JP2018501258A - Ｈ１ｎ１インフルエンザに対するコンピュータ最適化広反応性抗原の相乗的併用投与 - Google Patents

Ｈ１ｎ１インフルエンザに対するコンピュータ最適化広反応性抗原の相乗的併用投与 Download PDF

Info

Publication number
JP2018501258A
JP2018501258A JP2017533485A JP2017533485A JP2018501258A JP 2018501258 A JP2018501258 A JP 2018501258A JP 2017533485 A JP2017533485 A JP 2017533485A JP 2017533485 A JP2017533485 A JP 2017533485A JP 2018501258 A JP2018501258 A JP 2018501258A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
influenza
polypeptide
seq
amino acid
recombinant
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
JP2017533485A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2018501258A5 (ja
JP6764408B2 (ja
Inventor
テッド ミルバーン ロス
テッド ミルバーン ロス
ティム アレファンティス
ティム アレファンティス
ドナルド マーティン ジュニア カーター
ドナルド マーティン ジュニア カーター
クリストファー オースティン ダービー
クリストファー オースティン ダービー
ハロルド クリーンソウス
ハロルド クリーンソウス
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Oregon Health Science University
Original Assignee
Oregon Health Science University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Oregon Health Science University filed Critical Oregon Health Science University
Publication of JP2018501258A publication Critical patent/JP2018501258A/ja
Publication of JP2018501258A5 publication Critical patent/JP2018501258A5/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP6764408B2 publication Critical patent/JP6764408B2/ja
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/145—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55505—Inorganic adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55566—Emulsions, e.g. Freund's adjuvant, MF59
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/70—Multivalent vaccine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16123—Virus like particles [VLP]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本発明は、コンピュータ最適化Ｈ１Ｎ１インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）ポリペプチドの併用投与（例えば、免疫原性カクテル組成物及び／又はプライム−ブーストレジメン）を提供する。最適化Ｈ１Ｎ１インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）ポリペプチドの併用投与はウイルス感染の相乗的中和を促進し、季節性株及びパンデミック株の両方を含む多様な複数のＨ１Ｎ１インフルエンザウイルス株に対して改善された防御免疫（例えば広反応性免疫応答）をもたらす。【選択図】図１Ａ

Description

［関連出願の相互参照］
本願は、２０１４年１２月１９日付で出願された米国仮特許出願第６２／０９４，７７２号の利益を主張し、その出願日に依拠し、その開示全体が引用することにより本明細書の一部をなす。
［配列表］
本願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出された配列表を含み、その全体が引用することにより本明細書の一部をなす。２０１５年１２月１６日付けで作製された上記ＡＳＣＩＩコピーの名前は０１７１．０００５−ＰＣＴ＿ＳＬ．ｔｘｔであり、２０２２４バイトのサイズである。
インフルエンザは主に上気道、すなわち鼻、咽頭及び気管支、更には稀に肺を攻撃するウイルスによって引き起こされる。感染は通常約１週間持続する。インフルエンザは急激な高熱、筋肉痛、頭痛及び強い倦怠感、乾性咳嗽、咽頭痛及び鼻炎を特徴とする。大抵の人は、いかなる薬物治療も必要とすることなく１週間〜２週間以内に回復する。しかしながら若年者、高齢者及び肺疾患、糖尿病、癌、腎臓障害又は心臓障害等の医学的状態の患者において、インフルエンザは重大なリスクをもたらす。これらの人々においては、感染は基礎疾患の重症合併症、肺炎及び死亡につながる可能性がある。毎年のインフルエンザの流行が、世界的に毎年３００万例〜５００万例の重症疾患及び２５００００人〜５０００００人の死亡をもたらしていると考えられる。
インフルエンザウイルスはオルトミクソウイルス科の一員である。Ａ型インフルエンザ、Ｂ型インフルエンザ及びＣ型インフルエンザと称される３つのインフルエンザウイルス亜型が存在する。インフルエンザビリオンは以下のタンパク質をコードする分節陰性センスＲＮＡゲノムを含有する：ヘマグルチニン（ＨＡ）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、マトリックス（Ｍｌ）、プロトンイオンチャネルタンパク質（Ｍ２）、核タンパク質（ＮＰ）、ポリメラーゼ塩基性タンパク質１（ＰＢｌ）、ポリメラーゼ塩基性タンパク質２（ＰＢ２）、ポリメラーゼ酸性タンパク質（ＰＡ）及び非構造タンパク質２（ＮＳ２）。ＨＡ、ＮＡ、Ｍｌ及びＭ２は膜会合タンパク質であり、ＮＰ、ＰＢｌ、ＰＢ２、ＰＡ及びＮＳ２はヌクレオカプシド会合タンパク質である。Ｍｌタンパク質はインフルエンザ粒子中で最も豊富なタンパク質である。ＨＡタンパク質及びＮＡタンパク質は、ウイルス付着及びウイルス粒子の細胞への侵入に関与するエンベロープ糖タンパク質である。具体的には、ＨＡによりインフルエンザウイルスは膜の表面構造上にシアル酸を含有する細胞に結合する。
ＨＡタンパク質及びＮＡタンパク質はどちらも、ウイルス中和及び防御免疫の主要免疫優性エピトープの供給源であるため、予防的インフルエンザワクチンの重要な成分とされる。インフルエンザウイルスの遺伝子構造から、抗原ドリフトとして知られる頻繁な微小遺伝子変化が可能となる。このため、インフルエンザの主要抗原、特にＨＡのアミノ酸配列は群、亜型及び株間で非常に多様性がある。この理由から、現在の季節性インフルエンザワクチンはＨＡタンパク質及びＮＡタンパク質中の突然変異（抗原ドリフト）を考慮して１年〜３年毎に見直す必要がある。現在のワクチンアプローチの更なる制限は、ワクチンに使用されるインフルエンザ株が、ＷＨＯ／ＣＤＣにより次のインフルエンザの流行期の流行性インフルエンザ株に関する該機関の最も有力な推測に基づいて選択されるということである。多くの場合、この推測は正確でなく、ワクチン株が季節性インフルエンザ株と一致せず、季節性ワクチンの有効性が制限される。季節性ワクチンはまた、抗原シフトに起因し得るパンデミック株に対する保護を与えるようには設計されていない。さらに、その名の通り、季節性ワクチンは毎年投与しなければならない。
インフルエンザのパンデミックの発生は、ヒト集団が免疫学的にナイーブな（immunologically naive）病原性及び伝染性ウイルスの出現に起因する。該ウイルスは新しいため、ヒト集団はそれに対する免疫を殆ど又は全く有しない。該ウイルスは世界中で人から人へと迅速に蔓延する。前世紀では３回、Ａ型インフルエンザウイルスに主にそれらのＨ成分における大きな遺伝子変化が生じ、世界的なパンデミック、また疾患及び死亡の両方の点で大きな犠牲をもたらした。最も悪名高いパンデミックは、世界人口の大半に影響を及ぼし、１９１８年〜１９１９年に少なくとも４０００万人の死者を出したとされる「スペイン風邪」であった。より近年では、２回の他のＡ型インフルエンザのパンデミックが１９５７年（「アジアインフルエンザ」）及び１９６８年（「香港インフルエンザ」）に生じ、世界的に顕著な罹患率及び死亡率を引き起こした。現在のインフルエンザ流行とは対照的に、これらのパンデミックは健常な若年者においても深刻な結果を伴い、「スペイン風邪」のように大規模ではないが、死亡率は健常な若年成人で最も高かった。より近年では、ブタからヒトへと直接伝播する新たなＡ型インフルエンザ亜型（Ｈ１Ｎ１）の局地的な大流行が２００９年にメキシコで生じ、検出された国は増え続けている。現在、ブタ起源Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルスと関連する死亡率は季節性インフルエンザ株と同様であると思われる。しかしながら、ブタ起源Ｈ１Ｎ１インフルエンザの監視及び検出の増大により死亡率は上昇する可能性がある。抗原ドリフト、及び抗原シフトとして知られる更により劇的な変化のために、パンデミックインフルエンザ抗原（例えばパンデミック株のＨＡアミノ酸配列）は全く予測不能である。このため、ワクチンは従来、パンデミックの後期まで利用不可能であった。
季節性株及びパンデミック株の両方を含む複数のインフルエンザ株に対するより幅広い保護をもたらすことによって現在の抗原ドリフト、抗原シフト及びウイルスの不一致の問題により良好に対処することができるインフルエンザワクチンについて満たされていない要求が存在する。より長期にわたる免疫をもたらすインフルエンザワクチン、特に毎年投与する必要のないワクチンについても満たされていない要求が存在する。
本発明は特に、免疫系に提示されることで季節性及びパンデミックＨ１Ｎ１インフルエンザ株の両方に対する広域中和抗体を誘発することができる、コンピュータ最適化Ｈ１Ｎ１インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）ポリペプチドの併用投与（すなわち、プライム−ブースト組合せ又は組成物カクテル）を提供する。いかなる特定の理論にも束縛されるものではないが、各々個々のポリペプチドはＨＡ分子の異なる抗原性領域に結合する異なる抗体群を誘発するが、（カクテルとして又はプライム−ブーストレジメンの一環として）併用投与することで、ウイルス感染を相乗的に中和し、複数のＨ１Ｎ１インフルエンザウイルス株に対して改善された防御免疫（例えば、季節性株及びパンデミック株の両方に対する広範な反応性免疫応答）及び／又はより長期にわたる免疫をもたらす、異なるＨＡヘッドエピトープを認識する抗体を誘発すると考えられる。最適化ＨＡポリペプチドは、一連のＨＡタンパク質アラインメント、並びにその後の何千ものヒト及びブタＨ１Ｎ１インフルエンザ分離株に基づくコンセンサス配列の生成によって開発された。特定の実施の形態では、防御免疫は少なくとも例えば過去５年間、６年間、７年間、８年間、９年間、１１年間、１２年間、１５年間、２０年間にわたって生じたＨ１Ｎ１株に及ぶ。
少なくとも２つの組み換えＨ１Ｎ１インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）ポリペプチドの組合せを含む免疫原性組成物であって、該組合せが配列番号１と少なくとも９８％、９８．５％、９９％又は９９．５％同一のアミノ酸配列を含む第１の組み換え最適化Ｈ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチド（Ｐ１）と、１）配列番号２と少なくとも９９％又は９９．５％同一のアミノ酸配列（Ｘ６）、２）配列番号３と少なくとも９９％又は９９．５％同一のアミノ酸配列（Ｘ３）、及び３）配列番号４と少なくとも９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％又は９９．５％同一のアミノ酸配列（Ｘ１）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む第２の組み換え最適化Ｈ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチドとを含む、免疫原性組成物が本明細書で提供される。
少なくとも２つの組み換えＨ１Ｎ１インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）ポリペプチドの免疫原性組成物であって、該組合せが配列番号１の残基２〜５６６と少なくとも９８％、９８．５％、９９％又は９９．５％同一のアミノ酸配列を含む第１の組み換え最適化Ｈ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチドと、１）配列番号２の残基２〜５６５と少なくとも９９％又は９９．５％同一のアミノ酸配列、２）配列番号３の残基２〜５６６と少なくとも９９％又は９９．５％同一のアミノ酸配列、及び３）配列番号４の残基２〜５６６と少なくとも９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％又は９９．５％同一のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む第２の組み換え最適化Ｈ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチドとを含む、免疫原性組成物も本明細書で提供される。
幾つかの実施の形態では、本明細書に記載される組成物は（ｉ）配列番号１と少なくとも９８％、９８．５％、９９％又は９９．５％同一のアミノ酸配列を含む第１の組み換え最適化Ｈ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチドと、（ｉｉ）配列番号２と少なくとも９９％又は９９．５％同一のアミノ酸配列を含む第２の組み換え最適化Ｈ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチドとを含む。幾つかの実施の形態では、組成物はポリペプチドのアミノ酸配列が配列番号１又は配列番号２に対して２つ以下又は１つ以下の置換を含む、少なくとも２つの異なる組み換え最適化Ｈ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチドを含む。幾つかの実施の形態では、第１及び／又は第２の組み換え最適化Ｈ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチドはＮ末端メチオニン残基を欠く。幾つかの実施の形態では、本明細書に記載される組成物は、（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列又は配列番号１の残基２〜５６６を含む第１の組み換え最適化Ｈ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチドと、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列又は配列番号２の残基２〜５６５を含む第２の組み換え最適化Ｈ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチドとを含む。
幾つかの実施の形態では、本明細書に記載される組成物は（ｉ）配列番号１と少なくとも９８％、９８．５％、９９％又は９９．５％同一のアミノ酸配列を含む第１の組み換え最適化Ｈ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチドと、（ｉｉ）配列番号３と少なくとも９９％又は９９．５％同一のアミノ酸配列を含む第２の組み換え最適化Ｈ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチドとを含む。幾つかの実施の形態では、組成物はポリペプチドのアミノ酸配列が配列番号１又は配列番号３に対して２つ以下又は１つ以下の置換を含む、少なくとも２つの異なる組み換え最適化Ｈ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチドを含む。幾つかの実施の形態では、組み換えＨ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチドはＮ末端メチオニン残基を欠く。幾つかの実施の形態では、本明細書に記載される組成物は、（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列又は配列番号１の残基２〜５６６を含む第１の組み換え最適化Ｈ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチドと、（ｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列又は配列番号３の残基２〜５６６を含む第２の組み換え最適化Ｈ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチドとを含む。
幾つかの実施の形態では、本明細書に記載される組成物は（ｉ）配列番号１と少なくとも９８％、９８．５％、９９％又は９９．５％同一のアミノ酸配列を含む第１の組み換え最適化Ｈ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチドと、（ｉｉ）配列番号４と少なくとも９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％又は９９．５％同一のアミノ酸配列を含む第２の組み換え最適化Ｈ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチドとを含む。幾つかの実施の形態では、組成物はポリペプチドのアミノ酸配列が配列番号１又は配列番号４に対して２つ以下又は１つ以下の置換を含む、少なくとも２つの異なる組み換え最適化Ｈ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチドを含む。幾つかの実施の形態では、組み換え最適化Ｈ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチドはＮ末端メチオニン残基を欠く。幾つかの実施の形態では、本明細書に記載される組成物は、（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列又は配列番号１の残基２〜５６６を含む第１の組み換え最適化Ｈ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチドと、（ｉｉ）配列番号４のアミノ酸配列又は配列番号４の残基２〜５６６を含む第２の組み換え最適化Ｈ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチドとを含む。
幾つかの実施の形態では、組成物は配列番号１の残基２〜５６６と少なくとも９８％、９８．５％、９９％又は９９．５％同一のアミノ酸配列を含む第１の組み換え最適化Ｈ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチドと、配列番号２の残基２〜５６５と少なくとも９９％又は少なくとも９９．５％同一のアミノ酸配列を含む第２の組み換え最適化インフルエンザＨＡポリペプチドとからなる組み換えＨ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチドの組合せを含む。幾つかの実施の形態では、組成物は配列番号１の残基２〜５６６と少なくとも９８％、９８．５％、９９％又は９９．５％同一のアミノ酸配列を含む第１の組み換え最適化インフルエンザＨＡポリペプチドと、配列番号３のアミノ酸２〜５６６と少なくとも９９％又は少なくとも９９．５％同一のアミノ酸配列を含む第２の組み換え最適化インフルエンザＨＡポリペプチドとからなる組み換えＨ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチドの組合せを含む。幾つかの実施の形態では、組成物は配列番号１の残基２〜５６６と少なくとも９８％、９８．５％、９９％又は９９．５％同一のアミノ酸配列を含む第１の組み換え最適化インフルエンザＨＡポリペプチドと、配列番号４のアミノ酸２〜５６６と少なくとも９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％又は９９．５％同一のアミノ酸配列を含む第２の組み換え最適化インフルエンザＨＡポリペプチドとからなる組み換えＨ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチドの組合せを含む。幾つかの実施の形態では、本明細書に記載される組成物は、（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列又は配列番号１の残基２〜５６６を含む第１の組み換え最適化Ｈ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチドと、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列又は配列番号２の残基２〜５６５を含む第２の組み換え最適化Ｈ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチドとからなる。幾つかの実施の形態では、本明細書に記載される組成物は、（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列又は配列番号１の残基２〜５６６を含む第１の組み換え最適化Ｈ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチドと、（ｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列又は配列番号３の残基２〜５６６を含む第２の組み換え最適化Ｈ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチドとを含む。幾つかの実施の形態では、本明細書に記載される組成物は、（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列又は配列番号１の残基２〜５６６を含む第１の組み換え最適化Ｈ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチドと、（ｉｉ）配列番号４のアミノ酸配列又は配列番号４の残基２〜５６６を含む第２の組み換え最適化Ｈ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチドとを含む。
組み換えＨ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチドをコードする単離核酸分子及びベクターも本開示によって提供される。かかるベクターを含む単離細胞が更に提供される。本明細書に記載されるコンピュータ最適化組み換えＨＡポリペプチドを含む組み換えインフルエンザウイルスも提供される。
インフルエンザウイルス様粒子（ＶＬＰ）、不活化インフルエンザウイルス又はビリオン、及び本明細書に開示される最適化ＨＡポリペプチドを含む融合タンパク質も提供され、該ＶＬＰ及びウイルス／ビリオン並びに個々のＨＡポリペプチドの融合タンパク質は上記のカクテルへと混合するか又は組み合わせることができる。
薬学的に許容可能な担体中の本明細書に開示される最適化インフルエンザＨＡポリペプチド、融合タンパク質、ウイルス／ビリオン又はＶＬＰのカクテルを含む組成物が更に提供される。開示のＨＡポリペプチド、融合タンパク質、ウイルス又はＶＬＰのカクテルの免疫原性組成物を投与することによって被験体においてインフルエンザウイルスに対する免疫応答を誘発する方法も本開示によって提供される。
本明細書に開示される最適化Ｈ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチドを被験体に併用投与する方法も提供される。或る特定の実施の形態では、該方法は被験体に本明細書に開示される最適化Ｈ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチドの組合せ又はカクテルを含む組成物（単数又は複数）を投与することによって、Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルスに対して被験体を免疫化することを含む。本明細書に記載される第１の最適化Ｈ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチドを含むプライミングワクチン、続いて本明細書に記載される第２の最適化Ｈ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチドを含むブースティングワクチンを被験体に投与することによってＨ１Ｎ１インフルエンザウイルスに対して被験体を免疫化する方法であって、第２の最適化Ｈ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチドが第１の最適化Ｈ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチドとは異なる、方法が更に提供される。幾つかの実施の形態では、プライミングワクチンは生弱毒化インフルエンザウイルス（例えば温度感受性ウイルス）である。或る特定の実施の形態では、プライミングワクチンは配列番号１と少なくとも９８％同一の組み換え最適化Ｈ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチド（すなわちＰ１）を含み、ブースティングワクチンは配列番号２と少なくとも９９％同一、配列番号３と少なくとも９９％同一又は配列番号４と少なくとも９６％同一の組み換え最適化Ｈ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチド（例えばＸ６、Ｘ３又はＸ１）を含む。他の実施の形態では、プライミングワクチンは配列番号２と少なくとも９９％同一の組み換え最適化Ｈ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチドを含むことができ、ブースティングワクチンは配列番号１と少なくとも９８％同一、配列番号３と少なくとも９９％同一又は配列番号４と少なくとも９６％同一の組み換え最適化Ｈ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチドを含む。他の実施の形態では、プライミングワクチンは配列番号３と少なくとも９９％同一の組み換え最適化Ｈ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチドを含むことができ、ブースティングワクチンは配列番号１と少なくとも９８％同一、配列番号２と少なくとも９９％同一又は配列番号４と少なくとも９６％同一の組み換え最適化Ｈ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチドを含む。
本発明の上述及び他の目的、特徴及び利点は添付の図面を参照して進められる以下の詳細な説明からより明らかとなる。
以下の図から構成される本明細書に含まれる図面は、限定ではなく例示のみを目的とする。
ＣＯＢＲＡ ＶＬＰワクチンを使用するプライム−ブーストレジメンを用いたマウスのワクチン接種により誘導される血球凝集阻害（ＨＡＩ）血清抗体力価を示す図である。ＨＡＩ力価を、以下の指定のＣＯＢＲＡ ＶＬＰワクチンのプライム−ブーストレジメンを用いてワクチン接種した各群のマウスについて１７種のＨ１Ｎ１インフルエンザウイルスのパネルに対して決定した。バーは５６日目に収集した抗血清による幾何平均力価（±Ｓ．Ｅ．Ｍ．）を表す。点線の横線は１：４０のＨＡＩ抗体力価に相当するｌｏｇ ２値を表す。 ＣＯＢＲＡ ＶＬＰワクチンのカクテルを用いたマウスのワクチン接種により誘導される血球凝集阻害（ＨＡＩ）血清抗体力価を示す図である。１７種のＨ１Ｎ１インフルエンザウイルスのパネルに対するＨＡＩ力価を、以下のＣＯＢＲＡ ＶＬＰワクチンのカクテルの１つをワクチン接種した各群のマウスについて決定した：Ｘ１／Ｘ３、Ｘ１／Ｘ６若しくはＸ３／Ｘ６（Ａ）；Ｐ１／Ｘ６、Ｐ１／Ｘ３若しくはＰ１／Ｘ１（Ｂ）；Ｘ１／Ｘ６／Ｐ１（Ｃ）、又はＰ１／Ｘ３ ＶＬＰワクチンのカクテルによるプライム、続くＰ１／Ｘ６ ＶＬＰワクチンのカクテルによるブースト（Ｄ）。バーは５６日目に収集した抗血清による幾何平均力価（±Ｓ．Ｅ．Ｍ．）を表す。 ＣＯＢＲＡ ＶＬＰワクチンのプライム−ブーストレジメン（Ａ及びＢ）又はカクテル（Ｃ）を用いてワクチン接種したマウスのＨ１Ｎ１インフルエンザウイルスチャレンジによって誘導される体重減少率（％）を示す図である。各々のワクチン＋アジュバント（ＡＦＯ３又はＩｍｊｅｃｔアラム（alum））を用いて０週目及び４週目にワクチン接種したＢＡＬＢ／ｃマウス（１１匹のマウス／群）に、１×１０６ｐｆｕのＨ１Ｎ１分離株Ａ／カリフォルニア／０７／２００９（ＣＡ／０９）を感染させた。マウスを１４日間の観察期間にわたって体重減少について毎日モニタリングした。肺力価を評定するために感染後２日目に３匹のマウス、３日目に更に３匹のマウスを屠殺した。したがって、５匹のマウスの体重を１４日間にわたって記録した。 ＣＯＢＲＡ ＶＬＰプライムブーストレジメン（Ａ）又はＣＯＢＲＡ ＶＬＰカクテル（Ｂ）を用いてワクチン接種したマウスにおけるウイルス肺力価（感染後３日目）を示す図である。 以下のプライマーブーストレジメンを用いてワクチン接種したナイーブフェレットにおけるウイルス肺力価を示す図である：プライミング感染なし及びＰ１ ＶＬＰ又はＣＡ０９ ＶＬＰブースト（Ａ）；Ａ／シンガポール６／１９８６プライミング感染及びＰ１ ＶＬＰ又はＣＡ０９ ＶＬＰブースト（Ｂ）；Ａ／ブリスベン／５９／２００７プライミング感染及びＰ１ ＶＬＰ又はＣＡ０９ ＶＬＰブースト（Ｃ）；Ａ／カリフォルニア／０７／０９プライミング感染及びＰ１ ＶＬＰ又はＣＡ０９ ＶＬＰブースト（Ｄ）；ＣＯＢＲＡ Ｐ１プライミング感染及びＰ１ ＶＬＰ又はＣＡ０９ ＶＬＰブースト（Ｅ）；ＣＯＢＲＡ Ｘ３プライミング感染及びＰ１ ＶＬＰ又はＣＡ０９ ＶＬＰブースト（Ｆ）。ＨＡＩ力価をＸ軸に記載のＨ１ウイルスのパネルに対して評価した。
定義
本発明のより容易な理解のために、幾つかの用語を初めに下記に規定する。以下の用語及び他の用語の付加的な定義は本明細書を通して規定される。
本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される場合、文脈上他に明らかに指示されない限り、数量を特定していない単数形（the singular forms "a", "an", and "the"）は複数の指示対象を含む。このため、例えば「方法（a method）」への言及には１つ以上の方法、及び／又は本明細書に記載される及び／又は本開示を読むことで当業者に明らかとなるタイプの工程等が含まれる。
アジュバント：本明細書で使用される場合、「アジュバント」という用語は、抗原に対する免疫応答を非特異的に高める物質又はビヒクルを指す。アジュバントは、抗原が吸着する鉱物（アラム、アルミニウム塩、水酸化アルミニウム又はリン酸塩）の懸濁液；又は抗原溶液を鉱油に乳化した油中水型エマルション（例えばフロイント不完全アジュバント）、場合によっては抗原性を更に高めるために死滅マイコバクテリアを加えた油中水型エマルション（フロイント完全アジュバント）を含み得る。免疫賦活オリゴヌクレオチド（例えばＣｐＧモチーフを含むもの）もアジュバントとして使用することができる（例えば米国特許第６，１９４，３８８号、同第６，２０７，６４６号、同第６，２１４，８０６号、同第６，２１８，３７１号、同第６，２３９，１１６号、同第６，３３９，０６８号、同第６，４０６，７０５号及び同第６，４２９，１９９号を参照されたい）。アジュバントは脂質及び共刺激分子等の生体分子も含む。例示的な生物学的アジュバントとしては、ＡＳ０４（Didierlaurent, A.M. et al, J. Immunol., 2009, 183: 6186-6197）、ＩＬ−２、ＲＡＮＴＥＳ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、Ｇ−ＣＳＦ、ＬＦＡ−３、ＣＤ７２、Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＯＸ−４０Ｌ及び４１ ＢＢＬが挙げられる。
投与する：本明細書で使用される場合、組成物を被験体に「投与する」ことは、被験体に組成物を与える、適用する又は被験体を組成物と接触させることを意味する。投与は例えば局所、経口、皮下、筋肉内、腹腔内、静脈内、髄腔内及び皮内等の多数の経路のいずれかによって達成することができる。
抗体：本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は特定の標的抗原への特異的な結合をもたらすのに十分な標準免疫グロブリン配列要素を含むポリペプチドを指す。幾つかの実施形態では、本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は無傷抗体の一部、例えば抗体の抗原結合領域又は可変領域等を含む「抗体フラグメント」（単数又は複数）も指す。「抗体フラグメント」の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖフラグメント；トリアボディ（triabodies）；テトラボディ（tetrabodies）；線形抗体；一本鎖抗体分子；及び抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体に含まれるＣＤＲ含有部分が挙げられる。「抗体フラグメント」という用語が任意の特定の生成様式を意味せず、それに限定されるものではないことが当業者には認識される。抗体フラグメントは無傷抗体の切断、化学合成、組み換え産生等を含むが、これらに限定されない任意の適切な方法論を用いて作製することができる。当該技術分野で既知のように、天然に産生される無傷抗体は、一般に「Ｙ字型」構造と称されるものへと互いに会合する２つの同一の重鎖ポリペプチド（各々約５０ｋＤ）及び２つの同一の軽鎖ポリペプチド（各々約２５ｋＤ）から構成されるおよそ１５０ｋＤの四量体物質である。各々の重鎖は少なくとも４つのドメイン（各々約１１０アミノ酸長）、すなわちアミノ末端可変（ＶＨ）ドメイン（Ｙ構造の先端に位置する）に続く３つの定常ドメイン：ＣＨ１、ＣＨ２及びカルボキシ末端ＣＨ３（Ｙの軸の基部に位置する）から構成される。「スイッチ」として知られる短い領域は重鎖可変領域と定常領域とを接続する。「ヒンジ」はＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインと抗体の残りの部分とを接続する。このヒンジ領域中の２つのジスルフィド結合が２つの重鎖ポリペプチドを互いに接続し、無傷抗体となる。各々の軽鎖は２つのドメイン、すなわち別の「スイッチ」によって互いに隔てられるアミノ末端可変（ＶＬ）ドメインに続くカルボキシ末端定常（ＣＬ）ドメインから構成される。無傷抗体四量体は２つの重鎖−軽鎖二量体から構成されるが、ここで重鎖及び軽鎖が単一のジスルフィド結合によって互いに連結し、２つの他のジスルフィド結合によって重鎖ヒンジ領域が互いに接続されることで二量体が互いに接続され、四量体が形成される。天然に産生される抗体はまた、通例ＣＨ２ドメイン上でグリコシル化される。天然抗体中の各ドメインは、互いに固まって圧縮逆平行βバレルとなる２つのβシート（例えば３本鎖、４本鎖又は５本鎖シート）から形成される「免疫グロブリンフォールド」を特徴とする構造を有する。各々の可変ドメインは、「相補性決定領域」として知られる３つの超可変ループ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）及び４つの幾らか一定の「フレームワーク」領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４）を含有する。天然抗体がフォールディングする場合、ＦＲ領域がドメインに対して構造フレームワークを与えるβシートを形成し、重鎖及び軽鎖の両方のＣＤＲループ領域が、Ｙ構造の先端に位置する単一の超可変抗原結合部位を作り出すように三次元空間でまとめられる。抗体ポリペプチド鎖間のアミノ酸配列比較により、２つの軽鎖（κ及びλ）クラス、幾つかの重鎖（例えばμ、γ、α、ε、δ）クラス及び幾つかの重鎖サブクラス（α１、α２、γ１、γ２、γ３及びγ４）が規定された。抗体クラス（ＩｇＡ（ＩｇＡ１、ＩｇＡ２を含む）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４を含む）、ＩｇＭ）は利用される重鎖配列のクラスに基づいて規定される。本発明の目的上、或る特定の実施形態では、天然抗体に見られるような十分な免疫グロブリンドメイン配列を含む任意のポリペプチド又はポリペプチドの複合体を、かかるポリペプチドが天然に産生される（例えば、抗原に対して反応する生物によって生成される）か、又は組み換え操作、化学合成、若しくは他の人工系若しくは方法論によって作製されるかに関わらず「抗体」と称し、及び／又は「抗体」として使用することができる。幾つかの実施形態では、抗体はモノクローナルであり、幾つかの実施形態では、抗体はポリクローナルである。幾つかの実施形態では、抗体はマウス、ウサギ、霊長類又はヒト抗体に特徴的な定常領域配列を有する。幾つかの実施形態では、当該技術分野で既知のように抗体配列要素はヒト化、霊長類化（primatized）、キメラ等である。さらに、「抗体」という用語は本明細書で使用される場合、（他に指定がないか又は文脈から明らかでない限り）代替的な提示で抗体の構造的及び機能的特徴を捕捉するために当該技術分野で既知の又は開発される構築物又はフォーマットのいずれかを包含し、適切な実施形態においてそれらを指す場合があることが理解される。例えば幾つかの実施形態では、該用語は二重特異性又は他の多重特異性（例えばｚｙｂｏｄｉｅｓ等）抗体、Ｓｍａｌｌ Ｍｏｄｕｌａｒ ＩｍｍｕｎｏＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ（「ＳＭＩＰ（商標）」）、一本鎖抗体、ラクダ科抗体及び／又は抗体フラグメントを指す場合がある。幾つかの実施形態では、抗体は天然に産生される場合にそれが有し得る共有結合修飾（例えばグリカンの付着）を欠いていてもよい。幾つかの実施形態では、抗体は共有結合修飾（例えばグリカンの付着、ペイロード（payload）（例えば検出可能部分、治療的部分、触媒部分等）又は他のペンダント基（例えばポリ−エチレングリコール等））を含有していてもよい。
抗原：本明細書で使用される場合、「抗原」という用語は、免疫応答を誘発する作用物質；及び／又は（ｉｉ）生物に曝露又は投与した場合にＴ細胞受容体（例えばＭＨＣ分子によって提示される場合）又は抗体（例えばＢ細胞によって産生される）が結合する作用物質を指す。幾つかの実施形態では、抗原は生物において液性応答（例えば抗原特異的抗体の産生を含む）を誘発し、代替的又は付加的に、幾つかの実施形態では、抗原は生物において細胞応答（例えば受容体が抗原と特異的に相互作用するＴ細胞を伴う）を誘発する。特定の抗原が標的生物（例えばマウス、ウサギ、霊長類、ヒト）の１つ又は幾つかの成員において免疫応答を誘発するが、標的生物種の全ての成員で誘発するわけではないことが当業者に認識される。幾つかの実施形態では、抗原は免疫応答を標的生物種の成員の少なくとも約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％で誘発する。幾つかの実施形態では、抗原は抗体及び／又はＴ細胞受容体に結合するが、生物において特定の生理的応答を誘導する場合も又は誘導しない場合もある。幾つかの実施形態では、例えばかかる相互作用がｉｎ ｖｉｖｏで生じるか否かに関わらず、抗原はｉｎ ｖｉｔｒｏで抗体及び／又はＴ細胞受容体に結合し得る。幾つかの実施形態では、抗原は異種免疫原によって誘導されるものを含む特定の液性又は細胞性免疫の産物と反応する。開示の組成物及び方法の幾つかの実施形態では、インフルエンザＨＡＨ１Ｎ１タンパク質が抗原である。
およそ：本明細書で使用される場合、「およそ」又は「約」という用語は対象の１つ以上の値に適用される場合、述べられる参照値と同様の値を指す。或る特定の実施形態では、「およそ」又は「約」という用語は、他に指定のない限り又は文脈から明らかでない限りにおいて（かかる数が可能な値の１００％を超える場合を除いて）、述べられる参照値のいずれかの方向で（それを上回る又は下回る）２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％又はそれ以下に含まれる値の範囲を指す。
結合（Binding）：「結合」という用語は本明細書で使用される場合、通例２つ以上の実体の間の非共有的な会合を指すことが理解される。「直接」結合は実体又は部分の間の物理的接触を伴い、間接結合は１つ以上の中間にある実体との物理的接触による物理的な相互作用を伴う。２つ以上の実体の間の結合は、相互作用する実体又は部分を単独で又はより複雑な系の状況で（例えば、共有結合的に又は別の形で担体の実体と会合する及び／又は生物系若しくは細胞内で）研究する場合を含む様々な状況のいずれかで評定することができる。
担体：本明細書で使用される場合、「担体」という用語は組成物ともに投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤又はビヒクルを指す。幾つかの例示的な実施形態では、担体としては、例えば水、及び例えばピーナッツ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油等の石油、動物、植物又は合成起源の油を含む油等の滅菌液体が挙げられ得る。幾つかの実施形態では、担体は１つ以上の固形成分であるか、又はそれらを含む。
併用投与する：本明細書で使用される場合、「併用投与する（"co-administer" and "co-administering"）」は少なくとも２つの異なる最適化インフルエンザＨＡタンパク質の被験体への投与を指す。幾つかの実施形態では、少なくとも２つの最適化インフルエンザＨＡタンパク質は同時に組合せ又はカクテルとして投与することができる。幾つかの実施形態では、第１の最適化インフルエンザＨＡタンパク質及び第２の最適化インフルエンザＨＡタンパク質は順次投与する（例えば、第１の最適化インフルエンザＨＡタンパク質をプライミングワクチンとして投与し、続いて第２の最適化インフルエンザＨＡタンパク質をブースティングワクチンとして投与する）ことができ、この場合、第１の最適化インフルエンザＨＡタンパク質は第２の最適化インフルエンザＨＡタンパク質とは異なる。
コドン最適化（Codon-optimized）：本明細書で使用される場合、「コドン最適化」核酸配列は、核酸配列の翻訳及び得られるタンパク質の発現が特定の発現系について改善され、最適化されるように変更された核酸配列を指す。「コドン最適化」核酸配列は、「コドン最適化」核酸配列がベースとする非最適化親配列と同じタンパク質をコードする。例えば、核酸配列は哺乳動物細胞（例えばＣＨＯ細胞、ヒト細胞、マウス細胞等）、細菌細胞（例えば大腸菌（E. coli））、昆虫細胞、酵母細胞又は植物細胞における発現について「コドン最適化」することができる。
同等な：「同等な」という用語は本明細書で使用される場合、互いに同一でなくてもよいが、観察される差異又は類似性に基づいて結論を合理的に導き出すことができるようなそれらの間の比較が可能となるほど十分に同様である２つ以上の作用物質、実体、状況、条件等を指す。文脈上、２つ以上のかかる作用物質、実体、状況、条件等を同等であるとみなすためにどの程度の同一性が任意の所与の状況において必要とされるかが当業者には理解される。
決定する：本明細書に記載される多くの方法論は「決定する」工程を含む。当業者は本明細書を読むことで、かかる「決定」に例えば本明細書で明示的に言及される特定の技法を含む当業者が利用可能な様々な技法のいずれを利用してもよいことを認識する。幾つかの実施形態では、決定は物理的なサンプルの操作を含む。幾つかの実施形態では、決定は例えば関連分析を行うのに適したコンピュータ又は他のプロセシングユニットを利用するデータ又は情報の考察及び／又は操作を含む。幾つかの実施形態では、決定は供給源から関連情報及び／又は材料を受け取ることを含む。幾つかの実施形態では、決定はサンプル又は実体の１つ以上の特徴を同等な参照と比較することを含む。
エピトープ：本明細書で使用される場合、「エピトープ」という用語は、全体的又は部分的に免疫グロブリン（例えば抗体又は受容体）結合成分によって特異的に認識される任意の部分を含む。幾つかの実施形態では、エピトープは抗原上の複数の化学原子又は基から構成される。幾つかの実施形態では、かかる化学原子又は基は抗原が関連三次元立体構造をとる場合に表面に露出する。幾つかの実施形態では、かかる化学原子又は基は抗原がかかる立体構造をとる場合に空間内で互いに物理的に近い。幾つかの実施形態では、少なくとも幾つかのかかる化学原子は抗原が代替的な立体構造をとる（例えば線形化する）場合に互いに物理的に隔てられた基である。
賦形剤：本明細書で使用される場合、「賦形剤」という用語は、例えば所望の粘稠度又は安定化効果をもたらす又はそれに寄与する、医薬組成物中に含まれ得る非治療剤を指す。好適な医薬賦形剤としては、例えばデンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノール等が挙げられる。
発現：「発現」という用語は、本明細書で核酸に関して使用される場合、以下の事象の１つ又は複数を指す：（１）ＤＮＡ鋳型のＲＮＡ転写産物の（例えば転写による）産生；（２）ＲＮＡ転写産物の（例えばスプライシング、編集、５’キャップ形成及び／又は３’末端形成による）プロセシング；（３）ＲＮＡのポリペプチドへの翻訳；及び／又は（４）ポリペプチドの翻訳後修飾。
融合タンパク質：本明細書で使用される場合、「融合タンパク質」という用語は、２つの異なる（例えば異種）タンパク質の少なくとも一部をコードする核酸配列から操作される核酸配列によってコードされるタンパク質を指す。当業者にはもちろん知られているように、融合タンパク質を作り出すために、得られる読み（reading）が内部終止コドンを含有しないように核酸配列を接合する。幾つかの実施形態では、本明細書に記載される融合タンパク質はインフルエンザＨＡポリペプチド又はそのフラグメントを含む。
Ｈ１Ｎ１ ＨＡポリペプチド：「Ｈ１Ｎ１ ＨＡポリペプチド」は、該用語が本明細書で使用される場合、アミノ酸配列がＨ１Ｎ１に特徴的であり、Ｈ１Ｎ１と他のＨＡ亜型とを区別する少なくとも１つの配列要素を含むＨＡポリペプチドである。代表的な配列要素はアラインメントによって決定することができる。
宿主：「宿主」という用語は、対象のポリペプチドが存在する系（例えば細胞、生物等）を指すために本明細書で使用される。幾つかの実施形態では、宿主は特定の感染因子による感染の影響を受けやすい系である。幾つかの実施形態では、宿主は対象の特定のポリペプチドを発現する系である。
宿主細胞：本明細書で使用される場合、「宿主細胞」という語句は外因性ＤＮＡを（組み換え又は別の方法で）導入した細胞を指す。例えば、宿主細胞は本明細書に記載される最適化インフルエンザヘマグルチニンポリペプチドを標準組み換え技法によって作製するために使用することができる。当業者は本開示を読むことで、かかる用語が特定の被験体細胞だけでなく、かかる細胞の子孫を指すことを理解する。その後の生成において突然変異又は環境影響のために幾つかの修飾が行われる場合があるため、かかる子孫は実際に親細胞と同一でない場合もあるが、依然として本明細書で使用される「宿主細胞」という用語の範囲に含まれる。幾つかの実施形態では、宿主細胞は外因性ＤＮＡ（例えば組み換え核酸配列）を発現するのに好適な任意の原核及び真核細胞を含む。細胞の例としては、原核生物及び真核生物の細胞（単細胞又は多細胞）、細菌細胞（例えば大腸菌、バチルス属の一種、ストレプトミセス属の一種の株等）、マイコバクテリア細胞、真菌細胞、酵母細胞（例えばＳ．セレビシエ（S. cerevisiae）、Ｓ．ポンベ（S. pombe）、Ｐ．パストリス（P. pastoris）、Ｐ．メタノリカ（P. methanolica）等）、植物細胞、昆虫細胞（例えばＳＦ−９、ＳＦ−２１、バキュロウイルスに感染した昆虫細胞、トリコプルシア・ニ（Trichoplusia ni：イラクサギンウワバ）等）、非ヒト動物細胞、ヒト細胞、又は例えばハイブリドーマ若しくはクアドローマ等の細胞融合体が挙げられる。幾つかの実施形態では、細胞はヒト、サル、類人猿、ハムスター、ラット又はマウスの細胞である。幾つかの実施形態では、細胞は真核細胞であり、下記の細胞から選択される：ＣＨＯ（例えばＣＨＯ Ｋ１、ＤＸＢ−１１ ＣＨＯ、Ｖｅｇｇｉｅ−ＣＨＯ）、ＣＯＳ（例えばＣＯＳ−７）、網膜細胞、Ｖｅｒｏ、ＣＶ１、腎臓（例えばＨＥＫ２９３、２９３ ＥＢＮＡ、ＭＳＲ ２９３、ＭＤＣＫ、ＨａＫ、ＢＨＫ）、ＨｅＬａ、ＨｅｐＧ２、ＷＩ３８、ＭＲＣ ５、Ｃｏｌｏ２０５、ＨＢ ８０６５、ＨＬ−６０（例えば、ＢＨＫ２１）、Ｊｕｒｋａｔ、Ｄａｕｄｉ、Ａ４３１（表皮）、ＣＶ−１、Ｕ９３７、３Ｔ３、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、ＳＰ２／０、ＮＳ−０、ＭＭＴ ０６０５６２、セルトリ細胞、ＢＲＬ ３Ａ細胞、ＨＴ１０８０細胞、骨髄腫細胞、腫瘍細胞、及び上述の細胞由来の細胞株。幾つかの実施形態では、細胞は１つ以上のウイルス遺伝子、例えばウイルス遺伝子を発現する網膜細胞（例えばＰＥＲ．Ｃ６（商標）細胞）を含む。
免疫応答：本明細書で使用される場合、「免疫応答」という用語は抗原又はワクチン等の刺激に対するＢ細胞、Ｔ細胞、樹状細胞、マクロファージ又は多核球等の免疫系の細胞の応答を指す。免疫応答は、例えばインターフェロン又はサイトカインを分泌する上皮細胞を含む宿主防御応答に関与する任意の体細胞を含み得る。免疫応答は先天性及び／又は適応免疫応答を含むが、これらに限定されない。本明細書で使用される場合、防御免疫応答は被験体を感染から保護する（感染を予防するか、又は感染と関連する疾患の発症を予防する）免疫応答を指す。免疫応答を測定する方法は当該技術分野で既知であり、例えばリンパ球（Ｂ細胞又はＴ細胞等）の増殖及び／又は活性、サイトカイン又はケモカインの分泌、炎症、抗体産生等を測定することを含む。
免疫原：本明細書で使用される場合、「免疫原」という用語は動物に注射する又は吸収させる組成物を含む、動物において適切な条件下で抗体の産生又はＴ細胞応答等の免疫応答を刺激することが可能な化合物、組成物又は物質を指す。本明細書で使用される場合、「免疫原性組成物」は免疫原（ＨＡポリペプチド等）を含む投与可能な組成物である。「免疫原性組成物」としては、例えばワクチンが挙げられる。本明細書で使用される場合、「免疫化する」は例えばワクチン接種によって被験体を感染性疾患から保護されるようにすることを意味する。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ：本明細書で使用される場合、「ｉｎ ｖｉｔｒｏ」という用語は、多細胞生物内ではなく人工環境、例えば試験管又は反応器、細胞培養物等において生じる事象を指す。
ｉｎ ｖｉｖｏ：本明細書で使用される場合、「ｉｎ ｖｉｖｏ」という用語は、ヒト及び非ヒト動物等の多細胞生物内で生じる事象を指す。細胞ベースの系との関連では、該用語は（例えばｉｎ ｖｉｔｒｏ系とは対照的に）生細胞内で生じる事象を指すために使用することができる。
インフルエンザワクチン：本明細書で使用される場合、「インフルエンザワクチン」又は「ワクチン」という用語はインフルエンザウイルス感染の予防法、予防、改善又は治療のために投与される、免疫応答を刺激することが可能な免疫原性組成物を指す。インフルエンザワクチンは、例えば弱毒化又は死滅インフルエンザウイルス、そのサブユニット調製物（すなわち、スプリット不活化ワクチン）、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）及び／又は抗原性ポリペプチド（例えば、本明細書に記載されるコンピュータ最適化ヘマグルチニン）、又はそれらに由来するＤＮＡ、又はかかる免疫原性材料の任意の組み換え型を含み得る。本明細書に記載されるインフルエンザワクチンは任意に１つ以上のアジュバントを含有していてもよい。
単離された：本明細書で使用される場合、「単離された」という用語は、（１）初めに（天然で及び／又は実験状況において）作製された時点で会合していた成分の少なくとも一部から分離された、及び／又は（２）人の手で設計、作製、調製及び／又は製造された物質及び／又は実体を指す。単離物質及び／又は実体は、初めに会合した他の成分の約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、又は約９９％超から分離することができる。幾つかの実施形態では、単離因子は約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、又は約９９％超純粋である。本明細書で使用される場合、物質は実質的に他の成分を含まない場合に「純粋」である。幾つかの実施形態では、当業者に理解されるように、物質は或る特定の他の成分、例えば１つ以上の担体又は賦形剤（例えば緩衝剤、溶媒、水等）と組み合わせた後であっても「単離された」又は更には「純粋」であるとみなすことができる。かかる実施形態では、物質の単離率又は純度は、かかる担体又は賦形剤を含まずに算出される。一例を挙げると、幾つかの実施形態では、天然に生じるポリペプチド又はポリヌクレオチド等の生体高分子は、ａ）その起源又は誘導源がその自然状態で天然にそれに伴う成分の一部又は全てと関連しない；ｂ）それを天然に産生する種と同じ種の他のポリペプチド又は核酸を実質的に含まない；ｃ）それを天然に産生する種のものではない細胞又は他の発現系に由来する成分によって発現される、又はそれと別の形で関連している場合に「単離された」とみなされる。このため、例えば幾つかの実施形態では、化学的に合成されるか、又はそれを天然に産生するものとは異なる細胞系において合成されるポリペプチドは「単離」ポリペプチドとみなされる。代替的又は付加的に、幾つかの実施形態では、１つ以上の精製法に供されたポリペプチドは、ａ）それが天然に会合する；及び／又はｂ）初めに作製された時点でそれが会合していた他の成分から分離されている限りにおいて「単離」ポリペプチドとみなすことができる。
核酸：本明細書で使用される場合、「核酸」という語句はその最も広い意味で、オリゴヌクレオチド鎖に組み込まれる又は組み込むことができる任意の化合物及び／又は物質を指す。幾つかの実施形態では、核酸はホスホジエステル結合によってオリゴヌクレオチド鎖に組み込まれる又は組み込むことができる化合物及び／又は物質である。文脈から明らかなように、幾つかの実施形態では、「核酸」は個々の核酸残基（例えばヌクレオチド及び／又はヌクレオシド）を指し、幾つかの実施形態では、「核酸」は個々の核酸残基を含むオリゴヌクレオチド鎖を指す。幾つかの実施形態では、「核酸」はＲＮＡであるか又はそれを含み、幾つかの実施形態では、「核酸」はＤＮＡであるか又はそれを含む。幾つかの実施形態では、核酸は１つ以上の天然核酸残基であるか、それを含むか又はそれからなる。幾つかの実施形態では、核酸は１つ以上の核酸類似体であるか、それを含むか又はそれからなる。幾つかの実施形態では、核酸類似体はホスホジエステル骨格を利用しないという点で核酸とは異なる。例えば幾つかの実施形態では、核酸は当該技術分野で既知であり、骨格中にホスホジエステル結合の代わりにペプチド結合を有する１つ以上の「ペプチド核酸」であるか、それを含むか又はそれからなり、本発明の範囲内であるとみなされる。代替的又は付加的に、幾つかの実施形態では、核酸はホスホジエステル結合ではなく１つ以上のホスホロチオエート及び／又は５’−Ｎ−ホスホロアミダイト連結を有する。幾つかの実施形態では、核酸は１つ以上の天然ヌクレオシド（例えばアデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシン及びデオキシシチジン）であるか、それらを含むか、又はそれらからなる。幾つかの実施形態では、核酸は１つ以上のヌクレオシド類似体（例えば２−アミノアデノシン、２−チオチミジン、イノシン、ピロロ−ピリミジン、３−メチルアデノシン、５−メチルシチジン、Ｃ−５ プロピニル−シチジン、Ｃ−５ プロピニル−ウリジン、２−アミノアデノシン、Ｃ５−ブロモウリジン、Ｃ５−フルオロウリジン、Ｃ５−ヨードウリジン、Ｃ５−プロピニル−ウリジン、Ｃ５−プロピニル−シチジン、Ｃ５−メチルシチジン、２−アミノアデノシン、７−デアザアデノシン、７−デアザグアノシン、８−オキソアデノシン、８−オキソグアノシン、Ｏ（６）−メチルグアニン、２−チオシチジン、メチル化塩基、挿入塩基、及びそれらの組合せ）であるか、それらを含むか、又はそれらからなる。幾つかの実施形態では、核酸は天然核酸中のものと比較して１つ以上の修飾糖（例えば２’−フルオロリボース、リボース、２’−デオキシリボース、アラビノース及びヘキソース）を含む。幾つかの実施形態では、核酸はＲＮＡ又はタンパク質等の機能的遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を有する。幾つかの実施形態では、核酸は１つ以上のイントロンを含む。幾つかの実施形態では、核酸は天然供給源からの単離、相補的な鋳型をベースとした重合による酵素合成（ｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏ）、組み換え細胞又は系における複製、及び化学合成の１つ以上によって調製される。幾つかの実施形態では、核酸は少なくとも３残基長、４残基長、５残基長、６残基長、７残基長、８残基長、９残基長、１０残基長、１５残基長、２０残基長、２５残基長、３０残基長、３５残基長、４０残基長、４５残基長、５０残基長、５５残基長、６０残基長、６５残基長、７０残基長、７５残基長、８０残基長、８５残基長、９０残基長、９５残基長、１００残基長、１１０残基長、１２０残基長、１３０残基長、１４０残基長、１５０残基長、１６０残基長、１７０残基長、１８０残基長、１９０残基長、２０残基長、２２５残基長、２５０残基長、２７５残基長、３００残基長、３２５残基長、３５０残基長、３７５残基長、４００残基長、４２５残基長、４５０残基長、４７５残基長、５００残基長、６００残基長、７００残基長、８００残基長、９００残基長、１０００残基長、１５００残基長、２０００残基長、２５００残基長、３０００残基長、３５００残基長、４０００残基長、４５００残基長、５０００残基長又はそれ以上である。幾つかの実施形態では、核酸は一本鎖であり、幾つかの実施形態では、核酸は二本鎖である。幾つかの実施形態では核酸は、ポリペプチドをコードするか又はポリペプチドをコードする配列の相補体である少なくとも１つの要素を含むヌクレオチド配列を有する。幾つかの実施形態では、核酸は酵素活性を有する。
最適化インフルエンザＨＡタンパク質：本明細書で使用される場合、「最適化インフルエンザＨＡタンパク質」、「最適化Ｈ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチド」又は「コンピュータ最適化」は、ヒトＨ１Ｎ１インフルエンザウイルス分離株又はヒト及びブタＨ１Ｎ１インフルエンザウイルス分離株の配列アラインメントによって生成された非自然発生ＨＡタンパク質コンセンサス配列を指す（例えばRoss, T.M. et al.に対する国際公開第２０１３／１４８１６４号及び米国特許出願公開第２０１４／０１４７４５９号（その全体が引用することにより本明細書の一部をなす）に記載される）。最適化ＨＡタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、（例えばＲＮＡ安定性を増大するために）コドン最適化及びＲＮＡ最適化により哺乳動物細胞における発現について更に最適化される。本明細書に開示される最適化インフルエンザＨＡタンパク質（配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号４として本明細書に規定される）は、「ＣＯＢＲＡ」（computationally-optimized broadly reactive antigen；コンピュータ最適化広反応性抗原）配列とも称される。最適化ＨＡポリペプチドは被験体において広反応性免疫応答を誘発するように設計される。それらのアミノ酸配列はヒトによって設計され、及び／又はそれらの存在及び産生はヒトの行為を必要とする。例えば、本明細書に記載されるコンピュータ最適化ＨＡポリペプチドは、天然のインフルエンザ分離株中に見られるＨＡポリペプチドのアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有する。本開示において、「広反応性」はタンパク質配列が被験体において広範なＨ１Ｎ１インフルエンザウイルス（例えば、特定の亜型の殆ど又は全てのインフルエンザウイルス）の感染を阻害、中和又は予防するのに十分な免疫応答を誘発することを意味する。最適化Ｈ１Ｎ１インフルエンザＨＡタンパク質の併用投与により、パンデミック及び季節性Ｈ１Ｎ１インフルエンザ株の両方に対して防御免疫応答等の免疫応答を誘発することが可能である。
操作可能に連結した：本明細書で使用される場合、「操作可能に連結した」という語句は、記載の成分が意図される様式で機能することを可能にする関係の並置を指す。コード配列に「操作可能に連結した」制御配列は、コード配列の発現が制御配列に適合する条件下で達成されるようにライゲートする。「操作可能に連結した」配列は対象の遺伝子に隣接した発現制御配列、及び対象の遺伝子を制御するようにトランスで又は離れて作用する発現制御配列の両方を含む。「発現制御配列」という用語は本明細書で使用される場合、ライゲートするコード配列の発現及びプロセシングを達成するために必要とされるポリヌクレオチド配列を指す。発現制御配列は適切な転写開始、終結、プロモーター及びエンハンサー配列；スプライシング及びポリアデニル化シグナル等の効率的なＲＮＡプロセシングシグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化する配列；翻訳効率を高める配列（すなわちコザックコンセンサス配列）；タンパク質安定性を高める配列；並びに所望に応じて、タンパク質分泌を高める配列を含む。かかる制御配列の性質は宿主生物に応じて異なる。例えば原核生物では、かかる制御配列は概してプロモーター、リボソーム結合部位及び転写終結配列を含むが、真核生物では通例、かかる制御配列はプロモーター及び転写終結配列を含む。「制御配列」という用語は、その存在が発現及びプロセシングに不可欠な成分を含むことを意図し、その存在が有利である付加的な成分、例えばリーダー配列及び融合パートナー配列を含んでいてもよい。
流行：本明細書で使用される場合、インフルエンザウイルスの「流行」は所与の年の単一国内におけるウイルス分離株の集合を指す。
パンデミック株：「パンデミック」インフルエンザ株は、ヒト集団のパンデミック感染を引き起こした又は引き起こす能力を有する株である。幾つかの実施形態では、パンデミック株はパンデミック感染を引き起こしたものである。幾つかの実施形態では、かかるパンデミック感染は複数の地域にわたる流行性感染を含み、幾つかの実施形態では、パンデミック感染は感染が通常移らないような（例えば山、水域によって、別個の大陸の一部として）互いに隔てられた地域にわたる感染を含む。幾つかの実施形態では、パンデミック株はＡ／カリフォルニア／０７／２００９ Ｈ１Ｎ１である。
薬学的に許容可能なビヒクル：本開示において有用な薬学的に許容可能な担体（ビヒクル）は従来のものである。Remington's Pharmaceutical Sciences, by E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 15th Edition (1975)は１つ以上のインフルエンザワクチン等の１つ以上の治療組成物、及び付加的な薬剤の医薬送達に好適な組成物及び配合物を記載している。概して、担体の性質は用いられる特定の投与方法によって決まる。例えば非経口配合物は通常は薬学的及び生理学的に許容可能な流体、例えば水、生理食塩水、平衡塩類溶液、水性デキストロース、グリセロール等をビヒクルとして含む注射用流体を含む。固体組成物（例えば粉末、丸薬、錠剤又はカプセルの形態）については、従来の非毒性の固体担体として、例えば医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン又はステアリン酸マグネシウムを挙げることができる。生物学的に中性の担体に加えて、投与される医薬組成物は少量の非毒性補助物質、例えば湿潤剤又は乳化剤、保存料及びｐＨ緩衝剤等、例えば酢酸ナトリウム又はソルビタンモノラウレートを含有していてもよい。
ポリペプチド：「ポリペプチド」は一般的に、ペプチド結合によって互いに付着した少なくとも２つのアミノ酸の鎖である。幾つかの実施形態では、ポリペプチドは各々が少なくとも１つのペプチド結合によって付着した少なくとも３つ〜５つのアミノ酸を含み得る。ポリペプチドが場合によっては、ポリペプチド鎖へと組み込むことが可能であるかに関わらず「非天然の」アミノ酸又は他の実体を任意に含むことが当業者には認識される。幾つかの実施形態では、「ポリペプチド」という用語は特定のポリペプチドの機能的クラス、例えばＨＡポリペプチド等を指すために使用される。幾つかの実施形態では、有用なポリペプチド（例えば、本明細書に記載されるコンピュータ最適化Ｈ１ ＨＡポリペプチド）は親ポリペプチドのフラグメント（例えばエピトープ）を含むか又はそれからなることができる。幾つかの実施形態では、有用なポリペプチドは対象のポリペプチドがその親ポリペプチドの誘導体であるように、各々が互いに対象のポリペプチド中に見られるものとは異なる空間的配置で同じ親ポリペプチド中に見られる複数（例えば２つ、３つ、４つ等）のフラグメント（例えばエピトープ）を含むか又はそれからなることができる（例えば親ポリペプチドにおいて直接連結しているフラグメントが対象のポリペプチドで空間的に分離していても若しくはその逆であってもよく、及び／又はフラグメントが対象のポリペプチドにおいて親ポリペプチドとは異なる順序で存在していてもよい）。代替的には、幾つかの実施形態では、有用なポリペプチドは対象のポリペプチドがその親ポリペプチドの誘導体であるように、各々が対象のポリペプチドとは異なる親ポリペプチド中に見られる複数（例えば２つ、３つ、４つ等）のフラグメント（例えばエピトープ）を含むか又はそれからなることができる（例えば異なる親ポリペプチドに由来するフラグメント、及び／又はフラグメントが対象のポリペプチドにおいて親ポリペプチドとは異なる順序で存在していてもよい）。
予防：「予防」という用語は本明細書で使用される場合、特定の疾患、障害又は病態（例えばインフルエンザウイルスの感染等）の予防法、疾患の発現の回避、発症の遅延及び／又は１つ以上の症状の頻度及び／又は重症度の低減を指す。幾つかの実施形態では、予防は集団ベースで評定され、疾患、障害又は病態の１つ以上の症状の発症、頻度及び／又は強度の統計的に有意な減少が疾患、障害又は病態の影響を受けやすい集団において観察される場合に作用物質は特定の疾患、障害又は病態を「予防する」とみなされる。
純粋：本明細書で使用される場合、作用物質又は実体は実質的に他の成分を含まない場合に「純粋」である。例えば、約９０％を超える特定の作用物質又は実体を含有する調製物は通例、純粋な調製物とみなされる。幾つかの実施形態では、作用物質又は実体は少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％純粋である。
組み換え：本明細書で使用される場合、「組み換え」という用語は、組み換え手段によって設計、操作、調製、発現、創出又は単離されるポリペプチド（例えば、本明細書に記載されるようなＨＡポリペプチド）、例えば宿主細胞にトランスフェクトした組み換え発現ベクターを用いて発現されたポリペプチド、組み換えコンビナトリアルポリペプチドライブラリーから単離されたポリペプチド、又は選択配列要素を互いにスプライシングすることを含む任意の他の手段によって調製、発現、創出若しくは単離されたポリペプチドを指すことを意図したものである。幾つかの実施形態では、かかる選択配列要素の１つ以上が天然に見られる。幾つかの実施形態では、かかる選択配列要素の１つ以上がコンピュータによって設計される。幾つかの実施形態では、１つ以上のかかる選択配列要素は、例えば天然又は合成供給源に由来する既知の配列要素の突然変異誘発（例えばｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏ）によって生じる。幾つかの実施形態では、１つ以上のかかる選択配列要素は同じポリペプチド中に天然では存在しない複数（例えば２つ以上）の既知の配列要素（例えば、２つの別個のＨ１ ＨＡポリペプチドの２つのエピトープ）の組合せによって生じる。
参照：「参照」という用語は多くの場合、対象の作用物質、個体、集団、サンプル、配列又は値が比較される標準又は対照作用物質、個体、集団、サンプル、配列又は値を記載するために本明細書で使用される。幾つかの実施形態では、参照作用物質、個体、集団、サンプル、配列又は値は対象の作用物質、個体、集団、サンプル、配列又は値の試験又は決定と実質的に同時に試験及び／又は決定される。幾つかの実施形態では、参照作用物質、個体、集団、サンプル、配列又は値は任意に有形媒体に具現化された歴史的参照である。通例、当業者に理解されるように、参照作用物質、個体、集団、サンプル、配列又は値は、対象の作用物質、個体、集団、サンプル、配列又は値の決定又は特性化に利用されるものと同等な条件下で決定又は特性化される。
季節性株：「季節性」インフルエンザ株はヒト集団の季節性感染（例えば毎年の流行）を引き起こした又は引き起こす能力を有する株である。幾つかの実施形態では、季節性株は季節性感染を引き起こしたものである。
配列同一性：アミノ酸又は核酸配列間の類似性は、他に配列同一性と称される配列間の類似性に関して表される。配列同一性は同一性（又は類似性若しくは相同性）パーセンテージに関して測定されることが多く、パーセンテージがより高いほど、２つの配列はより同様である。所与の遺伝子又はタンパク質の相同体又は変異体は標準方法を用いてアラインメントした場合に比較的高度の配列同一性を有する。比較のための配列アラインメントの方法は当該技術分野で既知である。様々なプログラム及びアラインメントアルゴリズムが、Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482, 1981、Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970、Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2444, 1988、Higgins and Sharp, Gene 73:237-244, 1988、Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-153, 1989、Corpet et al., Nucleic Acids Research 16:10881-10890, 1988、及びPearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2444, 1988、Altschul et al., Nature Genet. 6:119-129, 1994に記載されている。配列分析プログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ及びｔｂｌａｓｔｘに関連して用いられるＮＣＢＩのＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ（商標））（Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990）が国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ、Bethesda，Md.）を含む幾つかの供給源から、またインターネットで利用可能である。
被験体：本明細書で使用される場合、「被験体」という用語はマウス、フェレット及びヒトを含む任意の哺乳動物を意味する。本発明の或る特定の実施形態では、被験体は成人、青年又は幼児である。幾つかの実施形態では、「個体」又は「患者」という用語が使用され、「被験体」と置き替え可能であることを意図する。ブタに対する最適化Ｈ１Ｎ１インフルエンザＨＡタンパク質の併用投与及び／又は方法の実行も本発明によって企図される。
実質的に：本明細書で使用される場合、「実質的に」という用語は、対象の特徴又は特性の完全な又はほぼ完全な程度又は度合いを示す定性的状態を指す。生物学分野の当業者には、生物学的及び化学的現象が完了する及び／又は完全に進行する、又は絶対的な結果が達成若しくは回避されることが稀であることが理解される。したがって、「実質的に」という用語は、多くの生物学的及び化学的現象に特有の完全性の潜在的欠如を含めるために本明細書で使用される。
形質転換：本明細書で使用される場合、外因性ＤＮＡを宿主細胞に導入する任意のプロセスを指す。形質転換は、天然又は人工条件下にて当該技術分野で既知の様々な方法を用いて行うことができる。形質転換は、外来核酸配列を原核又は真核宿主細胞に挿入する任意の既知の方法に基づく場合がある。幾つかの実施形態では、特定の形質転換方法論が形質転換される宿主細胞に基づいて選択され、これにはウイルス感染、エレクトロポレーション、接合（mating）、リポフェクションを挙げることができるが、これらに限定されない。幾つかの実施形態では、「形質転換」細胞は、挿入されたＤＮＡが自己複製プラスミドとして又は宿主染色体の一部として複製可能であるという点で安定に形質転換される。幾つかの実施形態では、形質転換細胞は導入された核酸を一定期間にわたって一過性に発現する。
ワクチン接種：本明細書で使用される場合、「ワクチン接種」という用語は、例えばインフルエンザ等の病原体に対する免疫応答を生成することを意図した組成物の投与（具体的には、本明細書に開示されるコンピュータ最適化Ｈ１Ｎ１ ＨＡポリペプチドの２つ以上の併用投与）を指す。ワクチン接種は病原体への曝露及び／又は１つ以上の症状の発現の前、その最中及び／又はその後、また幾つかの実施形態では、作用物質への曝露の前、その最中及び／又はその直後に行うことができる。ワクチンは予防的（prophylactic (preventative)）及び治療的応答の両方を誘発することができる。投与方法はワクチンに応じて異なるが、接種、摂取、吸入又は他の投与形態を含み得る。接種は非経口、例えば静脈内、皮下又は筋肉内を含む多数の経路のいずれかによって与えることができる。ワクチンは免疫応答をブーストするアジュバントとともに投与してもよい。幾つかの実施形態では、ワクチン接種は適切に間隔を空けたワクチン接種組成物の複数回投与を含む。
ベクター：本明細書で使用される場合、「ベクター」という用語は、連結した別の核酸を輸送することが可能な核酸分子を指す。ベクターの一種は、付加的なＤＮＡ断片がライゲートすることができる環状二本鎖ＤＮＡループを指す「プラスミド」である。別の種類のベクターはウイルスベクターであり、付加的なＤＮＡ断片がウイルスゲノムにライゲートすることができる。或る特定のベクターは、導入された宿主細胞における自己複製が可能である（例えば、細菌複製起点を含む細菌ベクター及びエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに組み込むことにより、宿主ゲノムとともに複製することができる。さらに、或る特定のベクターは操作可能に連結した遺伝子の発現を指示することが可能である。かかるベクターは本明細書で「発現ベクター」と称される。
ウイルス様粒子（ＶＬＰ）：本明細書で使用される場合、「ウイルス様粒子」又は「ＶＬＰ」という語句は、ウイルスに似ているが任意のウイルス遺伝子物質を欠くため、感染性ではない粒子を指す。「ウイルス様粒子」又は「ＶＬＰ」は哺乳動物細胞系、昆虫細胞株、酵母及び植物細胞を含む様々な細胞培養系における異種発現によって作製することができる。加えて、ＶＬＰは当該技術分野で既知の方法によって精製することができる。幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるインフルエンザＶＬＰはヘマグルチニン（ＨＡ）ポリペプチド及びノイラミニダーゼ（ＮＡ）ポリペプチドを含む。幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるインフルエンザＶＬＰはＨＡポリペプチド、ＮＡポリペプチド及び／又はウイルス構造ポリペプチド（例えば、インフルエンザＭ１等のインフルエンザ構造タンパク質）を含む。幾つかの或る特定の実施形態では、本明細書に記載されるインフルエンザＶＬＰはＨＡポリペプチド、ＮＡポリペプチド及び／又はＭ１ポリペプチドを含む。幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるインフルエンザＶＬＰはＨＡポリペプチド、ＮＡポリペプチド及び／又はＨＩＶ ｇａｇポリペプチドを含む。当業者が知っているように、他のウイルス構造タンパク質を本明細書で例示されるものの代替手段として用いてもよい。インフルエンザＶＬＰは、ＨＡ及びＮＡタンパク質、任意にＨＩＶ ｇａｇタンパク質をコードするプラスミドによる宿主細胞（例えば哺乳動物細胞）のトランスフェクションによって作製することができる。タンパク質発現を可能とする適切な時間（例えばおよそ７２時間）にわたるトランスフェクト細胞のインキュベーション後に、ＶＬＰを細胞培養上清から単離することができる。幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるインフルエンザＶＬＰは、哺乳動物細胞（例えばヒト細胞）における一過性トランスフェクションによって作製される。幾つかの実施形態では、インフルエンザＶＬＰは１つ以上のアッセイを用いて分析される。幾つか例を挙げると、インフルエンザＶＬＰはヘマグルチニン活性、動的光散乱及びヘマグルチニン含量定量化についてタンパク質染色によって分析することができる。他のアッセイが本開示を検討することで当業者に容易に明らかである。
或る特定の実施形態の詳細な説明
標準的な技法を組み換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、並びに組織培養及び形質転換に使用することができる（例えばエレクトロポレーション、リポフェクション）。酵素反応及び精製法は製造業者の仕様書に従って、又は当該技術分野で一般に達成されるように、又は本明細書に記載されるように行うことができる。上述の技法及び手順は概して当該技術分野で既知の従来の方法に従って、本明細書全体にわたって引用及び論考される様々な一般参照文献及びより具体的な参照文献に記載されるように行うことができる。例えば、Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)）（あらゆる目的で引用することにより本明細書の一部をなす）を参照されたい。
Ｈ１Ｎ１ヘマグルチニンコンピュータ最適化広反応性抗原（ＣＯＢＲＡ）の併用投与
Ａ型インフルエンザウイルスはオルトミクソウイルス科に属する。Ａ型インフルエンザウイルスは、それらのヘマグルチニン（ＨＡ）及びノイラミニダーゼ（ＮＡ）タンパク質に基づいて１６種のＨＡ亜型（Ｈ１〜Ｈ１６）及び９種のＮＡ亜型（Ｎ１〜Ｎ９）に分類される。ＨＡタンパク質は、細胞受容体へのウイルスの結合及びウイルスとエンドソーム膜との融合の媒介において重要な役割を果たす。ＮＡタンパク質は、シアル酸を細胞タンパク質並びにウイルスＨＡ及びＮＡタンパク質から除去することによって感染細胞からのウイルスの放出を促進する。インフルエンザの主要抗原、特にＨＡのアミノ酸配列は、抗原ドリフト及びそれほど頻繁ではないが抗原シフトのために群、亜型及び株間で非常に多様性がある。季節性株及びパンデミック株の両方を含む広範なＨ１Ｎ１インフルエンザ株に対する普遍的な広反応性の防御殺菌免疫（protective sterilizing immunity）を生じさせることによってＨ１Ｎ１抗原的多様性の問題を克服するインフルエンザワクチンが本明細書に開示される。
本明細書に開示される実施形態は、コンピュータ最適化広反応性抗原（ＣＯＢＲＡ）と称される複数回のコンセンサス生成を用いた抗原設計の方法論に基づく。この方法はＨ１Ｎ１ ＨＡ内の多様性に対処するために設計され、この抗原的に多様なポリペプチドにおいて抗体応答の幅の増大を誘発する可能性を有するワクチンを生成する世界的な監視努力を用いたものである。幾つかのＨ１Ｎ１ ＨＡコンピュータ最適化抗原（ＣＯＢＲＡ）が１）１９３３年〜２０１１年のヒト及びブタインフルエンザ株（Ｐ１）、２）１９９９年〜２０１２年のヒトインフルエンザ株（Ｘ６）、３）１９７８年〜２００８年のヒトインフルエンザ株（Ｘ３）、及び４）１９１８年〜２０１２年のヒトインフルエンザ株を含む１９１８年〜２０１２年に単離された選択Ｈ１Ｎ１ウイルスに基づいて設計されている。
季節性及びパンデミックＨ１Ｎ１株の両方を含む異なるＨ１Ｎ１インフルエンザ株に対する被験体における抗体応答の幅を拡大するＨ１Ｎ１ ＣＯＢＲＡ ＨＡの併用投与が本明細書で提供される。本発明の併用投与はＨ１Ｎ１ ＣＯＢＲＡ ＨＡタンパク質の新規の組合せ又はカクテル、並びにＨ１Ｎ１ ＣＯＢＲＡ ＨＡタンパク質のプライム−ブースト投与を含む。
本明細書に記載される組成物は、自然発生株と一致しないＨ１Ｎ１亜型の最適化ヘマグルチニン分子の組合せ又はカクテルを含む。組合せでは、これらの分子は自然発生Ｈ１Ｎ１株（季節性及びパンデミックの両方）に対して、いずれかの分子が個別にもたらすことができるよりも広いカバレージをもたらすように相乗的に作用する。本明細書に記載される組合せ／カクテルの相乗効果は実験的に検証可能である。例えば添付の実施例に記載されるように、ＣＯＢＲＡ ＨＡタンパク質の各々をウイルス様粒子（ＶＬＰ）上で発現させ、ワクチン免疫原として精製した。Ｈ１Ｎ１ ＣＯＢＲＡ ＨＡ ＶＬＰのカクテルをマウスに投与し、数十年にわたるインフルエンザ株のパネルに対する液性免疫応答を測定した。或る特定の季節性Ｈ１Ｎ１ ＣＯＢＲＡ ＨＡ ＶＬＰの併用投与は或る特定のインフルエンザ株の抗体応答に対して拮抗作用を有していた。カクテルへのパンデミックＨ１Ｎ１ ＣＯＢＲＡ ＶＬＰの添加により、パンデミックインフルエンザ株に対する強い抗体応答が誘発されただけでなく、驚くべきことに試験された季節性インフルエンザ株に対する抗体応答の幅が拡大された。プライム−ブーストレジメンにおけるＨ１Ｎ１ ＣＯＢＲＡ ＶＬＰの併用投与により、使用されるＣＯＢＲＡの組合せ及び投与順序に応じてＨ１Ｎ１インフルエンザ株に対する広反応性ＨＡＩ活性が誘発された。季節性Ｈ１Ｎ１ ＣＯＢＲＡ ＶＬＰの併用投与は、パンデミックＨ１Ｎ１株又は歴史的Ｈ１Ｎ１株（１９３４年〜１９５７年）に対する活性を僅かしか又は全くもたらさなかった。パンデミックＰ１ ＣＯＢＲＡ ＶＬＰと季節性ＣＯＢＲＡ ＶＬＰとを組み合わせることで、パンデミックＨ１Ｎ１株に対する強い抗体活性がもたらされ、場合によっては季節性インフルエンザ株に対する抗体応答の幅が相乗的に拡大した。Ｐ１ ＣＯＢＲＡ ＶＬＰによるプライミングは概して、Ｐ１ ＣＯＢＲＡ ＶＬＰによるブースティングよりも高いＨＩＡ力価を誘発した。他の例では、投与順序の変更が拮抗作用を有していた。総合すると、これらの研究結果から、パンデミックＨ１Ｎ１ ＣＯＢＲＡ及び季節性Ｈ１Ｎ１ ＣＯＢＲＡの併用投与により、歴史的インフルエンザウイルスのパネルに対する免疫応答の幅が相乗的に拡大し、プライム−ブーストレジメンにおけるＨ１Ｎ１ ＣＯＢＲＡの投与順序が重要であることが実証される。
本発明の実施形態において利用される特定の最適化ＨＡポリペプチドのアミノ酸配列は本明細書で配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号４として規定される。
Figure 2018501258
これらの分子の設計及び産生に関する詳細は、以前に特に国際公開第２０１３／１４８１６４号及び米国特許出願公開第２０１４／０１４７４５９号（その全体が引用することにより本明細書の一部をなす）において記載されている。最適化パンデミックＨ１Ｎ１ ＨＡポリペプチドは一連のＨＡタンパク質アラインメント、並びに１９３３年〜２０１１年に単離された１５６種のヒトインフルエンザ株及び４９種のブタＨ１Ｎ１インフルエンザ株に基づくその後のコンセンサス配列の生成によって開発された。最適化季節性Ｘ６ Ｈ１Ｎ１ ＨＡポリペプチドは一連のＨＡタンパク質アラインメント、並びに１９９９年〜２０１２年に単離された１２７３種のヒトインフルエンザ株に基づくその後のコンセンサス配列の生成によって開発された。最適化季節性Ｘ３ Ｈ１Ｎ１ ＨＡポリペプチドは一連のＨＡタンパク質アラインメント、並びに１９７８年〜２００８年に単離された１２０４種のヒトインフルエンザ株に基づくその後のコンセンサス配列の生成によって開発された。最適化季節性Ｘ１ Ｈ１Ｎ１ ＨＡポリペプチドは一連のＨＡタンパク質アラインメント、並びに１９１８年〜２０１２年に単離された１４４８種のヒトインフルエンザ株に基づくその後のコンセンサス配列の生成によって開発された。
最適化組み換えインフルエンザＨＡポリペプチドの非自然発生変異体が本明細書で提供される。或る特定の実施形態では、組み換え最適化インフルエンザＨＡポリペプチドは配列番号１と少なくとも９８％、９８．５％、９９％又は９９．５％同一のアミノ酸配列を含む。配列番号２と少なくとも９９％又は９９．５％同一のアミノ酸配列を含む組み換え最適化インフルエンザＨＡポリペプチドも提供される。配列番号３と少なくとも９９％又は９９．５％同一のアミノ酸配列を含む組み換え最適化インフルエンザＨＡポリペプチドも提供される。配列番号４と少なくとも９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％又は９９．５％同一のアミノ酸配列を含む組み換え最適化インフルエンザＨＡポリペプチドも提供される。
別の実施形態では、組み換え最適化インフルエンザＨＡポリペプチドは配列番号１の残基２〜５６６と少なくとも９８％、９８．５％、９９％又は９９．５％同一のアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、組み換え最適化インフルエンザＨＡポリペプチドは配列番号２の残基２〜５６５と少なくとも９９％又は９９．５％同一のアミノ酸配列を含む。更に別の実施形態では、組み換え最適化インフルエンザＨＡポリペプチドは配列番号３の残基２〜５６６と少なくとも９９％又は９９．５％同一のアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、組み換え最適化インフルエンザＨＡポリペプチドは配列番号４の残基２〜５６６と少なくとも９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％又は９９．５％同一のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、最適化インフルエンザＨＡポリペプチドのアミノ酸配列は（ｉ）配列番号１に対して８つ以下、７つ以下、６つ以下、５つ以下、４つ以下、３つ以下、２つ以下又は１つ以下のアミノ酸置換；（ｉｉ）配列番号２に対して６つ以下、５つ以下、４つ以下、３つ以下、２つ以下又は１つ以下のアミノ酸置換；（ｉｉｉ）配列番号３に対して６つ以下、５つ以下、４つ以下、３つ以下、２つ以下又は１つ以下のアミノ酸置換；（ｉｖ）配列番号４に対して１０つ以下、９つ以下、８つ以下、７つ以下、６つ以下、５つ以下、４つ以下、３つ以下、２つ以下又は１つ以下のアミノ酸置換を含む。
幾つかの実施形態では、最適化インフルエンザＨＡポリペプチドは配列番号１の残基２〜５６６、配列番号２の残基２〜５６５、配列番号３の残基２〜５６６又は配列番号４の残基２〜５６６のアミノ酸配列を含むか又はそれからなる。他の実施形態では、最適化インフルエンザＨＡポリペプチドは配列番号１、配列番号２、配列番号３又は配列番号４のアミノ酸配列を含むか又はそれからなる。
本明細書に開示される組み換えインフルエンザＨＡポリペプチドをコードする単離核酸分子が更に提供される。幾つかの実施形態では、核酸分子は哺乳動物細胞における発現についてコドン最適化される。核酸分子は任意にＲＮＡ安定性について更に最適化される。
一実施形態では、核酸分子は配列番号１のアミノ酸配列又は配列番号１の残基２〜５６６をコードする核酸配列を含む。別の実施形態では、核酸分子は配列番号２のアミノ酸配列又は配列番号２の残基２〜５６５をコードする核酸配列を含む。別の実施形態では、核酸分子は配列番号３のアミノ酸配列又は配列番号３の残基２〜５６６をコードする核酸配列を含む。別の実施形態では、核酸分子は配列番号４のアミノ酸配列又は配列番号４の残基２〜５６６をコードする核酸配列を含む。核酸分子によってコードされる最適化インフルエンザＨＡポリペプチド、核酸分子を含むベクター及び開示のベクターを含有する宿主細胞も本明細書で提供される。
本発明による核酸分子の発現は、分子が組み換えＤＮＡ分子により形質転換した宿主において発現されるように第２の核酸配列によって調節することができる。例えば本発明の核酸分子の発現は、当該技術分野で既知のプロモーター及び／又はエンハンサー要素によって制御することができる。
本発明の核酸構築物を当該技術分野で既知の方法によって発現ベクター又はウイルスベクターに挿入し、核酸分子を発現制御配列に操作可能に連結する。
核酸分子を含有する発現ベクターを好適な宿主細胞に形質転換して、核酸構築物によってコードされるタンパク質を産生させる。例示的な宿主細胞には、原核生物（例えば大腸菌）及び真核生物（例えばＣＯＳ、２９３又はＣＨＯ細胞）が含まれる。発現ベクターにより形質転換した宿主細胞を本発明の最適化ＨＡポリペプチドの産生を可能にする条件下で成長させた後、最適化ＨＡポリペプチドを回収する。
組み換えＨＡポリペプチドをコードする核酸分子を含むベクターも本開示により提供される。ベクターは哺乳動物発現ベクター等のＨＡポリペプチドの発現に好適な任意のベクターであり得る。特定の例では、ベクターはｐＴＲ６００発現ベクター（米国特許出願公開第２００２／０１０６７９８号（引用することにより本明細書の一部をなす）、Ross et ah, Nat Immunol. 1(2): 102-103, 2000、Green et al., Vaccine 20:242-248, 2001）である。一部の例では、ベクターはＨＡポリペプチドをコードする核酸配列に操作可能に連結したプロモーターを含む。特定の例では、プロモーターはＣＭＶプロモーターである。
本明細書に記載される最適化インフルエンザＨＡポリペプチド（例えば表１に見られるＨＡポリペプチド）を１つ以上含む融合タンパク質が本開示によって更に提供される。
Ｈ１Ｎ１インフルエンザに対する広反応性免疫応答を誘発する最適化アミノ酸配列を有する組み換えＨ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチドの組合せを含む組成物（すなわちカクテル）が本明細書で提供される。幾つかの実施形態では、本明細書に記載される組成物は、（ｉ）配列番号１と少なくとも９８％、９８．５％、９９％又は９９．５％同一のアミノ酸配列を含む第１の最適化インフルエンザＨＡポリペプチドと、（ｉｉ）配列番号２と少なくとも９９％又は少なくとも９９．５％同一のアミノ酸配列を含む第２の最適化インフルエンザＨＡポリペプチドとを含む。特定の実施形態では、配列番号１と少なくとも９８％、９８．５％、９９％又は９９．５％同一の第１の最適化インフルエンザＨＡポリペプチドのアミノ酸配列はＮ末端メチオニン残基を欠く。特定の実施形態では、配列番号２と少なくとも９９％又は少なくとも９９．５％同一の第２の最適化インフルエンザＨＡポリペプチドのアミノ酸配列はＮ末端メチオニン残基を欠く。幾つかの実施形態では、カクテルは配列番号１の残基２〜５６６と少なくとも９８％、９８．５％、９９％又は９９．５％同一のアミノ酸配列を含む第１の最適化インフルエンザＨＡポリペプチドと、配列番号２の残基２〜５６５と少なくとも９９％又は少なくとも９９．５％同一のアミノ酸配列を含む第２の最適化インフルエンザＨＡポリペプチドとを含む。特定の例では、第１の最適化インフルエンザＨＡポリペプチド及び第２の最適化インフルエンザＨＡポリペプチドのアミノ酸配列はそれぞれ配列番号１の残基２〜５６６及び配列番号２の残基２〜５６５のアミノ酸配列を含むか又はそれからなる。幾つかの実施形態では、カクテルは配列番号１の残基２〜５６６と少なくとも９９．５％同一のアミノ酸配列を含む第１の最適化インフルエンザＨＡポリペプチドと、配列番号３の残基２〜５６５と少なくとも９９．５％同一のアミノ酸配列を含む第２の最適化インフルエンザＨＡポリペプチドとを含む。幾つかの実施形態では、組成物中の最適化インフルエンザＨＡポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号１、配列番号２、配列番号１の残基２〜５６６又は配列番号２の残基２〜５６５と少なくとも９５％、少なくとも９５．５％、少なくとも９６％、少なくとも９６．５％、少なくとも９７％、少なくとも９７．５％、少なくとも９８％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％又は少なくとも９９．９％同一である。幾つかの実施形態では、組成物中の最適化インフルエンザＨＡポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号１、配列番号２、配列番号１の残基２〜５６６又は配列番号２の残基２〜５６５と１００％相同である。幾つかの実施形態では、組成物は少なくとも２つの異なる最適化インフルエンザＨＡポリペプチドを含み、該ポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号１又は配列番号２に対して２つ以下又は１つ以下の置換を含む。
幾つかの実施形態では、本明細書に記載される組成物は、（ｉ）配列番号１と少なくとも９８％、９８．５％、９９％又は９９．５％同一のアミノ酸配列を含む第１の最適化インフルエンザＨＡポリペプチドと、（ｉｉ）配列番号３と少なくとも９９％又は９９．５％同一のアミノ酸配列を含む第２の最適化インフルエンザＨＡポリペプチドとを含む。特定の実施形態では、配列番号１と少なくとも９８％、９８．５％、９９％又は９９．５％同一の第１の最適化インフルエンザＨＡポリペプチドのアミノ酸配列はＮ末端メチオニン残基を欠く。特定の実施形態では、配列番号３と少なくとも９９％又は９９．５％同一の第２の最適化インフルエンザＨＡポリペプチドのアミノ酸配列はＮ末端メチオニン残基を欠く。特定の実施形態では、第１の最適化インフルエンザＨＡポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号１の残基２〜５６６と少なくとも９８％、９８．５％、９９％又は９９．５％同一である。特定の実施形態では、第２の最適化インフルエンザＨＡポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号３の残基２〜５６６と少なくとも９９％又は９９．５％同一である。特定の実施形態では、第１の最適化インフルエンザＨＡポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号１の残基２〜５６６を含むか又はそれからなる。特定の実施形態では、第２の最適化インフルエンザＨＡポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号３の残基２〜５６６を含むか又はそれからなる。幾つかの実施形態では、組成物中の最適化インフルエンザＨＡポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号１、配列番号３、配列番号１の残基２〜５６６又は配列番号３の残基２〜５６６と少なくとも９５％、少なくとも９５．５％、少なくとも９６％、少なくとも９６．５％、少なくとも９７％、少なくとも９７．５％、少なくとも９８％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％又は少なくとも９９．９％同一である。幾つかの実施形態では、組成物中の最適化インフルエンザＨＡポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号１、配列番号３、配列番号１の残基２〜５６６又は配列番号３の残基２〜５６６と１００％相同である。幾つかの実施形態では、組成物は少なくとも２つの異なる最適化インフルエンザＨＡポリペプチドを含み、該ポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号１又は配列番号３に対して２つ以下又は１つ以下の置換を含む。
幾つかの実施形態では、本明細書に記載される組成物は、（ｉ）配列番号１と少なくとも９８％、９８．５％、９９％又は９９．５％同一のアミノ酸配列を含む第１の最適化インフルエンザＨＡポリペプチドと、（ｉｉ）配列番号４と少なくとも９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％又は９９．５％同一のアミノ酸配列を含む第２の最適化インフルエンザＨＡポリペプチドとを含む。特定の実施形態では、配列番号１と少なくとも９８％、９８．５％、９９％又は９９．５％同一の第１の最適化インフルエンザＨＡポリペプチドのアミノ酸配列はＮ末端メチオニン残基を欠く。特定の実施形態では、配列番号４と少なくとも９９％又は９９．５％同一の第２の最適化インフルエンザＨＡポリペプチドのアミノ酸配列はＮ末端メチオニン残基を欠く。特定の実施形態では、第１の最適化インフルエンザＨＡポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号１の残基２〜５６６と少なくとも９８％、９８．５％、９９％又は９９．５％同一である。特定の実施形態では、第２の最適化インフルエンザＨＡポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号４の残基２〜５６６と少なくとも９９％又は９９．５％同一である。特定の実施形態では、第１の最適化インフルエンザＨＡポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号１の残基２〜５６６を含むか又はそれからなる。特定の実施形態では、第２の最適化インフルエンザＨＡポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号４の残基２〜５６６を含むか又はそれからなる。幾つかの実施形態では、組成物中の最適化インフルエンザＨＡポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号１、配列番号４、配列番号１の残基２〜５６６又は配列番号４の残基２〜５６６と少なくとも９５％、少なくとも９５．５％、少なくとも９６％、少なくとも９６．５％、少なくとも９７％、少なくとも９７．５％、少なくとも９８％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％又は少なくとも９９．９％同一である。幾つかの実施形態では、組成物中の最適化インフルエンザＨＡポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号１、配列番号４、配列番号１の残基２〜５６６又は配列番号４の残基２〜５６６と１００％相同である。幾つかの実施形態では、組成物は少なくとも２つの異なる最適化インフルエンザＨＡポリペプチドを含み、該ポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号１又は配列番号４に対して２つ以下又は１つ以下の置換を含む。
幾つかの実施形態では、本明細書に記載される組成物は、（ｉ）配列番号２と少なくとも９９％又は少なくとも９９．５％同一のアミノ酸配列を含む第１の最適化インフルエンザＨＡポリペプチドと、（ｉｉ）配列番号３と少なくとも９９％又は９９．５％同一のアミノ酸配列を含む第２の最適化インフルエンザＨＡポリペプチドとを含む。特定の実施形態では、配列番号２と少なくとも９９％又は少なくとも９９．５％同一の第１の最適化インフルエンザＨＡポリペプチドのアミノ酸配列はＮ末端メチオニン残基を欠く。特定の実施形態では、配列番号３と少なくとも９９％又は９９．５％同一の第２の最適化インフルエンザＨＡポリペプチドのアミノ酸配列はＮ末端メチオニン残基を欠く。特定の実施形態では、第１の最適化インフルエンザＨＡポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号２の残基２〜５６５と少なくとも９９％又は少なくとも９９．５％同一である。特定の実施形態では、第２の最適化インフルエンザＨＡポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号３の残基２〜５６６と少なくとも９９％又は９９．５％同一である。特定の実施形態では、第１の最適化インフルエンザＨＡポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号２の残基２〜５６５を含むか又はそれからなる。特定の実施形態では、第２の最適化インフルエンザＨＡポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号３の残基２〜５６６を含むか又はそれからなる。幾つかの実施形態では、組成物中の最適化インフルエンザＨＡポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号２、配列番号３、配列番号２の残基２〜５６５又は配列番号３の残基２〜５６６と少なくとも９５％、少なくとも９５．５％、少なくとも９６％、少なくとも９６．５％、少なくとも９７％、少なくとも９７．５％、少なくとも９８％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％又は少なくとも９９．９％同一である。幾つかの実施形態では、組成物中の最適化インフルエンザＨＡポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号２、配列番号３、配列番号２の残基２〜５６５又は配列番号３の残基２〜５６６と１００％相同である。幾つかの実施形態では、組成物は少なくとも２つの異なる最適化インフルエンザＨＡポリペプチドを含み、該ポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号２又は配列番号３に対して２つ以下又は１つ以下の置換を含む。
幾つかの実施形態では、本明細書に記載される組成物は、（ｉ）配列番号２と少なくとも９９％又は少なくとも９９．５％同一のアミノ酸配列を含む第１の最適化インフルエンザＨＡポリペプチドと、（ｉｉ）配列番号４と少なくとも９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％又は９９．５％同一のアミノ酸配列を含む第２の最適化インフルエンザＨＡポリペプチドとを含む。特定の実施形態では、配列番号２と少なくとも９９％又は少なくとも９９．５％同一の第１の最適化インフルエンザＨＡポリペプチドのアミノ酸配列はＮ末端メチオニン残基を欠く。特定の実施形態では、配列番号４と少なくとも９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％又は９９．５％同一の第２の最適化インフルエンザＨＡポリペプチドのアミノ酸配列はＮ末端メチオニン残基を欠く。特定の実施形態では、第１の最適化インフルエンザＨＡポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号２の残基２〜５６５と少なくとも９９％又は少なくとも９９．５％同一である。特定の実施形態では、第２の最適化インフルエンザＨＡポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号４の残基２〜５６６と少なくとも９９％又は９９．５％同一である。特定の実施形態では、第１の最適化インフルエンザＨＡポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号２の残基２〜５６５を含むか又はそれからなる。特定の実施形態では、第２の最適化インフルエンザＨＡポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号４の残基２〜５６６を含むか又はそれからなる。幾つかの実施形態では、組成物中の最適化インフルエンザＨＡポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号２、配列番号４、配列番号２の残基２〜５６５又は配列番号４の残基２〜５６６と少なくとも９５％、少なくとも９５．５％、少なくとも９６％、少なくとも９６．５％、少なくとも９７％、少なくとも９７．５％、少なくとも９８％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％又は少なくとも９９．９％同一である。幾つかの実施形態では、組成物中の最適化インフルエンザＨＡポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号２、配列番号４、配列番号２の残基２〜５６５又は配列番号４の残基２〜５６６と１００％相同である。幾つかの実施形態では、組成物は少なくとも２つの異なる最適化インフルエンザＨＡポリペプチドを含み、該ポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号２又は配列番号４に対して２つ以下又は１つ以下の置換を含む。
幾つかの実施形態では、本明細書に記載される組成物は、（ｉ）配列番号３と少なくとも９９％又は９９．５％同一のアミノ酸配列を含む第１の最適化インフルエンザＨＡポリペプチドと、（ｉｉ）配列番号４と少なくとも９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％又は９９．５％同一のアミノ酸配列を含む第２の最適化インフルエンザＨＡポリペプチドとを含む。特定の実施形態では、配列番号３と少なくとも９９％又は９９．５％同一の第１の最適化インフルエンザＨＡポリペプチドのアミノ酸配列はＮ末端メチオニン残基を欠く。特定の実施形態では、配列番号４と少なくとも９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％又は９９．５％同一の第２の最適化インフルエンザＨＡポリペプチドのアミノ酸配列はＮ末端メチオニン残基を欠く。特定の実施形態では、第１の最適化インフルエンザＨＡポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号３の残基２〜５６６と少なくとも９９％又は９９．５％同一である。特定の実施形態では、第２の最適化インフルエンザＨＡポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号４の残基２〜５６６と少なくとも９９％又は９９．５％同一である。特定の実施形態では、第１の最適化インフルエンザＨＡポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号３の残基２〜５６６を含むか又はそれからなる。特定の実施形態では、第２の最適化インフルエンザＨＡポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号４の残基２〜５６６を含むか又はそれからなる。幾つかの実施形態では、組成物中の最適化インフルエンザＨＡポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号３、配列番号４、配列番号３の残基２〜５６６又は配列番号４の残基２〜５６６と少なくとも９５％、少なくとも９５．５％、少なくとも９６％、少なくとも９６．５％、少なくとも９７％、少なくとも９７．５％、少なくとも９８％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％又は少なくとも９９．９％同一である。幾つかの実施形態では、組成物中の最適化インフルエンザＨＡポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号３、配列番号４、配列番号３の残基２〜５６６又は配列番号４の残基２〜５６６と１００％相同である。幾つかの実施形態では、組成物は少なくとも２つの異なる最適化インフルエンザＨＡポリペプチドを含み、該ポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号３又は配列番号４に対して２つ以下又は１つ以下の置換を含む。
最適化ＨＡポリペプチドは、微細藻類（例えばシゾキトリウム属の一種（Schizochytrium sp.）、例えばBayne, A-C.V. et al., PLOS ONE, 8(4):e61790, April 2013を参照されたい）、植物ベースの系（例えばタバコ植物、例えば、Jul-Larsen, A., et al., Hum Vaccin Immunother., 8(5):653-61, 2012を参照されたい）、酵母（例えば、Athmaram, T.N. et al., Virol J., 8:524, 2011を参照されたい）及び真菌（例えば、Allgaier, S. et al., Biologicals, 37:128-32, 2009を参照されたい）を含む多様な真核ベースの発現系において発現／作製することができる。細菌ベースの発現系も本発明に包含される（例えば、Davis, A.R. et al., Gene, 21:273-284, 1983を参照されたい）。これらの刊行物はその全体が引用することにより本明細書の一部をなす。
本発明のコンピュータ最適化ＨＡポリペプチドは従来のイオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー及び／又はゲル濾過を含む当該技術分野で既知の任意の技法によって精製することができる。本発明のコンピュータ最適化ＨＡポリペプチドは、真核又は原核細胞からの分泌後に馴化培地から回収することもできる。
インフルエンザウイルス様粒子（ＶＬＰ）
幾つかの実施形態では、本発明は本明細書に記載されるコンピュータ最適化Ｈ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチド（又はその免疫原性フラグメント）（例えば表１に見られるＨＡポリペプチド）を１つ以上含むインフルエンザウイルス様粒子（ＶＬＰ）及びその組合せを提供する。インフルエンザＶＬＰは幾つかの実施形態では、概してＨＡ、ＮＡ及びウイルス構造（例えばＨＩＶ ｇａｇ）タンパク質で構成される。インフルエンザＶＬＰの作製は当該技術分野で既知であり、本開示を読むことで当業者に容易に明らかである。例えば、インフルエンザＶＬＰはＨＡ、ＮＡ及びＨＩＶ ｇａｇタンパク質をコードするプラスミドによる宿主細胞のトランスフェクションによって作製することができる。一例を挙げると、好適な宿主細胞にはヒト細胞（例えばＨＥＫ２９３Ｔ）が含まれる。タンパク質発現を可能にする適切な時間（例えばおよそ７２時間）にわたるトランスフェクト細胞のインキュベーション後に、ＶＬＰを細胞培養上清から単離することができる。幾つかの実施形態では、本明細書に開示されるインフルエンザＶＬＰをインフルエンザワクチンとして使用して、Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルスに対する広い中和免疫応答を誘発することができる。
全インフルエンザウイルス
本明細書に記載されるコンピュータ最適化組み換えＨＡポリペプチド（又はその免疫原性フラグメント（単数又は複数））を１つ以上含む全組み換えインフルエンザウイルスも提供される。組み換えインフルエンザウイルスは、プラスミドベースの逆遺伝学（例えば、Neumann, G. et la., Reverse Genetics of Influenza Viruses, Methods Mol Biol., 2012, 865:193-206（引用することにより本明細書の一部をなす）を参照されたい）及び卵ベースの技術；例えば卵において高い収率をもたらす本明細書に記載されるコンピュータ最適化Ｈ１ ＨＡポリペプチド、Ｈ１Ｎ１インフルエンザ株に由来する野生型ＮＡポリペプチド、及びドナーウイルスに由来する内部タンパク質遺伝子の骨格（例えば、Ａ型インフルエンザ／プエルトリコ／８／３４（ＰＲ８））を含む組み換えウイルスによって作製することができる。例えば、高成長Ａ型インフルエンザ／プエルトリコ／８／３４（ＰＲ８）ドナーウイルスの内部タンパク質をコードする６つのプラスミドを、本明細書に記載されるコンピュータ最適化Ｈ１Ｎ１ ＨＡポリペプチド及び野生型ノイラミニダーゼ（ＮＡ）糖タンパク質をコードする２つのプラスミドとともに適格哺乳動物細胞（例えばベロ細胞）に同時トランスフェクトし、続いて組み換えウイルスを単離することができる。ＰＲ８ウイルスに由来する内部タンパク質遺伝子を含有する組み換えウイルスを用いて、生弱毒化及び／又は不活化インフルエンザウイルスワクチンを調製することができる（例えば、Fodor, E. et al. Rescue of influenza A virus from Recombinant DNA. J. Virol., 1999, 73, 9679-9682（引用することにより本明細書の一部をなす）を参照されたい）。
本明細書に記載されるコンピュータ最適化Ｈ１Ｎ１ ＨＡポリペプチドを生弱毒化インフルエンザウイルスに組み込むことが可能である。生弱毒化ウイルスは、特に免疫系が完全に発達していない若年被験体における自然発生一過性感染である長期にわたる広範な免疫（液性及び細胞性）応答を誘発することができる。例えば、生弱毒化インフルエンザワクチンは、弱毒化温度感受性低温馴化ウイルス骨格（例えば、温度感受性低温馴化表現型をもたらし、病原性について弱毒化されたＡ／アナーバー／６／６０等の弱毒化ドナーウイルスに由来する６つの内部遺伝子断片との６：２の再集合体）上で循環ウイルスに由来するＮＡ遺伝子及びコンピュータ最適化Ｈ１Ｎ１ ＨＡ配列を用いて作製することができる。この骨格は或る特定の温度（例えば３３℃）を超える温度での複製を予防し、それにより下気道ではなく上気道での複製が制限される。かかる生弱毒化温度感受性（別名、低温馴化）インフルエンザウイルスを作製し、使用する方法は当該技術分野で既知である。例えば、He et al., Molecular Basis of Live-Attenuated Influenza Virus, PloS One., 2013, 8(3):e60413、Sridhar et al., Influenza Vaccination Strategies: Comparing Inactivated and Live Attenuated Influenza Vaccines, 2015, Vaccines, 2015, 3(2):373-89を参照されたい。
各々が本明細書に開示される異なる組み換えＨＡポリペプチドを含む異なる組み換えインフルエンザウイルスを別個に作製した後、組合せ／カクテルへと組み合わせることができる。組み換えインフルエンザウイルスの組合せ／カクテルは、ヒト及びブタＨ１Ｎ１インフルエンザウイルスを含むＨ１Ｎ１インフルエンザウイルスに対する防御免疫応答を誘発するインフルエンザワクチンとして使用することができる。例えば、これらの組合せ／カクテルは生弱毒化又はスプリット不活化ワクチンの成分として投与することができる。
このため、幾つかの実施形態では、本発明は本明細書に記載されるコンピュータ最適化Ｈ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチド（又はその免疫原性フラグメント）の組合せ又はカクテル（例えば、表１に見られるＨＡポリペプチドのカクテル）を含む不活化Ｈ１Ｎ１インフルエンザワクチンを提供し、該ワクチンは３種類の抗原調製物：不活化全ウイルス、精製ウイルス粒子を洗浄剤又は脂質エンベロープを可溶化する他の試薬で破壊したサブビリオン（「スプリット」ワクチン）又は精製ＨＡポリペプチド（「サブユニット」ワクチン）のうち１つを含む。幾つかの実施形態では、ウイルスはホルムアルデヒド、β−プロピオラクトン、エーテル、洗浄剤（ＴＷＥＥＮ−８０（商標）等）を含むエーテル、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）及びＴｒｉｔｏｎ Ｎ１０１、デオキシコール酸ナトリウム及びリン酸トリ（ｎ−ブチル）を用いた処理によって不活化することができる。不活化は（卵において作製したウイルスからの）尿膜腔液の清澄化の前又は後に行うことができ、ビリオンを遠心分離によって単離及び精製する（Nicholson et al., eds., 1998, Textbook of Influenza, Blackwell Science, Malden, MA、引用することにより本明細書の一部をなす）。ワクチンの効力を評定するために、一元放射免疫拡散（ＳＲＤ）試験を用いることができる（Schild et al., 1975, Bull. World Health Organ., 52:43-50 & 223-31、Mostow et al., 1975, J. Clin. Microbiol., 2:531、どちらも引用することにより本明細書の一部をなす）。
幾つかの実施形態では、ワクチンに使用するインフルエンザウイルスを卵、例えば孵化鶏卵において成長させるが、この場合に採取される材料は尿膜腔液である。代替的又は付加的には、インフルエンザウイルス又は最適化ヘマグルチニンポリペプチドは、ウイルスを成長させる組織培養を用いる任意の方法によって作製することができる。ウイルスの成長に又は別の方法で組み換えにより最適化ヘマグルチニンポリペプチドを作製するのに好適な細胞基質としては、例えばＭＤＣＫ等のイヌ腎細胞又はＭＤＣＫのクローンに由来する細胞、ＭＤＣＫ様細胞、ベロ細胞を含むＡＧＭＫ細胞等のサル腎細胞、連続細胞株としての培養上皮細胞、２９３Ｔ細胞、ＢＫ−２１細胞、ＣＶ−１細胞、又は商業的供給源（例えばATCC，Rockville，Md.）から容易に入手可能なワクチン目的でのインフルエンザウイルスの産生に好適な任意の他の哺乳動物細胞型（上気道上皮細胞を含む）が挙げられる。好適な細胞基質にはＭＲＣ−５細胞等のヒト細胞も含まれる。好適な細胞基質はこれらの細胞株に限定されず、例えばニワトリ胚線維芽細胞等の初代細胞も含まれる。
免疫原性組成物
本明細書に記載されるコンピュータ最適化Ｈ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチド（又はその免疫原性フラグメント）（例えば、表１に見られるＨＡポリペプチドのカクテル）、又は最適化インフルエンザＨＡタンパク質を含む融合タンパク質若しくはＶＬＰ、若しくはスプリット若しくは不活性ウイルスの組合せ又はカクテルを含む免疫原性組成物（例えばワクチン）も本明細書で提供される。幾つかの実施形態では、組成物は薬学的に許容可能な担体を更に含む。
幾つかの実施形態では、本発明によるワクチンは１つ以上のアジュバントを更に含む。例えば、アラム、アルミニウム塩（Baylor et al., 2002, Vaccine, 20:S18、引用することにより本明細書の一部をなす）及びモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ、Ribi et al., 1986, Immunology and Immunopharmacology of Bacterial Endotoxins, Plenum Publ. Corp., NY, p.407、引用することにより本明細書の一部をなす）をヒトワクチン中のアジュバントとして使用することができる。代替的又は付加的には、新たな化合物、例えばＭＦ５９（例えば、Ott et al., "MF59-Design and Evaluation of a Safe and Potent Adjuvant for Human Vaccines" in Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (Powell, M. F. and Newman, M. J. eds.) Plenum Press, New York, 1995, pp. 277-296（引用することにより本明細書の一部をなす）を参照されたい）；ＣＰＧ ７９０９等のＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）アジュバント（Cooper et al., 2004, Vaccine, 22:3136、引用することにより本明細書の一部をなす）；ＡＳ０４を含むモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）アジュバント及びリピドＡ模倣体（Didierlaurent, A.M. et al, J. Immunol., 2009, 183: 6186-6197、引用することにより本明細書の一部をなす）、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ、GSK）及びグルコピラノシルリピドＡ ＧＬＡ（Immune Design Corporation，IDC）；ＡＦ０３（Klucker, M.F. et al, J. Pharm Sci., 2012, 101: 4490-4500、引用することにより本明細書の一部をなす）；ＴＬＲ−３リガンドポリイノシン酸：ポリシチジル酸［ポリ（Ｉ：Ｃ）］；ＩＣ３１等のＴＬＲ９アジュバント（Riedl, K. et al., Vaccine, 2008, 26: 3461-3468、引用することにより本明細書の一部をなす）；イミキモド（Ｒ８３７）又はレシキモド（Ｒ８４８）等のイミダゾキノリン（ＴＬＲ−７／８アゴニストとして働く二重環状有機分子）；ＱＳ２１等のサポニン（Ghochikyan et al., 2006, Vaccine, 24:2275、引用することにより本明細書の一部をなす）、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸアジュバント（Duewell, P., et al., J. Immunol, 2011, 187: 55-63、引用することにより本明細書の一部をなす）、及びＭａｔｒｉｘ−Ｍ（商標）（Novavax）が現在ヒトワクチンにおいてアジュバントとして試験されている。
付加的に、ポリ［ジ（カルボキシラトフェノキシ）ホスファゼン］（ＰＣＣＰ；Payne et al., 1998, Vaccine, 16:92、引用することにより本明細書の一部をなす）、インターフェロン−γ（Cao et al., 1992, Vaccine, 10:238、引用することにより本明細書の一部をなす）、ブロックコポリマーＰ１２０５（ＣＲＬ１００５；Katz et al., 2000, Vaccine,. 18:2177、引用することにより本明細書の一部をなす）、インターロイキン−２（ＩＬ−２；Mbwuike et al., 1990, Vaccine, 8:347、引用することにより本明細書の一部をなす）及びポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ；Kreuter et al., 1981, J. Pharm. Sci., 70:367、引用することにより本明細書の一部をなす）等のインフルエンザワクチンの免疫原性を高める幾つかのアジュバントが当該技術分野で既知である。
概して、免疫原性組成物は滅菌水、生理食塩水、緩衝食塩水又はデキストロース溶液を含むが、これらに限定されない滅菌生体適合性担体等の１つ以上の不活性な作用物質を含む。代替的又は付加的には、組成物は安定剤、緩衝剤、賦形剤（例えば糖、アミノ酸等）又は保存料等の様々な添加剤のいずれを含有していてもよい。特定の実施形態において使用される薬学的に許容可能な担体としては、生理食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール及びそれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。幾つかの実施形態では、担体及び組成物は滅菌であり、配合物は投与方法に適合する。幾つかの実施形態では、免疫原性組成物は少量の湿潤剤若しくは乳化剤、又はｐＨ緩衝剤を含有する。幾つかの実施形態では、医薬組成物は液体溶液、懸濁液、エマルション、錠剤、丸薬、カプセル、持続放出配合物又は粉末である。経口配合物は医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース及び炭酸マグネシウム等の標準担体を含み得る。滅菌食塩水又はゴマ油等の一般的な医薬担体のいずれを使用してもよい。媒体は例えば浸透圧を調整する薬学的に許容可能な塩、緩衝剤、保存料等の従来の医薬補助材料を含有していてもよい。本明細書で提供される組成物及び方法とともに使用することができる他の媒体は生理食塩水及びゴマ油である。
幾つかの実施形態では、免疫原性組成物は皮内注射、鼻腔内投与又は筋肉内注射用に配合される。幾つかの実施形態では、注射剤は液体の溶液若しくは懸濁液、注射前の液体中の溶液若しくは懸濁液に好適な固体形態、又はエマルションとして従来の形態で調製される。幾つかの実施形態では、注射溶液及び懸濁液は滅菌粉末、顆粒から調製される。これらの経路による投与のための配合物及び薬剤の製造の概論は、例えばRemington’s Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1995（引用することにより本明細書の一部をなす）に見ることができる。現在、（例えば吸入による）経口又は鼻腔用のスプレー又はエアロゾル経路が、治療剤を肺及び呼吸器系に直接送達するために最も一般的に使用されている。幾つかの実施形態では、本発明による組成物は計量された投与量の組成物（例えば最適化ＨＡポリペプチド）を送達するデバイスを用いて投与される。本明細書に記載される皮内医薬組成物を送達するのに使用される好適なデバイスとしては、米国特許第４，８８６，４９９号、米国特許第５，１９０，５２１号、米国特許第５，３２８，４８３号、米国特許第５，５２７，２８８号、米国特許第４，２７０，５３７号、米国特許第５，０１５，２３５号、米国特許第５，１４１，４９６号、米国特許第５，４１７，６６２号（全て引用することにより本明細書の一部をなす）に記載されるような短針デバイスが挙げられる。皮内組成物は、国際公開第１９９９／３４８５０号（引用することにより本明細書の一部をなす）に記載されるような針の皮膚への有効侵入長を制限するデバイス及びその機能的等価物によっても投与することができる。液体ジェットインジェクター又は角質層を貫通し、真皮に到達する噴流を生じる針によって真皮に液体ワクチンを送達するジェット注射デバイスも好適である。ジェット注射デバイスは例えば米国特許第５，４８０，３８１号、米国特許第５，５９９，３０２号、米国特許第５，３３４，１４４号、米国特許第５，９９３，４１２号、米国特許第５，６４９，９１２号、米国特許第５，５６９，１８９号、米国特許第５，７０４，９１１号、米国特許第５，３８３，８５１号、米国特許第５，８９３，３９７号、米国特許第５，４６６，２２０号、米国特許第５，３３９，１６３号、米国特許第５，３１２，３３５号、米国特許第５，５０３，６２７号、米国特許第５，０６４，４１３号、米国特許第５，５２０，６３９号、米国特許第４，５９６，５５６号、米国特許第４，７９０，８２４号、米国特許第４，９４１，８８０号、米国特許第４，９４０，４６０号、国際公開第１９９７／３７７０５号及び国際公開第１９９７／１３５３７号（全て引用することにより本明細書の一部をなす）に記載されている。圧縮ガスを用いて粉末形態のワクチンを皮膚の外層を介して真皮へと促すバリスティック（ballistic）粉末／粒子送達デバイスも好適である。付加的に、従来の注入器を皮内投与の古典的マントー法に用いてもよい。
非経口投与用の調製物としては、滅菌水溶液又は非水溶液、懸濁液及びエマルションが挙げられる。非水溶媒の例はプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油等の植物油、及びオレイン酸エチル等の注射用有機エステルである。水性担体としては、生理食塩水及び緩衝媒体を含む水、アルコール／水溶液、エマルション又は懸濁液が挙げられる。非経口ビヒクルとしては、塩化ナトリウム溶液、リンガーデキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸加リンガー又は不揮発性油が挙げられる。静脈内ビヒクルとしては、流体及び栄養補給液（nutrient replenishers）、電解質補給液（例えばリンガーデキストロースをベースとするもの）等が挙げられる。例えば抗菌剤、酸化防止剤、キレート剤及び不活性ガス等の保存料及び他の添加剤が存在していてもよい。
組成物の一部は場合によっては、塩酸、臭化水素酸、過塩素酸、硝酸、チオシアン酸、硫酸及びリン酸等の無機酸、並びにギ酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸及びフマル酸等の有機酸との反応、又は水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウム等の無機塩基、並びにモノアルキルアミン、ジアルキルアミン、トリアルキルアミン及びアリールアミン、並びに置換エタノールアミン等の有機塩基との反応によって形成される薬学的に許容可能な酸付加塩又は塩基付加塩として投与することができる。
免疫応答を誘発するための最適化Ｈ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチドの併用投与
Ｈ１Ｎ１インフルエンザ感染の予防的又は治療的処置における本明細書に記載される併用投与（例えば、免疫原性カクテル組成物又はプライム−ブーストレジメン）の使用及び方法、例えば本明細書に開示されるような最適化Ｈ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチド、最適化Ｈ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチドを含有するＶＬＰ、融合タンパク質、不活化インフルエンザウイルス（例えばスプリット不活化）又は生弱毒化インフルエンザウイルス（例えば温度感受性ウイルス）（例えば、表１に見られるＨＡポリペプチドのカクテル）を併用投与することによって被験体におけるインフルエンザウイルスに対する免疫応答を生じさせる又は誘発する方法が更に提供される。或る特定の実施形態では、最適化Ｈ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチドは被験体に組合せ又はカクテルとして（すなわち同時に）併用投与される。他の実施形態では、最適化Ｈ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチドは個々のポリペプチド又はカクテルとしてのどちらかで順次に併用投与される。例えば、被験体において免疫応答を誘発する或る特定の方法は、被験体に本明細書に記載される第１の最適化Ｈ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチドを含む第１のプライミングワクチンを投与し、続いて本明細書に記載される第２の最適化Ｈ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチドを含む第２のブースティングワクチンを投与することを含み、この場合、第２の最適化Ｈ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチドは第１の最適化Ｈ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチドとは異なる。幾つかの実施形態では、第１のプライミングワクチンは第１の最適化Ｈ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチドを含有する生弱毒化ウイルス（例えば温度感受性ウイルス）を含み、第２のブースティングワクチンは第２の最適化Ｈ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチド、例えば第２の最適化Ｈ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチドを含有するＶＬＰを含む。
幾つかの実施形態では、ＨＡタンパク質、ＨＡ融合タンパク質、ＶＬＰ又はウイルスは、例えば筋肉内、鼻腔内又は経口等の任意の好適な投与経路を用いて投与することができる。幾つかの実施形態では、ＨＡタンパク質、融合タンパク質、ＶＬＰ又はウイルスは薬学的に許容可能な担体及び／又はアジュバントを更に含む組成物として投与される。
本明細書に記載される組成物の使用及び方法は、治療を必要とする被験体（例えばヒト被験体）を選択することを含み得る。最適化インフルエンザＨＡポリペプチドを含む組成物は、Ｈ１Ｎ１インフルエンザ感染の１つ以上の症状の発現の前又は後に投与することができる。投与は全身的であっても又は局所的であってもよい。すなわち、幾つかの実施形態では、本明細書に記載される組成物はＨ１Ｎ１インフルエンザ感染を予防するか、又は潜在的Ｈ１Ｎ１インフルエンザ感染の症状を改善するために予防的に投与することができる。幾つかの実施形態では、被験体がパンデミックインフルエンザウイルスに感染したことが知られている若しくはその疑いがある他の個体若しくは家畜（例えばブタ）と接触する場合、及び／又はＨ１Ｎ１インフルエンザ感染が流行している若しくはよく見られることが知られる若しくは考えられる場所に被験体が行く場合に、被験体はＨ１Ｎ１インフルエンザウイルス感染のリスクがある。幾つかの実施形態では、組成物はＨ１Ｎ１インフルエンザ感染を患っているとみなされる被験体又は一般にインフルエンザ感染と関連する１つ以上の症状を示す被験体に投与される。幾つかの実施形態では、被験体はＨ１Ｎ１インフルエンザウイルスに曝露されたことが知られる又は考えられる。幾つかの実施形態では、被験体がインフルエンザウイルスに曝露されたことが知られる又は考えられる場合に、被験体はＨ１Ｎ１インフルエンザ感染のリスクがある又はその影響を受けやすいとみなされる。幾つかの実施形態では、被験体がパンデミックインフルエンザウイルスに感染したことが知られている若しくはその疑いがある他の個体若しくは家畜（例えばブタ）と接触した場合、及び／又はＨ１Ｎ１インフルエンザ感染が流行している若しくはよく見られることが知られる若しくは考えられる場所に被験体が居る又は居た場合に、被験体はＨ１Ｎ１インフルエンザウイルスに曝露されたことが知られる又は考えられる。
本発明による免疫原性組成物は、所望の転帰を達成するのに適切な任意の用量で投与することができる。幾つかの実施形態では、所望の転帰は、季節性株及びパンデミック株の両方を含む広範なＨ１Ｎ１インフルエンザ株に対する持続的な適応免疫応答の誘導である。幾つかの実施形態では、所望の転帰は強度、重症度及び／又は頻度の低減、及び／又はインフルエンザ感染の１つ以上の症状の発症の遅延である。必要とされる用量は被験体の種、年齢、体重及び全身状態、治療される感染の重症度、使用される特定の組成物及びその投与方法に応じて被験体によって異なり得る。
免疫応答を誘発する又は被験体を免疫化する方法の幾つかの実施形態では、被験体に約１５μｇ〜約４５μｇの本明細書に記載される最適化Ｈ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチドの２つ又は３つ（例えば、１５μｇ〜４５μｇの表１に見られるＨＡポリペプチドの各々）を含む組成物を投与する。特定の例では、被験体に所与のカクテル中に約１５μｇ、約２０μｇ、約２５μｇ、約３０μｇ、約３５μｇ、約４０μｇ又は約４５μｇの各々の最適化Ｈ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチドを含む組成物を投与する。例えば、ワクチンが表１中のＨＡポリペプチドの２つのＨＡポリペプチドからなるＨ１Ｎ１ Ａ型インフルエンザＨＡ抗原カクテルを含む場合、被験体に３０μｇ〜９０μｇの総量の（各１５μｇ〜４５μｇの２つの）Ａ型インフルエンザＨＡを与えることができる。具体的な非限定的な一例では、被験体に約１５μｇの各々の最適化Ｈ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチドを投与する。特定の例では、被験体に約４５μｇ〜約９０μｇの総ヘマグルチニン抗原成分を含む組成物を投与する。投与量は例えば一元放射免疫拡散（ＳＲＤ）によって測定することができる（J. M. Wood, et al.: An improved single radial immunodiffusion technique for the assay of influenza haemagglutinin antigen: adaptation for potency determination of inactivated whole virus and subunit vaccines, J. Biol. Stand., 1977, 5:237-247、J. M. Wood, et al., International collaborative study of single radial diffusion and immunoelectrophoresis techniques for the assay of haemagglutinin antigen of influenza virus, J. Biol. Stand., 1981, 9:317-330）。
幾つかの実施形態では、本発明はヒト被験体に投与される本明細書に記載の免疫原性組成物（例えばワクチン）を提供する。特定の実施形態では、ヒト被験体は月齢６ヶ月以上、月齢６ヶ月〜３５ヶ月、３６ヶ月〜年齢８歳若しくは年齢９歳又はそれ以上である。
幾つかの実施形態では、本発明による免疫原性組成物は単回量又は複数回量で投与する。幾つかの実施形態では、本発明による医薬組成物は異なる日に複数回量で投与する（例えばプライム−ブーストワクチン接種戦略）。幾つかの実施形態では、本発明による医薬組成物は、被験体が受ける治療的投薬期間の間に挿入される治療的投薬よりも短い期間がない連続投薬レジメンに従って投与する。幾つかの実施形態では、本発明による医薬組成物は、被験体が受ける２つの治療的投薬期間の間に挿入される治療的投薬よりも短い少なくとも１つの期間がある間欠投薬レジメンに従って投与する。
本明細書に記載される免疫原性組成物の方法及び使用はプライム−ブーストワクチン接種戦略を含む。プライム−ブーストワクチン接種はプライミングワクチンを投与し、次いで或る時間が経過した後に被験体にブースティングワクチンを投与することを含む。免疫応答はプライミングワクチンの投与時に「プライム」され、ブースティングワクチンの投与時に「ブースト」される。プライミングワクチンは本明細書に記載される免疫原性ＨＡポリペプチド、及び／又はその組成物若しくはカクテルのいずれかを含み得る。同様に、ブースティングワクチンは本明細書に記載される免疫原性ＨＡポリペプチド、及び／又はその組成物若しくはカクテルのいずれかを含み得る。
例えば、プライミングワクチンは組み換えＨ１Ｎ１インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）ポリペプチドの組合せを含むことができ、該組合せは配列番号１と少なくとも９８％、９８．５％、９９％又は９９．５％同一のアミノ酸配列を含む第１の組み換え最適化Ｈ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチドと、１）配列番号２と少なくとも９９％又は９９．５％同一のアミノ酸配列、２）配列番号３と少なくとも９９％又は９９．５％同一のアミノ酸配列、及び３）配列番号４と少なくとも９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％又は９９．５％同一のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む第２の組み換え最適化Ｈ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチドとを含む。或る特定の実施形態では、プライミングワクチンは配列番号１のアミノ酸配列を含む第１の組み換え最適化Ｈ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチドと、配列番号２、配列番号３及び配列番号４のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む第２の組み換え最適化Ｈ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチドとを含むか又はそれらからなる。幾つかの実施形態では、ブースティングワクチンはプライミングワクチンと同じ最適化Ｈ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチドを含むか又はそれからなる。幾つかの実施形態では、プライミングワクチンはアジュバントを含む。幾つかの実施形態では、ブースティングワクチンはアジュバントを含む。
幾つかの実施形態では、プライミングワクチンは、配列番号１の残基２〜５６６と少なくとも９８％、９８．５％、９９％又は９９．５％同一のアミノ酸配列を含む第１の組み換え最適化Ｈ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチドと、１）配列番号２の残基２〜５６５と少なくとも９９％又は少なくとも９９．５％同一のアミノ酸配列、２）配列番号３の残基２〜５６６と少なくとも９９％又は少なくとも９９．５％同一のアミノ酸配列、及び３）配列番号４の残基２〜５６６と少なくとも９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％又は９９．５％同一のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む第２の組み換え最適化Ｈ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチドとを含む、組み換えＨ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチドの組合せを含む。或る特定の実施形態では、プライミングワクチンは配列番号１の残基２〜５６６を含む第１の組み換え最適化Ｈ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチドと、１）配列番号２の残基２〜５６５、２）配列番号３の残基２〜５６６、及び３）配列番号４の残基２〜５６６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む第２の組み換え最適化Ｈ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチドとを含むか又はそれらからなる。ブースティングワクチンはプライミングワクチンと同じであっても、又は本明細書に記載されるＨ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチドの異なるカクテルを含有していてもよい。例えば、幾つかの実施形態では、ブースティングワクチンはプライミングワクチンと同じ組合せの最適化Ｈ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチドを含むか又はそれからなる。本発明の実施形態の様々なプライム−ブーストカクテルの組合せを下記表にまとめる。
Figure 2018501258
幾つかの実施形態では、プライミングワクチンカクテルはアジュバントを含む。幾つかの実施形態では、ブースティングワクチンカクテルはアジュバントを含む。
代替的には、プライミングワクチン及びブースティングワクチンは各々、本明細書に記載される種々の最適化Ｈ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチドを含み得る。或る特定の実施形態では、プライミングワクチンは本明細書に記載されるパンデミックＨ１Ｎ１最適化インフルエンザＨＡタンパク質を含んでいてもよく、ブースティングワクチンは本明細書に記載される季節性Ｈ１Ｎ１最適化インフルエンザＨＡタンパク質を含んでいてもよい。例えば、プライミングワクチンは配列番号１と少なくとも９８％、９８．５％、９９％又は９９．５％同一のアミノ酸配列を含む組み換え最適化Ｈ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチドを含み得る。ブースティングワクチンは、１）配列番号２と少なくとも９９％又は９９．５％同一のアミノ酸配列、２）配列番号３と少なくとも９９％又は９９．５％同一のアミノ酸配列、及び３）配列番号４と少なくとも９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％又は９９．５％同一のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む組み換え最適化Ｈ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチドを含み得る。或る特定の実施形態では、プライミングワクチンは配列番号１のアミノ酸配列を含む第１の組み換え最適化Ｈ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチドを含むか又はそれからなり、ブースティングワクチンは配列番号２のアミノ酸配列、配列番号３及び配列番号４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む第２の組み換え最適化Ｈ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチドを含むか又はそれからなる。
他の実施形態では、プライミングワクチンは配列番号１の残基２〜５６６と少なくとも９８％、９８．５％、９９％又は９９．５％同一のアミノ酸配列を含む組み換え最適化Ｈ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチドを含み得る。ブースティングワクチンは、１）配列番号２の残基２〜５６５と少なくとも９９％又は９９．５％同一のアミノ酸配列、２）配列番号３の残基２〜５６６と少なくとも９９％又は９９．５％同一のアミノ酸配列、及び３）配列番号４の残基２〜５６６と少なくとも９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％又は９９．５％同一のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む組み換え最適化Ｈ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチドを含み得る。或る特定の実施形態では、プライミングワクチンは配列番号１の残基２〜５６６を含む第１の組み換え最適化Ｈ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチドを含むか又はそれからなり、ブースティングワクチンは１）配列番号２の残基２〜５６５、２）配列番号３の残基２〜５６６、及び３）配列番号４の残基２〜５６６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む第２の組み換え最適化Ｈ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチドを含むか又はそれからなる。
幾つかの実施形態では、被験体において免疫応答を誘発するか又は免疫化する方法は、
配列番号１と少なくとも９８％、９８．５％、９９％又は９９．５％同一のアミノ酸配列を含む第１の組み換え最適化Ｈ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチドを含むプライミングワクチンを投与することと、
配列番号２と少なくとも９９％又は９９．５％同一のアミノ酸配列を含む第２の組み換え最適化Ｈ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチドを含むブースティングワクチンを投与することと、
を含む。或る特定の実施形態では、第１の組み換え最適化Ｈ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチドは配列番号１の残基２〜５６６と少なくとも９８％、９８．５％、９９％又は９９．５％同一のアミノ酸配列を含み、第２の組み換え最適化Ｈ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチドは配列番号２の残基２〜５６５と少なくとも９９％又は９９．５％同一のアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、第１の組み換え最適化Ｈ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチドは配列番号１のアミノ酸配列又は配列番号１の残基２〜５６６を含み、第２の組み換え最適化Ｈ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチドは配列番号２のアミノ酸配列又は配列番号２の残基２〜５６５を含む。
幾つかの実施形態では、被験体において免疫応答を誘発するか又は免疫化する方法は、
配列番号１と少なくとも９８％、９８．５％、９９％又は９９．５％同一のアミノ酸配列を含む第１の組み換え最適化Ｈ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチドを含むプライミングワクチンを投与することと、
配列番号３と少なくとも９９％又は９９．５％同一のアミノ酸配列を含む第２の組み換え最適化Ｈ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチドを含むブースティングワクチンを投与することと、
を含む。或る特定の実施形態では、第１の組み換え最適化Ｈ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチドは配列番号１の残基２〜５６６と少なくとも９８％、９８．５％、９９％又は９９．５％同一のアミノ酸配列を含み、第２の組み換え最適化Ｈ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチドは配列番号３の残基２〜５６６と少なくとも９９％又は９９．５％同一のアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、第１の組み換え最適化Ｈ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチドは配列番号１のアミノ酸配列又は配列番号１の残基２〜５６６を含み、第２の組み換え最適化Ｈ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチドは配列番号３のアミノ酸配列又は配列番号３の残基２〜５６６を含む。
幾つかの実施形態では、被験体において免疫応答を誘発するか又は免疫化する方法は、
配列番号１と少なくとも９８％、９８．５％、９９％又は９９．５％同一のアミノ酸配列を含む第１の組み換え最適化Ｈ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチドを含むプライミングワクチンを投与することと、
配列番号４と少なくとも９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％又は９９．５％同一のアミノ酸配列を含む第２の組み換え最適化Ｈ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチドを含むブースティングワクチンを投与することと、
を含む。或る特定の実施形態では、第１の組み換え最適化Ｈ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチドは配列番号１の残基２〜５６６と少なくとも９８％、９８．５％、９９％又は９９．５％同一のアミノ酸配列を含み、第２の組み換え最適化Ｈ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチドは配列番号４の残基２〜５６６と少なくとも９９％又は９９．５％同一のアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、第１の組み換え最適化Ｈ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチドは配列番号１のアミノ酸配列又は配列番号１の残基２〜５６６を含み、第２の組み換え最適化Ｈ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチドは配列番号４のアミノ酸配列又は配列番号４の残基２〜５６６を含む。
他の実施形態では、上述のプライミングワクチン及びブースティングワクチンの投与順序は逆にしてもよい。このため、或る特定の実施形態では、プライミングワクチンは１）配列番号２と少なくとも９９％又は９９．５％同一のアミノ酸配列、２）配列番号３と少なくとも９９％又は９９．５％同一のアミノ酸配列、及び３）配列番号４と少なくとも９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％又は９９．５％同一のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む組み換え最適化Ｈ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチドを含むことができ、ブースティングワクチンは配列番号１と少なくとも９８％、９８．５％、９９％又は９９．５％同一のアミノ酸配列を含む組み換え最適化Ｈ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチドを含むことができる。或る特定の実施形態では、プライミングワクチンは配列番号２、配列番号３及び配列番号４のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む第１の組み換え最適化Ｈ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチドを含むか又はそれからなり、ブースティングワクチンは配列番号１のアミノ酸配列を含む第２の組み換え最適化Ｈ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチドを含むか又はそれからなる。
他の実施形態では、プライミングワクチンは１）配列番号２の残基２〜５６５と少なくとも９９％又は９９．５％同一のアミノ酸配列、２）配列番号３の残基２〜５６６と少なくとも９９％又は９９．５％同一のアミノ酸配列、及び３）配列番号４の残基２〜５６６と少なくとも９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％又は９９．５％同一のアミノ酸配列からなる群から選択される組み換え最適化Ｈ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチドを含み得る。ブースティングワクチンは、配列番号１の残基２〜５６６と少なくとも９８％、９８．５％、９９％又は９９．５％同一のアミノ酸配列を含む組み換え最適化Ｈ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチドを含み得る。或る特定の実施形態では、プライミングワクチンは１）配列番号２の残基２〜５６５、２）配列番号３の残基２〜５６６、及び３）配列番号４の残基２〜５６６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む第１の組み換え最適化Ｈ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチドを含むか又はそれからなり、ブースティングワクチンは配列番号１の残基２〜５６６を含む第２の組み換え最適化Ｈ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチドを含むか又はそれからなる。
幾つかの実施形態では、被験体において免疫応答を誘発するか又は免疫化する方法は、
配列番号２と少なくとも９９％又は９９．５％同一のアミノ酸配列を含む第１の組み換え最適化Ｈ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチドを含むプライミングワクチンを投与することと、
配列番号１と少なくとも９８％、９８．５％、９９％又は９９．５％同一のアミノ酸配列を含む第２の組み換え最適化Ｈ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチドを含むブースティングワクチンを投与することと、
を含む。或る特定の実施形態では、第１の組み換え最適化Ｈ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチドは配列番号２の残基２〜５６５と少なくとも９９％又は９９．５％同一のアミノ酸配列を含み、第２の組み換え最適化Ｈ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチドは配列番号１の残基２〜５６６と少なくとも９８％、９８．５％、９９％又は９９．５％同一のアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、第１の組み換え最適化Ｈ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチドは配列番号２のアミノ酸配列又は配列番号２の残基２〜５６５を含み、第２の組み換え最適化Ｈ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチドは配列番号１のアミノ酸配列又は配列番号１の残基２〜５６６を含む。
幾つかの実施形態では、被験体において免疫応答を誘発するか又は免疫化する方法は、
配列番号３と少なくとも９９％又は９９．５％同一のアミノ酸配列を含む第１の組み換え最適化Ｈ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチドを含むプライミングワクチンを投与することと、
配列番号１と少なくとも９８％、９８．５％、９９％又は９９．５％同一のアミノ酸配列を含む第２の組み換え最適化Ｈ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチドを含むブースティングワクチンを投与することと、
を含む。或る特定の実施形態では、第１の組み換え最適化Ｈ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチドは配列番号３の残基２〜５６６と少なくとも９９％又は９９．５％同一のアミノ酸配列を含み、第２の組み換え最適化Ｈ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチドは配列番号１の残基２〜５６６と少なくとも９８％、９８．５％、９９％又は９９．５％同一のアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、第１の組み換え最適化Ｈ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチドは配列番号３のアミノ酸配列又は配列番号３の残基２〜５６６を含み、第２の組み換え最適化Ｈ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチドは配列番号１のアミノ酸配列又は配列番号１の残基２〜５６６を含む。
幾つかの実施形態では、被験体において免疫応答を誘発するか又は免疫化する方法は、
配列番号３と少なくとも９９％又は９９．５％同一のアミノ酸配列を含む第１の組み換え最適化Ｈ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチドを含むプライミングワクチンを投与することと、
配列番号２と少なくとも９９％又は９９．５％同一のアミノ酸配列を含む第２の組み換え最適化Ｈ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチドを含むブースティングワクチンを投与することと、
を含む。或る特定の実施形態では、第１の組み換え最適化Ｈ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチドは配列番号３の残基２〜５６６と少なくとも９９％又は９９．５％同一のアミノ酸配列を含み、第２の組み換え最適化Ｈ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチドは配列番号２の残基２〜５６５と少なくとも９９％又は９９．５％同一のアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、第１の組み換え最適化Ｈ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチドは配列番号３のアミノ酸配列又は配列番号３の残基２〜５６６を含み、第２の組み換え最適化Ｈ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチドは配列番号２のアミノ酸配列又は配列番号２の残基２〜５６５を含む。
ブースターワクチンはプライマーワクチンの後に被験体に投与される。プライミングワクチン及びブースティングワクチンの投与は任意の好適な時間枠で隔てることができる。例えば、ブースターワクチンはプライミングワクチンの投与の１週間、２週間、３週間、４週間、５週間若しくは６週間、又は上述の値の任意の２つによって規定される範囲の後に投与することができる。被験体に投与するプライミングワクチン及びブースティングワクチンの用量は任意の副作用の程度、特定の投与経路等を含む多数の因子によって決まる。或る特定の実施形態では、プライミングワクチンの用量は約１５μｇ〜４５μｇ（例えば約１５μｇ、２０μｇ、２５μｇ、３０μｇ、３５μｇ、４０μｇ又は４５μｇ）の組み換えＨ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチドを含む。或る特定の実施形態では、ブースティングワクチンの用量は約１５μｇ〜４５μｇ（例えば約１５μｇ、２０μｇ、２５μｇ、３０μｇ、３５μｇ、４０μｇ又は４５μｇ）の組み換えＨ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチドを含む。幾つかの実施形態では、ブースティングワクチンの用量はプライミングワクチンの用量と同じである。
本発明の免疫原性組成物は単独で、又は他のワクチン及び／又は抗体を含むが、これらに限定されない１つ以上の他の治療剤と組み合わせて投与することができる。「と組み合わせて」とは、作用物質を同時に投与するか、又はともに送達するために配合しなければならないことを意味することを意図せず、これらの送達方法は本発明の範囲内である。概して、各々の作用物質はその作用物質について決定される用量及び時間スケジュールで投与される。幾つかの実施形態では、本発明による医薬組成物及び／又は本明細書に記載される最適化ＨＡポリペプチドは、抗ウイルス剤（例えば、オセルタミビル（ＴＡＭＩＦＬＵ（商標））、ザナミビル（ＲＥＬＥＺＡ（商標））等）及び／又はシアリダーゼの１つ以上と組み合わせて投与される。
幾つかの実施形態では、併用投与（例えば、免疫原性カクテル組成物又はプライム−ブーストレジメン）により少なくとも６種、少なくとも７種、少なくとも８種、少なくとも９種、少なくとも１０種、少なくとも１１種、少なくとも１２種、少なくとも１３種、少なくとも１４種、少なくとも１５種、少なくとも１６種、少なくとも１７種、少なくとも１８種、少なくとも１９種、少なくとも２０種、少なくとも２１種、少なくとも２２種、少なくとも２３種、少なくとも２４種又は少なくとも２５種の異なるＨ１Ｎ１インフルエンザ株に対する防御免疫応答が誘発される。特定の実施形態では、「防御免疫応答を誘発する」は例えば、概してインフルエンザワクチン有効性の代替的測定値として既知の血球凝集阻害アッセイ（ＨＡＩ）を用いて確認することができる。ＨＡＩアッセイではニワトリ、シチメンチョウ又はウマの赤血球をＨ１Ｎ１に特異的な抗体の検出に使用することができる。特定の実施形態では、防御免疫応答はインフルエンザ疾患の予防及び低減と関連付けられた１：４０を超える平均ＨＡＩ力価を誘発することによって実証される。幾つかの実施形態では、本明細書に記載される免疫原性組成物は、インフルエンザ感染の予防法又は治療のために被験体に投与した場合に少なくとも１：３０、１：４０、１：５０、１：６０、又は１：３０〜１：６０若しくは１：４０〜１：６０の範囲内のＨＡＩ抗体力価を誘発する。およそ１：３２〜１：４０のＨＡＩ抗体力価は、不活化ヒトインフルエンザウイルスワクチンによる免疫化後に概して約５０％の被験体を感染から保護する。ｌｏｇ ２データを変換する場合、５．５を僅かに下回る値が１：４０のＨＡＩ抗体力価に相当する。しかしながら、１：８と低い血清ＨＡＩ抗体力価がヒトインフルエンザウイルスによる感染に対する耐性をもたらすことが示され、保護に必要とされる抗体のレベルが相当低い可能性があることが示された（Treanor, J. & Wright, P. F. Immune correlates of protection against influenza in the human challenge model. Dev. Biol. (Basel), 2003, 115:97-104、引用することにより本明細書の一部をなす）。
幾つかの実施形態では、防御免疫応答の誘発はセロコンバージョン率によって同定することができる。特定の実施形態では、セロコンバージョンの保護レベルはＨＡＩ力価の少なくとも４倍の上昇、例えば１：１０未満の投与又はワクチン接種前ＨＡＩ力価及び１：４０以上のワクチン接種後力価と規定される。言い換えると、セロコンバージョンの成功率は、約１：１０未満のワクチン接種前ＨＡＩ力価及び約１：４０超のワクチン接種後ＨＡＩ力価、又は約１：１０超のワクチン接種前ＨＡＩ力価及びワクチン接種後ＨＡＩ抗体力価の最低４倍の上昇を有する被験体のパーセンテージとして規定することができる。特定の実施形態では、本明細書に記載される免疫原性組成物は、例えばインフルエンザ感染の予防法又は治療のために被験体に投与した場合に少なくとも３倍、４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍のＨＡＩ力価の上昇のセロコンバージョン率を誘発する。特定の実施形態では、免疫原性組成物はインフルエンザ感染の予防法又は治療のために被験体に投与した場合に、セロコンバージョン（ＨＡＩによって測定される）を少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％又は少なくとも９０％改善する。幾つかの実施形態では、併用投与（例えば、免疫原性カクテル組成物又はプライム−ブーストレジメン）は少なくとも５種、少なくとも６種、少なくとも７種、少なくとも８種、少なくとも９種、少なくとも１０種又は少なくとも１１種（例えば１１種）の異なるＨ１Ｎ１インフルエンザ株にわたる防御免疫応答を生成する。
動物実験
本発明は、動物宿主において本発明による最適化ＨＡポリペプチドを試験する方法を提供する。本明細書で使用される場合、「動物宿主」はインフルエンザ研究に好適な任意の動物モデルを含む。例えば、本発明に好適な動物宿主は霊長類、フェレット、ネコ、イヌ、ウシ、ウマ、マウス、ハムスター、モルモット、ウサギ及びラット等の齧歯類を含む任意の哺乳動物宿主であり得る。幾つかの実施形態では、本発明に用いられる動物宿主はフェレットである。特に、幾つかの実施形態では、動物宿主は（任意に本発明による組成物中の）本発明による結合剤の投与前にウイルス曝露又は感染に対してナイーブである。幾つかの実施形態では、動物宿主は本明細書に記載される最適化Ｈ１Ｎ１ ＨＡポリペプチドの併用投与（例えば、免疫原性カクテル組成物又はプライム−ブーストレジメン）の前に又はそれと同時にインフルエンザウイルスを接種するか、感染させるか又は別の方法でウイルスに曝露する。本発明の実施に際して使用される動物宿主は当該技術分野で既知の任意の方法によってウイルスを接種するか、感染させるか又は別の方法でウイルスに曝露することができる。幾つかの実施形態では、動物宿主の鼻腔内にウイルスを接種するか、感染させるか又はウイルスに曝露することができる。
ナイーブ及び／又は接種動物を様々な研究のいずれに使用することもできる。例えば、かかる動物モデルは当該技術分野で既知のようにウイルス伝播研究に使用することができる。ウイルス伝播研究におけるフェレットの使用が企図され、ヒトにおけるウイルス伝播の高信頼性の予測因子として働くことができる。例えば、接種動物（例えばフェレット）からナイーブ動物へのウイルスインフルエンザの空気伝播は当該技術分野で既知である（Tumpey et al., 2007, Science 315; 655-59、引用することにより本明細書の一部をなす）。ウイルス伝播研究を用いて、本発明によるコンピュータ最適化ＨＡポリペプチドを試験することができる。例えば、本明細書に記載されるコンピュータ最適化ＨＡポリペプチドのカクテル又は異なる個々のＣＯＢＲＡのプライム−ブーストレジメンを好適な動物宿主に投与し、動物宿主での広範な免疫応答の誘発における該カクテル又はプライム−ブーストレジメンの有効性を決定することができる。動物宿主における研究から集めた情報を用いて、ヒト宿主において広く防御的な応答を誘発する上記カクテル又はプライム−ブーストレジメンの有効性を予測することができる。
本発明は以下の実施例を参照することによってより完全に理解される。全ての文献引用は引用することにより本明細書の一部をなす。
実施例１ − 材料及び方法
Ｈ１Ｎ１ ＣＯＢＲＡ Ｈａの設計及び系統分析。コンピュータ最適化広反応性抗原（ＣＯＢＲＡ）の設計及び特性化は以前に記載されている（例えば米国特許出願公開第２０１４／０１４７４５９号、国際公開第２０１３／１４８１６４号及び国際公開第２０１２／０３６９９３号（引用することにより本明細書の一部をなす）を参照されたい）。ＨＡ配列をＨ１Ｎ１の異なる抗原期（antigenic eras）に基づいて年代順に、及び各々のインフルエンザウイルスを単離した種によって設計した。これらの設計は、約１００年間にわたってヒトにおいて単離されたＨ１Ｎ１インフルエンザウイルスの進化を考慮したものである。単離されたウイルスは、より高い配列変動多様性をもたらす異なる抗原期のＨ１Ｎ１ ＨＡ配列を示す。ＣＯＢＲＡ設計には、独自のＨＡドメインの抗原型を考慮に入れるためにこれらの年代順に異なる時期のＨ１Ｎ１ ＨＡ配列を用いた。方法論に使用される配列は１９１８年〜２０１２年、１９７８年〜２００８年及び１９９９年〜２０１２年にヒトから単離されたＨＡ配列、並びに１９３３年〜１９９８年に単離されたウイルスに由来するブタＨＡ配列を含むものであった。
次いで、特異的な一次コンセンサス配列をアラインメントし、最も多く見られるアミノ酸を選んで二次コンセンサス配列を得た。コンセンサス生成の各回について、多重アラインメント分析を適用し、コンセンサス配列を、ＡｌｉｇｎＸ（Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ）を用いて生成した。コンピュータ最適化広反応性抗原（ＣＯＢＲＡ）と称される最終アミノ酸配列を逆翻訳し、コドン使用頻度及びＲＮＡ最適化を含む哺乳動物細胞における発現について最適化した（GeneArt；Regensburg，Germany）。最終コンセンサス配列は表１中の４つのＨ１Ｎ１ ＣＯＢＲＡ ＨＡ名称の１つで称される。Ｘ１（配列番号４）は過去約１００年間のＨ１Ｎ１の歴史を表すＨＡ配列を包含するものであった（表１）。Ｘ３（配列番号３）はパンデミックＨ１Ｎ１ ＨＡ配列を含有しないが、Ｘ６（配列番号２）は２００９年のパンデミックＨ１Ｎ１時期の後の配列を含有する。Ｐ１（配列番号１）はヒト及びブタ種の両方から単離された独自のＨ１Ｎ１ ＨＡ配列セットを表す。ＣＯＢＲＡ ＨＡタンパク質の系統分析から、各々の分子が異なる代表的な野生型ワクチン株とクラスタ化したことが示された（データは示さない）。Ｐ１ ＣＯＢＲＡ ＨＡはブタ様ウイルスを有する系統樹上に位置し（ＣＡ／０９、ＮＪ／７６及びＳＣ／１９１８）、Ｘ１ ＣＯＢＲＡは歴史的Ｈ１Ｎ１ウイルスとクラスタ化した。Ｘ３及びＸ６ Ｈ１Ｎ１ ＣＯＢＲＡ ＨＡタンパク質は近代の季節性ＨＡタンパク質とクラスタ化した。さらに、ＣＯＢＲＡ ＨＡ配列の各々を用いるＢＬＡＳＴ検索から、各々の配列が環境から単離されていない独自配列であることが明らかになった（データは示さない）。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ発現。Ｈ１Ｎ１ ＣＯＢＲＡ ＨＡ構築物を合成し、ｐＴＲ６００発現ベクターに挿入した。ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）２９３Ｔ細胞（１×１０６）を、各々のＣＯＢＲＡ又は野生型ＨＡ遺伝子カセットを発現する３μｇのＤＮＡで一過性にトランスフェクトした。細胞を３７℃で７２時間インキュベートした後、１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ １００に溶解させ、遠心分離後に清澄化上清を採取した。次いで、細胞溶解物を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で電気泳動し、ＰＶＤＦ膜に転写した。ブロットをＨ１Ｎ１に由来するＨＡを発現するウイルスによる感染からプールしたマウス抗血清を用いて精査した。次いで、ＨＡ−抗体複合体をヤギ抗マウスＩｇＧ ＨＲＰ（Southern Biotech；Birmingham，AL，USA）を用いて検出した。ＨＲＰ活性を化学発光基質（Pierce Biotechnology；Rockford IL，USA）を用いて検出し、Ｘ線フィルム（ThermoFisher；Pittsburgh，PA，USA）に感光させた。
機能的特性化。受容体結合特徴を決定するために、ＣＯＢＲＡ ＨＡタンパク質を含有するウイルス様粒子（ＶＬＰ）を以前に記載されているように哺乳動物細胞系の上清から精製した。ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞をＨＩＶ Ｇａｇ、ＣＯＢＲＡ ＨＡ及びノイラミニダーゼ（ＮＡ、Ａ／タイ／１（ＫＡＮ−１）／２００４）を発現するプラスミドで一過性にトランスフェクトし、３７℃で７２時間インキュベートした。上清を収集し、ＶＬＰを超遠心分離（体積当たりの重量で２０％のグリセロールを用いて１０００００×ｇ）によって４℃で４時間精製した。ペレットを続いてリン酸緩衝食塩水ＰＢＳ（ｐＨ７．２）に再懸濁し、使用時まで−８０℃で保管した。タンパク質濃度をＭｉｃｒｏ ＢＣＡ（商標） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ（Pierce Biotechnology，Rockford，IL，USA）によって決定した。ＣＯＢＲＡ ＨＡ ＶＬＰを総ＨＡタンパク質によって測定される様々な量で調製し、各々個々の調製物をＶ字底マイクロタイタープレート内で二倍階段希釈した。ＰＢＳ中の同量の１％ウマ赤血球（ＲＢＣ）（Lampire；Pipersville，PA，USA）を希釈ＶＬＰに添加し、室温で６０分間インキュベートした。ＨＡ力価を、凝集ＲＢＣを含有する最後のウェルの逆希釈（reciprocal dilution）によって決定した。
ワクチン調製。ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞をＭ１（Ａ／プエルトリコ／８／１９３４、哺乳動物細胞における発現について最適化された）、ＮＡ（Ａ／タイ／１（ＫＡＮ−１）／２００４、哺乳動物細胞における発現について最適化された）及びＣＯＢＲＡ ＨＡ、又は野生型Ｈ１Ｎ１株に由来するＨＡを発現するプラスミドで一過性にトランスフェクトし、３７℃で７２時間インキュベートした（Medigen Inc，Rockville，MD，USA）。上清を収集し、細胞残屑を低速遠心分離によって除去し、続いて０．２２μｍ滅菌フィルターを通して真空濾過した。ＶＬＰを４℃で４時間の超遠心分離（体積当たりの重量で２０％のグリセロールを用いて１０００００×ｇ）によって精製した。ペレットを続いてＰＢＳ（ｐＨ７．２）に再懸濁し、単回使用アリコートで使用時まで−８０℃で保管した。総タンパク質濃度を、Ｍｉｃｒｏ ＢＣＡ（商標） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ（Pierce Biotechnology，Rockford，IL，USA）によって決定した。
ＨＡ特異的含量をウエスタンブロット及びデンシトメトリーによって決定した。精製組み換えＣＯＢＲＡ ＨＡ及び精製ＶＬＰを標準総タンパク質量で調製し、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で電気泳動し、ＰＶＤＦ膜に転写した。ブロットを、マウスポリクローナル抗血清を用いて精査し、ＨＡ−抗体複合体をホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）にコンジュゲートしたヤギ抗マウスＩｇＧ（Southern Biotech；Birmingham，AL，USA）を用いて検出した。ＨＲＰを化学発光基質（Pierce Biotechnology；Rockford IL，USA）によって検出し、Ｘ線フィルム（ThermoFisher；Pittsburgh，PA，USA）に感光させた。バンドの密度を、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（NIH）を用いて決定した。組み換えＨＡバンドの密度を用いて標準曲線を算出し、精製ＶＬＰの密度を組み換えＨＡによる結果を用いて内挿した。一価不活化インフルエンザスプリットウイルスワクチン（Sanofi-Pasteur，Swiftwater，PA，USA）はＡ／ニューカレドニア／２０／１９９９、Ａ／ブリスベン／５９／２００７又はＡ／カリフォルニア／０７／２００９Ｈ１Ｎ１ウイルスを表す。実験は三連で行い、複数の曝露時点を全ての反復について分析した。
マウス研究。ＢＡＬＢ／ｃマウス（ハツカネズミ、雌性、６週〜８週）をJackson Laboratories（Bar Harbor，ME，USA）から購入し、マイクロアイソレーターユニットに収容し、食餌及び水を自由摂取させ、ＵＳＤＡの実験動物ガイドライン下で飼育した。マウス（１群当たり１６匹のマウス）に、精製ＶＬＰ（３．０μｇ）をデンシトメトリーアッセイによるＨＡ含量に基づいてワクチン接種するか、又は一価不活化スプリットインフルエンザワクチン（ＩＩＶ）を筋肉内注射によって０週目にワクチン接種した後、同じ用量の異なるワクチンを用いて４週目及び８週目にブーストした。加えて、一部のマウスにＨ１Ｎ１ ＣＯＢＲＡ ＶＬＰワクチンのカクテル（各１．５μｇ用量の２つのワクチン）を投与した。各用量のワクチンに、製造業者のプロトコルに従ってＡＦＯ３若しくはＩｍｊｅｃｔ（商標）アラムアジュバント（Pierce Biotechnology；Rockford，IL，USA）として配合するか、又はリン酸緩衝食塩水単独をモックワクチン接種とした。各ワクチン接種の２８日後に、血液を麻酔マウスから眼窩後叢を介して収集し、マイクロチューブに移した。チューブを遠心分離し、血清サンプルを取り出し、−２０±５℃で凍結した。
最終ワクチン接種の４週間後に、マウスを５０μｌ容量の５×１０６プラーク形成単位（ＰＦＵ）のＡ／カリフォルニア／０７／２００９（Ｈ１Ｎ１）で鼻腔内チャレンジした。感染後にマウスを体重減少、疾患兆候及び死亡について感染後１４日間にわたって毎日モニタリングした。感染後２日目及び３日目に、１時点当たり５匹のマウスをウイルス肺力価の決定のために屠殺した。個々の体重及び死亡を各群について接種後毎日記録した。実験エンドポイントは２０％を超える体重減少と規定した。全ての手順はＮＲＣの実験動物の管理と使用に関する指針（Guide for the Care and Use of Laboratory Animals）、動物福祉法及びＣＤＣ／ＮＩＨの微生物学医学実験室のバイオセーフティ（Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories）に従うものであった。
ＥＬＩＳＡアッセイ。ＥＬＩＳＡアッセイを用いて、ＨＡに対する総抗体力価及びＩｇＧアイソタイプ力価を評定した。高結合９６ウェルポリスチレンプレート（Costar；Lowell，MA，USA）を５０ｎｇ／ウェルの組み換えＨＡで一晩コーティングした。コーティング抗原は以下の代表的なウイルス分離株に由来するものとした：Ａ／カリフォルニア／０７／２００９（Ｈ１Ｎ１）。プレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＰＢＳ（ブロッキングバッファー）で希釈した５％ミルクでブロッキングした。血清サンプルをブロッキングバッファーで希釈し、プレートに添加した。血清を二倍階段希釈し、室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、ＨＲＰコンジュゲートポリクローナルヤギ抗ネズミＩｇＧをブロッキングバッファーで希釈し、プレートに添加した。プレートを室温で１時間インキュベートし、洗浄し、ＨＲＰ活性をＴＭＢ基質（Sigma-Aldrich；St.Louis，MO，USA）により検出した。プレートを暗所で１５分間インキュベートした後、反応を２Ｎ Ｈ２ＳＯ４で停止した。波長４５０ｎｍでの光学密度（ＯＤ４５０）を分光光度計（BioTek；Winooski，VT，USA）によって読み取り、エンドポイント希釈力価を決定した。エンドポイント力価は最後のウェルの逆希釈として決定したが、ナイーブ動物血清の平均ＯＤ４５０＋２標準偏差を超えるＯＤ４５０を有していた。
血球凝集阻害（ＨＡＩ）アッセイ。ＨＡＩアッセイを用いて、ウマ赤血球の凝集を阻害することが可能なＨＡに対する機能的抗体を評定した。プロトコルはＣＤＣの実験室ベースのインフルエンザ監視マニュアルに適合するものであった。非特異的阻害剤を不活化するために、血清を試験前に受容体破壊酵素（ＲＤＥ；デンカ生研株式会社、日本）で処理した。簡潔に述べると、３部のＲＤＥを１部の血清に添加し、３７℃で一晩インキュベートした。ＲＤＥを５６℃で約３０分間のインキュベーションによって不活化した。ＲＤＥ処理血清をＶ字底マイクロタイタープレート内で二倍階段希釈した。およそ８ＨＡＵ／５０μｌに調整した同量の各々のＨ１Ｎ１ウイルスを各ウェルに添加した。プレートに蓋をし、室温で２０分間インキュベートし、続いてＰＢＳ中の１％ニワトリ赤血球（ＲＢＣ）（Lampire Biologicals，Pipersville，PA，USA）を添加した。赤血球を４℃で保管し、調製から７２時間以内に使用した。プレートを撹拌によって混合し、蓋をし、ＲＢＣを室温で１時間沈降させた。ＨＡＩ力価を、非凝集ＲＢＣを含有する最後のウェルの逆希釈によって決定した。陽性及び陰性血清対照が各プレートに含まれていた。全てのマウスは、ワクチン接種前に現在の循環ヒトインフルエンザウイルスに対する既存の抗体について陰性であった（１：１０以下のＨＡＩ）。
プラークアッセイ。メイディンダービーイヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞を６ウェルプレートの各ウェルにプレーティングした（５×１０５）。サンプルを希釈し（１００〜１０−６の最終希釈係数）、ペニシリン−ストレプトマイシンを添加した１００μｌのＤＭＥＭ中の細胞上に重層し、１時間インキュベートした。サンプルを取り出し、細胞を２回洗浄し、培地を２ｍｌのＬ１５培地＋０．８％アガロース（Cambrex；East Rutherford，NJ，USA）と交換し、３７℃、５％ＣＯ２で７２時間インキュベートした。アガロースを除去し、捨てた。細胞を１０％緩衝ホルマリンで固定した後、１％クリスタルバイオレットで１５分間染色した。ｄＨ２Ｏ中で十分に洗浄して過剰なクリスタルバイオレットを除去した後、プレートを乾燥させ、プラークを計数し、プラーク形成単位（ＰＦＵ）／ｍｌを算出した。
統計分析。抗体データの統計的有意性を、二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて決定し、ボンフェローニの事後検定を用いて異なる試験抗原に対する各々のワクチン群間の差異を分析した（多パラメータ）。体重減少、病状スコア及びウイルス力価の差異を二元ＡＮＯＶＡによって分析し、続いて各々のワクチン群について複数の時点でボンフェローニの事後検定を行った。有意性はｐ＜０．０５と規定した。統計分析をＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（商標）ソフトウェアを用いて行った。
実施例２ − モノクローナル抗体とインフルエンザＨＡヘッド及びストーク（stalk）ドメインとの結合
各々の三量化ＣＯＢＲＡ又は野生型ＨＡタンパク質を２９３Ｔ細胞から精製し、４つの以前に特性化されているモノクローナル抗体の結合を試験するために使用した。モノクローナル抗体Ｃ１７９はＨ１Ｎ１ ＨＡタンパク質のストーク中の立体構造領域に結合する。Ｃ１７９は全ての野生型及びＣＯＢＲＡ ＨＡタンパク質に様々な効率で結合した。対照的に、３つのＨＡヘッド特異的モノクローナル抗体は全てではなく、一部のＣＯＢＲＡ及び野生型ＨＡタンパク質に結合した。ＣＨ６５モノクローナル抗体はＡ／ニューカレドニア／２０／１９９９（ＮＣ／９９）に由来するＨＡに結合したが、ＣＡ／０９又はＰＲ／３４に由来するＨＡには結合しなかった。５Ｊ８及び４Ｋ８モノクローナル抗体はどちらもＣＡ／０９に結合したが、他の２つの野生型ＨＡタンパク質には結合しなかった。対照的に、５Ｊ８抗体はＰ１、Ｘ６、Ｘ３及びＸ１ ＣＯＢＲＡ抗原の各々に結合した。ＣＨ６５抗体はＰ１、Ｘ６及びＸ３ ＣＯＢＲＡ抗原に結合したが、Ｘ１ ＣＯＢＲＡ抗原には結合しなかった。モノクローナル抗体４Ｋ８はＸ１のみに結合した。総合すると、モノクローナル抗体の結合パターンから、ＣＯＢＲＡ ＨＡタンパク質が各々異なるエピトープ、ひいては異なる構造を露出することが示される。
実施例３ − プライム−ブーストＨ１Ｎ１ ＣＯＢＲＡ ＨＡ ＶＬＰワクチンは広反応性抗体応答を誘発する
ＢＡＬＢ／ｃマウスに異なる組合せのＣＯＢＲＡ ＶＬＰをプライム−ブースト戦略でワクチン接種し、血清を５６日目に収集した。マウスに４つのＨ１Ｎ１ ＣＯＢＲＡ ＶＬＰワクチン（Ｘ１、Ｘ３、Ｘ６及びＰ１）の１つを複数のプライム−ブースト組合せでワクチン接種し、血清サンプルをワクチン接種後８週目に分析した。Ｘ１及びＸ６ ＣＯＢＲＡ ＶＬＰのプライム−ブースト組合せをワクチン接種したマウスはパネル中の１５種のウイルスのいずれに対しても僅かなＨＡＩ活性しか有さず（図１Ａ及び図１Ｄ）、Ｘ３でプライムし、Ｘ６でブーストしたマウスはＳｉｎｇ／８６、Ｂｅｉ／９５、ＮＣ／９９及びＳＩ／０６に対するＨＡＩ活性を有していた（図１Ｂ）。他の組合せは僅かな又は低いＨＡＩ活性を誘発した（図１Ｃ〜図１Ｆ）。Ｐ１を欠く任意のプライム−ブースト投与によるパンデミックＨ１Ｎ１（２００９年〜２０１３年）又は歴史的Ｈ１Ｎ１株（１９３４年〜１９５７年）に対する活性は僅かしか又は全く見られなかった。
Ｐ１ ＶＬＰを含有する組合せをワクチン接種したマウスは、異なるＨ１Ｎ１ウイルス群を認識する抗体を誘発した。Ｐ１ ＶＬＰでプライムした後、Ｘ３又はＸ６ ＶＬＰでブーストしたマウスは、４種の季節性（Ｗｅｉｓｓ／４３、Ｓｉｎｇ／８６、Ｂｉｅ／９５、ＮＣ／９９）及び１種のパンデミックＨ１Ｎ１ウイルスに対する高いＨＡＩ活性を有していた（図１Ｇ及び図１Ｉ）。Ｘ３ ＶＬＰをマウスのプライムに使用し、これらのマウスをＰ１でブーストした場合、同じ４種の季節性ウイルスに対するＨＡＩ活性が検出されたが、パンデミックウイルスに対するＨＡＩは検出されなかった（図１Ｈ）。興味深いことに、Ｐ１ ＶＬＰによるプライミングはＰ１ ＶＬＰによるブースティングよりも高いＨＡＩ力価を誘発する。Ｐ１によるプライミング及びＸ１によるブースティングはパンデミック株のみに対してＨＡＩ活性を誘発し（図１Ｋ）、マウスをＸ１ ＶＬＰでプライムし、任意の他のＣＯＢＲＡ ＶＬＰワクチンでブーストした場合に検出可能なＨＡＩ活性は見られなかった。興味深いことに、Ｐ１でプライムし、Ｘ３ ＶＬＰでブーストしたマウスはＰ１及びＸ６ ＶＬＰのプライム−ブースト投与と同様のＨＡＩ活性を有していた。特に、Ｐ１及びＸ１の組合せは極めて不良であった。
Ｐ１及びＸ６ ＶＬＰのプライム−ブースト組合せでワクチン接種したマウスは、パンデミックウイルス（Ｃａｌ／０９）を含むＨ１Ｎ１ウイルスに対してはるかに広い応答、及び季節性インフルエンザウイルスの広範な時間的分布を示した（図１Ｉ及び図１Ｊ）。Ｘ６ ＣＯＢＲＡは１９９９年〜２０１２年のＨＡ配列のアラインメントを用いて設計したが、Ｐ１及びＸ６ ＣＯＢＲＡの併用投与は予期せぬことに、１９９９年以前に単離された多数のＨ１Ｎ１インフルエンザ株に対する活性を含む広いＨＡＩ活性を示した。
Ｐ１ ＶＬＰによるプライミング及びＸ６ ＶＬＰによるブースティングは、パンデミック株及び季節性株の両方に対してＸ６ ＶＬＰによるプライミング及びＰ１ ＶＬＰによるブースティングよりも高いＨＡＩ力価を誘発し、この場合もプライム−ブーストレジメンの投与順序の重要性が強調される（図１Ｉ及び図１Ｊ）。Ｐ１及びＸ３ ＶＬＰのプライム−ブースト組合せも、パンデミック株及び季節性株の両方に対して高いＨＡＩ力価を誘発した（図１Ｇ及び図１Ｈ）。特に、Ｐ１によるプライミング及びＸ３ ＶＬＰによるブースティングはＣａｌ／０９株に対して強いＨＡＩ活性をもたらしたが、Ｘ３によるプライミング及びＰ１ ＶＬＰによるブースティングは、この同じ株に対する活性を殆ど又は全くもたらさなかった（図１Ｇ及び図１Ｈ）。このため、これらのＨ１Ｎ１ ＣＯＢＲＡの投与順序が重要であるが、順序が異なるＨ１Ｎ１インフルエンザ株に対する応答の幅にどのように影響を及ぼすかを予測することは困難である。
実施例４ − Ｈ１Ｎ１ ＣＯＢＲＡ ＨＡ ＶＬＰワクチンのカクテル混合物は野生型Ｈ１Ｎ１株に対する広反応性ＨＡＩ活性を誘発する
ＣＯＢＲＡ ＨＡ ＶＬＰワクチンのカクテルを混合し、１５種のＨ１Ｎ１分離株のパネルに対するＨＡＩ活性について試験した。マウスに異なる組合せの２つのＨ１Ｎ１ ＣＯＢＲＡ ＨＡ ＶＬＰワクチン（各１．５μｇ用量のＶＬＰワクチン）を同時にワクチン接種した。Ｘ１及びＸ３ ＶＬＰのカクテルをワクチン接種したマウスは、パネル中の３つのウイルス（Ｓｉｎｇ／８６、Ｂｅｉ／９５及びＮＣ／９９）に対するＨＡＩ活性を有し、Ｘ１及びＸ６ ＶＬＰのカクテルをワクチン接種したマウスはＮＣ／９９及びＳＩ／０６のみを認識した（図２Ａ）。しかしながら、Ｘ３及びＸ６ ＶＬＰを同時にワクチン接種したマウスは６種の季節性Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルスに対するＨＡＩ活性を有していた（図２Ａ）。Ｘ１及びＸ６のカクテルは或る特定の株、特にＳｉｎｇ／８６及びＢｅｉ／９５に対して拮抗作用を有するようであり、Ｈ１Ｎ１ ＣＯＢＲＡ ＨＡワクチンの併用投与が予測不可能であることが強調された。マウスにＰ１ ＶＬＰを含有するカクテルをワクチン接種した場合、全てのマウスがＣＡ／０９に対する高いＨＡＩ活性を有していた（図２Ｂ）。Ｐ１及びＸ１、Ｘ３又はＸ６のカクテルは１９８６年〜２００６年のウイルスに対するＨＡＩ活性を有する抗体を誘発したが、以前のＨ１Ｎ１株又はＢｒｉｓ／０７に対する活性は僅かしか又は全く見られなかった。驚くべきことに、パンデミックＰ１ ＣＯＢＲＡをＸ１、Ｘ３又はＸ６ ＣＯＢＲＡに添加することで、季節性Ｈ１Ｎ１季節性株、特にＸ１／Ｘ３、Ｘ１／Ｘ６又はＸ３／Ｘ６の組合せのいずれも任意のＨＡＩ活性を示さなかったＮＪ／７６及びＴＸ／９１株に対する保護の幅が拡大された（図２Ａと図２Ｂとの比較）。同様の結果がＸ１、Ｘ３及びＰ１の三重カクテルをワクチン接種したマウスで観察された（図２Ｃ）。興味深いことに、Ｐ１／Ｘ３ ＶＬＰワクチンのカクテルでプライムし、Ｐ１／Ｘ６ ＶＬＰワクチンのカクテルでブーストしたマウス群はＳｉｎｇ／８６、Ｂｅｉ／９５、ＮＣ／９９、ＳＩ／０６及びＣＡ／０９に対して高いＨＡＩ活性を有していた（図２Ｄ）。このＨＡＩ活性パターンは、ＣＡ／０９に対する高いＨＡＩ活性及びＷｅｉｓｓ／４３に対するＨＡＩ活性の低減を例外としてＸ３ ＶＬＰでプライムし、Ｐ１ ＶＬＰでブーストしたマウスと同様であった（図１Ｈ）。
実施例５ − Ｈ１Ｎ１ ＣＯＢＲＡワクチンの組合せはＣＡ／０９ウイルスによるチャレンジからマウスを保護する
マウスに２つの異なるＨ１Ｎ１ ＣＯＢＲＡのプライム−ブーストレジメンでワクチン接種し、ＣＡ／０９インフルエンザウイルス（５×１０６ＰＦＵ）でチャレンジした。Ｐ１ ＶＬＰを含む任意のプライム−ブースト組合せをワクチン接種したマウスは、感染後６日目までにそれらの元の体重の１３％を失ったＸ１でプライムし、Ｐ１でブーストしたマウスを除いて平均体重減少が７％未満であった（図３Ａ及び図３Ｂ）。全ての他のプライム−ブーストワクチン接種マウスは感染後６日目〜７日目までに体重の１０％〜２０％を失い、一部のマウスが実験エンドポイントに達し、他の残りのマウスはその後ゆっくりと体重を回復し始めた。全てのモックワクチン接種マウスは体重の２０％超を失い、感染後７日目までに全て屠殺した。
カクテルをワクチン接種したマウスについても、Ｐ１ ＶＬＰを含有するワクチンレジメンは、ＣＡ／０９チャレンジに対して他のＣＯＢＲＡ ＶＬＰワクチンカクテルをワクチン接種したマウスよりも良好に保護した（図３Ｃ）。Ｐ１及びＸ３ ＶＬＰのカクテルをワクチン接種したマウスは罹患の兆候及び体重減少を有さず、Ｐ１ ＶＬＰを含有する他のカクテルをワクチン接種したマウスは体重の平均５％〜７％を失った。Ｐ１ ＶＬＰを含有しないカクテルをワクチン接種したマウスは体重の１５％〜２０％を失った（図３Ｃ）。
感染後３日目に、Ｐ１ ＶＬＰでプライムした全てのマウスはそれらの肺において検出可能なウイルス力価を僅かしか又は全く有さず（図４Ａ）、ＣＡ／０９ ＩＩＶをワクチン接種したマウスと同様であった。Ｘ３又はＸ６ ＣＯＢＲＡ ＶＬＰをプライムし、Ｐ１ ＶＬＰをブーストしたマウスは中程度のウイルス肺力価を有していた（１０２ｐｆｕ／ｇ〜１０３ｐｆｕ／ｇ（肺組織））。ＣＯＢＲＡ ＶＬＰの任意の他のプライム−ブーストレジメンでワクチン接種したマウスは１０６ｐｆｕ／ｇを超えるウイルス肺力価を有し、モックワクチン接種マウスと同様であった（図４Ａ）。対照的に、Ｐ１ ＶＬＰを含有する任意のカクテルをワクチン接種したマウスは、それらの肺において実質的に検出可能なウイルス力価を有しなかった（図４Ｂ）。任意の他のカクテルレジメンでワクチン接種したマウスではウイルス肺力価は１０６ｐｆｕ／ｇ超であった。
実施例６ − ナイーブフェレットにおけるＨ１Ｎ１ ＣＯＢＲＡワクチンの防御効果
インフルエンザナイーブの臭腺除去した（de-scented）フィッチフェレット（ムステラ・プトリウス・フロ、雌性、６月齢〜１２月齢）はMarshall Farms（Sayre，Pa.，USA）から購入することができる。フェレットはＳａｎｉ−ｃｈｉｐｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｂｅｄｄｉｎｇ（P.J. Murphy Forest Products，Montville，N.J.，USA）を有するステンレス鋼ケージ（Shor-line，Kansas City，Kans.，USA）に対で収容する。フェレットにＴｅｋｌａｄ Ｇｌｏｂａｌ Ｆｅｒｒｅｔ Ｄｉｅｔ（Harlan Teklad，Madison，Wis.，USA）及び新鮮な水を自由に与える。ＣＯＢＲＡ ＨＡ ＶＬＰをＰＢＳ（ｐＨ７．２）で希釈して最終濃度を達成する。フェレットにデンシトメトリーアッセイによって決定されるＨＡ含量に基づいて、２つの用量（１５μｇ、３μｇ）の１つで精製Ｘ１、Ｘ３、Ｘ６又はＰ１ ＣＯＢＲＡ ＶＬＰを０週目に０．２５ｍｌ容量での大腿四頭筋への筋肉内注射によりワクチン接種した後、３週目にＸ１、Ｘ３、Ｘ６又はＰ１から選択される同じ用量の異なるＣＯＢＲＡ ＶＬＰでブーストする。例えば、フェレットにＰ１ ＣＯＢＲＡ ＶＬＰ（１５μｇ又は３μｇ）をワクチン接種した後、Ｘ１、Ｘ３又はＸ６ ＣＯＢＲＡ ＶＬＰ（１５μｇ又は３μｇ）でブーストする。
代替的には、フェレットにデンシトメトリーアッセイによって決定されるＨＡ含量に基づいて、２つの用量（各ＶＬＰについて７．５μｇ、１．５μｇ）の１つで以下のＸ１、Ｘ３、Ｘ６又はＰ１ ＣＯＢＲＡ ＶＬＰの２つのカクテルを０週目に０．２５ｍｌ容量での大腿四頭筋への筋肉内注射によりワクチン接種した後、同じ用量の同じカクテルでブーストする。例えば、フェレットにＰ１ ＣＯＢＲＡ ＶＬＰ（７．５μｇ又は１．５μｇ）及びＸ１、Ｘ３又はＸ６ ＣＯＢＲＡ ＶＬＰの１つ（７．５μｇ又は１．５μｇ）のカクテルをワクチン接種した後、同じカクテルでブーストする。
ワクチンは使用前に−８０℃で保管し、使用直前にアラムアジュバント（Ｉｍｊｅｃｔ Ａｌｕｍ；Pierce Biotechnology，Rockford，Ill.，USA）と配合する。動物を体重減少、体温、活動の低下、鼻汁、くしゃみ及び下痢を含む有害事象についてワクチン接種レジメン中毎週モニタリングする。ワクチン接種の前に、動物が循環Ａ型インフルエンザ及びＢ型インフルエンザウイルスに対して血清陰性であるかをＨＡＩアッセイによって確認する。各々のワクチン接種の１４日後〜２１日後に、血液を麻酔フェレットから前大静脈を介して収集し、マイクロチューブに移す。チューブを遠心分離し、血清を取り出し、−８０±５℃で凍結する。各ワクチン群のＨＡＩ血清抗体力価を、代表的な再集合体ウイルス又はＣＯＢＲＡ ＨＡ ＶＬＰを用いて５週目に決定する。
最終ワクチン接種の３週間後に、フェレットを１ｍｌ容量の高病原性Ｈ１Ｎ１ウイルスで鼻腔内チャレンジする。感染後にフェレットを体重減少、疾患兆候及び死亡について感染後１４日間にわたって毎日モニタリングする。個々の体重、病状スコア及び死亡を各群について接種後毎日記録する。鼻洗浄を、３ｍｌのＰＢＳを麻酔フェレットの鼻孔に接種７日間にわたって毎日注入することによって行う。洗浄液を収集し、−８０℃で使用時まで保管する。
実施例７ − 予備免疫フェレットにおけるＨ１Ｎ１ ＣＯＢＲＡワクチンの防御効果
インフルエンザナイーブの臭腺除去したフィッチフェレット（ムステラ・プトリウス・フロ、雌性、６月齢〜１２月齢）はMarshall Farms（Sayre，Pa.，USA）から購入することができる。フェレットはＳａｎｉ−ｃｈｉｐｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｂｅｄｄｉｎｇ（P.J. Murphy Forest Products，Montville，N.J.，USA）を有するステンレス鋼ケージ（Shor-line，Kansas City，Kans.，USA）に対で収容する。フェレットにＴｅｋｌａｄ Ｇｌｏｂａｌ Ｆｅｒｒｅｔ Ｄｉｅｔ（Harlan Teklad，Madison，Wis.，USA）及び新鮮な水を自由に与える。
フェレットに季節性Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルス（１×１０６ＰＦＵ）を鼻腔内から１２週間隔で予備感染させる。動物を体重減少、体温、活動の低下、鼻汁、くしゃみ及び下痢を含む有害事象について感染レジメン中毎週モニタリングする。血液を全ての麻酔フェレットから前大静脈鎖骨下静脈を介して各感染後１４日目、２８日目、５６日目及び８４日目に採取する。血清を遠心分離チューブに移す。チューブを遠心分離し、血清を取り出し、−２０±５℃で凍結する。
最終予備感染の４週間後に、フェレットをデンシトメトリーアッセイによって決定されるＨＡ含量に基づいて２つの用量（１５μｇ、３μｇ）のうち１つの精製Ｘ１、Ｘ３、Ｘ６又はＰ１ ＣＯＢＲＡ ＶＬＰで０週目に０．２５ｍｌ容量での大腿四頭筋への筋肉内注射によりチャレンジした後、３週目にＸ１、Ｘ３、Ｘ６又はＰ１から選択される同じ用量の異なるＣＯＢＲＡ ＶＬＰでブーストする。例えば、フェレットにＰ１ ＣＯＢＲＡ ＶＬＰ（１５μｇ又は３μｇ）をワクチン接種した後、Ｘ１、Ｘ３又はＸ６ ＣＯＢＲＡ ＶＬＰ（１５μｇ又は３μｇ）でブーストする。
代替的には、フェレットにデンシトメトリーアッセイによって決定されるＨＡ含量に基づいて、２つの用量（各ＶＬＰについて７．５μｇ、１．５μｇ）の１つで以下のＸ１、Ｘ３、Ｘ６又はＰ１ ＣＯＢＲＡ ＶＬＰの２つのカクテルを０週目に０．２５ｍｌ容量での大腿四頭筋への筋肉内注射によりチャレンジした後、同じ用量の同じカクテルでブーストする。例えば、フェレットにＰ１ ＣＯＢＲＡ ＶＬＰ（７．５μｇ又は１．５μｇ）及びＸ１、Ｘ３又はＸ６ ＣＯＢＲＡ ＶＬＰの１つ（７．５μｇ又は１．５μｇ）のカクテルをワクチン接種した後、同じカクテルでブーストする。
ワクチンは使用前に−８０℃で保管し、使用直前にアラムアジュバント（Ｉｍｊｅｃｔ Ａｌｕｍ；Pierce Biotechnology，Rockford，Ill.，USA）と配合する。動物を体重減少、体温、活動の低下、鼻汁、くしゃみ及び下痢を含む有害事象についてワクチン接種レジメン中毎週モニタリングする。各々のワクチン接種の１４日後〜２１日後に、血液を麻酔フェレットから前大静脈を介して収集し、マイクロチューブに移す。チューブを遠心分離し、血清を取り出し、−８０±５℃で凍結する。各ワクチン群のＨＡＩ血清抗体力価を、代表的な再集合体ウイルス又はＣＯＢＲＡ ＨＡ ＶＬＰを用いて５週目に決定する。
最終ワクチン接種の３週間後に、フェレットを１ｍｌ容量の高病原性Ｈ１Ｎ１ウイルスで鼻腔内チャレンジする。感染後にフェレットを体重減少、疾患兆候及び死亡について感染後１４日間にわたって毎日モニタリングする。個々の体重、病状スコア及び死亡を各群について接種後毎日記録する。鼻洗浄を、３ｍｌのＰＢＳを麻酔フェレットの鼻孔に接種７日間にわたって毎日注入することによって行う。洗浄液を収集し、−８０℃で使用時まで保管する。
実施例８ − ナイーブフェレットにおけるＨ１Ｎ１ ＣＯＢＲＡワクチンの防御効果
異種プライム／ブースト状況におけるＨ１Ｎ１ ＣＯＢＲＡの免疫原性を評価するために、ナイーブフェレットを０日目に指定の生ウイルス（すなわち、Ａ／シンガポール／６／１９８６、Ａ／ブリスベン／５９／２００７、Ａ／カリフォルニア／０７／０９、ＣＯＢＲＡ Ｐ１及びＣＯＢＲＡ Ｘ３）に感染させた（図５Ａ〜図５Ｆ）。ＣＯＢＲＡ Ｐ１及びＣＯＢＲＡ Ｘ３ポリペプチドを弱毒化高収率ＰＲ８バックグラウンドに組み込み、生ウイルスを作製した。この０日目感染はプライミング感染とも称された。次いで、感染フェレットを８４日目及び１６８日目に１５μｇのＡ／カリフォルニア／２００９（ＣＡ／０９）に由来するＨＡタンパク質を有するＶＬＰ又はＡＦ０３アジュバントと組み合わせたＣＯＢＲＡ Ｐ１で免疫化した。ＣＡ／０９ ＨＡは現在のＨ１標準治療に含まれるＨＡであることから、これらのＨ１Ｎ１ ＣＯＢＲＡによって誘発されるＨＡＩ幅の評価に選ばれた。最終免疫化の１４日後に（Ｄ１８２）、ＨＡＩ応答をＨ１ウイルスのパネル（すなわちＳＣ／１９１８、Ａ／ワイス／１／１９４３、Ａ／ＦＭ／１／４７、Ａ／デンバー／１／５７、Ａ／ニュージャージー／８／７６、Ａ／ＵＳＳＲ／９０／７７、Ａ／ブラジル／１／７８、Ａ／チリ／１／８３、Ａ／シンガポール／０６／８６、Ａ／テキサス／３６／９１、Ａ／北京／２６２／９５、Ａ／ニューカレドニア／２０／９９、Ａ／ソロモン諸島／６／０６、Ａ／ブリスベン／５９／０７、Ａ／カリフォルニア／０７／０９及びＡ／フィラデルフィア／１／１３）に対して評価し、Ｌｏｇ２変換ＨＡＩ力価をプロットした。点線は１：４０の力価を示し、指定の株による感染に対する血清保護（seroprotective）力価と相関する（図５Ａ〜図５Ｆ）。
プライミング感染の非存在下で（図５Ａ）、２回の投与後であってもＶＬＰによって非常に限られた免疫原性が誘導された。プライミング感染後に（図５Ｂ〜図５Ｆ）、ＣＯＢＲＡ Ｐ１はＣＡ／０９ ＨＡよりも多数のウイルス株に対してより高い血清保護力価を一貫して誘導した。プライミング感染として使用される非ＣＯＢＲＡウイルスの中でも、シンガポール／６／１９８６が免疫化後に最も広い応答をもたらしたが（図５Ｂ）、ＣＡ／０９は試験した７／１６株に対してのみ血清保護応答を誘導した。対照的に、ＣＯＢＲＡ Ｐ１は試験した１６種のウイルスのうち１４種に対して血清保護力価を誘導し、試験した全ての株についてＣＡ／０９によって誘導されるものと比較してより大規模なＨＡＩ応答の傾向があった。
同様の傾向が全ての他のプライミング感染について観察され、ＣＯＢＲＡ Ｐ１ ＨＡがＡ／ブリスベン／５９／２００７プライミング（ＣＯＢＲＡ Ｐ１の８／１６に対してＣＡ／０９の６／１６；図５Ｃ）、Ａ／カリフォルニア／０７／２００９プライミング（ＣＯＢＲＡ Ｐ１の５／１６に対してＣＡ／０９の４／１６；図５Ｄ）、ＣＯＢＲＡ Ｐ１ プライミング（ＣＯＢＲＡ Ｐ１の８／１６に対してＣＡ／０９の５／１６；図５Ｅ）及びＣＯＢＲＡ Ｘ３ プライミング（ＣＯＢＲＡ Ｐ１の１３／１６に対してＣＡ／０９の８／１６；図５Ｆ）との関連でＣＡ／０９ ＨＡよりも多くの株に対する血清保護応答を開始させた。全ての場合で、ＣＯＢＲＡ Ｐ１ ＶＬＰがＣＡ／０９ ＶＬＰによっても誘導される株に対してより大規模の応答を誘導するという傾向が見られた。これらのデータから、ＣＯＢＲＡ Ｐ１が現在のＣＡ／０９標準治療によって誘発されるよりも広い免疫を誘導することが示され、インフルエンザワクチンに使用される広反応性抗原としての本明細書に開示されるＨ１Ｎ１ ＣＯＢＲＡの有用性が実証される。さらに、これらの結果から、異種プライム／ブーストレジメンをインフルエンザ抗原に対するＨＡＩ応答の幅及び規模を拡大するために使用することができることが示される。
均等物
請求項の要素を修飾する、特許請求の範囲における「第１」、「第２」、「第３」等の序数の使用は、それ自体で、１つの請求項の要素の別の請求項の要素に対する優先順位も、優位性も、順序も暗示するものでもなければ、方法の動作が実行される時間的な順序も暗示するものでもなく、請求項の要素を区別するために、単に、或る特定の名称を有する１つの請求項の要素を、同じ（序数の用語の使用を除く）名称を有する別の要素と区別するラベルとして用いられているにすぎない。
数量を特定していない冠詞（The articles "a" and "an"）は本明細書及び特許請求の範囲で使用される場合、明らかに反対の指示がない限り、複数の指示対象を含むと理解されるものとする。１つ以上の群の成員の間に「又は」を含むクレーム又は記載は、反対の指示がない限り又は文脈から明らかでない限り、群の成員の１つ、２つ以上又は全てが所与の生成物又はプロセスに存在する、それに用いられる又は他の形で関連する場合に満たされるとみなされる。本発明は、正確に１つの群の成員が所与の生成物又はプロセスに存在する、それに用いられる又は他の形で関連する実施形態を含む。本発明は、２つ以上又は全ての群の成員が所与の生成物又はプロセスに存在する、それに用いられる又は他の形で関連する実施形態も含む。さらに、他に指定のない限り又は矛盾若しくは不一致が生じ得ることが当業者に明らかでない限り、本発明が１つ以上の限定、要素、条項、記述用語等が記載の１つ以上のクレームから同じ基本クレームに従属する別のクレーム（又は適切な場合に、任意の他のクレーム）へと導入される全ての変更、組合せ及び置換を包含することが理解される。要素が（例えば、マーカッシュ群又は同様のフォーマットで）リストとして提示される場合、各々の要素の部分群も開示され、任意の要素（複数の場合もある）を群から除外することができることが理解される。概して、本発明又は本発明の態様が特定の要素、特徴等を含むと称される場合、或る特定の本発明の実施形態又は本発明の態様が、かかる要素、特徴等からなるか又はそれらから本質的になることを理解されたい。簡潔さを目的として、これらの実施形態はいずれの場合も具体的に文字通り規定されていない。具体的な除外が本明細書に列挙されるかに関わらず、本発明の任意の実施形態又は態様が明示的に特許請求の範囲から除外され得ることも理解されたい。本発明の背景を説明し、その実施に関する付加的な詳細を与えるために本明細書で言及される刊行物、ウェブサイト及び他の参考資料は引用することにより本明細書の一部をなす。

Claims (21)

  1. 少なくとも２つの組み換えＨ１Ｎ１インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）ポリペプチドの組合せを含む免疫原性組成物であって、配列番号１のアミノ酸配列を含む第１の組み換えインフルエンザＨＡポリペプチドと、配列番号２及び配列番号３のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む第２の組み換えインフルエンザＨＡポリペプチドとを含む、免疫原性組成物。
  2. 配列番号１のアミノ酸配列を含む第１の組み換えインフルエンザＨＡポリペプチドと、配列番号２のアミノ酸配列を含む第２の組み換えインフルエンザＨＡポリペプチドとからなる組み換えＨ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチドの組合せを含む、請求項１に記載の免疫原性組成物。
  3. 配列番号１のアミノ酸配列を含む第１の組み換えインフルエンザＨＡポリペプチドと、配列番号３のアミノ酸配列を含む第２の組み換えインフルエンザＨＡポリペプチドとからなる組み換えＨ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチドの組合せを含む、請求項１に記載の免疫原性組成物。
  4. 配列番号１のアミノ酸配列を含む第１の組み換えインフルエンザＨＡポリペプチドと、配列番号２のアミノ酸配列を含む第２の組み換えインフルエンザＨＡポリペプチドと、配列番号３のアミノ酸配列を含む第３の組み換えインフルエンザＨＡポリペプチドとの組み換えＨ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチドの組合せを含む、請求項１に記載の免疫原性組成物。
  5. 前記組み換えインフルエンザＨＡポリペプチドの少なくとも１つがＮ末端メチオニン残基を欠く、請求項１〜４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
  6. 少なくとも２つの組み換えＨ１Ｎ１インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）ポリペプチドの組合せを含む免疫原性組成物であって、該組合せが配列番号１のアミノ酸２〜５６６を含む第１の組み換えインフルエンザＨＡポリペプチドと、配列番号２のアミノ酸２〜５６５及び配列番号３のアミノ酸２〜５６６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む第２の組み換えインフルエンザＨＡポリペプチドとを含む、免疫原性組成物。
  7. 配列番号１のアミノ酸２〜５６６を含む第１の組み換えインフルエンザＨＡポリペプチドと、配列番号２のアミノ酸２〜５６５を含む第２の組み換えインフルエンザＨＡポリペプチドとからなる組み換えＨ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチドの組合せを含む、請求項６に記載の免疫原性組成物。
  8. 配列番号１のアミノ酸２〜５６６を含む第１の組み換えインフルエンザＨＡポリペプチドと、配列番号３のアミノ酸２〜５６６を含む第２の組み換えインフルエンザＨＡポリペプチドとからなる組み換えＨ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチドの組合せを含む、請求項６に記載の免疫原性組成物。
  9. 前記組み換えＨ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチドがウイルス様粒子（ＶＬＰ）上に提示される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
  10. 前記組み換えＨ１Ｎ１インフルエンザＨＡポリペプチドが不活化インフルエンザウイルス上に提示される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
  11. 前記不活化インフルエンザウイルスが全ウイルスである、請求項１０に記載の免疫原性組成物。
  12. 前記不活化インフルエンザウイルスがスプリットウイルスである、請求項１０に記載の免疫原性組成物。
  13. アジュバントを更に含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
  14. 被験体におけるインフルエンザ感染又は疾患の予防法への請求項１〜１３のいずれか一項に記載の免疫原性組成物の使用。
  15. 被験体におけるインフルエンザ感染又は疾患の予防法のための方法であって、該被験体に配列番号１のアミノ酸配列を含む第１の組み換えインフルエンザＨＡポリペプチドと、配列番号２及び配列番号３のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む第２の組み換えインフルエンザＨＡポリペプチドとを併用投与することを含む、方法。
  16. 被験体におけるインフルエンザ感染又は疾患の予防法のための方法であって、該被験体に配列番号１のアミノ酸２〜５６６を含む第１の組み換えインフルエンザＨＡポリペプチドと、配列番号２のアミノ酸２〜５６５及び配列番号３のアミノ酸２〜５６６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む第２の組み換えインフルエンザＨＡポリペプチドとを併用投与することを含む、方法。
  17. 前記第１の組み換えインフルエンザＨＡポリペプチドと前記第２の組み換えインフルエンザＨＡポリペプチドとを同時に併用投与する、請求項１５又は１６に記載の方法。
  18. 前記第１の組み換えインフルエンザＨＡポリペプチドを第２の組み換えインフルエンザＨＡポリペプチドの前に投与する、請求項１５又は１６に記載の方法。
  19. 前記免疫原性組成物又は前記第１の組み換えインフルエンザＨＡポリペプチド及び前記第２の組み換えインフルエンザＨＡポリペプチドを前記被験体に皮内、鼻腔内、筋肉内、経口又は皮下送達によって投与する、請求項１４に記載の使用又は請求項１５〜１８のいずれか一項に記載の方法。
  20. 前記被験体がヒトである、請求項１４に記載の使用又は請求項１５〜１９のいずれか一項に記載の方法。
  21. 前記免疫原性組成物又は前記第１の組み換えインフルエンザＨＡポリペプチド及び前記第２の組み換えインフルエンザＨＡポリペプチドが、前記被験体において少なくとも１：４０の血球凝集阻害（ＨＡＩ）抗体力価を誘発する、請求項１４に記載の使用又は請求項１５〜２０のいずれか一項に記載の方法。
JP2017533485A 2014-12-19 2015-12-18 Ｈ１ｎ１インフルエンザに対するコンピュータ最適化広反応性抗原の相乗的併用投与 Expired - Fee Related JP6764408B2 (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201462094772P 2014-12-19 2014-12-19
US62/094,772 2014-12-19
PCT/US2015/066882 WO2016100922A1 (en) 2014-12-19 2015-12-18 Synergistic co-administration of computationally optimized broadly reactive antigens for h1n1 influenza

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2020131336A Division JP2020186252A (ja) 2014-12-19 2020-08-03 Ｈ１ｎ１インフルエンザに対するコンピュータ最適化広反応性抗原の相乗的併用投与

Publications (3)

Publication Number Publication Date
JP2018501258A true JP2018501258A (ja) 2018-01-18
JP2018501258A5 JP2018501258A5 (ja) 2019-01-31
JP6764408B2 JP6764408B2 (ja) 2020-09-30

Family

ID=56127736

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2017533485A Expired - Fee Related JP6764408B2 (ja) 2014-12-19 2015-12-18 Ｈ１ｎ１インフルエンザに対するコンピュータ最適化広反応性抗原の相乗的併用投与
JP2020131336A Pending JP2020186252A (ja) 2014-12-19 2020-08-03 Ｈ１ｎ１インフルエンザに対するコンピュータ最適化広反応性抗原の相乗的併用投与

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2020131336A Pending JP2020186252A (ja) 2014-12-19 2020-08-03 Ｈ１ｎ１インフルエンザに対するコンピュータ最適化広反応性抗原の相乗的併用投与

Country Status (7)

Country Link
US (2) US10220086B2 (ja)
EP (1) EP3233116A4 (ja)
JP (2) JP6764408B2 (ja)
CN (1) CN107530417A (ja)
AU (1) AU2015364253B2 (ja)
CA (1) CA2970158A1 (ja)
WO (1) WO2016100922A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2021519085A (ja) * 2018-03-28 2021-08-10 サノフィ パスツール インコーポレイテッド ノイラミニダーゼを含む広範に防御的なワクチン組成物を生成する方法

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2015364253B2 (en) * 2014-12-19 2020-01-23 Oregon Health & Science University Synergistic co-administration of computationally optimized broadly reactive antigens for H1N1 influenza
US20190167738A1 (en) * 2017-12-01 2019-06-06 Kemin Industries, Inc. Compositions containing euglena gracilis for viral protection and related methods
WO2020092207A1 (en) * 2018-10-28 2020-05-07 University Of Georgia Research Foundation Broadly reactive immunogens of influenza virus, compositions, and methods of use thereof

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100221284A1 (en) * 2001-05-30 2010-09-02 Saech-Sisches Serumwerk Dresden Novel vaccine composition
WO2010125461A1 (en) * 2009-04-27 2010-11-04 Novartis Ag Adjuvanted vaccines for protecting against influenza
AU2013240365B2 (en) * 2012-03-30 2017-03-30 University Of Pittsburgh - Of The Commonwealth System Of Higher Education Computationally optimized broadly reactive antigens for H5N1 and H1N1 influenza viruses
JP2016505538A (ja) * 2012-11-27 2016-02-25 ユニバーシティー オブ ピッツバーグ − オブ ザ コモンウェルス システム オブ ハイヤー エデュケーション Ｈ１ｎ１インフルエンザに対する計算で最適化した広い反応性を示す抗原
AU2014214590A1 (en) 2013-02-11 2015-08-27 Novavax, Inc. Combination vaccine for respiratory syncytial virus and influenza
AU2015364253B2 (en) * 2014-12-19 2020-01-23 Oregon Health & Science University Synergistic co-administration of computationally optimized broadly reactive antigens for H1N1 influenza
CN108290932A (zh) 2015-06-09 2018-07-17 圣诺菲·帕斯图尔公司 优化编码工程改造的流感蛋白的核苷酸序列的方法
WO2017053413A1 (en) 2015-09-21 2017-03-30 Oregon Health & Science University Vaccines intelligently produced by epitope recombination (viper) for influenza

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2021519085A (ja) * 2018-03-28 2021-08-10 サノフィ パスツール インコーポレイテッド ノイラミニダーゼを含む広範に防御的なワクチン組成物を生成する方法
JP7329530B2 (ja) 2018-03-28 2023-08-18 サノフィ パスツール インコーポレイテッド ノイラミニダーゼを含む広範に防御的なワクチン組成物を生成する方法

Also Published As

Publication number Publication date
EP3233116A4 (en) 2018-05-30
AU2015364253B2 (en) 2020-01-23
CN107530417A (zh) 2018-01-02
US20170368164A1 (en) 2017-12-28
JP2020186252A (ja) 2020-11-19
US10925957B2 (en) 2021-02-23
JP6764408B2 (ja) 2020-09-30
EP3233116A1 (en) 2017-10-25
US10220086B2 (en) 2019-03-05
WO2016100922A1 (en) 2016-06-23
AU2015364253A1 (en) 2017-06-29
CA2970158A1 (en) 2016-06-23
US20190175721A1 (en) 2019-06-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Brazzoli et al. Induction of broad-based immunity and protective efficacy by self-amplifying mRNA vaccines encoding influenza virus hemagglutinin
Magini et al. Self-amplifying mRNA vaccines expressing multiple conserved influenza antigens confer protection against homologous and heterosubtypic viral challenge
Von Holle et al. Influenza and antibody-dependent cellular cytotoxicity
US11542527B2 (en) Parainfluenza virus 5 based vaccines
US10925957B2 (en) Synergistic co-administration of computationally optimized broadly reactive antigens for H1N1 influenza
US10548965B2 (en) Synergistic co-administration of computationally optimized broadly reactive antigens for human and avian H5N1 influenza
Kang et al. Virus-like particles as universal influenza vaccines
Giles et al. Antibody breadth and protective efficacy are increased by vaccination with computationally optimized hemagglutinin but not with polyvalent hemagglutinin-based H5N1 virus-like particle vaccines
McMahon et al. Assessment of a quadrivalent nucleoside-modified mRNA vaccine that protects against group 2 influenza viruses
AU2016270979B2 (en) Engineered influenza antigenic polypeptides and immunogenic compositions thereof
Kai McKinstry et al. Memory CD4 T cell-mediated immunity against influenza A virus: more than a little helpful
Lau et al. The contribution of systemic and pulmonary immune effectors to vaccine-induced protection from H5N1 influenza virus infection
JP7479424B2 (ja) 改変インフルエンザヘマグルチニンポリペプチドの修飾
Hong et al. Cationic lipid/DNA complex-adjuvanted influenza A virus vaccination induces robust cross-protective immunity
Fox et al. Extending the breadth of influenza vaccines: status and prospects for a universal vaccine
Lofano et al. B cells and functional antibody responses to combat influenza
US10485864B2 (en) Characterization of influenza vaccines
Geeraedts et al. Effect of viral membrane fusion activity on antibody induction by influenza H5N1 whole inactivated virus vaccine
JP2019521702A (ja) インフルエンザウイルスを標的とするｄｎａモノクローナル抗体
Zhang et al. Anti-neuraminidase immunity in the combat against influenza
EP3303368A2 (en) Engineered influenza antigenic polypeptides and immunogenic compositions thereof
Ebensen et al. Preclinical Animal Models for Developing Vaccines Against Influenza Infection for the Young and the Elderly

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20181214

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20181214

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20191015

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20200114

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20200407

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20200803

A911 Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911

Effective date: 20200812

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20200825

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20200911

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 6764408

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

LAPS Cancellation because of no payment of annual fees