。

在引发免疫反应或免疫受试者的方法的一些实施方案中，向受试者给予包含约15-约45 μg的两种或三种本文所述的优化的H1N1流感HA多肽(例如，各自15-45 μg的表1中出现的HA多肽)的组合物。在具体的实例中，向受试者给予包含在给定的合剂中各自约15 μg, 约20 μg, 约25 μg, 约30 μg, 约35 μg, 约40 μg或约45 μg的优化的H1N1流感HA多肽的组合物。例如，如果疫苗包含由表1中的两种HA多肽组成的H1N1流感A HA抗原合剂，受试者可接受总量30-90 µg (各自15-45 µg的两种)的流感A HA。在一个具体的非限制性实例中，向受试者给予各自约15 μg的优化的H1N1流感HA多肽。在具体的实例中，向受试者给予包含约45-约90 μg的总血凝素抗原组分的组合物。可通过例如单辐射免疫扩散(SRD)测量剂量(J. M. Wood, et al.: An improved single radial immunodiffusion technique for the assay of influenza haemagglutinin antigen: adaptation for potency determination of inactivated whole virus and subunit vaccines, J. Biol. Stand., 1977, 5:237-247; J. M. Wood, et al., International collaborative study of single radial diffusion and immunoelectrophoresis techniques for the assay of haemagglutinin antigen of influenza virus, J. Biol. Stand., 1981, 9:317-330)。

在一些实施方案中，本发明提供给予人受试者的本文所述的免疫原性组合物(例如，疫苗)。在具体的实施方案中，人受试者是6月龄或更大，6月龄至35月龄，36月龄至8岁，或9岁或更大。

在一些实施方案中，根据本发明的免疫原性组合物以单剂量或多个剂量给予。在一些实施方案中，根据本发明的药物组合物以在不同天给予的多个剂量给予(例如，引发-加强接种疫苗策略)。在一些实施方案中，根据本发明的药物组合物根据连续给药方案给予，使得受试者在治疗给药阶段之间不经历间插的没有治疗给药的阶段。在一些实施方案中，根据本发明的药物组合物根据间断给药方案给予，使得受试者在治疗给药的两个阶段之间经历间插的至少一个没有治疗给药的阶段。

本文所述的免疫原性组合物的方法和用途包括引发-加强接种疫苗策略。引发-加强接种疫苗包括给予引发疫苗，然后在一段时间后给予受试者加强疫苗。在给予引发疫苗时免疫反应被"引发"，和在给予加强疫苗时被"加强"。引发疫苗可包括本文所述的任何免疫原性HA多肽和/或其组合物或合剂。同样，加强疫苗可包括本文所述的任何免疫原性HA多肽和/或其组合物或合剂。

例如，引发疫苗可包含重组H1N1流感血凝素(HA)多肽的组合，其中所述组合包含第一重组、优化的H1N1流感HA多肽，其包含与SEQ ID NO: 1具有至少98%, 98.5%, 99%或99.5%同一性的氨基酸序列；和第二重组、优化的H1N1流感HA多肽，其包含选自以下的氨基酸序列：1) 与SEQ ID NO: 2具有至少99%或99.5%同一性的氨基酸序列，2) 与SEQ ID NO:3具有至少99%或99.5%同一性的氨基酸序列，和3) 与SEQ ID NO: 4具有至少96%, 96.5%,97%, 97.5%, 98%, 98.5%, 99%或99.5%同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，引发疫苗包含(或由以下组成)第一重组、优化的H1N1流感HA多肽，其包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列；和第二重组、优化的H1N1流感HA多肽，其包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO: 2,SEQ ID NO: 3和SEQ ID NO: 4的氨基酸序列。在一些实施方案中，加强疫苗包含与引发疫苗相同的优化的H1N1流感HA多肽，或由其组成。在一些实施方案中，引发疫苗包含佐剂。在一些实施方案中，加强疫苗包含佐剂。

在一些实施方案中，引发疫苗包含重组H1N1流感HA多肽的组合，其中所述组合包含第一重组、优化的H1N1流感HA多肽，其包含与SEQ ID NO: 1的残基2-566具有至少98%,98.5%, 99%或99.5%同一性的氨基酸序列；和第二重组、优化的H1N1流感HA多肽，其包含选自以下的氨基酸序列：1) 与SEQ ID NO: 2的残基2-565具有至少99%或至少99.5%同一性的氨基酸序列；2) 与SEQ ID NO: 3的残基2-566具有至少99%或至少99.5%同一性的氨基酸序列；和3) 与SEQ ID NO: 4的残基2-566具有至少96%, 96.5%, 97%, 97.5%, 98%, 98.5%,99%或99.5%同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，引发疫苗包含(或由以下组成)第一重组、优化的H1N1流感HA多肽，其包含SEQ ID NO: 1的残基2-566；和第二重组、优化的H1N1流感HA多肽，其包含选自以下的氨基酸序列：1) SEQ ID NO: 2的残基2-565; 2) SEQ IDNO: 3的残基2-566;和3) SEQ ID NO: 4的残基2-566。加强疫苗可以与引发疫苗相同，或可以包含本文所述的H1N1流感HA多肽的不同合剂。例如，在一些实施方案中，加强疫苗包含与引发疫苗相同的优化的H1N1流感HA多肽组合，或由其组成。本发明的实施方案的各种引发-加强合剂组合在下表中概述：

在一些实施方案中，引发疫苗合剂包含佐剂。在一些实施方案中，加强疫苗合剂包含佐剂。

或者，引发疫苗和加强疫苗可各自包括不同的本文所述的优化的H1N1流感HA多肽。在某些实施方案中，引发疫苗可包括本文所述的大流行H1N1优化的流感HA蛋白和加强疫苗可包括本文所述的季节性H1N1优化的流感HA蛋白。例如，引发疫苗可包含重组、优化的H1N1流感HA多肽，其包含与SEQ ID NO: 1具有至少98%, 98.5%, 99%或99.5%同一性的氨基酸序列。加强疫苗可包含重组、优化的H1N1流感HA多肽，其包含选自以下的氨基酸序列：1)与SEQ ID NO: 2具有至少99%或99.5%同一性的氨基酸序列，2) 与SEQ ID NO: 3具有至少99%或99.5%同一性的氨基酸序列，和3) 与SEQ ID NO: 4具有至少96%, 96.5%, 97%,97.5%, 98%, 98.5%, 99%或99.5%同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，引发疫苗包含第一重组、优化的H1N1流感HA多肽或由其组成，所述多肽包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列，和加强疫苗包含第二重组、优化的H1N1流感HA多肽或由其组成，所述多肽包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3和SEQ ID NO: 4的氨基酸序列。

在其它实施方案中，引发疫苗可包含重组、优化的H1N1流感HA多肽，其包含与SEQID NO: 1的残基2-566具有至少98%, 98.5%, 99%或99.5%同一性的氨基酸序列。加强疫苗可包含重组、优化的H1N1流感HA多肽，其包含选自以下的氨基酸序列：1) 与SEQ ID NO: 2的残基2-565具有至少99%或99.5%同一性的氨基酸序列，2) 与SEQ ID NO: 3的残基2-566具有至少99%或99.5%同一性的氨基酸序列，和3) 与SEQ ID NO: 4的残基2-566具有至少96%, 96.5%, 97%, 97.5%, 98%, 98.5%, 99%或99.5%同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，引发疫苗包含第一重组、优化的H1N1流感HA多肽或由其组成，所述多肽包含SEQ IDNO: 1的残基2-566，和加强疫苗包含第二重组、优化的H1N1流感HA多肽或由其组成，所述多肽包含选自以下的氨基酸序列：1) SEQ ID NO: 2的残基2-565, 2) SEQ ID NO: 3的残基2-566,和3) SEQ ID NO: 4的残基2-566。

在一些实施方案中，在受试者中引发免疫反应或免疫的方法包括：

给予包含第一重组、优化的H1N1流感HA多肽的引发疫苗，其包含与SEQ ID NO: 1具有至少98%, 98.5%, 99%或99.5%同一性的氨基酸序列；和

给予包含第二重组、优化的H1N1流感HA多肽的加强疫苗，其包含与SEQ ID NO: 2具有至少99%或99.5%同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，第一重组、优化的H1N1流感HA多肽包含与SEQ ID NO: 1的残基2-566具有至少98%, 98.5%, 99%或99.5%同一性的氨基酸序列，和第二重组、优化的H1N1流感HA多肽包含与SEQ ID NO: 2的残基2-565具有至少99%或99.5%同一性的氨基酸序列。在其它实施方案中，第一重组、优化的H1N1流感HA多肽包含SEQID NO: 1或SEQ ID NO: 1的残基2-566的氨基酸序列，和第二重组、优化的H1N1流感HA多肽包含SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 2的残基2-565的氨基酸序列。

在一些实施方案中，在受试者中引发免疫反应或免疫的方法包括：

给予包含第一重组、优化的H1N1流感HA多肽的引发疫苗，其包含与SEQ ID NO: 1具有至少98%, 98.5%, 99%或99.5%同一性的氨基酸序列；和

给予包含第二重组、优化的H1N1流感HA多肽的加强疫苗，其包含与SEQ ID NO: 3具有至少99%或99.5%同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，第一重组、优化的H1N1流感HA多肽包含与SEQ ID NO: 1的残基2-566具有至少98%, 98.5%, 99%或99.5%同一性的氨基酸序列，和第二重组、优化的H1N1流感HA多肽包含与SEQ ID NO: 3的残基2-566具有至少99%或99.5%同一性的氨基酸序列。在其它实施方案中，第一重组、优化的H1N1流感HA多肽包含SEQID NO: 1或SEQ ID NO: 1的残基2-566的氨基酸序列，和第二重组、优化的H1N1流感HA多肽包含SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 3的残基2-566的氨基酸序列。

在一些实施方案中，在受试者中引发免疫反应或免疫的方法包括：

给予包含第一重组、优化的H1N1流感HA多肽的引发疫苗，其包含与SEQ ID NO: 1具有至少98%, 98.5%, 99%或99.5%同一性的氨基酸序列；和

给予包含第二重组、优化的H1N1流感HA多肽的加强疫苗，其包含与SEQ ID NO: 4具有至少至少96%, 96.5%, 97%, 97.5%, 98%, 98.5%, 99%或99.5%同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，第一重组、优化的H1N1流感HA多肽包含与SEQ ID NO: 1的残基2-566具有至少98%, 98.5%, 99%或99.5%同一性的氨基酸序列，和第二重组、优化的H1N1流感HA多肽包含与SEQ ID NO: 4的残基2-566具有至少99%或99.5%同一性的氨基酸序列。在其它实施方案中，第一重组、优化的H1N1流感HA多肽包含SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 1的残基2-566的氨基酸序列，和第二重组、优化的H1N1流感HA多肽包含SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 4的残基2-566的氨基酸序列。

在其它实施方案中，上文所述的给予引发疫苗和加强疫苗的次序可反转。因此，在某些实施方案中，引发疫苗可包含重组、优化的H1N1流感HA多肽，其包含选自以下的氨基酸序列：1) 与SEQ ID NO: 2具有至少99%或99.5%同一性的氨基酸序列，2) 与SEQ ID NO: 3具有至少99%或99.5%同一性的氨基酸序列，和3) 与SEQ ID NO: 4具有至少96%, 96.5%,97%, 97.5%, 98%, 98.5%, 99%或99.5%同一性的氨基酸序列；和加强疫苗可包含重组、优化的H1N1流感HA多肽，其包含与SEQ ID NO: 1具有至少98%, 98.5%, 99%或99.5%同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，引发疫苗包含第一重组、优化的H1N1流感HA多肽或由其组成，所述多肽包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3和SEQ ID NO: 4的氨基酸序列；和加强疫苗包含第二重组、优化的H1N1流感HA多肽或由其组成，所述多肽包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列。

在其它实施方案中，引发疫苗可包含重组、优化的H1N1流感HA多肽，其选自：1) 与SEQ ID NO: 2的残基2-565具有至少99%或99.5%同一性的氨基酸序列，2) 与SEQ ID NO: 3的残基2-566具有至少99%或99.5%同一性的氨基酸序列，和3) 与SEQ ID NO: 4的残基2-566具有至少96%, 96.5%, 97%, 97.5%, 98%, 98.5%, 99%或99.5%同一性的氨基酸序列。加强疫苗可包含重组、优化的H1N1流感HA多肽，其包含与SEQ ID NO: 1的残基2-566具有至少98%, 98.5%, 99%或99.5%同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，引发疫苗包含第一重组、优化的H1N1流感HA多肽或由其组成，所述多肽包含选自以下的氨基酸序列：1) SEQID NO: 2的残基2-565, 2) SEQ ID NO: 3的残基2-566,和3) SEQ ID NO: 4的残基2-566；和加强疫苗包含第二重组、优化的H1N1流感HA多肽或由其组成，所述多肽包含SEQ ID NO:1的残基2-566。

在一些实施方案中，在受试者中引发免疫反应或免疫的方法包括：

给予引发疫苗，其包含第一重组、优化的H1N1流感HA多肽，其包含与SEQ ID NO: 2具有至少99%或99.5%同一性的氨基酸序列；和

给予加强疫苗，其包含第二重组、优化的H1N1流感HA多肽，其包含与SEQ ID NO: 1具有至少98%, 98.5%, 99%或99.5%同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，第一重组、优化的H1N1流感HA多肽包含与SEQ ID NO: 2的残基2-565具有至少99%或99.5%同一性的氨基酸序列和第二重组、优化的H1N1流感HA多肽包含与SEQ ID NO: 1的残基2-566具有至少98%,98.5%, 99%或99.5%同一性的氨基酸序列。在其它实施方案中，第一重组、优化的H1N1流感HA多肽包含SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 2的残基2-565的氨基酸序列和第二重组、优化的H1N1流感HA多肽包含SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 1的残基2-566的氨基酸序列。

在一些实施方案中，在受试者中引发免疫反应或免疫的方法包括：

给予引发疫苗，其包含第一重组、优化的H1N1流感HA多肽，其包含与SEQ ID NO: 3具有至少99%或99.5%同一性的氨基酸序列；和

给予加强疫苗，其包含第二重组、优化的H1N1流感HA多肽，其包含与SEQ ID NO: 1具有至少98%, 98.5%, 99%或99.5%同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，第一重组、优化的H1N1流感HA多肽包含与SEQ ID NO: 3的残基2-566具有至少99%或99.5%同一性的氨基酸序列和第二重组、优化的H1N1流感HA多肽包含与SEQ ID NO: 1的残基2-566具有至少98%,98.5%, 99%或99.5%同一性的氨基酸序列。在其它实施方案中，第一重组、优化的H1N1流感HA多肽包含SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 3的残基2-566的氨基酸序列和第二重组、优化的H1N1流感HA多肽包含SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 1的残基2-566的氨基酸序列。

在一些实施方案中，在受试者中引发免疫反应或免疫的方法包括：

给予引发疫苗，其包含第一重组、优化的H1N1流感HA多肽，其包含与SEQ ID NO: 3具有至少99%或99.5%同一性的氨基酸序列；和

给予加强疫苗，其包含第二重组、优化的H1N1流感HA多肽，其包含与SEQ ID NO: 2具有至少99%或99.5%同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，第一重组、优化的H1N1流感HA多肽包含与SEQ ID NO: 3的残基2-566具有至少99%或99.5%同一性的氨基酸序列和第二重组、优化的H1N1流感HA多肽包含与SEQ ID NO: 2的残基2-565具有至少99%或99.5%同一性的氨基酸序列。在其它实施方案中，第一重组、优化的H1N1流感HA多肽包含SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 3的残基2-566的氨基酸序列和第二重组、优化的H1N1流感HA多肽包含SEQ IDNO: 2或SEQ ID NO: 2的残基2-565的氨基酸序列。

在引发疫苗后给予受试者加强疫苗。给予引发疫苗和加强疫苗可分隔任何合适的时间框。例如，可在给予引发疫苗后1周、2周、3周、4周、5周或6周，或由任何两个上述值定义的范围，给予加强疫苗。给予受试者的引发疫苗和加强疫苗的剂量依赖于许多因素，包括任何副作用的程度，具体的给药途径等。在某些实施方案中，引发疫苗的剂量包含约15-45 μg(例如，约15, 20, 25, 30, 35, 40或45 μg)的重组H1N1流感HA多肽。在某些实施方案中，加强疫苗的剂量包含约15-45 μg (例如，约15, 20, 25, 30, 35, 40或45 μg)的重组H1N1流感HA多肽。在一些实施方案中，加强疫苗的剂量与引发疫苗的剂量相同。

本发明的免疫原性组合物可单独或与一种或多种其它治疗剂组合给予，所述治疗剂包括但不限于其它疫苗和/或抗体。“与……组合”不意图暗示所述试剂一定同时给予或经配制一起递送，尽管这些递送方法在本发明的范围内。一般而言，每种试剂以对该试剂确定的剂量和时间表给予。在一些实施方案中，根据本发明的药物组合物和/或本文所述的优化的HA多肽与一种或多种抗病毒剂(例如，Oseltamivir [TAMIFLU^®], Zanamavir [RELEZA^®]等)和/或唾液酸酶组合给予。

在一些实施方案中，共同给予(例如，免疫原性合剂组合物或引发-加强方案)针对至少6, 至少7, 至少8,至少9, 至少10, 至少11, 至少12, 至少13, 至少14, 至少15, 至少16, 至少17, 至少18, 至少19, 至少20, 至少21, 至少22, 至少23, 至少24或至少25个不同的H1N1流感毒株引发保护性免疫反应。在具体的实施方案中，“引发保护性免疫反应”可以通过例如使用众所周知的血细胞凝集抑制测定法(HAI)，作为流感疫苗功效的代替度量确定。HAI测定法可使用鸡、火鸡或马的红细胞来检测对H1N1特异性的抗体。在具体的实施方案中，保护性免疫反应通过引发大于1:40的平均HAI效价得到证实，其与流感疾病的预防和减轻相关。在一些实施方案中，当给予受试者以预防或治疗流感感染时，本文所述的免疫原性组合物引发至少1:30, 1:40, 1:50, 1:60或1:30-1:60或1:40-1:60范围内的HAI抗体效价。在用灭活的人流感病毒疫苗免疫后，大约1:32-1:40的HAI抗体效价通常保护约50%的受试者免于感染。当转化为log 2数据时，略微小于5.5的值对应于1:40的HAI抗体效价。然而，已表明低至1:8的血清HAI抗体效价提供对人流感病毒的感染的抗性，这表明保护所需的抗体的水平可相当低(Treanor, J. & Wright, P. F. Immune correlates of protection against influenza in the human challenge model. Dev. Biol. (Basel), 2003, 115:97–104; 通过引用结合到本文中)。

在一些实施方案中，保护性免疫反应的引发可通过血清转化率鉴定。在具体的实施方案中，血清转化的保护水平定义为HAI效价的至少4倍升高，例如给药或接种疫苗前的HAI效价为小于1:10，接种疫苗后的效价为大于或等于1:40。换句话说，成功的血清转化率可定义为接种疫苗前HAI效价小于约1:10和接种疫苗后HAI效价大于约1:40或接种疫苗前HAI效价大于约1:10和接种疫苗后HAI抗体效价最小4倍升高的受试者的百分比。在具体的实施方案中，当给予受试者以预防或治疗流感感染时，本文所述的免疫原性组合物引发HAI效价至少3倍、4倍、至少5倍、至少6倍等升高的血清转化率。在具体的实施方案中，当给予受试者以预防或治疗流感感染时，免疫原性组合物提高血清转化(通过HAI测量)至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%。在一些实施方案中，共同给予(例如，免疫原性合剂组合物或引发-加强方案)产生跨越至少5, 至少6, 至少7, 至少8, 至少9, 至少10或至少11 (例如，11)个不同的H1N1流感毒株的保护性免疫反应。

动物测试

本发明提供在动物宿主中测试根据本发明的优化的HA多肽的方法。如本文所用的，“动物宿主”包括适合于流感研究的任何动物模型。例如，适合于本发明的动物宿主可以是任何哺乳动物宿主，包括灵长类动物、雪貂、猫、狗、牛、马、啮齿动物例如小鼠、仓鼠、豚鼠、兔和大鼠。在一些实施方案中，用于本发明的动物宿主是雪貂。具体而言，在一些实施方案中，动物宿主在给予根据本发明的结合剂(任选在根据本发明的组合物中)之前，对于病毒暴露或感染是幼稚的。在一些实施方案中，在本文所述的优化的H1N1 HA多肽的共同给予(例如，免疫原性合剂组合物或引发-加强方案)之前或与其同时，动物宿主用流感病毒接种，用流感病毒感染，或以其它方式暴露于流感病毒。用于本发明的实践的动物宿主可通过本领域已知的任何方法，用病毒接种，用病毒感染或以其它方式暴露于病毒。在一些实施方案中，动物宿主可经鼻内用病毒接种，用病毒感染或暴露于病毒。

幼稚和/或接种的动物可用于各种研究的任一种。例如，这样的动物模型可用于病毒传递研究，如本领域已知的。预期在病毒传递研究中使用雪貂可用作在人中病毒传递的可靠预测器。例如，病毒流感自接种的动物(例如，雪貂)至幼稚动物的空气传递是本领域已知的(Tumpey et al., 2007, Science 315; 655-59; 通过引用结合到本文中)。病毒传递研究可用于测试根据本发明的计算优化的HA多肽。例如，本文所述的计算优化的HA多肽的合剂或不同的个体COBRA的引发-加强方案可给予合适的动物宿主以测定所述合剂或引发-加强方案在动物宿主中引发广泛免疫反应中的功效。使用自动物宿主的研究收集的信息，可预测所述合剂或引发-加强方案在人宿主中引发广泛保护的功效。

参照以下实施例将更加全面地理解本发明。所有文献引文通过引用结合到本文中。

实施例

实施例1 – 材料和方法

H1N1 COBRA Ha的设计和系统发生分析。计算优化的广泛反应性抗原(COBRA)的设计和表征之前已经描述(参见例如，US2014/0147459, WO2013/148164和WO2012/036993; 通过引用结合到本文中)。按照年代以及根据分离各流感病毒的物种，HA序列根据H1N1的不同抗原年代进行设计。这些设计考虑了在约100年时间跨度中在人中分离的H1N1流感病毒的进化。分离的病毒代表了H1N1 HA序列的不同的抗原年代，其产生了较高的序列变异多样性。COBRA设计利用这些按年代不同的H1N1 HA序列年代以说明HA结构域的独特抗原类型。用于该方法的序列包括在1918-2012年、1978-2008年和1999-2012年自人分离的HA序列，以及来自1933-1998年分离的病毒的猪HA序列。

然后比对特定的初级共有序列，和选择最常见的氨基酸，产生次级共有序列。对于每轮共有序列产生，应用多次比对分析和使用AlignX (Vector NTI)产生共有序列。最终的氨基酸序列，称为计算优化的广泛反应性抗原(COBRA)，经反向翻译和优化以在哺乳动物细胞中表达，包括密码子使用和RNA优化(GeneArt; Regensburg, Germany)。最终的共有序列被称为表1中的4个H1N1 COBRA HA命名之一。X1 (SEQ ID NO: 4)包括代表了约近100年的H1N1历史的HA序列(表1)。X3 (SEQ ID NO: 3)不包含大流行H1N1 HA序列，但X6 (SEQ IDNO: 2)包含代表2009年后大流行H1N1年代的序列。P1 (SEQ ID NO: 1)代表了自人和猪物种二者分离的H1N1 HA序列的独特组。COBRA HA蛋白的系统发生分析表明各分子以不同的代表性野生型疫苗毒株簇集(数据未显示)。P1 COBRA HA以猪-样病毒位于树上(CA/09,NJ/76,和SC/1918)，和X1 COBRA以历史H1N1病毒簇集。X3和X6 H1N1 COBRA HA蛋白以近代季节性HA蛋白簇集。此外，使用各COBRA HA序列的BLAST检索揭示，各序列是尚未自环境分离的独特序列(数据未显示)。

体外表达。H1N1 COBRA HA构建体经合成和插入pTR600表达载体。人胚肾(HEK)293T细胞(1x10⁶)用3 μg表达每个COBRA或野生型HA基因盒的DNA瞬时转染。将细胞在37^oC下孵育72 h，然后用1% Triton-X 100裂解和在离心后收获澄清的上清液。然后将细胞裂解物在10% SDS-PAGE凝胶上电泳分离和转移至PVDF膜。用合并小鼠抗血清(其来自用表达源自H1N1的HA的病毒感染)探查印迹。HA-抗体复合物然后使用山羊抗-小鼠IgG HRP检测(Southern Biotech; Birmingham, AL, USA)。HRP活性使用化学发光底物检测(PierceBiotechnology; Rockford IL, USA)并曝光于X-射线胶片(ThermoFisher; Pittsburgh,PA, USA)。

功能表征。为了测定受体-结合特征，包含COBRA HA蛋白的病毒-样颗粒(VLP)按之前所述，自哺乳动物细胞系的上清液纯化。HEK 293T细胞用表达HIV Gag、COBRA HA和神经氨酸酶(NA, A/Thailand/1(KAN-1)/2004)的质粒瞬时转染和在37^oC下孵育72 h。收集上清液和通过在4^oC下超离心(100,000 X g，通过20%甘油，重量/体积) 4 h纯化VLP。随后将沉淀重悬于磷酸盐缓冲盐水PBS, pH 7.2和在-80^oC下贮存备用。蛋白浓度通过Micro BCA^TM蛋白测定试剂盒(Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA)测定。COBRA HA VLP以各种量制备，如通过全HA蛋白测量的，和每个单独的制备物在v底微量滴定板中经2倍连续稀释。将等体积的1%马红细胞(RBC) (Lampire; Pipersville, PA, USA)/PBS加入稀释的VLP和在室温下孵育60分钟。通过包含凝集的RBC的最后孔的稀释度的倒数确定HA效价。

疫苗制备。HEK 293T细胞用表达M1 (A/Puerto Rico/8/1934，经优化以在哺乳动物细胞中表达)、NA (A/Thailand/1(KAN-1)/2004，经优化以在哺乳动物细胞中表达)和COBRA HA或来自野生型H1N1毒株的HA的质粒瞬时转染，和在37^oC下孵育72h (MedigenInc, Rockville, MD, USA)。收集上清液，和通过低速离心接着通过0.22 μm无菌滤器真空过滤除去细胞碎片。VLP通过在4^oC下超离心(100,000 X g通过20%甘油，重量/体积) 4 h纯化。沉淀随后重悬于PBS pH 7.2和在-80^oC下以单次使用等分贮存备用。总蛋白浓度通过Micro BCA^TM蛋白测定试剂盒(Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA)测定。

HA比含量通过蛋白质印迹和光密度法测定。纯化的重组COBRA HA和纯化的VLP以标准的总蛋白量制备和在10% SDS-PAGE凝胶上电泳分离和转移至PVDF膜。用小鼠多克隆抗血清探查印迹，和HA-抗体复合物使用缀合至辣根过氧化物酶(HRP)的山羊抗-小鼠IgG检测(Southern Biotech; Birmingham, AL, USA)。HRP通过化学发光底物检测(PierceBiotechnology; Rockford IL, USA)和曝光于X-射线胶片(ThermoFisher; Pittsburgh,PA, USA)。条带的密度使用ImageJ软件(NIH)测定。重组HA条带的密度用于计算标准曲线，和纯化的VLP的密度使用来自重组HA的结果内插得到。单价灭活的流感裂解病毒疫苗(Sanofi-Pasteur, Swiftwater, PA, USA)代表A/New Caledonia/20/1999, A/Brisbane/59/2007或A/California/07/2009 H1N1病毒。一式三份进行实验，和对于所有重复分析多个曝光时间。

小鼠研究。BALB/c小鼠(Mus musculis, 雌性, 6–8周)购自JacksonLaboratories, (Bar Harbor, ME, USA)和在微隔离室中饲养并允许自由获得食物和水，和按照实验室动物的USDA指南护理。通过在第0周肌内注射和然后用不同的疫苗在第4和8周以相同剂量加强，小鼠(16只小鼠/组)用纯化的VLP (3.0 μg) (根据来自光密度测定法的HA含量)接种，或它们用单价灭活的裂解流感疫苗(IIV)接种。此外，向一些小鼠给予H1N1COBRA VLP疫苗的合剂(各自1.5 μg剂量的两种疫苗)。各剂量的疫苗与AFO3或Imject®明矾佐剂(Pierce Biotechnology; Rockford, IL, USA)按照制造商的方案一起配制，或磷酸盐缓冲盐水单独作为模拟接种疫苗。各接种疫苗后28天，自麻醉的小鼠经过眶后丛收集血液和转移至微量离心管。将管离心，和取出血清样品和在-20 ± 5℃下冷冻。

最后接种疫苗后4周，小鼠用5x10⁶噬斑形成单位(PFU)的A/California/07/2009(H1N1)以50 μl体积鼻内攻击。感染后，在感染后14天内，每日监测小鼠的重量减轻，疾病迹象和死亡。在感染后第2和3天，将5只小鼠按时间点处死以测定病毒肺效价。在接种后每一天对各组记录个体重量和死亡。实验终点定义为大于20%重量减轻。所有程序按照实验动物护理和使用的NRC指南、动物福利法令和微生物和生物医学实验室的CDC/NIH生物安全性进行。

ELISA测定。ELISA测定用于评价对HA的全抗体效价和IgG同种型效价。高结合、96-孔聚苯乙烯板(Costar; Lowell, MA, USA)用50ng/孔的重组HA包被过夜。包被抗原源自以下代表性的病毒分离株：A/California/07/2009 (H1N1)。用在含0.05% Tween 20的PBS中稀释的5%乳(封闭缓冲液)将板封闭。将血清样品在封闭缓冲液中稀释和加入板中。将血清2倍连续稀释和允许在室温下孵育1小时。将板洗涤，将HRP-缀合的多克隆山羊抗-鼠IgG在封闭缓冲液中稀释和加入板中。在室温下将板孵育1小时，洗涤和用TMB底物(Sigma-Aldrich;St. Louis, MO, USA)检测HRP活性。在暗处将板孵育15分钟，然后用2N H₂SO₄停止反应。波长450nm处的光密度(OD450)通过分光光度计读出(BioTek; Winooski, VT, USA)和确定终点稀释效价。确定终点效价为最后孔的稀释度的倒数，该孔具有大于幼稚动物血清的平均OD450加两个标准偏差的OD450。

血细胞凝集抑制(HAI)测定。HAI测定用于评价对HA的功能性抗体，其能够抑制马红细胞的凝集。方案自基于CDC实验室的流感监测手册改编。为了灭活非特异性抑制剂，试验之前，血清用受体破坏酶(RDE; Denka Seiken, Co., Japan)处理。简言之，将三份RDE加入至一份血清，和在37℃下孵育过夜。RDE通过在56℃下孵育约30 min灭活。RDE处理的血清在v-底微量滴定板中经2倍连续稀释。将等体积的各H1N1病毒，调节至大约8 HAU/50μl，加入各孔。将板覆盖，和在室温下孵育20 min，接着加入1%鸡红细胞(RBC) (LampireBiologicals, Pipersville, PA, USA)/PBS。将红细胞在4℃下贮存和在制备的72 h内使用。将板通过搅拌混合，覆盖和使RBC在室温下沉降1 h。HAI效价通过最后孔的稀释度的倒数确定，该孔包含未凝集的RBC。对每个板，包括阳性和阴性血清对照。接种疫苗之前，对于目前传播的人流感病毒的已存在的抗体，所有小鼠是阴性的(HAI小于或等于1:10)。

噬斑测定。将Madin-Darby犬肾(MDCK)细胞在6-孔板的各孔中接种(5 x 10⁵)。在100 μl补充有青霉素-链霉素的DMEM中将样品稀释(最终稀释度为10⁰-10^-6)和覆盖在细胞上和孵育1hr。除去样品，将细胞洗涤2次，和用2 ml的L15培养基加0.8%琼脂糖(Cambrex;East Rutherford, NJ, USA)替换培养基和在37℃下与5% CO₂孵育72 h。取出琼脂糖并丢弃。细胞用10%缓冲的福尔马林固定，然后用1%结晶紫染色15 min。在dH₂O中充分洗涤以除去过量的结晶紫后，使板干燥，将噬斑计数，和计算噬斑形成单位(PFU)/ml。

统计学分析。抗体数据的统计显著性使用双向变量分析(ANOVA)，用Bonferroni事后检验确定，以分析对于不同的试验抗原(多参数)，各疫苗组之间的差异。对于各疫苗组在多个时间点，重量减轻、疾病评分和病毒效价的差异通过双向ANOVA接着Bonferroni事后检验进行分析。显著性定义为p < 0.05。使用GraphPad Prism®软件进行统计学分析。

实施例2 -单克隆抗体与流感HA头和茎结构域的结合

各三聚化的COBRA或野生型HA蛋白自293T细胞纯化和用于测试4种之前表征的单克隆抗体的结合。单克隆抗体C179结合至H1N1 HA蛋白的茎中的构象区。C179以不同的效率结合所有野生型和COBRA HA蛋白。相比之下，三种HA头-特异性单克隆抗体结合一些，但并非所有的COBRA和野生型HA蛋白。CH65单克隆抗体结合至来自A/New Caledonia/20/1999 (NC/99)的HA，但不结合来自CA/09或PR/34的HA。5J8和4K8单克隆抗体二者结合至CA/09，但不结合其它两种野生型HA蛋白。相比之下，5J8抗体结合至P1, X6, X3,和X1 COBRA抗原的每一个。CH65抗体结合至P1, X6,和X3 COBRA抗原，但不结合X1 COBRA抗原。单克隆抗体4K8仅结合至X1。总体上，单克隆抗体结合的模式表明每个COBRA HA蛋白暴露不同的表位，因此不同的结构。

实施例3 –引发-加强H1N1 COBRA HA VLP疫苗引发广泛反应性抗体反应

在引发-加强策略中，BALB/c小鼠用COBRA VLP的不同组合接种，在第56天收集血清。小鼠用4种H1N1 COBRA VLP疫苗(X1, X3, X6和P1)之一以多个引发-加强组合接种，和在接种疫苗后第8周分析血清样品。用X1和X6 COBRA VLP的引发-加强组合接种的小鼠针对小组中15种病毒的任一种具有很少的HAI活性(图1A和D)，而用X3引发和用X6加强的小鼠具有针对Sing/86, Bei/95, NC/99和SI/06的HAI活性(图1B)。其它组合引发很少或低的HAI活性(图1C-F)。通过缺少P1的任何引发-加强给予，针对大流行H1N1 (2009-2013年)或历史H1N1毒株(1934-1957年)存在很少或没有活性。

用包含P1 VLP的组合接种的小鼠引发识别不同的H1N1病毒组的抗体。用P1 VLP引发然后用X3或X6 VLP加强的小鼠针对4种季节性(Weiss/43, Sing/86, Bie/95, NC/99)和1种大流行H1N1病毒(图1G和I)具有高的HAI活性。当X3 VLP用于引发小鼠和这些小鼠用P1加强时，针对相同的4种季节性病毒的HAI活性被检出，但针对大流行病毒，没有HAI被检出(图1H)。有趣的是，用P1 VLP的引发引起比用P1 VLP加强更高的HAI效价。用P1引发和用X1加强引发仅针对大流行毒株的HAI活性(图1K)和当小鼠用X1 VLP引发和用任何其它COBRAVLP疫苗加强时没有可检测的HAI活性。有趣的是，用P1引发和用X3 VLP加强的小鼠具有与引发-加强给予P1和X6 VLP类似的HAI活性。明显的是，P1和X1组合相当差。

用P1和X6 VLP的引发-加强组合接种的小鼠显示针对H1N1病毒，包括大流行病毒(Cal/09)和广泛短暂分布的季节性流感病毒的更加广泛的反应(图1I和1J)。尽管X6 COBRA使用来自1999-2012年的HA序列比对进行设计，但共同给予P1和X6 COBRA出人意料地显示广泛的HAI活性，包括针对1999年之前分离的许多H1N1流感毒株的活性。

用P1 VLP引发和用X6 VLP加强引起比用X6 VLP引发和用P1 VLP加强更高的针对大流行和季节性毒株二者的HAI效价，再次突出了给予引发-加强方案的次序的重要性(图1I-J)。P1和X3 VLP的引发-加强组合还引起高的针对大流行和季节性毒株二者的HAI效价(图1G-H)。明显的是，用P1引发和用X3 VLP加强产生强的针对Cal/09毒株的HAI活性，而用X3引发和用P1 VLP加强产生很少至没有针对该相同毒株的活性(图1G-H)。因此，尽管给予这些H1N1 COBRA的次序是重要的，但难以预测所述次序如何影响针对不同的H1N1流感毒株的反应的宽度。

实施例4 - H1N1 COBRA HA VLP疫苗的合剂混合物针对野生型H1N1毒株引发广泛 反应性HAI活性

将COBRA HA VLP疫苗的合剂混合在一起和测试针对一小组15个H1N1分离株的HAI活性。小鼠用两种H1N1 COBRA HA VLP疫苗的不同组合同时接种(1.5 µg剂量的每种VLP疫苗)。用X1和X3 VLP的合剂接种的小鼠具有针对小组中的三种病毒的HAI活性(Sing/86,Bei/95和NC/99)和用X1和X6 VLP的合剂接种的小鼠仅识别NC/99和SI/06 (图2A)。然而，用X3和X6 VLP同时接种的小鼠具有针对6种季节性H1N1流感病毒的HAI活性(图2A)。X1和X6的合剂显示具有针对某些毒株，特别是Sing/86和Bei/95的拮抗作用，突出了共同给予H1N1COBRA HA疫苗的不可预测性。当小鼠用包含P1 VLP的合剂接种时，所有小鼠具有高的针对CA/09的HAI活性(图2B)。P1和X1、X3或X6的合剂引发具有针对来自1986-2006年的病毒的HAI活性的抗体，但很少或没有针对更早的H1N1毒株或Bris/07的活性。令人惊讶的是，加入大流行P1 COBRA至X1、X3或X6 COBRA拓展了针对季节性H1N1季节性毒株，特别是NJ/76和TX/91毒株的保护宽度，针对这些毒株，X1/X3、X1/X6或X3/X6组合无一显示任何HAI活性(比较图2A与图2B)。用X1、X3和P1的三联合剂接种的小鼠观察到类似的结果(图2C)。有趣的是，用P1/X3 VLP疫苗的合剂引发和用P1/X6 VLP疫苗的合剂加强的小鼠组具有高的针对Sing/86, Bei/95, NC/99, SI/06和CA/09的HAI活性(图2D)。该HAI活性模式类似于用X3 VLP引发和用P1 VLP加强的小鼠，除了高的针对CA/09的HAI活性和针对Weiss/43的HAI活性降低(图1H)之外。

实施例5 - H1N1 COBRA疫苗的组合保护小鼠免于CA/09病毒攻击

小鼠用两种不同的H1N1 COBRA的引发-加强方案接种和用CA/09流感病毒(5 X10⁶PFU)攻击。用包括P1 VLP的任何引发-加强组合接种的小鼠具有小于7%的平均重量减轻，除了用X1引发和用P1加强的小鼠之外，其到感染后第6天失去13%的原始重量(图3A和B)。到感染后第6-7天，所有其它的引发-加强接种小鼠失去10-20%的体重，其中一些小鼠达到实验终点和其它剩余的小鼠然后缓慢地开始恢复重量。所有模拟物-接种小鼠失去大于20%体重和到感染后第7天所有小鼠被人工处死。

对于合剂接种小鼠，包含P1 VLP的疫苗方案再次比用其它COBRA VLP疫苗合剂接种的小鼠更好地保护免于CA/09攻击(图3C)。用P1和X3 VLP的合剂接种的小鼠没有发病迹象和重量减轻，而用包含P1 VLP的其它合剂接种的小鼠平均失去5-7%体重。用不包含P1VLP的合剂接种的小鼠失去15-20%体重(图3C)。

在感染后第3天，用P1 VLP引发的所有小鼠在它们的肺中具有很少或没有可检测的病毒效价(图4A)，这类似于用CA/09 IIV接种的小鼠。用X3或X6 COBRA VLP引发和用P1VLP加强的小鼠具有中等病毒肺效价(10²-10³ pfu/g肺组织)。用COBRA VLP的任何其它引发-加强方案接种的小鼠具有大于10⁶ pfu/g的病毒肺效价，其类似于模拟物接种小鼠(图4A)。相比之下，用包含P1 VLP的任何合剂接种的小鼠在它们的肺中实际上没有可检测的病毒效价(图4B)。在用任何其它合剂方案接种的小鼠中，病毒肺效价大于10⁶ pfu/g。

实施例6 – 在幼稚雪貂中H1N1 COBRA疫苗的保护作用

流感幼稚和遗传的雪貂(fitch ferret)(Mustela putorius faro, 雌性, 6-12月龄)可购自Marshall Farms (Sayre, Pa., USA)。将雪貂在包含Sani-chips LaboratoryAnimal Bedding (P.J. Murphy Forest Products, Montville, N.J., USA)的不锈钢笼(Shor-line, Kansas City, Kans., USA)中成对饲养。给雪貂提供Teklad Global雪貂饲料(Harlan Teklad, Madison, Wis., USA)和自由饮用新鲜水。将COBRA HA VLP在PBS, pH7.2中稀释以得到终浓度。雪貂用纯化的X1, X3, X6或P1 COBRA VLP以两个剂量(15 μg, 3μg)之一，根据通过光密度测定法测定的HA含量，经由在四头肌中肌内注射以0.25 ml的体积在第0周接种，然后在第3周用相同剂量的选自X1, X3, X6或P1的不同COBRA VLP加强。例如，雪貂用P1 COBRA VLP (15 μg或3 μg)接种，然后用X1, X3或X6 COBRA VLP (15 μg或3μg)加强。

或者，雪貂用两种以下X1, X3, X6或P1 COBRA VLP的合剂以两个剂量(各VLP7.5μg, 1.5 μg)之一，根据通过光密度测定法测定的HA含量，经由在四头肌中肌内注射，以0.25 ml的体积在第0周接种，然后用相同剂量的合剂加强。例如，雪貂用P1 COBRA VLP(7.5 μg或1.5 μg)和X1, X3或X6 COBRA VLP (7.5 μg或1.5 μg)之一的合剂接种，然后用相同的合剂加强。

使用前，将疫苗在-80℃下贮存，临用前用明矾佐剂(Imject Alum; PierceBiotechnology, Rockford, Ill., USA)配制。在接种疫苗方案期间每周监测动物的不良事件，包括重量减轻、温度、活动减少、鼻涕、喷嚏和腹泻。在接种疫苗前，通过HAI测定法证实动物对于传播流感A和流感B病毒是血清阴性的。各接种疫苗后14-21天，通过前腔静脉自麻醉的雪貂收集血液和转移至微量离心管。将管离心和取出血清并在-80 ± 5℃下冷冻。各疫苗组的HAI血清抗体效价在第5周使用代表性的重配株病毒或COBRA HA VLP测定。

最后接种疫苗后三周，雪貂用1 ml体积的高病原性H1N1病毒经鼻内攻击。感染后，在感染后14天内每日监测雪貂的重量减轻、疾病迹象和死亡。在接种后每一天，记录每组的个体体重、疾病评分和死亡。在接种后7天内，每天通过灌输3 ml的PBS至麻醉的雪貂的鼻孔中进行洗鼻。收集洗液和在-80℃下贮存备用。

实施例7 – 在免疫前雪貂中H1N1 COBRA疫苗的保护作用

流感幼稚和遗传的雪貂(Mustela putorius faro, 雌性, 6-12月龄)可购自MarshallFarms (Sayre, Pa., USA)。雪貂在包含Sani-chips Laboratory Animal Bedding (P.J.Murphy Forest Products, Montville, N.J., USA)的不锈钢笼(Shor-line, KansasCity, Kans., USA)中成对饲养。给提供雪貂Teklad Global雪貂饲料(Harlan Teklad,Madison, Wis., USA)和自由引用新鲜水。

以12-周间隔，雪貂用季节性H1N1流感病毒(1 × 10⁶ PFU)经鼻内预感染。在感染方案期间每周监测动物的不良事件，包括重量减轻、温度、活动减少、鼻涕、喷嚏和腹泻。在各感染后第14, 28, 56和84天，通过前腔静脉锁骨下静脉，从所有麻醉的雪貂收集血液。将血清转移至离心管。将管离心，和取出血清并在−20 ± 5℃下冷冻。

最后预感染后4周，在第0周雪貂用纯化的X1, X3, X6或P1 COBRA VLP以两个剂量(15 μg, 3 μg)之一，根据通过光密度测定法测定的HA含量，经由在四头肌中肌内注射，以0.25 ml的体积攻击，然后在第3周用相同剂量的选自X1, X3, X6或P1的不同COBRA VLP加强。例如，雪貂用P1 COBRA VLP (15 μg或3 μg)接种，然后用X1, X3或X6 COBRA VLP (15 μg或3 μg)加强。

或者，在第0周雪貂用两种以下X1, X3, X6或P1 COBRA VLP的合剂，以两个剂量(各VLP，7.5 μg, 1.5 μg)之一，根据通过光密度测定法测定的HA含量，经由在四头肌中肌内注射，以0.25 ml的体积攻击，然后用相同剂量的相同合剂加强。例如，雪貂用P1 COBRAVLP (7.5 μg或1.5 μg)和X1, X3或X6 COBRA VLP (7.5 μg或1.5 μg)之一的合剂接种，然后用相同的合剂加强。

使用前，将疫苗在-80℃下贮存，临用前用明矾佐剂(Imject Alum; PierceBiotechnology, Rockford, Ill., USA)配制。在接种疫苗方案期间，每周监测动物的不良事件，包括重量减轻、温度、活动减少、鼻涕、喷嚏和腹泻。各接种疫苗后14-21天，通过前腔静脉自麻醉的雪貂收集血液和转移至微量离心管。将管离心和取出血清，并在-80 ± 5℃下冷冻。使用代表性的重配株病毒或COBRA HA VLP，在第5周测定各疫苗组的HAI血清抗体效价。

最后接种疫苗后3周，雪貂用1 ml体积的高病原性H1N1病毒经鼻内攻击。感染后，在感染后14天内每日监测雪貂的重量减轻、疾病迹象和死亡。接种后每天记录各组的个体体重、疾病评分和死亡。接种后7天内，每天通过灌输3 ml的PBS至麻醉的雪貂的鼻孔进行洗鼻。收集洗液和在-80℃下贮存备用。

实施例8 – 在幼稚雪貂中H1N1 COBRA疫苗的保护作用

为了在异源引发/加强环境中评价H1N1 COBRA的免疫原性，幼稚雪貂在第0天用指定的活病毒(即，A/Singapore/6/1986, A/Brisbane/59/2007, A/California/07/09, COBRAP1和COBRA X3)感染。图5A-F。将COBRA P1和COBRA X3多肽掺入减毒、高收率PR8背景，以制备活病毒。该第0天感染也被称为引发感染。感染的雪貂然后在第84和168天用15 μg的带有来自A/California/2009 (CA/09)或COBRA P1的HA蛋白的VLP与AF03佐剂的组合免疫。CA/09 HA表示目前H1护理标准中包括的HA，因此经选择以评价由这些H1N1 COBRA引发的HAI宽度。最后免疫后14天(D182)，评价针对H1病毒小组的HAI反应(即，SC/1918, A/Weiss/1/1943, A/FM/1/47, A/Denver/1/57, A New Jersey/8/76, A/USSR/90/77, A/Brazil/1/78, A/Chile/1/83, A/Singapore/06/86, A/Texas/36/91, A/Beijing/262/95, A/NewCaledonia/20/99, A/Solomon Islands/6/06, A/Brisbane/59/07, A/California/07/09和A/Philadelphia/1/13)，和将Log₂转化的HAI效价作图。虚线表示1:40的效价，其与针对指定毒株的感染的血清保护效价相关。图5A-F。

在缺少引发感染的情况下(图5A)，存在非常有限的由VLP诱导的免疫原性，甚至在2剂量后。引发感染后(图5B-F)，与CA/09 HA相比，COBRA P1一致地诱导更高的血清保护效价和对抗更多数量的病毒毒株。在用作引发感染的非-COBRA病毒中，在免疫后Singapore/6/1986得到最广泛反应(图5B)，但CA/09仅针对测试的7/16毒株诱导血清保护反应。相比之下，COBRA P1针对测试的14/16病毒诱导血清保护效价，和对于测试的所有毒株与CA/09诱导的相比，倾向于更高幅度的HAI反应。

对于所有其它引发感染，观察到类似的趋势，其中在A/Brisbane/59/2007引发(COBRA P1的8/16对比CA/09的6/16; 图5C)、A/California/07/2009引发(COBRA P1的5/16对比CA/09的4/16；图5D)、COBRA P1引发(COBRA P1的8/16对比CA/09的5/16; 图5E)和COBRA X3引发(COBRA P1的13/16对比CA/09的8/16; 图5F)的情况下，与CA/09 HA相比，COBRA P1 HA驱动针对更多毒株的血清保护反应。在所有情况下，针对CA/09 VLP也诱导的毒株，存在COBRA P1 VLP诱导更高幅度的反应的趋势。这些数据表明，与通过目前CA/09护理标准引发的相比，COBRA P1诱导更广泛的免疫，证实了本文公开的H1N1 COBRA作为广泛反应性抗原用于流感疫苗的功用。此外，这些结果表明，异源引发/加强方案可用于拓展对流感抗原的HAI反应的宽度和幅度。

等同方案

序数术语例如“第一”、“第二”、“第三”等在权利要求中修饰要求的要素的使用，本身不意味着一个要求的要素相比另一个的任何优先级、优越性或次序，或其中进行方法行为的时间次序，而是仅用作标记以区分具有某一名称的一个要求的要素与具有相同名称的另一个要素(但用于序数术语)以区分要求的要素。

如本文在说明书和权利要求中所用的冠词“一个”和“一种”，除非清楚指明相反，应理解为包括复数参考。在一组的一个或多个成员之间包括“或”的权利要求或描述，如果一个、超过一个或所有的组成员存在于给定产品或方法、用于给定产品或方法或以其它方式与给定产品或方法相关，则被认为得到满足，除非指明相反或从上下文另外清楚。本发明包括其中确切一个组成员存在于给定产品或方法、用于给定产品或方法或以其它方式与给定产品或方法相关的实施方案。本发明还包括其中超过一个或整个组成员存在于给定产品或方法、用于给定产品或方法或以其它方式与给定产品或方法相关的实施方案。此外，应理解，本发明包括所有变化、组合和排列，其中将来自一个或多个所列权利要求的一个或多个限制、要素、条款、说明项等引入从属于相同基础权利要求(或作为相关的任何其它权利要求)的另一个权利要求，除非另外指明或除非对本领域普通技术人员而言显而易见地产生矛盾或不一致。在要素作为列表提供的情况下(例如，在Markush组或类似的格式中)，应理解每个亚组的要素也被公开，和任何要素可从该组中除去。应理解，一般而言，在本发明或本发明的各方面涉及包含特定要素、特征等时，本发明或本发明的各方面的某些实施方案由这样的要素、特征等组成或基本上由其组成。为简单起见，在本文中这些实施方案在各情况下未特别以如此多的语言阐明。还应理解，本发明的任何实施方案或方面可明确从权利要求中排除，而不管说明书中是否叙述了该特定排除。本文提及以描述本发明的背景和提供关于其实施的另外细节的出版物、网站和其它参考资料通过引用结合到本文中。

Claims (21)

1. 免疫原性组合物，其包含至少两种重组H1N1流感血凝素(HA)多肽的组合，所述组合包含第一重组流感HA多肽，其包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列；和第二重组流感HA多肽，其包含选自SEQ ID NO: 2和SEQ ID NO: 3的氨基酸序列的氨基酸序列。

2. 权利要求1的免疫原性组合物，其中所述组合物包含重组H1N1流感HA多肽的组合，所述组合由包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的第一重组流感HA多肽和包含SEQ ID NO: 2的氨基酸序列的第二重组流感HA多肽组成。

3. 权利要求1的免疫原性组合物，其中所述组合物包含重组H1N1流感HA多肽的组合，所述组合由包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的第一重组流感HA多肽和包含SEQ ID NO: 3的氨基酸序列的第二重组流感HA多肽组成。

4. 权利要求1的免疫原性组合物，其中所述组合物包含包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的第一重组流感HA多肽、包含SEQ ID NO: 2的氨基酸序列的第二重组流感HA多肽和包含SEQ ID NO: 3的氨基酸序列的第三重组流感HA多肽的重组H1N1流感HA多肽的组合。

5.权利要求1-4中任一项的免疫原性组合物，其中至少一种重组流感HA多肽缺少N-末端甲硫氨酸残基。

6. 免疫原性组合物，其包含至少两种重组H1N1流感血凝素(HA)多肽的组合，其中所述组合包含第一重组流感HA多肽，其包含SEQ ID NO: 1的氨基酸2-566；和第二重组流感HA多肽，其包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO: 2的氨基酸2-565和SEQ ID NO: 3的氨基酸2-566。

7. 权利要求6的免疫原性组合物，其中所述组合物包含重组H1N1流感HA多肽的组合，所述组合由包含SEQ ID NO: 1的氨基酸2-566的第一重组流感HA多肽和包含SEQ ID NO: 2的氨基酸2-565的第二重组流感HA多肽组成。

8. 权利要求6的免疫原性组合物，其中所述组合物包含重组H1N1流感HA多肽的组合，所述组合由包含SEQ ID NO: 1的氨基酸2-566的第一重组流感HA多肽和包含SEQ ID NO: 3的氨基酸2-566的第二重组流感HA多肽组成。

9.权利要求1-8中任一项的免疫原性组合物，其中所述重组H1N1流感HA多肽在病毒-样颗粒(VLP)上提供。

10.权利要求1-8中任一项的免疫原性组合物，其中所述重组H1N1流感HA多肽在灭活的流感病毒上提供。

11.权利要求10的免疫原性组合物，其中灭活的流感病毒是完整病毒。

12.权利要求10的免疫原性组合物，其中灭活的流感病毒是裂解病毒。

13.前述权利要求中任一项的免疫原性组合物，其中免疫原性组合物还包含佐剂。

14.权利要求1-13中任一项的免疫原性组合物用于在受试者中预防流感感染或疾病的用途。

15. 在受试者中预防流感感染或疾病的方法，所述方法包括共同给予受试者包含SEQID NO: 1的氨基酸序列的第一重组流感HA多肽和包含选自以下的氨基酸序列的第二重组流感HA多肽：SEQ ID NO: 2和SEQ ID NO: 3的氨基酸序列。

16. 在受试者中预防流感感染或疾病的方法，所述方法包括共同给予受试者包含SEQID NO: 1的氨基酸2-566的第一重组流感HA多肽和包含选自以下的氨基酸序列的第二重组流感HA多肽：SEQ ID NO: 2的氨基酸2-565和SEQ ID NO: 3的氨基酸2-566。

17.权利要求15或16的方法，其中所述第一和第二重组流感HA多肽同时共同给予。

18.权利要求15或16的方法，其中所述第一重组流感HA多肽在第二重组流感HA多肽之前给予。

19.权利要求14的用途或权利要求15-18中任一项的方法，其中所述免疫原性组合物或所述第一和第二重组流感HA多肽通过皮内、鼻内、肌内、口服或皮下递送给予受试者。

20.权利要求14的用途或权利要求15-19中任一项的方法，其中所述受试者是人。

21.权利要求14的用途或权利要求15-20中任一项的方法，其中所述免疫原性组合物或所述第一和第二重组流感HA多肽在受试者中引发至少1:40的血细胞凝集-抑制(HAI)抗体效价。