JP2021519085A - ノイラミニダーゼを含む広範に防御的なワクチン組成物を生成する方法 - Google Patents

Abstract

本開示は、組換えノイラミニダーゼ（ＮＡ）ポリペプチドを生成するためのクラスターベースコンセンサスアプローチに関する。本開示は、組換えＮＡポリペプチドを含むインフルエンザワクチン組成物にさらに関する。【選択図】図１Ａ

Description

本出願は、その内容すべてを全体として参照により組み入れる米国仮出願第６２／６４９，００２号、２０１８年３月２８日出願および米国仮出願第６２／７１８，５２７号、２０１８年８月１４日出願の優先権を主張する。

本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出され、その全体を参照により本明細書に組み入れる配列表を含む。２０１９年３月２７日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、０１１２１−００３７−００ＰＣＴ＿ＳＬ．ｔｘｔと名付けられ、サイズ６９，０１５バイトである。

インフルエンザは、１つまたはそれ以上のインフルエンザウイルスによって生じる非常に伝染性の呼吸器疾患である。現在、ワクチンは、インフルエンザに対する最も有効な防御を提供する。ワクチン組成物は、蔓延しているインフルエンザ株における差異に適応するように世界保健機関によって毎年更新されている。しかし、不正確な予測から生じるワクチンミスマッチは、ワクチン接種された集団においてさえ顕著な罹患率および死亡率を生じる場合がある。

インフルエンザウイルスは、ウイルス膜の表面に２つの構造糖タンパク質、すなわち、ヘマグルチニン（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）を含有する。ＨＡは、シアル酸に結合し、ウイルス侵入に関与する一方で、ＮＡは、シアル酸の除去により感染細胞からのウイルスの放出に関与する。現在、インフルエンザワクチンは、一般に、ＨＡへの免疫応答を誘導することに基づいている。しかし、ＨＡにおける可変性は、関連する蔓延している株の小さなサブセットに対してだけ有効であるようなワクチンを生じる場合がある。ＮＡもインフルエンザワクチン組成物にしばしば含まれる。しかし、ＮＡの含有量および活性は、現在のワクチン製剤において標準化されていない。

ミスマッチ株を含むインフルエンザウイルスに対して広範で、持続的な（例えば、複数シーズン）防御を提供できる有効なインフルエンザワクチンに対する必要性が残っている。

本発明は、特に、複数のインフルエンザ株に対して広範に反応性で、防御的な免疫応答を誘発することができるＮＡポリペプチドを生成するためのクラスターベースコンセンサス（ＣＢＣ）アプローチを提供する。種々の実施形態では、方法は：
・１つより多いインフルエンザＮＡポリペプチド配列を選択すること、および配列をアラインすること；
・ペアワイズ類似性／非類似性マトリクスを算出すること；
・ペアワイズ類似性／非類似性マトリクスから類似配列のクラスターを同定することおよび創出すること；
・各クラスター内で、ペアワイズアライメント法を使用して配列アライメント中の各位置についてコンセンサスアミノ酸があるかどうかを決定することであって、所与の位置でのアミノ酸の頻度が５０％以上である場合、そのアミノ酸はコンセンサスアミノ酸と指定され、所与の位置でのアミノ酸の頻度が５０％未満である場合、そのアミノ酸は可変アミノ酸と指定されること；
・各クラスターについてコンセンサスアミノ酸および可変アミノ酸を含む第１の配列を生成すること；
・場合により、１つより多いクラスターが分析される場合：
○各クラスターについて生成された配列をアラインすること；
○ペアワイズアライメント法を使用して配列アライメント中の各位置についてコンセンサスアミノ酸があるかどうかを決定することであって、所与の位置でのアミノ酸の頻度が５０％以上である場合、そのアミノ酸はコンセンサスアミノ酸と指定され、所与の位置でのアミノ酸の頻度が５０％未満である場合、そのアミノ酸は可変アミノ酸と指定されること；および
○コンセンサスアミノ酸および可変アミノ酸を含む第２の配列を生成すること
によって、クラスターから生成された第１の配列と別のクラスターまたは複数のクラスターにおいて生成された配列とを比較すること；
・生成された第１の配列または第２の配列内で：
○第１のまたは第２の配列に基づいて一連の検査配列を生成することであって、検査アミノ酸を可変アミノ酸位置に位置させること；
○検査配列それぞれについて分子モデリングを実行すること；
○負の総エネルギー値を有するポリペプチドをもたらすアミノ酸（複数可）を選択することによって各可変アミノ酸位置についてのコンセンサスアミノ酸を決定すること
によって、各可変アミノ酸位置についてコンセンサスアミノ酸を決定すること、ならびに
・コンセンサスアミノ酸を含むインフルエンザＮＡポリペプチドを生成すること
を含む。

種々の実施形態では、本発明は、本発明の方法を使用して生成されたＮＡポリペプチドを提供する。例示的実施形態では、ＮＡポリペプチは、配列番号１〜３またはこれらの断片のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本発明は、本明細書に記載の１つまたはそれ以上のＮＡポリペプチドを含む四量体ＮＡタンパク質にさらに関する。

種々の実施形態では、本発明のＮＡポリペプチドおよび／または四量体ＮＡタンパク質は、ワクチン抗原として利用される。一部の実施形態では、ＮＡポリペプチドおよび四量体ＮＡタンパク質は、複数のインフルエンザ株、型またはサブタイプに対して広範に防御的な免疫応答を提供する。理論に束縛されることを望むわけではないが、ＮＡポリペプチドおよび四量体ＮＡタンパク質がインフルエンザウイルス内の複数のエピトープ（例えば、保存されたエピトープ）に対する中和抗体応答を誘発できると考えられる。

本出願のさらなる実施形態は、以下のとおりである：
実施形態Ａ１．コンセンサスアミノ酸を含む組換えインフルエンザノイラミニダーゼ（ＮＡ）ポリペプチドを生成するための方法であって：
ａ．１つより多いインフルエンザＮＡポリペプチド配列を選択すること、および配列をアラインすること；
ｂ．ペアワイズ類似性／非類似性マトリクスを算出すること；
ｃ．ペアワイズ類似性／非類似性マトリクスから類似配列のクラスターを同定することおよび創出すること；
ｄ．各クラスター内で、ペアワイズアライメント法を使用して配列アライメント中の各位置についてコンセンサスアミノ酸があるかどうかを決定することであって、所与の位置でのアミノ酸の頻度が５０％以上である場合、そのアミノ酸はコンセンサスアミノ酸と指定され、所与の位置でのアミノ酸の頻度が５０％未満である場合、そのアミノ酸は可変アミノ酸と指定されること；
ｅ．各クラスターについてコンセンサスアミノ酸および可変アミノ酸を含む第１の配列を生成すること；
ｆ．場合により、複数のクラスターが分析される場合：
ｉ．各クラスターについて工程（ｅ）において生成された配列をアラインすること；
ｉｉ．ペアワイズアライメント法を使用して配列アライメント中の各位置についてコンセンサスアミノ酸があるかどうかを決定することであって、所与の位置でのアミノ酸の頻度が５０％以上である場合、そのアミノ酸はコンセンサスアミノ酸と指定され、所与の位置でのアミノ酸の頻度が５０％未満である場合、そのアミノ酸は可変アミノ酸と指定されること；ならびに
ｉｉｉ．コンセンサスアミノ酸および可変アミノ酸を含む第２の配列を生成すること
によって、クラスターの工程（ｅ）において生成された第１の配列と別のクラスターまたは複数のクラスターにおいて生成された第１の配列とを比較すること；
ｇ．工程（ｅ）において生成された第１の配列または工程（ｆ）（ｉｉｉ）において生成された第２の配列内で：
ｉｖ．第１のまたは第２の配列に基づいて一連の検査配列を生成することであって、検査アミノ酸を可変アミノ酸位置に位置させること；
ｖ．検査配列それぞれについて分子モデリングを実行すること；
ｖｉ．負の総エネルギー値を有するポリペプチドをもたらすアミノ酸（複数可）を選択することによって各可変アミノ酸位置についてのコンセンサスアミノ酸を決定すること
によって、各可変アミノ酸位置についてコンセンサスアミノ酸を決定すること、ならびに
ｈ．コンセンサスアミノ酸を含む組換えインフルエンザＮＡポリペプチドを生成すること
を含む方法。
実施形態Ａ２．配列をアラインすることは、ＭＡＦＦＴ、ＭＵＳＣＬＥ、ＣＬＵＳＴＡＬ ＯＭＥＧＡ、ＦＡＳＴＡ、これらの組合せまたは任意の他の多重配列アライメントソフトウェアパッケージを使用することを含む、実施形態Ａ１の方法。
実施形態Ａ３．ペアワイズ類似性／非類似性マトリクスを算出することは、ＢＬＯＳＵＭ、ＰＡＭ、ＩＤＥＮＴＩＴＹ置換マトリクスまたはこれらの組合せを使用することを含む、実施形態Ａ１またはＡ２の方法。
実施形態Ａ４．ペアワイズ類似性／非類似性マトリクスから類似配列のクラスターを同定および創出することは、Ｋ平均クラスタリング、ミニマックスクラスタリング（minimax clustering）、主成分分析（ＰＣＡ）、多次元尺度構成法（ＭＤＳ）またはこれらの組合せを使用することを含む、実施形態Ａ１〜３のいずれか１つの方法。
実施形態Ａ５．分子モデリングは、インフルエンザＮＡポリペプチドまたはタンパク質の結晶構造と比較することを含む、実施形態Ａ１〜４のいずれか１つの方法。
実施形態Ａ６．分子モデリングは、Ｒｏｓｅｔｔａまたは任意の他の分子モデリングソフトウェアの使用を含む、実施形態Ａ１〜５のいずれか１つの方法。
実施形態Ａ７．検査アミノ酸は、タンパク質に見出される任意の天然または非天然アミノ酸を含む、実施形態Ａ１〜６のいずれか１つの方法。
実施形態Ａ８．実施形態Ａ１〜７のいずれか１つの方法を使用して生成された組換えインフルエンザＮＡポリペプチド。
実施形態Ａ９．配列番号１、２もしくは３またはこれらの断片から選択されるアミノ酸配列、または配列番号１、２もしくは３またはその断片に少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態Ａ８の組換えインフルエンザＮＡポリペプチド。
実施形態Ａ１０．配列番号１、２または３のアミノ酸７５〜４６９を含む、実施形態Ａ９の組換えＮＡポリペプチド。
実施形態Ａ１１．実施形態Ａ８〜１０のいずれか１つの１つまたはそれ以上の組み換えＮＡポリペプチドを含む組換え四量体ＮＡタンパク質。
実施形態Ａ１２．実施形態Ａ８〜１０のいずれか１つの組換えＨＡポリペプチドまたは実施形態Ａ１１の組換え四量体ＮＡタンパク質をコードする単離された核酸。
実施形態Ａ１３．実施形態Ａ１２の核酸を含むベクター。
実施形態Ａ１４．実施形態Ａ１３のベクターを含む、単離された細胞。
実施形態Ａ１５．哺乳動物細胞である、実施形態Ａ１４の単離された細胞。
実施形態Ａ１６．ＨＥＫ２９３Ｔ細胞またはＣＨＯ細胞である、実施形態Ａ１５の単離された細胞。
実施形態Ａ１７．昆虫細胞である、実施形態Ａ１４の単離された細胞。
実施形態Ａ１８．実施形態Ａ８〜１０のいずれか１つの組換えＮＡポリペプチドまたは実施形態Ａ１１の組換え四量体ＮＡタンパク質を含む融合タンパク質。
実施形態Ａ１９．実施形態Ａ８〜１０のいずれか１つの組換えＮＡポリペプチドまたは実施形態Ａ１１の組換え四量体ＮＡタンパク質を含むインフルエンザウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
実施形態Ａ２０．インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質、インフルエンザマトリクス（Ｍ１）タンパク質、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ｇａｇタンパク質またはこれらの組合せの１つもしくはそれ以上をさらに含む、実施形態Ａ１９のインフルエンザＶＬＰ。
実施形態Ａ２１．実施形態Ａ８〜１０のいずれか１つの組換えＮＡポリペプチド、実施形態Ａ１１の組換え四量体ＮＡタンパク質、実施形態Ａ１８の融合タンパク質または実施形態Ａ１９もしくはＡ２０のインフルエンザＶＬＰおよび薬学的に許容される担体、賦形剤またはアジュバントを含む医薬組成物。
実施形態Ａ２２．１つまたはそれ以上のインフルエンザ株、型および／またはサブタイプに対する免疫応答を誘発する、実施形態Ａ２１の医薬組成物。
実施形態Ａ２３．インフルエンザウイルスに対して対象を免疫化する方法であって、実施形態Ａ８〜１０のいずれか１つの組換えＮＡポリペプチド、実施形態Ａ１１の組換え四量体ＮＡタンパク質、実施形態Ａ１８の融合タンパク質、実施形態Ａ１９もしくはＡ２０のインフルエンザＶＬＰまたは実施形態Ａ２１もしくはＡ２２の医薬組成物の有効量を対象に投与することを含む方法。
実施形態Ａ２４．対象においてインフルエンザウイルスへの免疫応答を誘導する方法であって、実施形態Ａ８〜１０のいずれか１つの組換えＮＡポリペプチド、実施形態Ａ１１の組換え四量体ＮＡタンパク質、実施形態Ａ１８の融合タンパク質、実施形態Ａ１９もしくはＡ２０のインフルエンザＶＬＰまたは実施形態Ａ２１もしくはＡ２２の医薬組成物の有効量を対象に投与することを含む方法。
実施形態Ａ２５．インフルエンザウイルスは、季節性またはパンデミックインフルエンザウイルスである、実施形態Ａ２３またはＡ２４の方法。
実施形態Ａ２６．免疫応答は、１つまたはそれ以上のインフルエンザウイルス株、型またはサブタイプに対する抗体の産生を含む、実施形態Ａ２４またはＡ２５の方法。
実施形態Ａ２７．対象は、哺乳動物である、実施形態Ａ２３〜２６のいずれか１つの方法。
実施形態Ａ２８．対象は、ヒトである、実施形態Ａ２７の方法。
実施形態Ａ２９．投与することは、筋肉内、鼻腔内、皮内、皮下、経口または静脈内経路を介して実行される、実施形態Ａ２３〜２８のいずれか１つの方法。

追加的目的および有利点は、続く記載に部分的に記載され、部分的に記載から明らかになり、実行によって収得される。目的および有利点は、添付の特許請求の範囲に具体的に示される要素および組合せの手段によって認識され、達成される。

前述の一般的な記載および続く詳細な記載の両方は、例示的および説明的なだけであり、特許請求の範囲の限定ではないことは理解される。

本明細書に組み入れられ、その一部を構成する添付の図は、１つ（複数）の実施形態（複数可）を例示し、記載と共に本明細書に記載の原理を説明する目的を果たす。

ＮＡポリペプチドを設計するために使用される例示的クラスターベースコンセンサス（ＣＢＣ）法を示す図である。図１Ａは、本明細書において説明される方法を使用して生成された３種のＮＡポリペプチド候補ＮＡ５２００、ＮＡ７９００、およびＮＡ９１００を示す。 ＮＡポリペプチドを設計するために使用される例示的クラスターベースコンセンサス（ＣＢＣ）法を示す図である。図１Ｂは、多次元尺度構成法によって決定される、他の既知のＨ１Ｎ１サブタイプの配列に対する配列空間における当該３種のＮＡポリペプチドの位置を示す。 ＮＡコンストラクトの模式図および活性を示す図である。図２Ａは、単量体および四量体ＮＡコンストラクトのイラストを提供する。 ＮＡコンストラクトの模式図および活性を示す図である。図２Ｂは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において、異なる発現プラスミド（すなわち、ｐＣＡＸＬ、ｐｃＤＮＡ３、またはｐＥＦ）によって発現された場合の様々なＮＡコンストラクトの相対蛍光単位（ｒｅｌａｔｉｖｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｕｎｉｔ）（ＲＦＵ、平均増加／分）を示す。ＴＢ Ｐａｎは、可溶性テトラブラチオン−パンデミックＡ／ベルギー／１／２００９（＝Ａ／カルフォルニア／０７／２００９）コンストラクトを表す。ｃＮＡ１は、ＮＡ５２００を表し、ｃＮＡ２は、ＮＡ７９００を表し、ｃＮＡ３は、ＮＡ９１００を表す。 図３Ａ〜３Ｆは、異なるＮＡコンストラクトをコードするＤＮＡで免疫したマウスからの血清の結合活性を測定するＥＬＩＳＡアッセイの結果を提供する図である。異なるインフルエンザウイルスの結合活性は、Ａ／プエルトリコ／８／１９３４（ＰＲ８；図３Ａ）；Ａ／ＵＳＳＲ／９０／１９７７（ＵＳＳＲ／７７；図３Ｂ）；Ａ／シンガポール／６／１９８６（Ｓｉｎｇ／８６；図３Ｃ）；Ａ／ニューカレドニア／２０／１９９９（Ｎ．Ｃａｌ／９９；図３Ｄ）；Ａ／ブリスベン／５９／２００７（Ｂｒｉｓ／０７；図３Ｅ）；およびＡ／ベルギー／１／２００９（Ｐｄｍ／０９；図３Ｆ）として示される。グラフにおいて、Ｘ軸は、血清希釈率を表し、Ｙ軸は、ＯＤを表す。 図３−１の続き。 図３−２の続き。 図４Ａ〜４Ｅは、異なるＮＡコンストラクトをコードするＤＮＡで免疫されたマウスからの血清のＮＡ阻害（ＮＡＩ）活性を測定する酵素結合レシチン（ＥＬＬＡ）アッセイの結果を提供する図である。当該ＮＡＩ活性は、Ａ／プエルトリコ／８／１９３４（ＰＲ８；図４Ａ）；空ベクター（図４Ｂ）；ＮＡ５２００（図４Ｃ）；ＮＡ７９００（図４Ｄ）；およびＮＡ９１００（図４Ｅ）として示される。 図４−１の続き。 図４−２の続き。 図５Ａ〜５Ｆは、異なるＮＡコンストラクトをコードするＤＮＡで２回ワクチン接種させ、その後に１ＬＤ５０量のパンデミック２００９ウイルスでチャレンジ感染させたマウスの生残率および体重減少の割合を示す図である。図５Ａ、５Ｃ、および５Ｅは、生残率を示す。図５Ｂ、５Ｄ、および５Ｆは、体重減少の割合を示す。図５Ａ〜５Ｂは、ＮＡ５２００に関連する結果を提供する。図５Ｃ〜５Ｄは、ＮＡ７９００に関連する結果を提供する。図５Ｅ〜５Ｆは、ＮＡ９１００に関連する結果を提供する。示されている場合、＊は、空ベクターに対する統計的有意性を示す。 図５−１の続き。 図５−２の続き。 図６Ａ〜６Ｆは、異なるＮＡコンストラクトをコードするＤＮＡで２回ワクチン接種させ、その後に１ＬＤ５０量のＰＲ８ウイルスでチャレンジ感染させたマウスの生残率および体重減少の割合を示す図である。図６Ａ、６Ｃ、および６Ｅは、生残率を示す。図６Ｂ、６Ｄ、および６Ｆは、体重減少の割合を示す。図６Ａ〜６Ｂは、ＮＡ５２００に関連する結果を提供する。図６Ｃ〜６Ｄは、ＮＡ７９００に関連する結果を提供する。図６Ｅ〜６Ｆは、ＮＡ９１００に関連する結果を提供する。示されている場合、＊は、空ベクター群に対する統計的有意性を示し、¶は、ｐｄｍ０９群に対する統計的有意性を示す。 図６−１の続き。 図６−２の続き。 図７Ａは、組換え四量体ＮＡタンパク質の精製プロファイルを提供する図である。詳細には、ＮＡ５２００、ＮＡ７９００、またはＮＡ９１００ＮＡポリペプチドを含む可溶性四量体タンパク質を、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において産生させた。上清を収集し、親和性クロマトグラフィーによって精製し、その後にサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。図７Ａは、四量体可溶性ＮＡタンパク質におけるサイズ排除クロマトグラフィーの後のＵＶ吸収プロファイルを示す。グラフの上部の垂直線は、既知のタンパク質のサイズの標準値を表す。図７Ｂは、組換え四量体ＮＡタンパク質の比酵素活性度（specific enzymatic activity）を提供する図である。詳細には、ＮＡ５２００、ＮＡ７９００、またはＮＡ９１００ＮＡポリペプチドを含む可溶性四量体タンパク質を、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において産生させた。上清を収集し、親和性クロマトグラフィーによって精製し、その後にサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。図７Ｂは、野生型Ａ／ベルギー／２００９ （Ｂｅｌ／０９） ＮＡと共に、当該組換え四量体ＮＡタンパク質の酵素活性を測定するＭＵＮＡＮＡアッセイによる結果を示す。比活性度は、４−メチルウンベリフェロンの標準曲線から計算した。 ＮＡ５２００、ＮＡ７９００、またはＮＡ９１００を含む四量体ＮＡタンパク質に対して産生された抗血清が、ＷＴ ＮＡ抗血清よりも広い範囲のＡ型インフルエンザウイルス（ＩＡＶ）に対するＮＡ阻害（ＮＡＩ）を示したことを示す図である。マウスを、Ｓｉｇｍａ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ（ＳＡＳ）の存在下において、Ａ／プエルトリコ／８／１９３４（ＰＲ８／３４）ＮＡ、Ａ／ニューカレドニア／１９９９（ＮＣ／９９）ＮＡ、Ａ／ベルギー／１／２００９（Ｂｅｌ／０９；Ｂｅｌ／０９；ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／？ｔｅｒｍ＝ｔｘｉｄ１５０２３８２に記載される）ＮＡ、ＮＡ５２００、ＮＡ７９００、ＮＡ９１００、またはＰＢＳのみを含む四量体ＮＡタンパク質１μｇによって、皮下によりプライミングおよび追加免疫した（３週間の間隔において）。追加免疫の３週間後、抗血清を収集し、Ｎ１ウイルスのパネルのＮＡ活性を阻害するそれらの能力について試験した。四量体ＮＡタンパク質に対して産生された熱不活性化血清の増加段階希釈物を、Ｈ１Ｎ１ウイルスのパネルと混合した。酵素結合レクチン（ＥＬＬＡ）アッセイにより、フェチュインでコーティングしたプレート上において感染後１８時間でのＮＡ活性を決定した。データは、非線形回帰分析によって決定したときの、ｌｏｇ_２値としてプロットされた１：ＩＣ_５０値を示している。図８Ａにおいて、データは、トリプリケートにおいて実施した実験の平均（±１ＳＤ）として報告される。ｙ軸上の点線は、試験した血清の最も高い濃度４．３（すなわち、１：２０）を表している。この線より低い値は、非線形回帰分析を使用して滴定曲線から推定し、その場合、２．３（すなわち、１：５）を真に陽性の力価として設定した。図８Ｂにおいて、データは、ＮＡのヘッドドメインのアミノ酸配列によってクラスター化されたＮＡの系統樹の隣に、１：ＩＣ_５０値のヒートマップとして示されている。 ＮＡ５２００、ＮＡ７９００、またはＮＡ９１００を含む四量体ＮＡタンパク質に対して産生された抗血清が、ＷＴ ＮＡ抗血清よりも広い範囲のＡ型インフルエンザウイルス（ＩＡＶ）に対するＮＡ阻害（ＮＡＩ）を示したことを示す図である。マウスを、Ｓｉｇｍａ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ（ＳＡＳ）の存在下において、Ａ／プエルトリコ／８／１９３４（ＰＲ８／３４）ＮＡ、Ａ／ニューカレドニア／１９９９（ＮＣ／９９）ＮＡ、Ａ／ベルギー／１／２００９（Ｂｅｌ／０９；Ｂｅｌ／０９；ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／？ｔｅｒｍ＝ｔｘｉｄ１５０２３８２に記載される）ＮＡ、ＮＡ５２００、ＮＡ７９００、ＮＡ９１００、またはＰＢＳのみを含む四量体ＮＡタンパク質１μｇによって、皮下によりプライミングおよび追加免疫した（３週間の間隔において）。追加免疫の３週間後、抗血清を収集し、Ｎ１ウイルスのパネルのＮＡ活性を阻害するそれらの能力について試験した。四量体ＮＡタンパク質に対して産生された熱不活性化血清の増加段階希釈物を、Ｈ１Ｎ１ウイルスのパネルと混合した。酵素結合レクチン（ＥＬＬＡ）アッセイにより、フェチュインでコーティングしたプレート上において感染後１８時間でのＮＡ活性を決定した。データは、非線形回帰分析によって決定したときの、ｌｏｇ_２値としてプロットされた１：ＩＣ_５０値を示している。図８Ａにおいて、データは、トリプリケートにおいて実施した実験の平均（±１ＳＤ）として報告される。ｙ軸上の点線は、試験した血清の最も高い濃度４．３（すなわち、１：２０）を表している。この線より低い値は、非線形回帰分析を使用して滴定曲線から推定し、その場合、２．３（すなわち、１：５）を真に陽性の力価として設定した。図８Ｂにおいて、データは、ＮＡのヘッドドメインのアミノ酸配列によってクラスター化されたＮＡの系統樹の隣に、１：ＩＣ_５０値のヒートマップとして示されている。 図９Ａ〜９Ｌは、５２００、ＮＡ７９００、またはＮＡ９１００を含む四量体タンパク質によるワクチン接種が、Ａ型インフルエンザウイルス（ＩＡＶ）による致死感染に対してマウスを防御したことを示す図である。マウスを、Ｓｉｇｍａ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ（ＳＡＳ）において、ＮＡ５２００（黒丸）、ＮＡ７９００（白四角）、またはＮＡ９１００（白丸）を含む四量体タンパク質１μｇで、皮下においてプライミングおよび追加免疫（３週間後）したか、またはＳＡＳにおいてＰＢＳで模擬ワクチン接種した（白三角）。ワクチン接種後、マウスに、５ＬＤ_５０量の、Ａ／プエルトリコ／８／１９３４（ＰＲ８／３４；図９Ａ〜９Ｂ）、Ａ／ＵＳＳＲ／９０／１９７７（ＵＳＳＲ／７７；図９Ｃ〜９Ｄ）、Ａ／ニューカレドニア／２０／１９９９（ＮＣ／９９；図９Ｅ〜９Ｆ）、Ａ／ベルギー／１／２００９（Ｂｅｌ／０９；図９Ｇ〜９Ｈ）、Ａ／ブタ／ベルギー／１／１９９８（Ｓｗ／Ｂｅｌ／９８；図９Ｉ〜９Ｊ）、またはＨ５Ｎ１型ＮＩＢＲＧ−１４（Ｈ５Ｎ１）（図９Ｋ〜９Ｌ）を鼻腔内感染させ、体重減少（左側）または死亡率（右側）を観察した。マウスが、元の体重の≧２５％を失った場合、当該動物を処分した。体重減少のデータは、経時での元の体重の平均百分率（±ＳＥＭ）として報告される（図９Ａ、９Ｃ、９Ｅ、９Ｇ、９Ｉ、および９Ｋ、ｎ＝８〜１０）。生残データは、経時での生残率として示される（図９Ｂ、９Ｄ、９Ｆ、９Ｈ、９Ｊ、および９Ｌ、ｎ＝８〜１０）。経時での体重減少を、二元配置分散分析（ｔｗｏ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）によって分析し、主要カラムの効果を評価した。両側対数順位（Ｍａｎｔｅｌ Ｃｏｘ）検定を使用して、生残率を評価した。模擬ワクチン接種したマウスとの比較において、＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１である。 図９−１の続き。 図９−２の続き。 図９−３の続き。 図９−４の続き。 図９−５の続き。 図１０Ａ〜１０Ｆは、肺のウイルス価および肺環境内での炎症の減少を結果として生じるＮＡ５２００、ＮＡ７９００、またはＮＡ９１００を含む四量体ＮＡタンパク質によって媒介される防御を示す図である。マウスを、Ｓｉｇｍａ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ（ＳＡＳ）において、ＮＡ５２００、ＮＡ７９００、またはＮＡ９１００を含む四量体タンパク質１μｇによって、皮下によりプライミングおよび追加免疫するか（３週間後）、またはＳＡＳにおいてＰＢＳによって模擬ワクチン接種した。ワクチン接種後、マウスに、５ＬＤ_５０量の、Ａ／プエルトリコ／８／１９３４（ＰＲ８／３４；図１０Ａ〜１０Ｂ）、Ａ／ニューカレドニア／２０／１９９９（ＮＣ／９９；図１０Ｃ〜１０Ｄ）、またはＡ／ベルギー／１／２００９（Ｂｅｌ／０９；図１０Ｅ〜１０Ｆ）を鼻腔内感染させた。感染後３日目または７日目に、ＢＡＬ体液および肺を採取し、ＴＣＩＤ_５０によって、ウイルス価について肺ホモジネートを評価した（図１０Ａ、１０Ｃ、および１０Ｅ）。７日目に、タンパク質の総レベルについて、無細胞ＢＡＬ体液を調べた（図１０Ｂ、１０Ｄ、および１０Ｆ）。ウイルス価のグラフにおいて、破線は、ＴＣＩＤ_５０アッセイのカットオフ限界（０．７）を示す。タンパク質レベルについて；バーは、平均ウイルス価±ＳＤを表す。データは、２回の非依存性実験からプールされる。一元配置分散分析（ｏｎｅ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）を使用して、有意性を評価した。模擬ワクチン接種させたマウスとの比較において、＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１である。 図１０−１の続き。 図１０−２の続き。 ３ラウンドのＤＮＡ免疫化の後に、Ｐｄｍ０９によって誘導される広範なＮＡＩ活性を示す図である。当該抗血清を、図１２〜１４Ｆに示される受動的移入（passive transfer）実験のために使用した。 ３ラウンドのＤＮＡ免疫化の後に、ＮＡ５２００によって誘導される広範なＮＡＩ活性を示す図である。当該抗血清を、図１２〜１４Ｆに示される受動的移入実験のために使用した。 ３ラウンドのＤＮＡ免疫化の後に、ＮＡ７９００によって誘導される広範なＮＡＩ活性を示す図である。当該抗血清を、図１２〜１４Ｆに示される受動的移入実験のために使用した。 ３ラウンドのＤＮＡ免疫化の後に、ＮＡ９１００によって誘導される広範なＮＡＩ活性を示す図である。当該抗血清を、図１２〜１４Ｆに示される受動的移入実験のために使用した。 実施例６において説明される受動的移入実験の実験スケジュールを示す図である。マウスを、ＮＡ５２００、ＮＡ７９００、ＮＡ９１００、免疫前血清（ネガティブ；−ｖｅコントロール）、またはそれぞれのポジティブ（＋ｖｅ）コントロール（ｔｅｔＮＡ＋ＳＡＳによる免疫化；Ｂｅｌ０９またはＮｅｗＣａｌ９９）に対して産生された熱不活性化抗血清１００μｌによって、腹腔内により処理した。２４時間後、当該マウスにチャレンジ感染させた。 図１３Ａ〜１３Ｈは、１ＬＤ５０量のＡ／ベルギー／１／２００９（Ｂｅｌ０９）によるチャレンジ感染後のマウス（１つの群あたり５匹）の体重減少防御および生残を示す図である。ＤＮＡ免疫化によってＮＡ５２００（図１３Ａおよび１３Ｃ）、ＮＡ７９００（図１３Ｂおよび１３Ｄ）、ＮＡ９１００（図１３Ｅおよび１３Ｇ）、またはＢｅｌ／０９（図１３Ｆおよび１３Ｈ）に対して産生された抗血清により、チャレンジ感染の前にマウスを受動的に２４時間免疫した。図１３Ａ、１３Ｂ、１３Ｅ、および１３Ｆは、体重のデータを示している。図１３Ｃ、１３Ｄ、１３Ｇ、および１３Ｈは、生残率のデータを示している。 図１３−１の続き。 図１３−２の続き。 図１３−３の続き。 図１４Ａ〜１４Ｆは、１ＬＤ５０量の、Ａ／ベルギー／１／２００９（Ｂｅｌ０９、図１４Ａおよび１４Ｂ）、Ａ／ニューカレドニア／２０／１９９９（ＮｅｗＣａｌ９９、図１４Ｃおよび１４Ｄ）、またはＡ／プエルトリコ／８／１９３４（ＰＲ８、図１４Ｅおよび１４Ｆ）によるチャレンジ感染後のマウス（１つの群あたり７〜８匹）の体重減少防御および生残を示す図である。図１４Ａ，１４Ｃ、および１４Ｅは、体重のデータを表す。図１４Ｂ、１４Ｄ、および１４Ｆは、生残のデータを表す。ＤＮＡ免疫化によってＮＡ５２００、ＮＡ７９００、またはＮＡ９１００に対して産生された抗血清により、チャレンジ感染の２４時間前に、マウスを受動的に免疫した。 図１４−１の続き。 図１４−２の続き。 図１５Ａ〜１５Ｆは、抗体が、ＮＡ５２００、ＮＡ７９００、またはＮＡ９１００を含む四量体ＮＡタンパク質によるタンパク質ワクチン接種によって提供される防御において主要な役割を果たすことを裏付ける図である。ＣＢＣ ＮＡ、野生型ＰＲ８／３４ ｒＮＡ、野生型ＮＣ／９９ ｒＮＡ、または野生型Ｂｅｌ／０９ ｒＮＡ（図８Ａ〜８Ｂにおいて使用されるのと同じ）に対して産生された抗血清を、受動的移入によってインフルエンザウイルス感染を抑制するそれらの能力について評価した。マウスを、ＮＡ５２００、ＮＡ７９００、ＮＡ９１００、ＰＢＳ（ネガティブ；−ｖｅコントロール）、またはそれぞれの同種ｒＮＡポジティブ（＋ｖｅ）コントールを含む四量体ＮＡタンパク質に対して産生された熱不活性化抗血清２０μｌによって、鼻腔内により処理した。当該マウスを、鼻腔内により、２ＬＤ_５０量のＡ／プエルトリコ／８／１９３４（ＰＲ８／３４；図１５Ａ〜１５Ｂ）、Ａ／ニューカレドニア／２０／１９９９（ＮＣ／９９；図１５Ｃ〜１５Ｄ）、またはＡ／ベルギー／１／２００９（Ｂｅｌ／０９；図１５Ｅ〜１５Ｆ）によって２４時間後にチャレンジ感染させ、体重減少（図１５Ａ、１５Ｃ、および１５Ｅ）および生残（図１５Ｂ、１５Ｄ、および１５Ｆ）について１４日間観察した。体重減少のデータは、経時での元の体重の平均百分率（±ＳＥＭ）として報告され（ｎ＝８）、生残のデータは、経時での生残率として示される（ｎ＝８）。データは、２つの独立した実験からプールされる。経時での体重減少を分析するために二元配置分散分析を使用して、主要カラムの効果を評価し、その一方で、生残の割合を評価するために、両側対数順位（Ｍａｎｔｅｌ Ｃｏｘ）検定を使用した。ネガティブコントロールのマウスとの比較において、＊は、ｐ ＜ ０．０５である。 図１５−１の続き。 図１５−２の続き。 図１６Ａ〜１６Ｌは、ＣＢＣ ＮＡが、野生型ＮＡよりも広範な防御を提供すること、および一価不活性化ワクチンに加えられた場合に増加された幅を提供することを示す図である。マウスに、ＳＡＳアジュバントの存在下において、１μｇの野生型Ｂｅｌ／０９ｒＮＡ、野生型ＮＣ／９９ｒＮＡ、ＣＢＣ ＮＡ ＮＡ５２００、もしくはＮＡ９１００（図１６Ａ〜１６Ｃおよび１６Ｇ〜１６Ｉ）によって、または単独もしくは１μｇの野生型Ｂｅｌ／０９ｒＮＡ、野生型ＮＣ／９９ｒＮＡ、ＣＢＣ ＮＡ ＮＡ５２００、もしくはＮＡ９１００と組み合わせた０．１μｇの一価ｐｄｍ０９ワクチンによって（図１６Ｄ〜１６Ｆおよび１６Ｊ〜１６Ｌ）、皮下経路により、プライミングおよび３週間の間隔において追加免疫した。さらに、ある群のマウスには、模擬ワクチン接種した。最終的な追加免疫の３週間後、当該マウスを、鼻腔内により、５ＬＤ_５０量のＢｅｌ／０９またはＮＣ／９９によってチャレンジ感染させた。１４日間にわたって、体重減少（図１６Ａ、１６Ｄ、１６Ｇ）および生残（図１６Ｂ、１６Ｅ、１６Ｆ）についてマウスを観察した。マウスが、それらの元の体重の≧２５％を失った場合、それらを犠牲にした。Ｂｅｌ／０９感染に対しては７日目およびＮＣ／９９感染に対しては６日目に、肺ホモジネートを得て、ＴＣＩＤ_５０によってウイルス量を評価した。体重減少のデータは、経時での元の体重の平均百分率（±ＳＥＭ）として示されており、生残のデータは、経時での生残率として示される（同種ｒＮＡワクチン接種したマウスに対しては２つの独立した実験からプールしたｎ＝９〜１０（図１６Ａ〜１６Ｃおよび１６Ｇ〜１６Ｉ）；一価単独ワクチン接種させたマウスに対しては１つの実験からのｎ＝５（図１６Ｄ〜１６Ｆおよび１６Ｊ〜１６Ｌ））。経時での体重減少は、二元配置分散分析によって分析し、主要カラムの効果を調べ、生残率は、両側対数順位（Ｍａｎｔｅｌ Ｃｏｘ）検定を使用して評価した。ウイルス価について、一元配置分散分析を使用して有意性を評価した。同種ｒＮＡワクチン接種させたマウスとの比較において（図１６Ａ〜１６Ｃおよび１６Ｇ〜１６Ｉ）；または一価単独ワクチン接種させたマウスとの比較において（図１６Ｄ〜１６Ｆおよび１６Ｊ〜１６Ｌ）、＊はｐ＜０．０５であり、＊＊はｐ＜０．０１である。 図１６−１の続き。 図１６−２の続き。 図１６−３の続き。 図１７Ａ〜１７Ｃは、ＮＡ５２００およびＮＡ９１００を含む四量体ＮＡタンパク質に対して産生された抗血清が、Ａ（Ｈ１Ｎ１）ｐｄｍ０９ ＨＡドリフト変異株（ｄｒｉｆｔ ｓｔｒａｉｎ）（中高年齢の成人における感染率増加に起因してＣＤＣによって決定されるＨＡドリフト（ｄｒｉｆｔ））に対してＮＡＩを媒介したこと（図１７Ａ〜１７Ｂ）、ならびにＣＢＣ ＮＡおよびＡ（Ｈ１Ｎ１）ｐｄｍ０９ウイルスによって共有される同一性のパーセント（図１７Ｃ）を示す図である。マウスを、ＳＡＳの存在下において、ＮＡ５２００またはＮＡ９１００を含む四量体ＮＡタンパク質によってプライミングおよび追加免疫した（３週間の間隔で）。Ａ／ベルギー／１／２００９（Ｂｅｌ／０９）ｒＮＡおよび組換えコンセンサスＮＡに対して産生された熱不活性化血清の希釈物を、ＥＬＬＡアッセイにおいて、Ａ／ベルギー／１／２００９（Ｂｅｌ／０９）および／シンガポール／ＧＰ１９０８／２０１５（Ｓｉｎｇ／１５）に対してＮＡＩを媒介するそれらの能力を試験した。図１７Ａにおいて、１：４．３における点線は、試験した血清の最も高い濃度を表す。この線より低い値は、非線形回帰方程式によって決定された曲線から推定し、その場合、１：２．３を真に陽性のシグナルとして設定した。データは、トリプリケートにおいて実施した実験の平均（±１ＳＤ）として報告される。＊は、一元配置分散分析におけるｐ＜０．０５である。図１７Ｃは、ＢｌａｓｔＰ スイート−２配列ソフトウェアを使用して決定された、ＣＢＣ ＮＡおよびＡ（Ｈ１Ｎ１）ｐｄｍ０９ウイルスによって共有される同一性のパーセントを示す図である。太字の数字は、どこでＮＡＩアッセイにおいて＞２．３（すなわち、１：５）の１：ＩＣ_５０が観察されるかを特定する。 図１７−１の続き。

配列の記載

定義
アジュバント：本明細書において使用される場合、アジュバントは、抗原への免疫応答を非特異的に増強する物質またはビヒクルを指す。アジュバントとして、抗原が吸着されるミネラル（例えば、アラム、水酸化またはリン酸アルミニウム）の懸濁物；抗原溶液がミネラル油中または水中に乳化されている油中水または水中油乳剤（例えば、フロイント不完全アジュバント）が非限定的に挙げられる。時に、死菌マイコバクテリアが抗原性をさらに増強するために含まれる（例えば、フロイント完全アジュバント）。免疫賦活性オリゴヌクレオチド（例えば、ＣｐＧモチーフ）もアジュバントとして使用できる（例えば、米国特許第６，１９４，３８８号；第６，２０７，６４６号；第６，２１４，８０６号；第６，２１８，３７１号；第６，２３９，１１６号；第６，３３９，０６８号；第６，４０６，７０５号；および第６，４２９，１９９号を参照されたい）。アジュバントは、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニストおよび共刺激分子などの生物学的分子も含む。例示的生物学的アジュバントとして、これだけに限らないが、ＩＬ−２、ＲＡＮＴＥＳ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−ａ、ＩＦＮ−γ、Ｇ−ＣＳＦ、ＬＦＡ−３、ＣＤ７２、Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＯＸ−４０Ｌ、４１ ＢＢＬまたはこれらの組合せが挙げられる。

抗体：本明細書において使用される場合、抗体は、特定の抗原に特異的結合を付与するために十分なカノニカル免疫グロブリン配列エレメントを含むタンパク質またはポリペプチドを指す。一部の実施形態では、抗体は、２本の重鎖および２本の軽鎖を含む古典的抗体である。各重鎖は、１つの可変領域（例えば、Ｖ_Ｈ）ならびに少なくとも３つの定常領域（例えば、ＣＨ_１、ＣＨ_２およびＣＨ_３）を含み、各軽鎖は、１つの可変領域（Ｖ_Ｌ）および１つの定常領域（Ｃ_Ｌ）を含む。可変領域は、抗体の特異性を決定する。各可変領域は、４つの比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）に隣接された、相補性決定領域（ＣＤＲ）としても周知の３つの高頻度可変性領域を含む。３つのＣＤＲは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と称され、抗体結合特異性に寄与する。一部の実施形態では、抗体は、例えば、抗体の抗原結合または可変領域などの未処置抗体の一部を含む「抗体断片」または「抗体断片（複数）」とも称される。「抗体断片」の例として、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片、三価抗体（triabody）、四価抗体（tetrabody）、直鎖抗体、１本鎖抗体分子および多特異性抗体に含まれるＣＤＲ含有部分が挙げられる。ある特定の実施形態では、天然抗体において見出されるような十分な免疫グロブリンドメイン配列を含む任意のポリペプチドまたはポリペプチドの複合体は、かかるポリペプチドが天然で産生される（例えば、抗原に反応する生物によって生成される）、または組換え工学、化学合成もしくは他の人工システムもしくは方法によって産生されるかに関わらず、「抗体」と呼ばれるおよび／または「抗体」として使用される。一部の実施形態では、抗体は、モノクローナルである；一部の実施形態では、抗体は、ポリクローナルである。一部の実施形態では、抗体は、キメラ抗体である。一部の実施形態では、抗体はヒト化されている。

抗原：本明細書において使用される場合、抗原は、生物に曝露もしくは投与される場合に免疫応答を誘発する作用剤および／または、Ｔ細胞受容体（例えば、ＭＨＣ分子によって提示される場合）によって結合されるもしくは抗体（例えば、Ｂ細胞によって産生される）に結合する作用剤を指す。一部の実施形態では、抗原は、生物において液性応答（例えば、抗原特異的抗体の産生を含む）を誘発する。代替的にまたは追加的に、一部の実施形態では、抗原は、生物において細胞性応答（例えば、その受容体が抗原と特異的に相互作用するＴ細胞を含む）を誘発する。具体的な抗原が標的生物（例えば、マウス、ウサギ、霊長類、ヒト）の１つまたはいくつかのメンバーにおいて免疫応答を誘発できるが、標的生物種のすべてのメンバーにおいてではないことは、当業者によって理解される。一部の実施形態では、抗原は、標的生物種のメンバーの少なくとも約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％において免疫応答を誘発する。一部の実施形態では、抗原は、抗体および／またはＴ細胞受容体に結合し、生物において具体的な生理学的応答を誘導する場合としない場合がある。一部の実施形態では、例えば抗原は、かかる相互作用がｉｎ ｖｉｖｏで生じるかどうかに関わらずｉｎ ｖｉｔｒｏで抗体に、および／またはＴ細胞受容体に結合できる。一部の実施形態では、抗原は、異種性免疫原によって誘導されたものを含む特異的液性または細胞性免疫の産生物と反応する。一部の実施形態では、インフルエンザＮＡポリペプチドまたはその免疫原性断片は、抗原である。

抗原ドリフト：本明細書において使用される場合、抗原ドリフトは、比較的頻繁に生じるＨＡまたはＮＡ抗原における変異を指す。抗原ドリフトは、インフルエンザウイルスが免疫認識を逃れられるようにでき、ワクチン効能を減少させる場合がある。

抗原シフト：本明細書において使用される場合、抗原シフトは、異なるインフルエンザ株間の遺伝子材料の再集合によって生じるＨＡまたはＮＡ抗原における主な変化を指す。

およそ：本明細書において使用される場合、用語「およそ」または「約」は、目的の１つまたはそれ以上の値に適用される場合、述べられる基準値に近い値を指す。ある特定の実施形態では、用語「およそ」または「約」は、他に述べられない限りまたは内容から他が明らかでない限り、述べられた基準値のいずれかの方向における（超えるまたは少ない）約２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％またはこれ未満の範囲内の値の範囲を指す（かかる値が可能値の１００％を超える場合を除く）。

エピトープ：本明細書において使用される場合、免疫グロブリン（例えば、抗体または受容体）結合成分の全体または部分によって特異的に認識される任意の部分を指す。一部の実施形態では、エピトープは、抗原上の複数の化学原子または基からなる。一部の実施形態では、かかる化学的原子または基は抗原が適切な三次元コンホメーションをとった場合に表面に曝露される。一部の実施形態では、かかる化学原子または基は、抗原がかかるコンホメーションをとった場合に空間的に互いに物理的に近い。一部の実施形態では、化学的原子または基の少なくとも一部は、抗原が代替的コンホメーションをとった（例えば、直鎖化されている）場合に互いに物理的に離される。

宿主：本明細書において使用される場合、用語「宿主」は、目的のポリペプチドが存在するシステム（例えば、細胞、生物など）を指す。一部の実施形態では、宿主は、特定の感染病原体での感染に感受性であるシステムである。一部の実施形態では、宿主は、目的の特定のポリペプチドまたはタンパク質を発現するシステムである。

宿主細胞：本明細書において使用される場合、「宿主細胞」は、外来性ＤＮＡ（組換えまたはその他）が導入される細胞を指す。例えば、宿主細胞は、標準的組換え技術によって本明細書に記載のインフルエンザＮＡポリペプチドを産生するために使用できる。当業者は、かかる用語が具体的な対象細胞だけでなく、かかる細胞の後代も指すことを理解する。ある特定の改変が、変異または環境の影響のいずれかのために続く世代に生じる場合があることから、かかる後代は、実際に、親細胞と同一でない場合があるが、本明細書において使用される、用語「宿主細胞」の範囲内にいまだ含まれる。一部の実施形態では、宿主細胞は、外来性ＤＮＡ（例えば、組換え核酸配列）を発現するために好適な任意の原核および真核細胞を含む。例示的細胞として、原核もしくは真核細胞（単細胞もしくは多細胞）、細菌細胞（例えば、大腸菌、バチルス種、ストレプトマイセス種などの株）、マイコバクテリア細胞、真菌細胞、酵母細胞（例えば、出芽酵母、分裂酵母、Ｐ．パストリス、Ｐ．メタノリカ（P.methanolica）など）、植物細胞、昆虫細胞（例えば、ＳＦ−９、ＳＦ−２１、バキュロウイルス感染昆虫細胞、イラクサギンウワバなど）、非ヒト動物細胞、ヒト細胞、または細胞融合物（例えば、ハイブリドーマまたはクアドローマ）が挙げられる。一部の実施形態では、細胞は、ヒト、サル、類人猿、ハムスター、ラットまたはマウス細胞である。一部の実施形態では、細胞は、真核細胞であり、これだけに限らないが、ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯ Ｋ１、ＤＸＢ−１１ＣＨＯ、Ｖｅｇｇｉｅ−ＣＨＯ）、ＣＯＳ（例えば、ＣＯＳ−７）、網膜細胞、Ｖｅｒｏ、ＣＶ１、腎細胞（例えば、ＨＥＫ２９３、２９３ＥＢＮＡ、ＭＳＲ２９３、ＭＤＣＫ、ＨａＫ、ＢＨＫ）、ＨｅＬａ、ＨｅｐＧ２、ＷＩ３８、ＭＲＣ５、Ｃｏｌｏ２０５、ＨＢ８０６５、ＨＬ−６０、（例えば、ＢＨＫ２１）、ジャーカット、ダウディ、Ａ４３１（上皮性）、ＣＶ−１、Ｕ９３７、３Ｔ３、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、ＳＰ２／０、ＮＳ−０、ＭＭＴ０６０５６２、セルトリ細胞、ＢＲＬ３Ａ細胞、ＨＴ１０８０細胞、骨髄腫細胞、腫瘍細胞および前述の細胞由来の細胞系から選択される。一部の実施形態では、細胞は、１つまたはそれ以上のウイルス遺伝子を含む、例えば、ウイルス遺伝子を発現する網膜細胞（例えば、ＰＥＲ．Ｃ６（商標）細胞）。

免疫応答：本明細書において使用される場合、用語「免疫応答」は、抗原またはワクチンなどの刺激への、Ｂ細胞、Ｔ細胞、樹状細胞、マクロファージまたは多形核球（polymorphonucleocyte）などの免疫システムの細胞の応答を指す。免疫応答は、例えば、インターフェロンまたはサイトカインを分泌する上皮細胞を含む、宿主防御応答に関与する任意の体細胞を含む。免疫応答として、これだけに限らないが、自然および／または適応免疫応答が挙げられる。本明細書において使用される場合、防御免疫応答は、対象を感染から保護する（例えば、感染を予防するまたは感染に関連する疾患の発症を予防する）免疫応答を指す。免疫応答を測定する方法は、当技術分野において十分周知であり、例えば、リンパ球（ＢまたはＴ細胞など）の増殖および／または活性、サイトカインまたはケモカインの分泌、炎症、抗体産生などを測定することによるものが挙げられる。

免疫原：本明細書において使用される場合、用語「免疫原」は、動物に注射または吸収される組成物を含む、好適な条件下で動物において抗体の産生またはＴ細胞応答などの免疫応答を刺激できる化合物、組成物または物質を指す。本明細書において使用される場合、「免疫原性組成物」は、免疫原（ＮＡポリペプチドまたは四量体ＮＡタンパク質など）を含む組成物である。本明細書において使用される場合、「免疫化」は、ワクチン接種によってなど感染性疾患から対象が保護されるようにすることを意味する。

インフルエンザウイルス：本明細書において使用される場合、オルトミクソウイルス科に属するセグメント化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスを指す。

インフルエンザワクチン：本明細書において使用される場合、インフルエンザウイルス感染の予防、回復または処置のために投与される、免疫応答を刺激できる免疫原性組成物を指す。インフルエンザワクチンとして、例えば、弱毒化または死菌（例えば、分割された）インフルエンザウイルス、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）および／または抗原ポリペプチドもしくはタンパク質（例えば、本明細書に記載のＮＡポリペプチドもしくは四量体ＮＡタンパク質）またはそれら由来のＤＮＡまたはかかる免疫原性材料の任意の組換えバージョンが挙げられる。インフルエンザワクチンは、ＤＮＡおよびウイルスベクターに基づくワクチンも含む。本明細書において検討されるワクチンは、場合により、１つまたはそれ以上のアジュバントを含む場合がある。

単離された：本明細書において使用される場合、（ｉ）最初に産生された（天然において、または実験設定においてであるかに関わらず）際に付随していた構成成分の少なくとも一部から分離された；または（ｉｉ）人工的に産生された、のいずれかである作用剤または実体を指す。単離された作用剤または実体は、最初に付随していた他の構成成分の少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％またはこれ超から分離されている。一部の実施形態では、単離された作用剤は、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％を超えて純粋である。本明細書において使用される場合、他の構成成分を実質的に含まない場合に物質は、「純粋」である。一部の実施形態では、当業者によって理解されるとおり、物質は、例えば、１つまたはそれ以上の担体または賦形剤（例えば、緩衝液、溶媒、水など）などのある特定の他の構成成分と配合された後でも「単離された」または「純粋」とさえ見なすことができ；かかる実施形態では、物質の単離または純度パーセントは、かかる担体または賦形剤を含まずに算出される。例示的実施形態では、天然に存在するポリペプチドまたはポリヌクレオチドなどの生物学的ポリマーは、ａ）その起源または誘導の供給源が、天然でのその天然状態においてそれに伴う構成成分の一部またはすべてと付随しない理由から；ｂ）天然でそれを産生する種と同じ種の他のポリペプチドまたは核酸を実質的に含まない；ｃ）天然でそれを産生する種のものではない細胞または他の発現システムによって発現される、またはそれ由来の構成成分に付随する、場合に、「単離された」と見なされる。したがって、例えば、一部の実施形態では、化学的に合成されるまたは、天然でそれを産生するのとは異なる細胞システムにおいて合成されるポリペプチドは、「単離された」ポリペプチドと見なされる。代替的にまたは追加的に、一部の実施形態では、１つまたはそれ以上の精製技術に供されたポリペプチドは、ａ）天然でそれに付随する；および／またはｂ）最初に産生された際に付随する、他の構成成分から分離されている程度に「単離された」ポリペプチドと見なされる。

ノイラミニダーゼまたはＮＡタンパク質：本明細書において使用される場合、ノイラミニダーゼまたはＮＡタンパク質は、インフルエンザウイルス膜の表面上の構造糖タンパク質を指す。ＮＡは、細胞表面タンパク質からのシアル酸の除去により感染細胞からのインフルエンザウイルスの放出に関与する。現在、抗体とのそれらの相互作用によって決められる１１個の周知のＮＡサブタイプ（すなわち、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８、Ｎ９、Ｎ１０およびＮ１１）がある。所与のＮＡサブタイプのすべてのバリアントは、類似の一連の抗体によって中和される。ＮＡ阻害（ＮＡＩ）アッセイは、具体的なインフルエンザウイルスにおけるＮＡ糖タンパク質サブタイプを同定するために使用でき、それによりウイルスを分類できる。ヒトは、一般にＮ１またはＮ２サブタイプのウイルスに感染する。一部の実施形態では、ＮＡタンパク質は、モノマーであり、単一のＮＡポリペプチドを含む。他の実施形態では、ＮＡタンパク質は、四量体であり、４つのＮＡポリペプチドを含む。図２Ａは、本明細書に記載のモノマーおよび四量体ＮＡタンパク質の実施形態を例示する。本明細書において使用される場合、「ノイラミニダーゼポリペプチド」または「ＮＡポリペプチド」は、そのアミノ酸配列がＮＡの少なくとも１つの特徴的な配列を含むポリペプチドを指す。ＮＡポリペプチドは、全長インフルエンザＮＡポリペプチド配列およびその断片を含む場合がある。当業者は、ＮＡポリペプチド一般の、および／または具体的なＮＡポリペプチド（例えば、Ｎ１もしくはＮ２ポリペプチド）の、または具体的な宿主（例えば、トリ、ラクダ、イヌ、ネコ、ジャコウネコ、ウマ、ヒト、ヒョウ、ミンク、マウス、アシカ、ムナジロテン、ブタ、トラ、クジラなど）の感染を媒介するＮＡの特徴的である配列を容易に同定できる。ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）は、ＮＡポリペプチド配列のデータベースを維持している。

大発生：本明細書において使用される場合、インフルエンザウイルス「大発生」は、所与の年に単一の国の中から単離されたウイルスの集合物を指す。

パンデミック、季節性、ブタ株：本明細書において使用される場合、「パンデミック」インフルエンザ株は、ヒト集団のパンデミック感染を生じたまたは生じる能力を有するものである。一部の実施形態では、パンデミック株は、パンデミック感染を生じさせたことがある。一部の実施形態では、かかるパンデミック感染は、複数の地域にわたる伝染性感染を含む。一部の実施形態では、パンデミック感染は、感染がそれらの間を通常は通過しないような互いに分かれている地域（例えば、山、水域によって、異なる大陸の部分としてなど）にわたる感染を含む。一部の実施形態では、パンデミックインフルエンザ株は、ヒトがそれに対する免疫を欠いているトリまたはブタ由来の新規ＨＡまたはＮＡを有するウイルスを生じる、ヒトインフルエンザウイルスとトリまたはブタインフルエンザウイルスとの間の再集合から生じるもの（およそ２０〜３０年ごとに生じる抗原シフト）を含む。言い換えると、ヒト集団は、無感作であり、過去のワクチン接種または過去の曝露のいずれかの結果としての抵抗性を有さないまたはわずかしか有さないと考えられる。パンデミック株と季節性株とは、抗原的に異なり、配列によって全く異なる。一般に、季節性インフルエンザ株は、具体的な季節または具体的な年、例えば、１９８６年から２００９年（パンデミックではない２００９年配列を含む）由来の蔓延している株、および抗原領域をコードする実質的に類似（すなわち、抗原配列空間において類似）の遺伝配列を有する他の株と定義される。ブタインフルエンザ株は、ブタに固有のウイルスに関連する任意のインフルエンザ株を指す。例示的パンデミック株として、非限定的に、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０４／２００９、Ａ／Ｂｅｌｇｉｕｍ／１４５／２００９、Ａ／Ｓｏｕｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ／０１／１９１８およびＡ／Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ／１９７６が挙げられる。パンデミックサブタイプとして、特に、Ｈ５Ｎ１、Ｈ２Ｎ２、Ｈ９Ｎ２、Ｈ７Ｎ７、Ｈ７Ｎ３、Ｈ７Ｎ９およびＨ１０Ｎ７サブタイプが挙げられる。例示的季節性株として、非限定的に、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／１９３４、Ａ／Ｆｏｒｔ Ｍｏｎｍｏｕｔｈ／１／１９４７、Ａ／Ｃｈｉｌｅ／１／１９８３、Ａ／Ｔｅｘａｓ／３６／１９９１、Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／６／１９８６、Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／３２／１９９２、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／１９９９、Ａ／Ｓｏｌｏｍｏｎ Ｉｓｌａｎｄｓ／０３／２００６、およびＡ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７が挙げられる。例示的ブタ株として、非限定的に、Ａ／Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ／１９７６単離体およびＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９が挙げられる。追加的インフルエンザパンデミック、季節性および／またはブタ株は、当技術分野において周知である。

予防：本明細書において使用される場合、具体的な疾患、障害または状態（例えば、感染、例えばインフルエンザウイルスでの）の、予防（prophylaxis）、疾患顕在化の回避、発病の遅延ならびに／または１つまたはそれ以上の症状の頻度および／もしくは重症度の低減を指す。一部の実施形態では、予防は集団ベースで評価され、疾患、障害または状態の発症、頻度および／または１つまたはそれ以上の症状の強度における統計的に有意な減少が疾患、障害または状態に感受性の集団において観察される場合に、作用剤は具体的な疾患、障害または状態を「予防」すると見なされる。

組換え：本明細書において使用される場合、用語「組換え」は、宿主細胞にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを使用して発現されたポリペプチド、組換え、コンビナトリアルポリペプチドライブラリーから単離されたポリペプチドまたは、選択された配列エレメントを互いにスプライシングすることを含む任意の他の手段によって製造、発現、創出または単離されたポリペプチドなどの、組換え手段によって設計、操作、製造、発現、創出または単離されるポリペプチドまたはタンパク質（例えば、本明細書に記載のＮＡポリペプチドもしくは四量体ＮＡタンパク質）を指すと意図される。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上のかかる選択された配列エレメントは、天然で見出される。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上のかかる選択された配列エレメントは、コンピューターで設計される。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上のかかる選択された配列エレメントは、周知の配列エレメント、例えば、天然または合成供給源由来、の変異導入（例えば、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏ）から生じる。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上のかかる選択された配列エレメントは、同じポリペプチドに天然では存在しない複数（例えば、２つ以上）（例えば、２つの別々のＮＡポリペプチド由来の２つのエピトープ）の周知の配列エレメントの組合せから生じる。

シグナル配列、分泌シグナル、または分泌シグナルペプチド：本明細書において使用される場合、用語は、細胞からの分泌のためのシグナルを伝達するペプチド配列を指す。分泌シグナルは、そうでなければ分泌されないポリペプチドまたはタンパク質の分泌をもたらすことができる。

四量体化ドメイン：本明細書において使用される場合、用語は、ポリペプチドまたはタンパク質の四量体アセンブリを生じるドメインをコードするアミノ酸配列を指す。具体的なタンパク質に由来しない四量体化ドメインは、人工または異種性四量体化ドメインと称される。例示的四量体化ドメインとして、これだけに限らないが、テトラブラキオン、ＧＣＮ４ロイシンジッパーまたは血管拡張因子刺激リン酸化タンパク質（ＶＡＳＰ）由来の配列が挙げられる。

配列同一性：アミノ酸配列または核酸配列間の類似性は、配列間の類似性および／または同一性の観点から表される。配列類似性は、配列同一性および相同性によって密接に関連している配列の要素を含む。配列類似性は、類似性（または同一性もしくは相同性）百分率の観点からしばしば測定される；百分率が高いほど２つの配列はより類似している。所与の遺伝子またはタンパク質のホモログまたはバリアントは、標準的方法を使用してアラインされた場合に比較的高い程度の配列同一性を有する。比較のための配列のアライメント法は、当技術分野において十分周知である。種々のプログラムおよびアライメントアルゴリズムが当技術分野において記載されている：Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２，１９８１；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３，１９７０；Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：２４４４，１９８８；Ｈｉｇｇｉｎｓ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ，Ｇｅｎｅ ７３：２３７〜２４４，１９８８；Ｈｉｇｇｉｎｓ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１〜１５３，１９８９；Ｃｏｒｐｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １６：１０８８１〜１０８９０，１９８８およびＰｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：２４４４，１９８８．Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．６：１１９〜１２９，１９９４。ＮＣＢＩ Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ（登録商標））（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０，１９９０）は、配列分析プログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎおよびｔｂｌａｓｔｘとの関連での使用のためにｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．）を含むいくつかの供給元から入手可能である。

対象：本明細書において使用される場合、動物界の任意のメンバーを指す。一部の実施形態では、「対象」はヒトを指す。一部の実施形態では、「対象」は非ヒト動物を指す。一部の実施形態では、対象として、これだけに限らないが、哺乳動物、鳥類、は虫類、両生類、魚類、昆虫および／または虫が挙げられる。ある特定の実施形態では、非ヒト対象は、哺乳動物（例えば、げっ歯類、マウス、ラット、ウサギ、サル、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、霊長類および／またはブタ）である。一部の実施形態では、対象は、トランスジェニック動物、遺伝的に操作された動物、および／またはクローンである場合がある。本発明のある特定の実施形態では、対象は、成人、青年または幼児である。一部の実施形態では、用語「個体」または「患者」は、「対象」と互換的であるとして使用され、意図される。本発明によって同様に検討されるのは、子宮内での医薬組成物の投与および／または処置法の実施である。

ワクチン接種：本明細書において使用される場合、用語「ワクチン接種」または「ワクチン接種する」は、例えば病原体への、免疫応答を生成する目的の組成物の投与を指す。ワクチン接種は、病原体への曝露および／または１つまたはそれ以上の症状の発症の前、その間および／または後、一部の実施形態では、病原体への曝露の前、その間および／または直後に投与される。一部の実施形態では、ワクチン接種は、ワクチン接種組成物の適切な時間間隔での複数回投与を含む。

ウイルス様粒子（ＶＬＰ）：本明細書において使用される場合、句「ウイルス様粒子」または「ＶＬＰ」は、ウイルスに類似しているが、いかなるウイルス遺伝材料も欠いており、したがって感染性でない粒子を指す。「ウイルス様粒子」または「ＶＬＰ」は、哺乳動物細胞系、昆虫細胞系、酵母および植物細胞を含む種々の細胞培養システムにおける異種性発現によって産生される。加えてＶＬＰは、当技術分野において周知の方法によって精製される。一部の実施形態では本明細書に記載のインフルエンザＶＬＰは、ＨＡポリペプチドおよび／またはＮＡポリペプチドを含む。一部の実施形態では、本明細書に記載のインフルエンザＶＬＰは、ＨＡポリペプチド、ＮＡポリペプチドおよび／または構造ポリペプチドを含む。一部のある特定の実施形態では、本明細書に記載のインフルエンザＶＬＰは、ＨＡポリペプチド、ＮＡポリペプチドおよび／またはインフルエンザＭ１ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、本明細書に記載のインフルエンザＶＬＰは、ＨＡポリペプチド、ＮＡポリペプチドおよび／またはＨＩＶ ｇａｇポリペプチドを含む。当業者は、他のウイルス構造タンパク質を本明細書に例示されるものの代替として使用できることを認識する。インフルエンザＶＬＰは、ＨＡおよびＮＡタンパク質、ならびに場合によりＭ１タンパク質および／またはＨＩＶ ｇａｇタンパク質をコードするプラスミドを用いた、宿主細胞（例えば、哺乳動物細胞）のトランスフェクションによって産生できる。タンパク質発現を可能にするための好適な期間でのトランスフェクトされた細胞のインキュベーション後に、ＶＬＰは細胞培養上清から単離される。一部の実施形態では、本明細書に記載のインフルエンザＶＬＰは、哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞）での一過性トランスフェクションによって産生される。一部の実施形態では、インフルエンザＶＬＰは、１つまたはそれ以上のアッセイの使用によって分析される。例えば、インフルエンザＶＬＰ粒子サイズは、動的光散乱によって分析でき、かかるＶＬＰは、タンパク質染色によって、ヘマグルチニン活性およびヘマグルチニン含有量の定量についても分析される。

野生型（ＷＴ）：当技術分野において理解されるとおり、用語「野生型」は、天然で見出されるタンパク質または核酸の通常の形態を一般に指す。例えば、野生型ＮＡポリペプチドは、インフルエンザウイルスの天然の単離物において見出される。種々の異なる野生型ＮＡ配列をＮＣＢＩインフルエンザウイルス配列データベースにおいて見出すことができる。

ノイラミニダーゼ（ＮＡ）ポリペプチドを設計するための方法
コンセンサスインフルエンザタンパク質配列を生成することに関連する重要な課題は、時間的および地理的配列バイアスに関する。かかるバイアスは、一部は、公的なおよび／または民間の配列データベースに提供される配列記録がしばしばより最近の配列に大きく偏っているために存在する。さらに、合衆国などのある特定の地理的領域と関連する配列がしばしば大きな比率を占める。一態様では、本発明は、かかる時間的および地理的配列バイアスを克服するクラスターベースコンセンサスアプローチを使用して、コンセンサスアミノ酸を含むインフルエンザＮＡポリペプチドを生成するための新規方法を提供する。本発明の方法は、系統発生学的情報と無関係で、一次アミノ酸配列に含有される情報だけに依存する。したがって、本方法は、全体的な配列多様性を反映し、時間的または地理的に大きな比率を占める配列へのバイアスがないＮＡポリペプチド配列を生成することができる。

種々の実施形態では、方法は、複数のインフルエンザＮＡ配列における配列差異のコンピューター分析に基づいてＮＡポリペプチド配列を設計すること、類似配列のクラスターを生成するためにコンセンサスベース配列アルゴリズムを適用すること、およびコンセンサスアミノ酸配列を有するＮＡポリペプチドの構造分析を実施することを含む。一部の実施形態では、本方法は、Ｋ平均法、ミニマックスクラスタリングおよび最遠距離優先クラスタリング（Farthest-First clustering）などのツールを使用してクラスター化できるペアワイズ類似性／非類似性マトリクスを生成する。代替的にまたは追加的に、ペアワイズ類似性／非類似性マトリクスは、好適なクラスターを定義するため（例えば、クラスターを分離し、数を決めるため）の、多次元尺度構成法（ＭＤＳ）または主成分分析（ＰＣＡ）などのオーディネーション技術を使用してコンパクト表現で可視化される。さらに本方法は、コンセンサス配列内の可変アミノ酸位置を解明し、正しくフォールドし、それにより機能性であり易い候補を順位付けるために、分子モデリングおよび結晶構造との比較を利用する。

理論に束縛されることを望むわけではないが、本発明の方法は、さまざまなインフルエンザ株、型および／またはサブタイプにわたって保存されたエピトープを含むＮＡポリペプチドを生成すると考えられる。したがって、種々の実施形態では、本方法は、広範なインフルエンザ株（例えば、１つまたはそれ以上の季節性、パンデミックもしくはブタ株）、インフルエンザ型（例えば、１つまたはそれ以上のインフルエンザＡ型、Ｂ型もしくはＣ型）および／またはインフルエンザサブタイプ（例えば、非限定的に、Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２もしくはＨ５Ｎ１などの１つまたはそれ以上のインフルエンザサブタイプ）に対して交差反応性免疫応答の増強を誘導できるＮＡポリペプチドを生成する。

一部の実施形態では、本方法は、種々のインフルエンザＮＡポリペプチド配列を選択することを含む。種々の異なるＮＡ配列は、ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）インフルエンザウイルス配列データベースなどの配列データベースにおいて見出すことができる。一部の実施形態では、固有の配列の非重複サブセットは、配列アライメントのために選択される。

一部の実施形態では、本方法は、インフルエンザＮＡポリペプチド配列をアラインすることを含む。当技術分野において周知の任意の多重配列アライメントツールを使用できる。例えば、Ｋａｔｏｈ ａｎｄ Ｋｕｍａ（２００２）ＮＡＲ，３０：３０５９；Ｋａｔｏｈ ａｎｄ Ｓｔａｎｄｌｅｙ（２０１３）Ｍｏｌ ＢｉｏＬ Ｅｖｏｌ ３０：７７２；Ｅｄｇａｒ，Ｒ．Ｃ．（２００４）ＮＡＲ，３２：１７９２；Ｅｄｇａｒ，Ｒ．Ｃ．（２００４）ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆ，１１３；Ｓｉｅｖｅｒｓ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｍｏｌ Ｓｙｓ Ｂｉｏｌ ７：５３９；およびＰｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ．（１９８８）ＰＮＡＳ，８５：２４４４を参照されたい。本発明のために利用できる例示的配列アライメントツールとして、これだけに限らないが、ＭＡＦＦＴ、ＭＵＳＣＬＥ、ＣＬＵＳＴＡＬ ＯＭＥＧＡ、ＦＡＳＴＡ、またはこれらの組合せが挙げられる。

一部の実施形態では、特異的配列領域は、さらなる分析から遮蔽される場合がある。例えば、ＮＡシグナルペプチド配列、膜貫通ドメイン配列または任意の他の保存ＮＡドメインの任意の１つは、さらなる分析から遮蔽される場合がある。

一部の実施形態では、本方法は、アラインされた配列からペアワイズ類似性／非類似性マトリクスを算出することを含む。２つ以上の配列間の距離を算出するための任意の方法を使用できる。ペアワイズ類似性／非類似性マトリクスを算出するための例示的ツールとして、これだけに限らないが、ＢＬＯＳＵＭ、ＰＡＭ、ＩＤＥＮＴＩＴＹ置換マトリクスまたはこれらの組合せが挙げられる。一実施形態では、ＦａｓｔＴｒｅｅなどのペアワイズ類似性／非類似性マトリクスを算出するための代替法を使用する場合がある（Ｐｒｉｃｅ，Ｍ．Ｎ．，Ｄｅｈａｌ，Ｐ．Ｓ．，ａｎｄ Ａｒｋｉｎ，Ａ．Ｐ．（２００９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ２６：１６４１〜１６５０）。

一部の実施形態では、本方法は、ペアワイズ類似性／非類似性マトリクスから類似配列のクラスターを同定するおよび創出することをさらに含む。類似配列のクラスターを同定するための例示的ツールとして、これだけに限らないが、Ｋ平均クラスタリング、ミニマックスクラスタリング、最遠距離優先クラスタリング、主成分分析（ＰＣＡ）、多次元尺度構成法（ＭＤＳ）またはこれらの組合せが挙げられる。一実施形態では、クラスタリングのためにＫ平均法が利用される（Ｈａｒｔｉｇａｎ，Ｊ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（１９７９）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｒｏｙａｌ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｓｅｒｉｅｓ Ｃ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ，２８（１）：１００〜１０８を参照されたい）。別の実施形態では、ミニマックスクラスタリング（例えば、類似性マトリクスのミニマックスリンケージ階層クラスタリング（linkage hierarchical clustering））が利用される（Ｂｉｅｎ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，（２０１１）Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎを参照されたい）。さらなる実施形態では、近似解法（farthest-first traversal）が使用される（Ｒｏｓｅｎｋｒａｎｔｚ ｅｔ ａｌ．（１９７７）ＳＩＡＭ Ｊ Ｃｏｍｐ，６：５６３を参照されたい）。

一部の実施形態では、オーディネーション技術が、ペアワイズ類似性／非類似性マトリクス由来の類似配列のクラスターを同定および創出するために使用される。例えば、一部の実施形態では、ＰＣＡは、ペアワイズ類似性／非類似性マトリクスの次元削減（dimension reduction）のために使用される。ＰＣＡは、高次元、ペアワイズ類似性／非類似性マトリクスを、類似配列のクラスターの可視化および同定を促進する低次元サブ空間に変換するために利用できる（Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｋ．（１９０１）Ｐｈｉｌｏｓｏｐｈｉｃａｌ Ｍａｇａｚｉｎｅ ２（１１）：５５９〜５７２およびＨｏｔｅｌｌｉｎｇ，Ｈ．（１９３３）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ Ｐｓｙｃｈｏｌｏｇｙ，２４，４１７〜４４１，ａｎｄ ４９８〜５２０を参照されたい）。さらなる実施形態では、多次元尺度構成法（ＭＤＳ）が使用される。ＭＤＳは、多次元データセットの類似性および非類似性のレベルを算出および可視化し、一連の点のすべての対の間の距離を最良に再現する次元の削減されたセットを見出す手段を指す。一部の実施形態では、ＭＤＳは、オブジェクト間の距離が維持されるように、Ｎ次元空間中の各オブジェクトを位置させるために使用される。一部の実施形態では、ＭＤＳは、距離マトリクスに含有される情報の提示を可能にする。一部の実施形態では、ＭＤＳは、削減された次元空間にＮＡ配列を置き、それによりウイルス配列の対の間の相対距離を正確に維持する。一部の実施形態では、系統発生学的方法が再集合および／または組換えの存在下で一致しない場合があることから、ＭＤＳは、系統発生学的方法における欠点を克服する。一部の実施形態では、ＭＤＳは、無作為であるインフルエンザウイルスにおける中立置換を除去する。種々の実施形態では、ＭＤＳまたはＰＣＡなどのオーディネーション技術は、クラスターの可視化および同定を促進するために、高次元、ペアワイズ距離マトリクスを低次元サブ空間に変換することを助ける。

一部の実施形態では、本明細書に記載の方法は、類似配列の１より多いクラスター（例えば、季節性様、パンデミック様またはブタ様配列）を創出する。本明細書に記載の方法での使用のための配列の例示的クラスターは、これだけに限らないが、図１Ａに示されるものである。

一部の実施形態では、各クラスター内で、コンセンサス配列は、多重配列アライメントにおける各位置で最も頻繁なアミノ酸に基づいて算出される。例えば、所与の位置でのアミノ酸の頻度が５０％（または使用者が定義する任意の他の閾値）以上である場合、そのアミノ酸はコンセンサスアミノ酸と指定される。代替的に、所与の位置でのアミノ酸の頻度が５０％（または使用者が定義する任意の他の閾値）未満である場合、そのアミノ酸は可変アミノ酸と指定される。一部の実施形態では、第１の配列は、コンセンサスアミノ酸および可変アミノ酸を含む各クラスターについて生成される。一部の実施形態では、各クラスターについて生成された第１の配列は、クラスター内コンセンサス配列と指定される。

一部の実施形態では、コンセンサス配列は、複数配列クラスターについて生成される。かかる実施形態では、複数クラスターについて選択されたクラスター内コンセンサス配列は、特定された結果の特性に基づいて追加的コンセンサス配列を導き出すためにマージされる。例えば、特定の地理的領域、宿主または時期と関連するクラスター内コンセンサス配列は、クラスターを超えるコンセンサス配列（例えば、第２の配列）を生成するためにマージされる。

種々の実施形態では、クラスターを超えるコンセンサス配列を生成するために、１つのクラスターから生成されたクラスター内コンセンサス配列（例えば、第１の配列）は、別のクラスターまたは複数クラスターから生成されたクラスター内コンセンサス配列（例えば、第１の配列）と比較される。一部の実施形態では、生成された配列は、互いに対してアラインされる。一部の実施形態では、ペアワイズアライメント法は、アライメントにおいて各位置に対するコンセンサスアミノ酸があるかどうかを決定するために利用される。既に記載したとおり、所与の位置でのアミノ酸の頻度が５０％（または使用者が定義する任意の他の閾値）以上である場合、そのアミノ酸はコンセンサスアミノ酸と指定され、所与の位置でのアミノ酸の頻度が５０％（または使用者が定義する任意の他の閾値）未満である場合、そのアミノ酸は可変アミノ酸と指定される。一部の実施形態では、コンセンサスアミノ酸および可変アミノ酸を含むクラスターを超えるコンセンサス配列（例えば、第２の配列）は、かかる多重クラスター分析から生成される。種々の実施形態では、各位置で配列をアラインするおよびコンセンサスアミノ酸を決定するプロセスは、目的のすべての配列クラスターが検討されるまで繰り返し実施される。

一部の実施形態では、追加的工程は、生成されたクラスター内コンセンサス配列内、および／またはクラスターを超えるコンセンサス配列（例えば、第１の配列および／または第２の配列）内の、各可変アミノ酸位置についてコンセンサスアミノ酸を決定するために実施される。かかる実施形態では、一連の検査配列は、コンセンサス配列（例えば、第１のおよび／または第２の配列）に基づいて生成され、検査アミノ酸を、可変アミノ酸位置に位置させる。本明細書に記載の方法において使用される検査アミノ酸は、必須または非必須アミノ酸を含むタンパク質において見出される任意の天然または非天然（例えば、非古典的）アミノ酸を包含する。例示的アミノ酸として、下の表２に提供されるアミノ酸および本明細書他所に記載されるものが挙げられる。

種々の実施形態では、本方法は、検査配列を分析するための分子モデリングの使用を検討する。一部の実施形態では、分子モデリングは、検査配列のそれぞれについて実施される。一部の実施形態では、分子モデリングは、分析されるインフルエンザタンパク質（すなわち、ＮＡ）の結晶構造との比較を含む。かかる結晶構造情報は、例えば、ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋから容易に入手可能である。一実施形態では、分子モデリングは、Ｒｏｓｅｔｔａ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｒｏｓｅｔｔａｃｏｍｍｏｎｓ．ｏｒｇ／ｓｏｆｔｗａｒｅ）または任意の他の同様の分子モデリングソフトウェアの使用を含む（例えば、Ｌｅａｖｅｒ−Ｆａｙ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．４８７：５４５〜７４を参照されたい）。例えば、コンセンサス配列中の可変アミノ酸位置を解明するために、Ｒｏｓｅｔｔａ内のメトロポリス−モンテカルロシミュレートされたアニーリングプロトコールは、差異の同定された部位に存在するアミノ酸残基のすべての可能な組合せの置換を標本抽出するために使用される。次いで可能な置換は、エネルギー値に基づいてスコア化される。

一部の実施形態では、各可変アミノ酸位置についてのコンセンサスアミノ酸は、出発値と同様のまたはそれより低い算出された総エネルギー値を有するＮＡポリペプチドを生じるアミノ酸（複数可）を選択することによって決定される。一部の実施形態では、各可変アミノ酸位置についてのコンセンサスアミノ酸は、負の総エネルギー値を有するＮＡポリペプチドを生じるアミノ酸（複数可）を選択することによって決定される。理論に束縛されることを望むわけではないが、負の総エネルギースコアを有するＮＡポリペプチドは、安定なタンパク質にさらにフォールドし易い一方で、正のエネルギースコアを有するポリペプチドは、あまり正しくフォールドしないと考えられる。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上のＮＡポリペプチドは、それらの負の総エネルギースコアおよび／または参照構造との比較に従って生成され、順位付けられる。

種々の実施形態では、本方法は種々の位置にコンセンサスアミノ酸を含むＮＡポリペプチド配列を生成する。本発明の方法を使用して生成された例示的ＮＡポリペプチドは表１に示されている。表１の配列表は、米国仮特許出願第６２／６４９，００２号の表１の配列表と同一である。

ノイラミニダーゼ（ＮＡ）ポリペプチドおよびタンパク質
別の態様では、本発明は、本明細書に記載の方法を用いて生成されたＮＡポリペプチドを提供する。一部の実施形態では、ＮＡポリペプチドは、コンセンサスアミノ酸配列を含み、複数のインフルエンザ株（例えば、１つまたはそれ以上のパンデミック、季節性、および／またはブタインフルエンザ株）、タイプ（例えば、１つまたはそれ以上のインフルエンザＡ型、Ｂ型、および／またはＣ型ウイルス）、および／またはサブタイプ（例えば、１つまたはそれ以上のＨ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、またはＨ５Ｎ１）に対する免疫応答を誘発することができる。したがって、一部の実施形態では、ＮＡポリペプチドは、インフルエンザに対する改良された防御免疫を提供するために、抗原としてワクチン組成物中に取り込まれ得る。

一部の実施形態では、本発明は、配列番号１、２、もしくは３から選択されるアミノ酸配列を含むＮＡポリペプチド、またはこれらの断片を提供する。例えば、一部の実施形態では、ＮＡポリペプチドは、配列番号１、２、または３のアミノ酸７５〜４６９を含む。一部の実施形態では、ＮＡポリペプチドは、配列番号１、２、もしくは３と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列、またはその断片（例えば、配列番号１、２、もしくは３のアミノ酸７５〜４６９を含む断片）を含む。

一部の実施形態では、本発明は、配列番号７〜１８から選択されるアミノ酸配列を含むＮＡポリペプチド、またはその断片を提供する。一部の実施形態では、ＮＡポリペプチドは、配列番号７〜１８と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列、またはその断片を含む。

一部の実施形態では、本発明は、配列番号１、２、もしくは３、または配列番号７〜１８のいずれか１つに対して１つまたはそれ以上のアミノ酸突然変異を有するＮＡポリペプチド、またはその断片を提供する。例えば、ＮＡポリペプチドは、配列番号１、２、もしくは３、または配列番号７〜１８のいずれか１つに対してアミノ酸突然変異、またはこれらの断片に対して約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４、約３５、約３６、約３７、約３８、約３９、約４０、約４１、約４２、約４３、約４４、約４５、約４６、約４７、約４８、約４９、もしくは約５０個のアミノ酸突然変異、またはその断片を含むことができる。

一部の実施形態では、１つまたはそれ以上のアミノ酸突然変異は、置換、挿入、欠失、および切断から独立して選択される。一部の実施形態では、アミノ酸突然変異は、アミノ酸置換であり、保存的および／または非保存的置換を含み得る。

保存的置換は、例えば、関連するアミノ酸残基の極性、電荷、サイズ、溶解性、疎水性、親水性、および／または両親媒性の性質における類似性に基づいて行われる。例えば、２０個の天然に存在するアミノ酸は、以下の６つの標準なアミノ酸群に群分けすることができる：（１）疎水性：Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；（５）鎖配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；および（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。本明細書で使用される場合、「保存的置換」は、上記で示された６つの標準的なアミノ酸群と同じ群内にリストされた別のアミノ酸によるアミノ酸の交換として定義される。例えば、ＧｌｕによるＡｓｐの交換は、改変されたポリペプチドに１つの負電荷を保持する。さらに、α−ヘリックスを破壊する能力に基づいて、グリシンおよびプロリンが互いに置換される。本明細書で使用される場合、「非保存的置換」は、上記で示された６つの標準アミノ酸群の異なる群にリストされた別のアミノ酸によるアミノ酸の交換として定義される。

種々の実施形態では、置換はまた、非古典的アミノ酸（例えば、セレノシステイン、ピロリジン、Ｎ−ホルミルメチオニンβ−アラニン、ＧＡＢＡおよびδ−アミノレブリン酸、４−アミノ安息香酸（ＰＡＢＡ）、一般的なアミノ酸のＤ−異性体、２，４−ジアミノ酪酸、α−アミノイソ酪酸、４−アミノ酪酸、Ａｂｕ、２−アミノ酪酸、γ−Ａｂｕ、ε−Ａｈｘ、６−アミノヘキサン酸、Ａｉｂ、２−アミノイソ酪酸、３−アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコスメ、シトルリン、ホモシトルリン、シスチン酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、β−アラニン、フルオロアミノ酸、デザイナーアミノ酸、例えば、βメチルアミノ酸、Ｃα−メチルアミノ酸、Ｎα−メチルアミノ酸、および一般的なアミノ酸類似体）を含み得る。

種々の実施形態では、本発明は、さらに、４つのＮＡポリペプチドを含む四量体ＮＡタンパク質を提供する。一部の実施形態では、四量体ＮＡタンパク質内の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または４つすべてのＮＡポリペプチドは、本明細書に記載のアミノ酸配列を含む。例えば、四量体ＮＡタンパク質の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または４つ全てのＮＡポリペプチドは、配列番号１、２、もしくは３、または配列番号７〜１８のアミノ酸配列、またはその断片を含み得る。例示的な実施形態では、四量体ＮＡタンパク質は、配列番号１、２、もしくは３のアミノ酸７５〜４６９を含む少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つＮＡポリペプチドを含む。一部の実施形態では、四量体ＮＡタンパク質は、４つの同一のＮＡポリペプチドを含む。他の実施形態では、四量体ＮＡタンパク質は、異なるアミノ酸配列を有する２つ以上の非同一のＮＡポリペプチドを含む。

種々の実施形態では、本発明は、本発明のＮＡポリペプチド、またはその断片を含む融合タンパク質をさらに提供する。

種々の実施形態では、本発明のＮＡポリペプチドは、四量体化配列または四量体化ドメインを含み、それは単量体ＮＡポリペプチドの四量体ＮＡタンパク質への集合を促進する。一部の実施形態では、ＮＡポリペプチドは、天然のインフルエンザ分離株に見られるＮＡポリペプチドに存在する四量体化配列または四量体化ドメインを含む。例えば、ＮＡポリペプチドは、四量体形成を促進することが公知である天然のインフルエンザ分離株に見られるＮＡポリペプチドのステム領域配列を含み得る。他の実施形態では、ＮＡポリペプチドは、野生型ＮＡポリペプチドには天然に存在しない、操作されたもしくは異種の四量体化配列または四量体化ドメインを含み得る。例えば、ある実施形態では、ＮＡポリペプチドは、テトラブラキオンまたは血管拡張剤刺激リンタンパク質（ＶＡＳＰ）に由来する四量体化ドメインを含むように操作される。別の実施形態では、ＮＡポリペプチドは、ＧＣＮ４ロイシンジッパードメインを含み得る。例示的な実施形態では、本発明のＮＡポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列を含む四量体化ドメインを含むように操作される。四量体化を促進することができる任意の配列またはドメインを本発明に利用することができる。

一部の実施形態では、ＮＡポリペプチドは、分泌シグナルペプチドを含み得る。一実施形態では、分泌シグナルペプチドの取り込みは、ＮＡポリペプチドまたは四量体ＮＡタンパク質が宿主細胞から分泌されることを可能にする。別の実施形態では、分泌シグナルペプチドの取り込みは、タンパク質の発現および生成に使用される宿主細胞（例えば、宿主細胞の上清）からのＮＡポリペプチドまたは四量体ＮＡタンパク質の精製を可能にする。

当該技術分野において公知である任意の分泌シグナルペプチドを本発明のＮＡポリペプチドに組み込むことができると期待される。一部の実施形態では、分泌シグナルペプチドは、タンパク質の発現および生成に使用される宿主細胞に特異的である。例示的な分泌シグナルペプチドには、限定されないが、ＣＤ３３シグナルペプチド配列、ヒトＩｇＧカッパ軽鎖シグナルペプチド（ヒト細胞における発現のため）、ミツバチメリチンシグナル配列（昆虫細胞における発現のため）、および酵母アルファ−因子シグナル配列（酵母細胞における発現のため）が含まれる。例示的な実施形態では、分泌シグナル配列は、ＣＤ５分泌シグナルペプチドである。一実施形態では、ＣＤ５分泌シグナルペプチドは、配列番号５のアミノ酸配列を含む。

一部の実施形態では、ＮＡポリペプチドは、リンカー配列などのさらなる機能的配列を含む。一部の実施形態では、リンカーは、ポリペプチドである。一部の実施形態では、リンカーは、アミノ酸の長さが約１００個未満である。例えば、リンカーは、アミノ酸の長さが約１００個未満、約９０個、約８０個、約７０個、約６０個、約５０個、約４０個、約３０個、約２０個、約１９個、約１８個、約１７個、約１６個、約１５個、約１４個、約１３個、約１２個、約１１個、約１０個、約９個、約８個、約７個、約６個、約５個、約４個、約３個、または約２個であり得る。

種々の実施形態では、リンカーは、グリシンおよび／またはセリン残基（例えば、約３０％、もしくは約４０％、もしくは約５０％、もしくは約６０％、もしくは約７０％、もしくは約８０％、もしくは約９０％、もしくは約９５％、もしくは約９７％のグリシンおよびセリン）で実質的に構成される。例えば、一部の実施形態では、リンカーは（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_ｎであり、ｎは約１〜約８、例えば、１、２、３、４、５、６、７、または８（配列番号２１）である。ある実施形態では、リンカー配列は、ＧＧＳＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２２）である。さらなる例示的リンカーには、限定されないが、配列ＬＥ、ＧＧＧＧＳ（配列番号２３）、（ＧＧＧＧＳ）_ｎ（ｎ＝１〜４）（配列番号２４）、（Ｇｌｙ）_８（配列番号２５）、（Ｇｌｙ）_６（配列番号２６）、（ＥＡＡＡＫ）_ｎ（ｎ＝１〜３）（配列番号２７）、Ａ（ＥＡＡＡＫ）_ｎＡ（ｎ＝２〜５）（配列番号２８）、ＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡ（配列番号２９）、Ａ（ＥＡＡＡＫ）_４ＡＬＥＡ（ＥＡＡＡＫ）_４Ａ（配列番号３０）、ＰＡＰＡＰ（配列番号３１）、ＫＥＳＧＳＶＳＳＥＱＬＡＱＦＲＳＬＤ（配列番号３２）、ＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＳＴ（配列番号３３）、ＧＳＡＧＳＡＡＧＳＧＥＦ（配列番号３４）、および（ＸＰ）_ｎ、（Ｘは、任意のアミノ酸、例えば、Ａｌａ、Ｌｙｓ、またはＧｌｕを示す）を有するリンカーが含まれる。例示的な実施形態では、リンカーは、ＧＧＳまたはＧＳＧである。別の例示的な実施形態では、リンカーはＳＡである。

一部の実施形態では、ＮＡポリペプチドは、機能的タグ配列（例えば、タンパク質精製を促進するため）をさらに含む。限定されないが、ＮＡポリペプチドは、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ポリヒスチジン（例えば、６×Ｈｉｓ（配列番号３５）））、プロテインＡ、ストレプトアビジン／ビオチンベースのタグ、ならびに当該技術分野において公知である任意の他のタンパク質タグなどのアフィニティータグを含み得る。

一部の実施形態では、ＮＡポリペプチドは、トロンビン切断部位、トリプシン切断部位、エンテロキナーゼ切断部位、または当該技術分野において公知である任意の他のプロテアーゼ切断部位などのプロテアーゼ切断部位をさらに含む。

種々の実施形態では、本明細書に記載のＮＡポリペプチド（または四量体ＮＡタンパク質）は、異なる配列を有するある範囲のインフルエンザウイルスに対する改良された防御免疫（例えば、広範な反応性の免疫応答）を提供する。種々の実施形態では、本明細書に記載のＮＡポリペプチド（または四量体ＮＡタンパク質）は、複数のインフルエンザ株の間で保存されたエピトープに対する増強された免疫応答を誘発する。種々の実施形態では、本明細書に記載のＮＡポリペプチド（または四量体ＮＡタンパク質）は、抗原シフトまたは抗原ドリフトを示す異なるインフルエンザウイルスに対する免疫応答を誘導する。

一部の実施形態では、本明細書に記載のＮＡポリペプチドまたは四量体ＮＡタンパク質は、野生型または天然に存在するインフルエンザウイルス株由来のＮＡポリペプチドまたは四量体ＮＡタンパク質と比較して、異なるインフルエンザ株／タイプ／サブタイプにわたってより大きな免疫原性を示す。一部の実施形態では、本明細書に記載のＮＡポリペプチドまたは四量体ＮＡタンパク質は、野生型または天然に存在するインフルエンザウイルス株由来のＮＡポリペプチドまたは四量体ＮＡタンパク質と比較してより大きな安定性を有する。

核酸の構築および発現
種々の実施形態では、組換えＮＡポリペプチドを産生する方法が提供される。本方法は、本明細書に記載のクラスターベースコンセンサス法を用いて、コンセンサスアミノ酸配列を含むＮＡポリペプチドを生成し、宿主細胞を、ＮＡポリペプチドをコードするベクターでトランスフェクトすることによってＮＡポリペプチドを生成することを含む。種々の実施形態では、組換え四量体ＮＡタンパク質を生成する方法もまた提供される。

一部の実施形態では、本明細書に記載のＮＡポリペプチドは、当該技術分野において公知である分子生物学的方法を使用して、核酸から産生される。例えば、核酸分子は、適切な宿主細胞に導入された場合にＮＡポリペプチドを発現することができるベクターに挿入される。適切な宿主細胞には、限定されないが、細菌、酵母、昆虫、および哺乳動物細胞、ならびに本明細書の他の箇所に記載される任意の他の細胞型が含まれる。ベクターへのＤＮＡ断片の挿入のための当業者に公知である任意の方法を使用して、転写／翻訳制御シグナルの制御下でＮＡポリペプチドをコードする発現ベクターを構築することができる。これらの方法は、インビトロの組換えＤＮＡおよび合成クローニング技術、ならびにインビボの組換え技術を含み得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ； Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｅｄｓ．Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌ．Ａｓｓｏｃ．、Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ＮＹ）を参照されたい）。

一部の実施形態では、本発明は、ＮＡポリペプチド、またはＮＡポリペプチドの特徴的もしくは生物学的に活性な部分をコードする核酸を提供する。一部の実施形態では、本発明は、ＮＡポリペプチド、またはＮＡポリペプチドの特徴的もしくは生物学的に活性な部分をコードする核酸に相補的な核酸を提供する。他の実施形態では、本発明は、四量体ＮＡタンパク質をコードする核酸をさらに提供する。

一部の実施形態では、本発明は、ＮＡポリペプチド、またはＮＡポリペプチドの特徴的もしくは生物学的に活性な部分をコードする核酸にハイブリダイズする核酸分子を提供する。このような核酸は、例えば、プライマーとしてまたはプローブとして用いることができる。例示的な実施形態では、このような核酸は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）におけるプライマーとして、ハイブリダイゼーション（インサイチュのハイブリダイゼーションを含む）のためのプローブとして、および／または逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）のためのプライマーとして使用することができる。

一部の実施形態では、核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得、一本鎖または二本鎖であり得る。一部の実施形態では、本発明による核酸は、１つまたはそれ以上の非天然ヌクレオチドを含み得る。一部の実施形態では、本発明による核酸は、天然ヌクレオチドのみを含む。

本発明による核酸分子の発現は、組換えＤＮＡ分子で形質転換された宿主において分子が発現されるように、第２の核酸配列によって調節される。例えば、本発明の核酸分子の発現は、当該技術分野において公知であるプロモーターおよび／またはエンハンサーエレメントによって制御することができる。

一部の実施形態では、核酸分子を含む発現ベクターは、核酸構築物によってコードされるＮＡポリペプチドまたはタンパク質の生成を可能にするために、適切な宿主細胞に形質転換される。次に、発現ベクターで形質転換された宿主細胞を、本発明のＮＡポリペプチドまたは四量体ＮＡタンパク質の生成を可能にする条件下で増殖させ、続いて、ポリペプチドまたはタンパク質を回収する。本発明で用いることができる例示的な細胞型には、限定されないが、哺乳動物細胞、昆虫細胞、酵母細胞、植物細胞、および細菌細胞が含まれる。昆虫細胞には、限定されないが、ＳＦ細胞、毛虫細胞、蝶細胞、蛾細胞、ＳＦ９細胞、ＳＦ２１細胞、ショウジョウバエ細胞、Ｓ２細胞、ツマジロクサヨトウ（ｆａｌｌ ａｒｍｙｗｏｒｍ）細胞、キャベツルーパー細胞、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞、およびイラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌａｓｉａ ｎｉ）細胞が含まれる。適切な哺乳動物細胞には、限定されないが、Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙイヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＥＢｘ細胞、ニワトリ胚細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、サル腎臓細胞、ヒト胚性腎臓細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＮＳＯ細胞、骨髄腫細胞、ハイブリドーマ細胞、初代アデノイド細胞株、初代気管支上皮細胞、形質転換ヒト細胞株、およびＰｅｒ．Ｃ６細胞が含まれる。他の有用な細胞または細胞系には、限定されないが、植物ベースのシステム（例えば、タバコ植物；例えば、Ｊｕｌ−Ｌａｒｓｅｎ，Ａ．ら、Ｈｕｍ Ｖａｃｃｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．、８巻（５号）：６５３〜６１頁、２０１２年を参照されたい）、酵母（例えば、Ａｔｈｍａｒａｍ，Ｔ．Ｎ．ら、Ｖｉｒｏｌ Ｊ．、８巻：５２４頁、２０１１年を参照されたい）、および真菌（例えば、Ａｌｌｇａｉｅｒ，Ｓ．ら、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、３７巻：１２８〜３２頁、２００９年を参照されたい）が含まれる。細菌ベースの発現系もまた、本発明に包含される（例えば、Ｄａｖｉｓ，Ａ．Ｒ．ら、Ｇｅｎｅ、２１巻：２７３〜２８４頁、１９８３年を参照されたい）。本発明は、さらに、バキュロウイルスシステムの使用を意図する。

本発明のＮＡポリペプチドまたは四量体ＮＡタンパク質は、当該技術分野において公知である任意の技術によって精製することができる。例えば、ＮＡポリペプチドまたは四量体ＮＡタンパク質は、可溶性画分においてまたは封入体として細胞から回収することができ、そこから、例えば、塩酸グアニジニウムおよび透析によってこれらを抽出することができる。ＮＡポリペプチドまたは四量体ＮＡタンパク質をさらに精製するために、従来のイオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲル濾過、またはこれらの組み合わせを使用することができる。一部の実施形態では、ＮＡポリペプチドまたは四量体ＮＡタンパク質はまた、真核細胞または原核細胞からの分泌後に、馴化培地から回収することができる。このような実施形態では、精製された組換えＮＡポリペプチドまたは四量体ＮＡタンパク質は、細胞がポリペプチドまたはタンパク質を培養上清中に分泌するのに十分な条件下で宿主細胞を培養し、上清からポリペプチドまたはタンパク質を精製することによって産生される。

一部の実施形態では、組換えＮＡポリペプチドは、モノマーとして宿主細胞から精製される。他の実施形態では、組換えＮＡポリペプチドは、四量体として宿主細胞から精製される。

ＮＡポリペプチドおよびタンパク質の評価
一部の実施形態では、本発明は、（ｉ）１つまたはそれ以上のインフルエンザウイルスに対する免疫応答を誘発するかどうか、（ｉｉ）１つまたはそれ以上のインフルエンザウイルスに対する防御的な免疫応答を提供するかどうか、または（ｉｉｉ）対象への投与後に１つまたはそれ以上のインフルエンザウイルスに対する抗体を産生するかどうかを決定するために、本明細書に記載の方法を用いて産生されたＮＡポリペプチドまたは四量体ＮＡタンパク質を評価することを意図する。このような機能を試験するための種々の方法は、当該技術分野において周知であり、利用することができる。

一部の実施形態では、本明細書に記載の方法に従って生成されたＮＡポリペプチドまたは四量体ＮＡタンパク質は、所望の発現および立体構造について評価される。スクリーニング法は当該技術分野において周知であり、無細胞、細胞ベース、および動物アッセイを含む。インビトロアッセイには、検出可能な標識の使用を伴う固体状態または可溶性標的分子検出法が含まれる。このようなアッセイにおいて、ＮＡポリペプチドまたは四量体ＮＡタンパク質は、標的分子（例えば、免疫グロブリン）への結合を介して同定される。一部の実施形態では、本明細書に記載のＮＡポリペプチドまたはタンパク質は、所望の発現および立体構造特性に基づいて選択される。

本発明は、さらに、動物宿主においてＮＡポリペプチドを試験する方法を提供する。本明細書で使用される場合、「動物宿主」は、インフルエンザ研究に適した任意の動物モデルを含む。例えば、動物宿主には、哺乳動物宿主が含まれ、限定されないが、霊長類、フェレット、ネコ、イヌ、ウシ、ウマ、ウサギ、およびげっ歯類、例えば、マウス、ハムスター、およびラットを含む。一部の実施形態では、ＮＡポリペプチドまたは四量体ＮＡタンパク質の投与前にまたはそれと同時に、動物宿主にインフルエンザウイルスを接種し、動物宿主をインフルエンザウイルスに感染させ、または代わりに動物宿主をインフルエンザウイルスに曝露する。あるいは、動物宿主は、ＮＡポリペプチドまたは四量体ＮＡタンパク質をコードするＤＮＡ分子とともに投与される。鼻腔内経路を含む、当該技術分野において公知である任意の方法により、動物宿主にインフルエンザウイルスを接種し、動物宿主をインフルエンザウイルスに感染させ、または代わりに動物宿主をインフルエンザウイルスに曝露する。

一部の実施形態では、動物宿主は、ＮＡポリペプチドまたは四量体ＮＡタンパク質（場合により、組成物中の成分として）の投与前に、ウイルス曝露または感染に対して未感作である。未感作および／または接種された動物は、種々の研究のいずれにも使用することができる。例えば、このような動物モデルは、当該技術分野において公知であるように、ウイルス伝播の研究に使用することができる。例えば、接種された動物（例えば、フェレット）から未感作動物へのウイルスインフルエンザの空気伝播が公知である（Ｔｕｍｐｅｙら、２００７年、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１５巻；６５５〜５９頁）。例示的なウイルス伝播研究において、ＮＡポリペプチドまたは四量体ＮＡタンパク質を適切な動物宿主に投与して、動物宿主において広範な免疫応答を誘発する上での上記ＮＡポリペプチドまたはタンパク質の有効性を決定することができる。動物宿主における研究から収集されたこのような情報を使用して、ヒト宿主において免疫応答を誘発するためのＮＡポリペプチドまたはタンパク質の有効性を予測することができる。

インフルエンザウイルス様粒子（ＶＬＰ）
一部の実施形態では、本発明は、本明細書に記載されるように、ＮＡポリペプチドまたは四量体ＮＡタンパク質を含むインフルエンザウイルス様粒子（ＶＬＰ）を提供する。インフルエンザＶＬＰは、一部の実施形態では、一般的に、ＨＡ、ＮＡおよび／またはウイルス構造タンパク質（例えば、ＨＩＶ ｇａｇ、インフルエンザＭ１タンパク質）から構成される。インフルエンザＶＬＰの生成は、当該技術分野において公知である。例えば、インフルエンザＶＬＰは、ＨＡ、ＮＡおよび／もしくはＨＩＶ ｇａｇまたはＭ１タンパク質をコードするプラスミドで宿主細胞をトランスフェクションすることによって産生される。例示的な実施形態では、適切な宿主細胞は、ヒト細胞（例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ）を含む。トランスフェクトされた細胞を適切な時間インキュベートして、タンパク質発現を可能にした後（例えば、約７２時間）、ＶＬＰを細胞培養上清から単離することができる。一部の実施形態では、本明細書に開示されるインフルエンザＶＬＰは、１つまたはそれ以上のインフルエンザウイルスに対する広範な中和免疫応答を誘発するためのインフルエンザワクチンとして使用される。

医薬組成物および投与
種々の実施形態では、本発明は、本明細書に記載されるようなＮＡポリペプチドもしくは四量体ＮＡタンパク質、および／または関連実体を含む医薬組成物を提供する。一部の実施形態では、医薬組成物は、インフルエンザウイルスに対する防御的な免疫応答などの免疫応答を誘発することができる免疫原性組成物（例えば、ワクチン）である。

例えば、一部の実施形態では、医薬組成物は、以下：（１）生弱毒化インフルエンザウイルス、例えば、複製欠損ウイルス、（２）不活化ウイルス、（３）ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、（４）本発明の組換えＮＡポリペプチドもしくは組換え四量体ＮＡタンパク質、またはその特徴的もしくは生物学的活性部分、（５）本発明のＮＡポリペプチドもしくは四量体ＮＡタンパク質をコードする核酸、またはその特徴的もしくは生物学的活性部分、（６）本発明のＮＡポリペプチドもしくは四量体ＮＡタンパク質をコードするＤＮＡベクター、またはその特徴的もしくは生物学的活性部分、ならびに／または（７）発現系、例えば、本発明のＮＡポリペプチドもしくは四量体ＮＡタンパク質を発現する細胞のうちの１つまたはそれ以上を含み得る。

一部の実施形態では、本発明は、本発明のＮＡポリペプチドまたは四量体ＮＡタンパク質に関連する抗体または他の薬剤を含む医薬組成物を提供する。ある実施形態では、医薬組成物は、本明細書に記載のＮＡポリペプチドまたは四量体ＮＡタンパク質に結合および／または競合する抗体を含む。あるいは、抗体は、本明細書に記載のＮＡポリペプチドまたは四量体ＮＡタンパク質を含むウイルス粒子を認識することができる。別の実施形態では、医薬組成物は、本明細書に記載のＮＡポリペプチドまたは四量体ＮＡタンパク質と相互作用するかまたは競合する小分子を含む。さらなる実施形態では、医薬組成物は、遺伝子サイレンシングに用いることができる、ＮＡポリペプチド配列に相補的な配列を有する核酸などの核酸を含む。

一部の実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物は、免疫応答を増強するために、単独でまたは１つまたはそれ以上の薬剤と組み合わせて投与される。例えば、一部の実施形態では、医薬組成物は、アジュバントと組み合わせて投与される。本発明は、任意の公知のアジュバントの使用を意図する。例示的アジュバントには、限定されないが、フロイント不完全アジュバントまたはフロイント完全アジュバントが含まれる。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上のサイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＲＡＮＴＥＳ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−α、またはＩＦＮ−γ）、１つまたはそれ以上の増殖因子（例えば、ＧＭ−ＣＳＦまたはＧ−ＣＳＦ）、１つまたはそれ以上の分子、例えば、ＯＸ−４０Ｌもしくは４１ ＢＢＬ、またはこれらの組み合わせが、生物学的アジュバントとして使用される。一部の実施形態では、医薬組成物は、アジュバントとしてアルミニウム塩およびモノホスホリルリピドＡを含み得る。代替的にまたは追加的に、ヒトワクチン、例えば、ＭＦ５９（Ｃｈｉｒｏｎ Ｃｏｒｐ．）、ＣＰＧ ７９０９（Ｃｏｏｐｅｒら（２００４年）Ｖａｃｃｉｎｅ、２２巻：３１３６頁）、およびサポニン、例えば、ＱＳ２１（Ｇｈｏｃｈｉｋｙａｎら（２００６年）Ｖａｃｃｉｎｅ、２４巻：２２７５頁）に使用されるアジュバントを用いることができる。アジュバントのさらなる例としては、限定されないが、ポリ［ジ（カルボキシルアトフェノキシ）ホスファゼン］（ＰＣＣＰ；Ｐａｙｎｅら（１９９８年）Ｖａｃｃｉｎｅ、１６巻：９２頁）、ブロック共重合体Ｐ１２０５（ＣＲＬ１００５；Ｋａｔｚら（２０００年）Ｖａｃｃｉｎｅ、１８巻：２１７７頁）、およびポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ；Ｋｒｅｕｔｅｒら（１９８１年）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．、７０巻：３６７頁）が挙げられる。さらなるアジュバントは、本明細書の他の箇所に記載される。

一部の実施形態では、医薬組成物は、薬学的に許容される担体または賦形剤をさらに含む。本明細書で使用される場合、用語「担体」とは、医薬組成物とともに投与する希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを指す。例示的な実施形態では、担体には、無菌液体、例えば、水および油が含まれ得、石油、動物、植物、または合成起源の油、例えば、ピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油などが挙げられる。一部の実施形態では、担体は、１つまたはそれ以上の固体成分であるかまたはそれを含む。また、薬学的に許容される担体には、限定されないが、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール、およびこれらの組み合わせが含まれる。本明細書で使用される場合、賦形剤は、医薬組成物に含まれる任意の非治療剤であり、例えば、所望の稠度もしくは安定化効果を提供または寄与し得る。適切な医薬賦形剤には、限定されないが、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールが含まれる。種々の実施形態では、医薬組成物は無菌である。

一部の実施形態では、医薬組成物は、少量の湿潤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含有する。一部の実施形態では、医薬組成物は、安定剤、緩衝剤、または保存剤などの種々の添加剤のいずれかを含み得る。さらに、補助剤、安定剤、増粘剤、潤滑剤、および着色剤を含むことができる。

種々の実施形態では、医薬組成物は、任意の所望の投与様式に適合するように製剤化される。例えば、医薬組成物は、溶液、懸濁液（複数）、エマルジョン、液滴、錠剤、丸剤、ペレット、カプセル、液体を含有するカプセル、ゼラチンカプセル、粉末、徐放性製剤、坐薬、エマルジョン（複数）、エアロゾル、スプレー、懸濁液、凍結乾燥粉末、凍結懸濁液、乾燥粉末、または使用に適した任意の他の形態をとることができる。医薬剤の製剤化および製造における一般的な考察は、例えば、参照により本明細書に組み入れられるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１９版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、１９９５年に見出される。

医薬組成物は、任意の投与経路を介して投与することができる。投与経路には、例えば、経口、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、粘膜内、硬膜外、舌下、鼻腔内、脳内、膣内、経皮、直腸、気管内点滴、気管支点滴、吸入、または局所的が含まれる。投与は、局所または全身であり得る。一部の実施形態では、投与は、経口的に行われる。別の実施形態では、投与は非経口注射による。場合によっては、投与は、本明細書に記載のＮＡポリペプチドまたは四量体ＮＡタンパク質の血流中への放出をもたらす。投与様式は、医師の裁量に任せることができる。

ある実施形態では、医薬組成物は、経口投与に適合される。経口送達のための組成物は、例えば、錠剤、ロゼンジ、水性もしくは油性懸濁液、顆粒、粉末、エマルジョン、カプセル、シロップ、またはエリキシルの形態であり得る。

別の実施形態では、医薬組成物は、非経口投与（例えば、静脈内、筋肉内、腹腔内、および皮下）に適している。このような組成物は、例えば、溶液、懸濁液、分散液、エマルジョンなどとして製剤化することができる。これらはまた、使用直前に無菌注射可能媒体に溶解または懸濁することができる無菌固体組成物（例えば、凍結乾燥組成物）の形態で製造することができる。例えば、非経口投与は、注射によって達成することができる。このような実施形態では、注射剤は、慣用の形態、すなわち、液体溶液または懸濁液、注射前の液体の溶液または懸濁液に適した固体形態、またはエマルジョンとして調製される。一部の実施形態では、注射溶液および懸濁液は、無菌粉末、凍結乾燥粉末、または顆粒から調製される。

さらなる実施形態では、医薬組成物は、吸入による送達（例えば、肺および呼吸器系への直接送達）のために製剤化される。例えば、組成物は、鼻スプレーまたは任意の他の公知のエアロゾル製剤の形態をとることができる。一部の実施形態では、吸入またはエアロゾル送達のための調製物は、複数の粒子を含む。一部の実施形態では、このような調製物は、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、または約１３ミクロンの平均粒径を有することができる。一部の実施形態では、吸入またはエアロゾル送達のための調製物は、乾燥粉末として製剤化される。一部の実施形態では、吸入またはエアロゾル送達のための調製物は、例えば、湿潤剤の含有を介して、湿潤粉末として製剤化される。一部の実施形態では、湿潤剤は、水、食塩水、または生理的ｐＨの他の液体からなる群から選択される。

一部の実施形態では、本発明による医薬組成物は、液滴として鼻腔または口腔に投与される。一部の実施形態では、用量は、複数の液滴（例えば、１〜１００、１〜５０、１〜２０、１〜１０、１〜５など）を含み得る。

一部の実施形態では、医薬組成物は、脂質小胞内にカプセル化され、トラップされ、もしくは結合されるＮＡポリペプチドまたは四量体ＮＡタンパク質、生物学的利用能および／もしくは生体適合性および／もしくは生分解性マトリックス、または他の微粒子を含む。一部の実施形態では、医薬組成物は、ＮＡポリペプチドまたは四量体ＮＡタンパク質を示すナノ粒子を含む。一部の実施形態では、ナノ粒子は、フェリチンナノ粒子である（例えば、米国特許公開第２０１４／００７２９５８号を参照されたい）。

本発明の医薬組成物は、所望の結果を達成するのに適切な任意の用量で投与することができる。一部の実施形態では、所望の結果は、１つまたはそれ以上インフルエンザ株に対する長期持続性適応免疫応答の誘導である。一部の実施形態では、所望の結果は、インフルエンザ感染の１つまたはそれ以上の症状の強度、重症度、頻度の減少、および／または発症の遅延である。一部の実施形態では、所望の結果は、インフルエンザウイルス感染の阻害または予防である。必要とされる用量は、対象の種、年齢、体重、および一般的な状態、予防または治療される感染の重症度、使用される特定の組成物、およびその投与様式に依存して、対象によって変化する。

一部の実施形態では、本発明による医薬組成物は、単回または複数回用量で投与される。一部の実施形態では、医薬組成物は、異なる日に複数回用量で投与される（例えば、プライム−ブーストワクチン接種戦略）。一部の実施形態では、医薬組成物は、対象が治療的投薬の期間中に介在する治療的投薬より少ない期間を経ないように、連続投薬レジメンに従って投与される。一部の実施形態では、医薬組成物は、対象が治療的投薬の２つの期間中に介在する治療的投薬より少ない、少なくとも１つの期間を受けるように、間欠的投薬レジメンに従って投与される。一部の実施形態では、医薬組成物は、ブーストレジメンの一部として投与される。

種々の実施形態では、医薬組成物は、１つまたはそれ以上のさらなる治療剤と同時に投与される。同時投与は、これらの投与のタイミングが、追加の治療剤およびＮＡポリペプチドまたは四量体ＮＡタンパク質の薬理活性が時間的に重なり合い、それによって組み合わされた治療効果を発揮するようなものである場合、同時に投与される治療剤を必要としない。一般的に、各薬剤は、その薬剤について決定された用量および時間スケジュールで投与される。

一部の実施形態では、医薬組成物は、他の慣用的インフルエンザワクチンと同時に投与される。例えば、本発明の医薬組成物は、季節性インフルエンザワクチンと同時に投与することができる。一部の実施形態では、季節性インフルエンザワクチンは、一価、二価、三価、または四価であり得る。

一部の実施形態では、本発明は、薬剤と併用して、それらの生物学的利用能を改善し、これらの代謝を減少もしくは修飾し、これらの排出を阻害し、および／または体内でのこれらの分布を修飾し得る医薬組成物の送達を包含する。一部の実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物は、１つまたはそれ以上の抗ウイルス剤（例えば、オセルタミビル［ＴＡＭＩＦＬＵ（登録商標）］またはザナマビル［ＲＥＬＥＺＡ（登録商標）］など）と併用して投与される。

ＮＡポリペプチドに対する抗体
本発明は、本発明に従って生成されたＮＡポリペプチドまたは四量体ＮＡタンパク質に対する抗体を提供する。これらは、モノクローナルまたはポリクローナルであり得、当業者に公知である種々の技術（例えば、参照により本明細書に組み込まれるＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、１９８８年、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙを参照されたい）のいずれかによって調製される。例えば、抗体は、モノクローナル抗体の生成を含む細胞培養技術によって、または抗体の生成を可能にするために、適切な細菌もしくは哺乳動物の宿主細胞への抗体遺伝子のトランスフェクションを介して産生される。

一部の実施形態では、抗体は、２つの重鎖および２つの軽鎖で構成される古典的な抗体であり得る。他の実施形態では、抗体は、抗体誘導体であり得る。例えば、一部の実施形態では、抗体は、単一ドメイン抗体、組換え重鎖のみの抗体（ＶＨＨ）、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、サメ重鎖のみの抗体（ＶＮＡＲ）、マイクロプロテイン（システインノットプロテイン、ノッティン）、ＤＡＲＰｉｎ、テトラネクチン、アフィボディ、トランスボディ、アンチカリン、アドネクチン、アフィリン、マイクロボディ、ペプチドアプタマー、オルターラーゼ、プラスチック抗体、フィロマー、ストラドボディ、マキシボディ、エビボディ、フィノマー、アルマジロリピートタンパク質、クニッツドメイン、アビマー、アトリマー、プロボディ、イムノボディ、トリオマブ、トロイボディ、ペプボディ；ワクシボディ、ユニボディ；アフィマー、デュオボディ、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、ペプチド模倣分子、もしくは合成分子、または当該技術分野において公知である任意の他の抗体フォーマットであり得る。

免疫化およびインフルエンザウイルスからの防御方法
別の態様では、本発明は、対象における１つまたはそれ以上のインフルエンザウイルスに対して対象を免疫化する方法を提供する。本発明は、さらに、対象における１つまたはそれ以上のインフルエンザウイルスに対する免疫応答を誘発する方法を提供する。一部の実施形態では、本方法は、本明細書に記載の有効量の医薬組成物を対象に投与することを含む。一部の実施形態では、本方法は、本明細書に記載の有効量の組換えＮＡポリペプチドまたは四量体ＮＡタンパク質を対象に投与することを含む。一部の実施形態では、本方法は、本明細書に記載の有効量のＮＡポリペプチドまたは四量体ＮＡタンパク質を含むＶＬＰを対象に投与することを含む。

種々の実施形態では、本明細書に提供される免疫化方法は、１つまたはそれ以上のインフルエンザウイルス内の複数のエピトープに対する広範な防御的な免疫応答を誘発する。種々の実施形態では、本明細書に提供される免疫化方法は、１つまたはそれ以上のインフルエンザウイルスに対する広範な中和免疫応答を誘発する。一部の実施形態では、免疫応答は、抗体応答を含む。したがって、種々の実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物は、異なるタイプのインフルエンザウイルスに対して広範な交差防御を与えることができる。一部の実施形態では、医薬組成物は、トリ、ブタ、季節性および／またはパンデミックインフルエンザウイルスに対する交差防御を与える。一部の実施形態では、医薬組成物は、１つまたはそれ以上インフルエンザＡ、Ｂ、またはＣサブタイプに対する交差防御を与える。一部の実施形態では、医薬組成物は、インフルエンザＡ Ｈ１サブタイプウイルス（例えば、Ｈ１Ｎ１）、インフルエンザＡ Ｈ３サブタイプウイルス（例えば、Ｈ３Ｎ２）、および／またはインフルエンザＡ Ｈ５サブタイプウイルス（例えば、Ｈ５Ｎ１）の複数の株に対して交差防御を与える。

一部の実施形態では、本発明の方法は、１つまたはそれ以上の季節性インフルエンザ株に対する改善された免疫応答を誘発することができる。例示的な季節性株には、限定されないが、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／１９３４、Ａ／Ｆｏｒｔ Ｍｏｎｍｏｕｔｈ／１／１９４７、Ａ／Ｃｈｉｌｅ／１／１９８３、Ａ／Ｔｅｘａｓ／３６／１９９１、Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／６／１９８６、Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／３２／１９９２、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／１９９９、Ａ／Ｓｏｌｏｍｏｎ Ｉｓｌａｎｄｓ／０３／２００６、およびＡ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７が含まれる。一部の実施形態では、本発明の方法は、１つまたはそれ以上のパンデミックインフルエンザ株に対する改善された免疫応答を誘発することができる。例示的なパンデミック株としては、限定されないが、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０４／２００９、Ａ／Ｂｅｌｇｉｕｍ／１４５／２００９、Ａ／Ｓｏｕｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ／０１／１９１８、およびＡ／Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ／１９７６が挙げられる。パンデミックのサブタイプには、特にＨ５Ｎ１、Ｈ２Ｎ２、Ｈ９Ｎ２、Ｈ７Ｎ７、Ｈ７Ｎ３、Ｈ７Ｎ９、Ｈ１０Ｎ７のサブタイプが含まれる。一部の実施形態では、本発明の方法は、１つまたはそれ以上のブタインフルエンザ株に対する改善された免疫応答を誘発することができる。例示的なブタ株としては、限定されないが、Ａ／Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ／１９７６分離株およびＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９が挙げられる。追加のインフルエンザパンデミック、季節性、および／またはブタ株は、当該技術分野において公知である。

種々の実施形態では、本方法は、ある範囲の抗原的に異なるインフルエンザ株にわたって免疫防御を拡大することができる。例えば、本発明の方法は、抗原シフトから生じる新たなパンデミック株に対する免疫応答を誘発することができる（すなわち、これらが、延長されたタイムラインにわたって遺伝的配列空間において遠く離れている抗原的に異なる株をカバーするようにする）。本発明の医薬組成物が、抗原的に浮遊した蔓延している季節性株に対する免疫応答（例えば、改良された季節応答）を誘発することによって継続して有効であるように、比較的短い期間にわたって生じる遺伝的変化に対処するために、本発明の方法を適用させることもできる。したがって、種々の実施形態では、本方法は、（１）１つまたはそれ以上の季節性株に対するカバレッジ（すなわち、中和免疫応答を誘発する能力）を拡大するため；（２）１つまたはそれ以上のパンデミック株に対するカバレッジを拡大するため（抗原ドリフトに対処するため）；および（３）任意の他の抗原的に異なるインフルエンザ株に対するカバレッジを拡大するために使用される。本方法は、ミスマッチ株を含むインフルエンザウイルスに対して、広範な、長期間持続する（例えば、多季節）防御を提供することができると期待される。

一部の実施形態では、本発明は、本発明の医薬組成物をそれを必要とする対象に投与することによって、インフルエンザ感染を予防または治療する方法を提供する。一部の実施形態では、対象は、インフルエンザ感染に罹患しているかまたはそれに感受性である。一部の実施形態では、対象がインフルエンザ感染に一般的に関連する１つまたはそれ以上の症状を示す場合、対象はインフルエンザ感染に罹患していると考えられる。一部の実施形態では、対象は、インフルエンザウイルスに曝露されたことが知られているかまたは曝露されたと思われる。一部の実施形態では、対象がインフルエンザウイルスに曝露されたことが知られているかまたは曝露されたと思われる場合、対象はインフルエンザ感染に感受性であると考えられる。一部の実施形態では、対象が、インフルエンザウイルスに感染したことが知られているかもしくはそれが疑われる他の個人と接触していた場合、および／または対象が、インフルエンザ感染が知られているもしくは流行していると考えられる場所にいるかもしくはそこにいた場合、インフルエンザウイルスに曝露されたことが知られているか、または曝露されたと思われる。

種々の実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物は、インフルエンザ感染の１つまたはそれ以上の症状の発症前または後に投与される。一部の実施形態では、医薬組成物は、予防として投与される。このような実施形態では、本発明の方法は、インフルエンザウイルス感染から対象を予防または防御するのに有効である。一部の実施形態では、本発明の医薬組成物は、季節性および／もしくはパンデミックインフルエンザワクチンの成分として、または長期にわたる（多季節）防御を付与することを意図したインフルエンザワクチン接種レジメンの一部として使用される。一部の実施形態では、本発明の医薬組成物は、インフルエンザ感染の症状を治療するために使用される。

一部の実施形態では、インフルエンザ感染に罹患しているかまたは感受性である対象は、本発明による医薬組成物の投与前、投与中、または投与後に、本発明のＮＡポリペプチドまたは四量体ＮＡタンパク質に対する抗体について試験される。一部の実施形態では、このような抗体を有する対象は、本発明の医薬組成物を投与されない。一部の実施形態では、医薬組成物の適切な用量は、このような抗体の検出（またはその欠如）に基づいて選択される。

種々の実施形態では、対象は、動物界の任意のメンバーである。一部の実施形態では、対象は、非ヒト動物である。一部の実施形態では、対象は、哺乳動物、トリ（例えば、ニワトリまたはトリ）、爬虫類、両生類、魚類、昆虫、および／または線虫である。特定の実施形態では、非ヒト対象は、哺乳動物（例えば、げっ歯類、マウス、ラット、ウサギ、サル、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、霊長類、および／またはブタ）である。一部の実施形態では、対象は、トランスジェニック動物、遺伝的に操作された動物、および／またはクローンである。

一部の実施形態では、対象は、ヒトである。一部の実施形態では、対象は、成人、青年、または乳児である。一部の実施形態では、ヒト対象は、６カ月未満の年齢である。一部の実施形態では、ヒト対象は、６カ月以上の年齢であり、６カ月齢から３５カ月の年齢であり、３６カ月の年齢から８歳であり、または９歳以上である。一部の実施形態では、ヒト対象は、５５歳以上の高齢者、例えば、６０歳以上、または６５歳以上である。また、本発明は、医薬組成物の投与および／または子宮内での処置法の性能も意図している。

この説明および例示的な実施形態は、限定的であるものとして解釈されるべきではない。本明細書および添付の特許請求の範囲の目的で、特に断らない限り、明細書および特許請求の範囲において使用される量、パーセンテージ、または比率を表す全ての数字、および他の数値は、全ての場合において、これらがまだそのように修飾されていない範囲で、用語「約」によって修飾されていると理解されるべきである。したがって、別段の指示がない限り、以下の明細書および添付の特許請求の範囲に記載される数値パラメータは、求められる所望の特性に応じて変化し得る近似値である。少なくとも、均等論の適用を特許請求の範囲に限定する試みとしてではなく、各数値パラメータは、報告された有効桁数に照らし、通常の丸め技法を適用して、少なくとも解釈されるべきである。

本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形の「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」、ならびに任意の単語の任意の単数形の使用は、明示的であり、明確に１つの指示対象に限定されない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。本明細書で使用される場合、用語「含む」およびその文法的変形は、リスト中の項目の記載が、リスト中の項目に置換または追加される他の類似の項目の除外にならないように、非限定的であることが意図される。

本発明は、以下の実施例を参照することによって、より十分に理解される。本明細書に含まれる全ての文献の引用は、参照により組み入れられる。

以下の実施例は、ある特定の開示された実施形態を説明するために提供されるのであって、いかなる形態においても本開示の範囲を限定するものとして解釈すべきではない。本明細書において使用される場合、ＣＢＣ ＮＡは、本明細書において説明されるクラスターベースコンセンサス（ＣＢＣ）アプローチを使用して設計されたＮＡポリペプチドまたはタンパク質を意味する。

組換えインフルエンザＮＡポリペプチドを設計するためのクラスターベースのコンセンサスアプローチ
クラスターベースコンセンサス（ＣＢＣ）アプローチを使用して、組換えインフルエンザＮＡポリペプチドを生成させた。第一段階として、１９１８年から２０１１年までのインフルエンザＡ型ノイラミニダーゼ（ＮＡ）タンパク質配列（サブタイプＨ１Ｎ１）を、全米バイオテクノロジー情報センターのＩｎｆｌｕｅｎｚａ Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓｏｕｒｃｅからダウンロードした（Ｂａｏら． （２００８） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ８２， ５９６〜６０１を参照されたい）。詳細には、コンセンサスアミノ酸配列の分析および生成のために、１７９６の完全長ヒト宿主ＮＡタンパク質配列の非冗長セットを同定した。当該非冗長配列を、 ＭＡＦＦＴ ｖ７（Ｋａｔｏｈ， Ｓ． （２０１３） Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． Ｅｖｏｌ． ３０， ７７２〜７８０）を使用してアラインすることにより、多重配列アラインメントを得た。それに続いて、当該全て対全てのペアワイズ同一性マトリックスを、パイソンを使用して計算した。次いで、同様の配列のクラスターを生成させるため、配列の間における次元削減および類似性の視覚化のために、ペアワイズ同一性マトリックスに対して古典的多次元尺度構成法（ＭＤＳ）を実施した。ＭＤＳから最初の二つの次元のみを維持することは、高次元同一性マトリックスにおける各個別配列の間の関係性を二次元散布図へとマッピングすることを可能にした。

概して、同様のタンパク質配列の５つの非重複クラスターが、当該ペアワイズ同一性マトリックスの当該二次元表現から定義された（図１Ａ）。当該５つのクラスターは、季節性様配列（３つのクラスター：１９３３〜１９５０；１９４８〜１９９７；１９９８〜２００９）、ブタ様配列（１つのクラスター：１９７６〜２００８）、およびパンデミック様配列（１つのクラスター：２００９〜２０１１）を表した。

配列クラスターの間においてコンセンサス配列を生成させるため、最初に、多数決（すなわち、各位置において最も頻繁なアミノ酸）によって、各配列クラスター内のコンセンサス配列を生成した。例として、所与の位置でのアミノ酸の頻度が５０％以上であった場合、そのアミノ酸はコンセンサスアミノ酸と指定され、所与の位置でのアミノ酸の頻度が５０％未満であった場合、そのアミノ酸は可変アミノ酸と指定される。アラインメントにおける特定の位置においてアミノ酸が変動する場合（例えば、最大頻度が＜０．５である場合）、当該位置における代表的なアミノ酸の決定は、比較モデル化によって生成されたコンセンサス配列の構造モデルの分析に基づいた。

詳細には、明確な多数決が、配列における特定の位置において単一のアミノ酸を定義することができない場合には、複数のコンセンサス配列（当該アラインメントに基づいて可能性のある各アミノ酸に対して１つ）を生成させた。明確に決定することができない位置は、任意の１つの特定の場所において生じ得る、可能性の高いアミノ酸の唯一のセットから分子モデリングによって解決されるように、「Ｘ」としてコードした。したがって、潜在的な構造上の問題を解決するため、および可変位置において好適なアミノ酸を選択するため、および計算された低いエネルギーに基づいて配列を選択するために、当該設計の重要な一面を、分子モデリングによって洗練させた。例えば、当該コンセンサス法によって生成された配列の３Ｄ構造を、Ｒｏｓｅｔｔａ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｏｄｅｌｉｎｇパッケージ（Ｌｅａｖｅｒ−Ｆａｙら． （２０１１） Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． ４８７：５４５〜７４）を使用してモデル化した。負の総エネルギー値を有する分子は、安定なおよび／または機能的なタンパク質への折り畳みの高い可能性を有すると予測され、その一方で、正のエネルギー値を有するものは、適切に折り畳まれる可能性は低いと考えられた。したがって、コンセンサス生成法を使用して残基位置を明確に割り当てることがでない場合、最も低い、または最も低い値に近い、計算されたポテンシャルエネルギーを有する構造を生じるアミノ酸を選択したが、それは、それらが安定であると推定されるためであり、したがって、発現される可能性が高く、機能的であると見込まれるためである。このプロセスを使用することにより、複数の候補配列を含む、エネルギー最小化設計のセットを生成させた。場合によって、さらなる評価のために、５つのクラスターのそれぞれに対して単一の代表的配列（クラスター内典型配列）を選択した。

抗原適用範囲の幅をさらに広げるために、複数のコンセンサス配列（すなわち、クラスター内配列）を組み合わせることにより、コンセンサス配列を定義するのと同じ手順および前に説明したような構造モデリングを使用して、クラスター間コンセンサス配列を得た。したがって、
（ｉ）ＮＡポリペプチドを得るためのブタ様（１９７６〜２００８）およびパンデミック様（２００９〜２０１１）配列−ＮＡ５２００（配列番号１）、（ｉｉ）ＮＡ７９００（配列番号２）を得るための、３つの季節性様（１９３３〜１９５０、１９４８〜１９９７、１９９８〜２００９）配列クラスター、およびｉｉｉ）ＮＡ９１００（配列番号３）を得るための５つ全ての配列クラスター、の組み合わせによって、コンセンサスアミノ酸を含むＮＡポリペプチド配列を生成させた（図１Ａを参照されたい）。図１Ｂは、多次元尺度構成法によって決定される、他の既知のＨ１Ｎ１サブタイプ配列に対する配列空間におけるＮＡ５２００、ＮＡ７９００、およびＮＡ９１００の位置を示している。追加の例示的ＮＡ配列は、配列番号７〜１８として表１に提示される。

ＣＢＣ ＮＡポリペプチドの機能的キャラクタリゼーション
ＣＢＣ ＮＡポリペプチドの機能的活性を評価するために、ＭＵＮＡＮＡ（４−メチルウンベリフェロン）アッセイを実施した。詳細には、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、１μｇのＥｎｄｏ−ｆｒｅｅ ＭａｘｉｐｒｅｐＮＡプラスミド（すなわち、ＮＡ膜貫通およびステムドメインを有する完全長ＮＡ）によって、または１００ｎｇのＧＦＰコントロールプラスミドによってトランスフェクトした。ｐＣＡＸＬ（新しい制限部位が生成されたｐＣＡＧＧに由来する）、ｐｃＤＮＡ３、およびＰＥＦプラスミドを使用した結果を比較した。トランスフェクトの３日後に試料を収集した。

３７℃での、２００ｍのＭＮａＡｃ（ｐＨ６．５）、２ｍＭのＣａＣｌ_２、および１％のブタノール中におけるＣＢＣ ＮＡによる２’−（４−メチルウンベリフェリル）−α−Ｄ−Ｎ−アセチルノイラミン酸（１ｍＭ）からの４−メチルウンベリフェロンの切断によって、ＮＡ活性を決定した。４−メチルウンベリフェロンの放出を、１時間にわたって２分毎に測定した（３５５ｎｍおよび４６０ｎｍ）。１つのノイラミニダーゼユニットを、１分間あたりの１ｎｍｏｌの４−メチルウンベリフェロンを放出するＮＡの量として定義した。

図２Ｂに示されるように、最も高いＮＡ活性は、ｐＣＡＸＬベクターにおいて見られ、それは、このプラスミドにおける最も高い発現レベルに一致した。ＮＡ７９００は、ｐＣＡＸＬにおいて発現された場合、ＮＡ９１００と同様の発現レベルを有したが、より低い酵素活性を有した。ＮＡ７９００は発現されず、ｐｃＤＮＡ３において発現された場合、酵素活性も有さなかった。

次に、ＣＢＣ ＮＡポリペプチドの免疫原性を、ＤＮＡ免疫化によって試験した。１セットの実験において、ｐＣＡＸＬベクター中にクローンした完全長のＮＡ５２００、ＮＡ７９００、またはＮＡ９１００の３０μｇによって、ＢＡＬＢ／Ｃマウスをプライミングおよび追加免疫した（３週間空けて）。空プラスミドをネガティブコントロールとして含ませた。免疫化は、筋肉内エレクトロポレーションによって実施した。詳細には、エレクトロポレーションは、１００ｍｓの間隔での２０ｍｓの２００Ｖの８つの電気パルスによって、注入の部位の周りにおいて２プロング針を使用することにより実施した。図３Ａ〜３Ｆは、インフルエンザＨ１Ｎ１ウイルス抗原（すなわち、ＰＲ８、ＵＳＳＲ／７７、Ｓｉｎｇ／８６、Ｎ．Ｃａｌ／９９、Ｂｒｉｓ／０７、またはＰｄｍ／０９）のパネルに対する血清の結合活性を測定したＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す。結果は、ＣＢＣ ＮＡコンストラクトによって免疫したマウスからの血清が、Ｈ１Ｎ１ウイルス抗原のパネルに対して広範な交差反応性を示したことを示した。実際に、ＣＢＣ ＮＡコンストラクトによって免疫したマウスからの血清は、このＥＬＩＳＡアッセイにおいて、野生型ＰＲ８ ＮＡによって免疫したマウスから生成された血清よりもＨ１Ｎ１ウイルスへのより広範な結合性の証拠を示した。

ＣＢＣ ＮＡポリペプチドをさらに特徴付けるため、ＥＬＬＡアッセイを使用して、ｐＣＡＸＬベクター中へとクローンした完全長のＮＡ５２００、ＮＡ７９００、またはＮＡ９１００の３０μｇによって免疫したマウスからの血清のＮＡ阻害（ＮＡＩ）活性を決定した（図４Ａ〜４Ｅ）。当該ＥＬＬＡアッセイを、Ｃｏｕｚｅｎｓ， Ｌ．ら （２０１４） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ２１０， ７〜１４に記載されるように実施した。簡潔には、ＮＡ５２００、ＮＡ７９００、またはＮＡ９１００をコードするＮＡコンストラクトで免疫したマウスから血清を調製した。９０％最大ＮＡ活性を与えるために、熱不活性化血清の段階希釈物（１：２０倍の希釈から開始）を、所定のウイルス濃度においてインフルエンザＡウイルス（ＩＡＶ）と共にインキュベートした。インキュベートは、１０ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ、１ｍＭのＣａＣｌ_２、０．５ｍＭのＭｇＣｌ_２、および０．５％Ｔｗｅｅｎ２０を補ったＰＢＳにおいて、３７℃で３０分間実施した。フェチュイン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、５μｇ／ｍｌ）でコーティングされたプレートのウェルに希釈物を加えて、３７℃で１８時間インキュベートした。フェチュインからのシアル酸のＮＡ媒介除去の後に露出したガラクトース残基を検出するために、ＨＲＰ標識ピーナッツアグルチニン（ＰＮＡ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、２．５μｇ／ｍｌ）を使用した。非線形回帰分析（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ）によって、５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を計算した。図４Ａ〜４Ｅに示されるように、ＣＢＣ ＮＡによって免疫したマウスからの血清は、広範な交差反応性ＮＡＩ活性を示した。

ＣＢＣ ＮＡコンストラクトで免疫したマウスの生残率および体重も分析した。詳細には、これらのマウスに、１ＬＤ５０量のｐｄｍ／０９（Ａ／ベルギー／１／２００９）またはＰＲ８ウイルスをチャレンジ感染させた（それぞれ、図５Ａ〜５Ｆおよび６Ａ〜６Ｆ）。結果は、ＮＡ５２００、ＮＡ７９００、およびＮＡ９１００をコードするＤＮＡコンストラクトでワクチン接種したマウスは、野生型ＮＡでワクチン接種したマウスと比べて、ウイルスのチャレンジ感染に対してより高い生残率およびより少ない体重減少を実証したことを示している。

四量体ＣＢＣ ＮＡタンパク質の発現および精製
ＮＡポリペプチドは、自然な進化過程とは異なる基準に従って設計されたため、正しい折り畳みおよびエピトープの完全性の維持を確認することは重要であった。したがって、構造の完全性の代用として、ＮＡ酵素活性を使用した。ザナミビルの添加によって酵素的に阻害されたＮＡ抗原による免疫化によって、ＮＡ阻害抗体を誘導することができるが（Ｓｕｌｔａｎａ， Ｉ．，ら （２０１１） Ｖａｃｃｉｎｅ ２９， ２６０１〜２６０６を参照されたい）、当該ＮＡは、依然として、その天然の四量体形態であることが必要とされる（Ｂｕｃｈｅｒ， Ｄ． Ｊ． ａｎｄ Ｋｉｌｂｏｕｒｎｅ， Ｅ． Ｄ． （１９７２） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． １０， ６０〜６およびＤｅｒｏｏ， Ｔ．ら （１９９６） Ｖａｃｃｉｎｅ １４， ５６１〜５６９）ことが分かっている。したがって、哺乳動物発現系において可溶性四量体タンパク質として製造および精製できるように、当該ＮＡ５２００、ＮＡ７９００、およびＮＡ９１００ポリペプチドコンストラクトを改変した。２００９パンデミックインフルエンザＡ（Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ）に由来する可溶性四量体ＮＡも製造し、それらは、天然に存在するコントロールとしての役割を果たした（Ｓｃｈｏｔｓａｅｒｔら ２０１６を参照されたい）。

本質的にＡ／ベルギー／１／２００９ ｒＮＡに対して前に説明したように、組換え四量体ＮＡタンパク質（ｒＮＡとも呼ばれる）を製造した（Ｓｃｈｏｔｓａｅｒｔら ２０１６を参照されたい）。簡潔には、ポリペプチドが、配列番号１、２、または３のアミノ酸７５〜４６９を含むように、単量体ＮＡポリペプチド（すなわち、ＮＡ５２００、ＮＡ７９００、およびＮＡ９１００）の茎部を除去した。当該茎部を、四量体コイルドコイルへの自己組織化を駆動することができるテトラブラキオン（配列番号４）に由来するヘリックス構造のペプチドで置き換え、それにより、ＮＡ酵素ドメインの三次構造および四次構造を安定化した。当該四量体ＮＡタンパク質構造の概略図を、図２Ａに提供する。

Ｎ末端ＣＤ５誘導分泌シグナル（配列番号５）によって、ＮＡポリペプチドおよび／またはＮＡタンパク質の分泌を促進させた。タンパク質精製を容易にするために、Ｓｔｒｅｐタグ（配列番号６）またはＨＩＳタグ（例えば、６Ｘ Ｈｉｓ（配列番号３５））のどちらかを、分泌シグナル配列と四量体化配列との間においてクローンした（Ｓｃｈｍｉｄｔ，ら （２０１１） ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ６， ｅ１６２８４）。さらに、リンカー配列（配列番号１９）も組み込んだ。当技術分野において既知の他のリンカー配列、例えば、トロンビン切断部位（配列番号２０）を含むものなど、も使用してもよいことが想到される。

Ｓｔｒｅｐタグ付けされたＮＡタンパク質の精製のために、当該ＮＡコンストラクトをＥｘｐｉ２９３細胞において発現させた。培地上清を、低速遠心分離（１０００Ｘｇ）によって清澄化し、その後に、０．２μｍろ過によって不溶性細胞破片を除去した。細胞上清を、限界ろ過および接線流ろ過によって濃縮し、その後に、アビジンを補ったＰＢＳに対する透析によって、発現培地に存在する全てのビチオンを除去した。透析した上清を、ＰＢＳで平衡化したＳｔｒｅｐ−Ｔｒａｐカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードした。結合タンパク質を、ＰＢＳ中における２．５ｍＭのデスチオビオチンによって溶出させた。溶出分画をプールし、ＰＢＳで平衡化したＨｉＬｏａｄ １６／６００ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）における分取ＳＥＣによってポリッシュするために濃縮した。

Ｈｉｓタグ付けされた組換えＮＡタンパク質の精製のために、当該ＮＡコンストラクトをＥｘｐｉ２９３細胞において発現させた。培地上清を、前に説明したように、清澄化し濃縮した。透析した上清を、ＰＢＳで平衡化したｐＨ７．４のＨｉｓ Ｔｒａｐ Ｅｘｃｅｌ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）樹脂に吸着させた。非結合タンパク質をＰＢＳで洗い流し、結合タンパク質を、ＰＢＳ中における２０〜５００ｍＭのイミダゾールの直線勾配によって溶出させた。次いで、溶出したタンパク質を、サイズ排除モードにおいて、ＰＢＳで平衡化したＨｉＬｏａｄ ＸＫ５０／７０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００、ｐｒｅｐグレードカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）において精製した。いくつかの実施形態では、透析した試料を、５０ｍＭのＴｒｉｓで平衡化したｐＨ８のＨｉＴｒａｐ Ｑ ＨＰカラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードした。全ての非結合タンパク質を、ｐＨ８の５０ｍＭのＴｒｉｓで洗い流し、結合タンパク質を、５０ｍＭのＴｒｉｓ中における０〜１ＭのＮａＣｌによるｐＨ８．０の直線勾配によって溶出させた。プールした分画を、０．２μｍフィルターによってろ過し、ＰＢＳに対して透析して、少量の一定分量を液体窒素において急速冷凍した。

サイズ排除クロマトグラフィー分析により、予測された可溶性四量体ＮＡの分子量に対応する保持時間によって、ＮＡ５２００、ＮＡ７９００、およびＮＡ９１００を含むタンパク質の支配的なピークが明らかとなった（図７Ａ）。ＮＡ５２００およびＮＡ９１００四量体タンパク質の場合、小さなピークが観察され、それらは、当該支配的なピークよりサイズ排除カラムからより速く溶出した。これらの分画は、おそらく、ＮＡの凝集形態に対応し、よって破棄した。

当該四量体ＮＡタンパク質のＮＡ活性を、ＭＵＮＡＮＡアッセイによって決定した。図７Ｂに示されるように、小分子シアル酸コンジュゲート前駆体からの４−メチルウンベリフェロンの放出によって決定した場合、３つ全ての四量体ＣＢＣ ＮＡタンパク質（ＮＡ５２００、ＮＡ７９００、またはＮＡ９１００ポリペプチドを含む）は、酵素的に活性であった。当該３つの四量体ＮＡの比活性度（specific activity）は、２００９Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ由来可溶性四量体ＮＡと同様であるかまたはわずかに高かった（図７Ｂ）。

次に、ＮｅｔＮＧｌｙｃ １．０サーバを使用して、当該ＣＢＣ ＮＡのヘッドドメインにおける可能性のあるＮ−グリコシル化部位の予測を実施した。潜在的Ｎ−グリコシル化部位を、関連するＮ１と比較した。ＮＡ５２００、ＮＡ７９００、およびＮＡ９１００ポリペプチドは、３つの潜在的Ｎ−グリコシル化部位、すなわち、８８、１４６、および２３５の位置における部位を有しており（表１を参照されたい）、それらは、ほとんどすべてのＮ１ ＮＡに存する（Ｓｕｎら， ＰＬｏＳ Ｏｎｅ， ６， ｅ２２８４４， ２０１１）。

全体として、これらのデータは、当該四量体ＣＢＣ ＮＡタンパク質が、正しい折り畳みおよびエピトープの完全性の維持を示したことを示した。

四量体ＣＢＣ ＮＡタンパク質による免疫化の研究
ＮＡによるワクチン接種による防御は、ノイラミニダーゼ阻害（ＮＡＩ）を媒介することができる抗体の誘導に依存することが知られている（Ｗｏｈｌｂｏｌｄら ２０１５を参照されたい）。したがって、当該四量体ＣＢＣ ＮＡタンパク質に対する抗体反応の潜在的幅を調べる初期段階として、タンパク質の免疫化の研究を実施した。詳細には、６週齢のマウスを、免疫刺激剤モノホスホリルリピドＡおよび合成トレハロースジコリノミコレートを含有するＳｉｇｍａ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ（ＳＡＳ）を使用して、１μｇの組換え四量体ＣＢＣ ＮＡタンパク質もしくはコントロールＮＡによって、または単独もしくはＮＡと組み合わせた０．１μｇＨＡの一価の不活性化ワクチンによって、プライミングし、次いで３週間の間隔の後に追加免疫した。プライミングおよび追加免疫の３週間後に、尾部出血によって血清試料を採取した。場合により、眼窩後方出血による追加免疫ワクチン接種の３週間後に、終末放血（terminal bleed）を実施した。

当該ＣＢＣ ＮＡタンパク質で免疫したマウスからの熱不活性化血清を、ヒトＨ１Ｎ１ウイルスのパネルに対してＮＡＩを媒介するそれらの能力について、３種の野生型ＮＡタンパク質で免疫したマウスと比較した。詳細には、この研究において使用したＡ型インフルエンザウイルス（ＩＡＶ）は、マウス適合Ｈ１Ｎ１株Ａ／ＵＳＳＲ／９０／１９７７（ＵＳＳＲ／７７）、Ａ／ニューカレドニア／２０／１９９９（ＮＣ／９９）、Ａ／ブリスベン／５９／２００７（Ｂｒｉｓ／０７）、およびＡ／ベルギー／１／２００９（Ｂｅｌ／０９；ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／？ｔｅｒｍ＝ｔｘｉｄ１５０２３８２に記載される通り）であった。当該Ａ／ブタ／ベルギー／１／９８株は、マウスの肺における連続継代によってマウスに適合させた（Ｎｅｉｒｙｎｃｋ， Ｓ．ら （１９９９） Ｎａｔ． Ｍｅｄ． ５， １１５７〜１１６３）。Ａ／プエルトリコ／８／３４（ＰＲ８／３４）および当該Ｈ５Ｎ１ウイルスＮＩＢＲＧ−１４も当該パネルに含めた。特に、当該ＮＩＢＲＧ−１４株は、それが、潜在的パンデミック原因ウイルスを代表するので含ませた。ＮＩＢＲＧ−１４は、Ａ／ベトナム／１１９４／２００４のＮＡ（多塩基切断部位を除去）およびＨＡセグメント、感染したヒトから単離された鳥ウイルス、ならびにＰＲ８／３４からの他の６つの遺伝子セグメント、を発現する６：２リバースジェネティクス由来の合併結合変異ウイルスである。全体として、これらの株は、これらの遠縁のウイルスからのＮＡに対する、任意の誘導された抗ＮＡ抗体の交差反応性を探すために選択した。

前に説明したように、ＥＬＬＡアッセイを使用してＮＡＩ活性を評価した。前の研究（Ｗｏｈｌｂｏｌｄら ２０１５）によって観察されたように、天然のＮＡに対して産生された免疫血清は、いくらかの交差反応性を有した（図８Ａおよび８Ｂ）。ＰＲ８／３４ ＮＡ抗血清は、ＰＲ８／３４に対してＮＡＩを媒介し、ＵＳＳＲ／７７およびＳｗ／Ｂｅｌ／９８に対してはより少ない程度に媒介した。同様に、ＮＣ／９９に由来する精製した組換え四量体ＮＡによるワクチン接種によって誘導された抗血清は、それ自体およびＢｒｉｓ／０７と反応した。Ｂｅｌ／０９ ＮＡ抗血清は、それ自体およびＳｗ／Ｂｅｌ／９８に対して最も強いＮＡＩ力価を媒介し、次にＮＩＢＲＧ−１４に対して強いＮＡＩ力価を媒介した。

結果は、当該四量体ＣＢＣ ＮＡタンパク質が、複数の株（遠縁の株を含む）に対する増強された交差防御を明確に誘起したことを示している（図８Ａおよび８Ｂ）。抗ＮＡ５２００抗血清は、Ｂｅｌ／０９、Ｓｗ／Ｂｅｌ／９８、およびＮＩＢＲＧ−１４のＮＡ活性を強く示し、ＰＲ８／３４およびＵＳＳＲ／７７に対してはより少ない程度に示した。抗ＮＡ７９００抗血清は、試験した４種全ての季節性Ｈ１Ｎ１ウイルス（ＰＲ８／３４、ＵＳＳＲ／７７、ＮＣ／９９、およびＢｒｉｓ／０７）およびＮＩＢＲＧ−１４に対してＮＡＩを媒介し、それにより、ＮＣ／９９四量体ｒＮＡに対して産生された抗血清よりも広範なＮＡＩ範囲を示した。最後に、ＮＡ９１００に対して産生された抗血清は、試験した全てのＨ１Ｎ１ウイルスに対して、実質的なＮＡＩを示した。

さらに、当該ＣＢＣ ＮＡまたは野生型（ＷＴ）ＮＡと、ＥＬＬＡアッセイにおいて使用したＨ１Ｎ１ウイルスとの間において共有される配列同一性のパーセントを決定した。評価のために、７５から前方のアミノ酸のみ（配列番号１、２、または３に対して）を、固有のＮＡ茎部配列を欠いた個別のＮＡポリペプチドと見なした。ＢｌａｓｔＰ スイート−２配列ソフトウェアを使用して同一性のパーセントを決定した（Ｂａｏ ２００８およびＫａｔｏｈ ２０１３を参照されたい）。太字の数字は、当該ＮＡＩアッセイにおいて、＞２．３（すなわち、１：５）の１：ＩＣ５０が観察された場合を特定する。

表３に示されるように、ＮＡ９１００は、試験したＨ１Ｎ１ウイルスに対して最も高い同一性のパーセントを共有し、次いで、ＮＡ７９００、続いてＮＡ５２００の順であった。比較において、他のＨ１Ｎ１ ＮＡに対するＷＴ ＮＡの同一性は、大いに異なった。概して、ＷＴウイルスとＣＢＣ設計ＮＡとの間におけるより高い程度の配列同一性は、ＮＡＩにおける適用範囲のより広い幅と相関した（表３の太字に示されるように）。大部分のコンセンサスＮＡが、≧８８％同一性においてＮＡＩを示したにもかかわらず、ＮＣ／９９ ＮＡは、ＵＳＳＲ／７７と９２％の同一性を共有するが、ＮＡＩは検出されなかった。

まとめると、これらのデータは、野生型四量体ＮＡは、ある程度の交差反応性抗体反応を誘導するが、その一方で、四量体ＣＢＣ ＮＡタンパク質は、複数のインフルエンザ株に対する著しく高められた交差防御を提供したことを示している。理論に束縛されることを望むわけではないが、当該ＣＢＣ ＮＡは、天然ＮＡができないような、インフルエンザＮＡ内における複数の保存エピトープに対しても広範な反応性免疫応答を引き起こすことができると考えられる。

四量体ＣＢＣ ＮＡタンパク質によるワクチン接種チャレンジ感染研究
四量体ＣＢＣ ＮＡタンパク質の防御能力をさらに研究するために、活性ワクチン接種チャレンジ感染実験を実施した。これらの実験において、マウスを、アジュバントと一緒にＮＡ５２００、ＮＡ７９００、またはＮＡ９１００ポリペプチドを含む四量体ＣＢＣ ＮＡタンパク質によって、皮下によりプライミングおよび追加免疫した。緩衝液およびアジュバントのみによって模擬ワクチン接種したマウスを、コントロールとして含ませた。追加免疫の３週間後、マウスを、５ＬＤ５０量のＰＲ８／３４、ＵＳＳＲ／７７、ＮＣ／９９、Ｂｅｌ／０９、Ｓｗ／Ｂｅｌ／９８、またはＮＩＢＲＧ−１４のいずれかによって、鼻腔内感染により、チャレンジ感染させた。続いて、当該マウスを、体重および生残の変化について１４日間にわたって評価した（図９Ａ〜９Ｌ）。

アジュバントのみを受けた全てのチャレンジ感染させたマウスは、９日目までに感染症で死亡した（図９Ａ〜９Ｌの「模擬」群）。ＮＡ５２００を含む四量体ＣＢＣ ＮＡタンパク質によるワクチン接種は、ＵＳＳＲ／７７を除いて、試験した全てのＨ１Ｎ１ウイルスによるチャレンジ感染からマウスを著しく防御した。対照的に、ＮＡ５２００は、ＵＳＳＲ／７７でチャレンジ感染させたワクチン接種マウスを部分的にのみ防御した。これらのマウスが、経時において一時的な体重減少を示し、死亡に対して部分的にのみ防御されたからである（図９Ｃ〜９Ｄ）。ＮＡ７９００を含む四量体ＣＢＣ ＮＡタンパク質によるワクチン接種は、ＰＲ８／３４、ＵＳＳＲ／７７、ＮＣ／９９、またはＮＩＢＲＧ−１４感染によるチャレンジ感染からマウスを著しく防御したが、Ｂｅｌ／０９およびＳｗ／Ｂｅｌ／９８に対してはそうではなく、それらにおいては、部分的防御のみが観察された。ＮＡ９１００を含む四量体ＣＢＣ ＮＡタンパク質によるワクチン接種は、広い範囲の防御を示し、ＰＲ８／３４、ＮＣ／９９、Ｂｅｌ／０９、Ｓｗ／Ｂｅｌ／９８、およびＮＩＢＲＧ−１４感染によるチャレンジ感染からマウスを著しく防御した。ＵＳＳＲ／７７を感染させ、ＮＡ９１００をワクチン接種させたマウスは、二元配置分散分析の主要カラム効果を考慮した場合、模擬ワクチン接種させたマウスと比較して有意な差を示さなかった（ｐ値＝０．０８）。しかしながら、６日目から９日目において、ＮＡ９１００ワクチン接種したマウスは、模擬ワクチン接種させたマウスと比較して、体重減少において有意な差があり（ｐ＜０．０１、二元配置分散分析）、ならびに１００％のマウスが当該感染を生残した（図９Ｃ）。全体として、これらの結果は、ＮＡ５２００およびＮＡ９１００ポリペプチドを含む四量体ＣＢＣ ＮＡタンパク質が、潜在的に長期の時間枠および対応する抗原性空間にわたって、インフルエンザウイルス感染に対して広範な防御を提供したことを示している。

以前の研究は、抗ＮＡ免疫性が誘導される場合、肺内のウイルス量が減少することを示していた（Ｂｏｓｃｈ， Ｂ． Ｊ．ら （２０１０） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ８４， １０３６６〜７４；Ｓｃｈｕｌｍａｎ， Ｊ． Ｌ．，ら （１９６８） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ２， ７７８〜８６；およびＷｅｂｓｔｅｒ， Ｒ． Ｇ． および Ｌａｖｅｒ， Ｗ． Ｇ． Ｊ．， （１９６７） Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ９９）。したがって、ＮＡ５２００、ＮＡ７９００、またはＮＡ９１００ポリペプチドを含む四量体ＣＢＣ ＮＡタンパク質によるワクチン接種を、肺のウイルス量を減少させる能力についても評価した。詳細には、マウスを、ＮＡ５２００、ＮＡ７９００、またはＮＡ９１００のいずれかを含む四量体ＣＢＣ ＮＡタンパク質によってプライミングおよび追加免疫し、追加免疫の３週間後に５ＬＤ５０量のＰＲ８／３４、ＮＣ／９９、またはＢｅｌ／０９を感染させた。感染後３日目および７日目に、肺を採取し、ウイルス量を調べた。

体重減少および生残についてマウスを観察し、それらが元の体重の≧２５％を失った場合、安楽死させた。いくつかの実験において、３日目、６日目、または７日目に、ペントバルビタールナトリウムの過剰投与（最終濃度は３ｍｇ／マウス）によってマウスを犠牲にし、気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）を実施して、肺を切除した。ＢＡＬは、Ｖａｎ Ｈｏｅｃｋｅら（Ｖａｎ Ｈｏｅｃｋｅ，ら （２０１７） Ｊ． Ｖｉｓ． Ｅｘｐ． ｅ５５３９８〜ｅ５５３９８）に従って実施し、ウイルス量について、組織培養伝染性用量（ＴＣＩＤ５０）において無細胞上清を評価した。ＢＳＡの標準曲線を使用して、Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質色素によって無細胞ＢＡＬ体液における総タンパク質レベルを決定した。肺ホモジネートを調製し、前に説明したように清澄化し（Ｄｅ Ｂａｅｔｓ， Ｓ．ら （２０１５） ＰＬｏＳ Ｏｎｅ １０を参照されたい）、ＴＣＩＤ５０アッセイによってウイルス価を評価した。

清澄化した肺ホモジネートまたはＢＡＬ体液（ＢＡＬＦ）におけるウイルス価を評価するために、標準ＴＣＩＤ５０アッセイを使用した。非必須アミノ酸、２ｍＭのＬ−グルタミン、０．４ｍＭのピルビン酸ナトリウムを補った、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳにおいて培養した、９６ウェルプレートにおけるＭＤＣＫ細胞の融合性単層を、無血清培地で洗浄し、１μｇ／ｍｌのＴＰＣＫ処理トリプシン（Ｓｉｇｍａ）を含有する無血清ＤＭＥＭにおいて１０倍希釈の試料と共にインキュベートした。感染の７日後に、ニワトリ赤血球の凝集によってウェルにおいてウイルスを検出し、Ｒｅｅｄ ａｎｄ Ｍｕｅｎｃｈ法（Ｒｅｅｄ ａｎｄ Ｍｕｅｎｃｈ １９３８）によって値を計算した。

図１０Ａ〜１０Ｆに示されるように、ウイルス量は、３日目においては、模擬処理動物と比較して、ＣＢＣ ＮＡワクチン接種した群において有意な減少を示さなかった。しかしながら、チャレンジ感染後の７日目まで、四量体ＣＢＣ ＮＡタンパク質でワクチン接種した全てのマウスは、模擬ワクチン接種したマウスより肺において著しく低いウイルス量を有した。血管漏出および肺浮腫は、重篤なインフルエンザ感染の兆候であり（Ｔａｔｅ， Ｍ． Ｄ．ら Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． （２００９） １８３およびＪｏｂ， Ｅ． Ｒ．ら Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． （２０１４） １９２）、無細胞ＢＡＬ体液内の総タンパク質含有量に基づくこれらのパラメータについて、ＮＡワクチン接種における可能性のある恩恵も評価した。四量体ＣＢＣ ＮＡタンパク質でワクチン接種し、ＰＲ８／３４、ＮＣ／９９、またはＢｅｌ／０９のいずれかを感染させたマウスは、チャレンジ感染後の３日目に単離されたＢＡＬ体液では、タンパク質レベルにおいて有意な差を示さなかったが、感染後７日目において、コントロールと比較して著しく低い総タンパク質を有した（図１０Ａ〜１０Ｆ）。

合わせて、これらのデータは、ＮＡ５２００、ＮＡ７９００、またはＮＡ９１００を含む四量体ＣＢＣ ＮＡタンパク質によるワクチン接種が、様々な異なるアッセイプラットフォームによって測定した場合に、有意な抗ウイルス効力を示したことを示している。

受動的移入実験
前に説明したように、ＮＡによるワクチン接種による防御の主要な相関関係は、ＮＡ阻害抗体を誘導する能力である。したがって、抗体が、ＣＢＣ ＮＡによって誘導される防御の主要メディエーターであるかどうかを決定するために、受動的移入実験を実施した。そのような実験において、ＮＡ５２００、ＮＡ７９００、ＮＡ９１００をコードするＤＮＡまたは緩衝液単独（ＰＢＳ）によって免疫したマウスから、熱不活性化抗血清を調製した。図１１Ａ〜１１Ｄに示されるように、当該抗血清は、３ラウンドの免疫化の後、広範なＮＡＩ活性を示した。次いで、２ＬＤ５０量のＰＲ８／３４、ＮＣ／９９、またはＢｅｌ／０９のいずれかによる感染の１日前に、当該抗血清を、６週齢のマウスに、鼻腔内により受動的に移入した。個々の野生型ｒＮＡに対して産生された抗血清を、同種ポジティブコントロールとして含ませた。抗血清は、ＮＡＩ応答の拡張を評価するために実施例４（図８Ａおよび８Ｂ）において前に使用したのと同じ血清であった。全てのウイルスチャレンジ感染において、当該ポジティブコントロールの抗血清は、同種ウイルスによる潜在的致死性感染後、マウスを体重減少および生残から完全に防御した。受動的移入実験のための例示的実験スケジュールを図１２に提供する。

受動的実験の結果を図１３Ａ〜１３Ｈに提供し、それらは、１ＬＤ５０量のＢｅｌ０９によるチャレンジ感染の後の、ＣＢＣ ＮＡによる体重減少防御および生残の増加を示している。図１４Ａ〜１４Ｆは、１ＬＤ５０量のＢｅｌ０９、ＮＣ／９９、またはＰＲ８／３４によるチャレンジ感染後の、ＣＢＣ ＮＡによって提供された体重減少防御および生残の増加を示している。

受動的移入実験も、四量体ＣＢＣ ＮＡタンパク質によってマウスを免疫することによって実施した。図１５Ａ〜１５Ｆに示されるように、ＮＡ５２００を含む四量体ＣＢＣ ＮＡによる活性ワクチン接種は、ＰＲ８／３４、ＮＣ／９９、およびＢｅｌ／０９感染に対して防御するが、ＮＡ５２００抗血清のみの受動的移入は、Ｂｅｌ／０９またはＰＲ８／３４で感染させたマウスにおいて体重減少および死亡に対する著しい防御を提供し、ＮＣ／９９で感染させたマウスにおいては提供しなかった（ｐ＜０．０１、二元配置分散分析または対数順位検定）。ＮＡ７９００免疫血清を含む四量体ＣＢＣ ＮＡによって免疫したマウスからの抗血清の受動的移入は、ＰＲ８／３４およびＮＣ／９９で感染させた場合、ネガティブコントロール群と比較して、罹患および死亡に対して著しく防御した（ｐ＜０．０１、二元配置分散分析または対数順位検定）。しかしながら、ＮＡ７９００抗血清の受動的移入は、Ｂｅｌ／０９ウイルスによるチャレンジ感染からマウスを有意には防御しなかった。最後に、ＮＡ９１００抗血清の受動的移入は、体重減少および生残の両方において、３種全てのチャレンジ感染ウイルスに対して有意な防御を提供した（ｐ＜０．０１、二元配置分散分析または対数順位検定）。

全ての受動的移入実験において、死亡に対する完全な防御は、ＮＡＩを媒介する当該抗血清の能力と相関した（図８Ａを参照されたい）。そのため、抗体は、四量体ＣＢＣ ＮＡタンパク質によって誘導される防御において主要な役割を果たすが、いくつかの場合においては、例えば、ＮＡＩは存在しないが防御は明白である場合、他のメカニズムも防御に貢献しているかもしれないと結論付けることができる。

一価ワクチンによる防御範囲および複合アプローチの評価
次に、ＣＢＣ ＮＡが、（ｉ）野生型組換え四量体ＮＡタンパク質（ｒＮＡ）と比べて、インビボにおいてより広範な防御を提供することができるかどうか、および（ｉｉ）不活性化スプリットワクチンによって提供される防御において増加することができるかどうか、について試験するために、実験を実施した。詳細には、ＮＡ５２００およびＮＡ９１００または、Ｂｅｌ／０９およびＮＣ／９９単独に由来するかもしくは一価Ｈ１Ｎ１ ｐｄｍ０９ワクチンとの組み合わせに由来する野生型可溶性組換えＮＡによって、マウスをワクチン接種した。続いて、当該マウスを、Ｂｅｌ／０９またはＮＣ／９９でチャレンジ感染させた。

ＮＣ／９９ ｒＮＡでワクチン接種したマウスは、Ｂｅｌ／０９ ｒＮＡでワクチン接種してその後にＢｅｌ／０９をチャレンジ感染させたマウスと比較して、体重減少および死亡から有意には防御されなかった。同種ワクチン接種したマウスは、ＮＡ５２００およびＮＡ９１００でワクチン接種した両方のマウスよりも、わずかに少ないが有意な体重減少を示したが、当該マウスの１００％が感染を生残した（図１６Ａ、１６Ｂ）。さらに、ＮＣ／９９ワクチン接種した７日目の肺におけるウイルス量は、平均して、模擬ワクチン接種したマウスと同様であった。ＮＡ５２００およびＮＡ９１００でワクチン接種したマウスの７日目におけるウイルス価は、模擬ワクチン接種させたマウスと比べて有意に減少したが（ｐ＜０．０１、一元配置分散分析）、同種ｒＮＡおよびＮＡ５２００の両方は、ＮＡ９１００ ＮＡより勝っていた（図１６Ｃ）。このパターンも、ＮＣ／９９でチャレンジ感染させたマウスに対して観察された。Ｂｅｌ／０９ ｒＮＡでワクチン接種したマウスは、より著しく体重を失い、感染後６日目において、ＮＣ／９９でワクチン接種したマウスと比較して、増加した死亡とより高いウイルス量を示した（図１６Ｇ、１６Ｈ、１６Ｉ）。

図９Ｅおよび９Ｆに提示されたデータと比較して、ＮＡ５２００は、ＮＣ／９９でチャレンジ感染させたマウスを同じ程度には防御しなかったが、ＮＡ９１００は、同種ワクチン接種したマウスと比較して、マウスを防御する能力において有意な差を示さなかった。さらに、Ｂｅｌ／０９ ｒＮＡも、ＰＲ８／３４ウイルスで感染させた場合、罹患および死亡からマウスを防御しなかった（データは示されていない）。まとめると、これらのデータは、ＮＡ９１００が、試験した野生型ＮＡより広範な防御を示したことを示している。

一価Ｈ１Ｎ１ ｐｄｍ０９ワクチン（単独において、または組換え四量体ＮＡタンパク質との組み合わせにおいて）でワクチン接種し、Ｂｅｌ／０９をチャレンジ感染させたマウスは、体重減少の兆候をほとんど示さず、死亡もほとんどなかった（図１６Ｄおよび１６Ｅ）。さらに、感染後７日目において、肺にウイルスの兆候はなかった（図１６Ｆ）。これらの結果は、一価ワクチンによる、とりわけアジュバントとの組み合わせにおける免疫化は、同種ウイルスに対して堅牢であることを確認する。

マウスをＮＣ／９９でチャレンジ感染させた場合、模擬ワクチン接種したマウスと比較して、アジュバントワクチン単独によっても、ある程度の防御が提供された（図１６Ｇ〜１６Ｌ）。ＮＡ５２００およびＮＡ９１００の両方は、一価のみとの比較において、体重減少および生残に対して相加効果を示さなかった（図１６Ｊおよび１６Ｋ）。しかしながら、一価ワクチンへのＮＣ／９９またはＮＡ９１００ ＮＡの追加は、一価単独と比較して、肺におけるウイルス価を著しく減少させた（図１６Ｌ）。そのため、これらのデータは、伝統的なワクチンアプローチとの組み合わせにおける防御に貢献するＮＡの能力を示している。

ＨＡ変異体に対する効力の評価
２０１７年の南半球インフルエンザシーズンに対して、世界保健機構（ＷＨＯ）は、季節性インフルエンザワクチンのＡ（Ｈ１Ｎ１）ｐｄｍ０９様ウイルスを、Ａ／Ｍｉｃｈｉｇａｎ／４５／２０１５様株で置き換えることを推奨した。このインフルエンザ変異体は、結果として中高年の成人における増加した感染率を生じるＨＡ内での変化を有することが想定された（Ｂ． Ｆｌａｎｎｅｒｙら ２０１８， ＪＩＤ）。

したがって、この変異体の配列が元のＣＢＣ ＮＡ設計戦略に含まれないため、当該四量体ＣＢＣ ＮＡタンパク質が、この変異体に対してＮＡ阻害を媒介することができるかどうかを試験するために実験を実施した。

最初に、赤血球凝集抑制（ＨＡＩ）を使用して、Ｂｅｌ／０９と当該Ａ／ミシガン／４５／２０１５様ウイルスＡ／シンガポール／ＧＰ１９０８／２０１５（Ｓｉｎｇ／１５）との間のＨＡ抗原性の差を調べた。Ｂｅｌ／０９およびＳｉｎｇ／１５（１２８０ＨＡＵｖｓ６４０ＨＡＵ）に対してＨＡＩを媒介する、当該一価スプリットＡ（Ｈ１Ｎ１）ｐｄｍ０９ワクチンに対してマウスにおいて産生された抗血清の能力において、二倍の差が観察された。この結果は、フェレット基準血清が有意な抗原性ドリフトの証拠を示さなかった以前の研究と一致していた。

次に、Ｂｅｌ／０９およびＳｉｎｇ／１５に対するＮＡ阻害を媒介する、当該四量体ＣＢＣ ＮＡタンパク質または四量体Ｂｅｌ／０９ＮＡに対して産生された抗血清の能力を試験した（図１７Ａ〜１７Ｃ）。Ｂｅｌ／０９抗血清は、Ｂｅｌ／０９と比較した場合、ドリフト変異体Ｓｉｎｇ／１５に対して著しく低いＮＡＩ力価を有したが（ｐ＜０．０５、一元配置分散分析）、ＮＡ５２００またはＮＡ９１００を含む四量体ＣＢＣ ＮＡに対して産生された抗血清は、野生型Ｂｅｌ／０９抗血清より低いレベルにもかかわらず、Ｓｉｎｇ／１５およびＢｅｌ／０９の両方に対して同様に良好にＮＡＩを媒介した（図１７Ａおよび１７Ｂ）。アミノ酸同一性を考慮する場合、７５のアミノ酸から前方において、Ｓｉｎｇ／１５は、それぞれＮＡ５２００、ＮＡ７９００、ＮＡ９１００、およびＢｅｌ／０９に対して９１％、８７％、８９％、および９７％の同一性を共有した（図１７Ｃ）。したがって、これらのデータは、当該ＣＢＣ ＮＡが、当該タンパク質の初期設計に含まれなかった株に対して同じレベルの阻害を示したことを示している。

したがって、クラスターベースコンセンサスアプローチは、ＨＡ抗原性ドリフトが生じる株にわたって抗ＮＡ応答を生じさせることができるＮＡポリペプチドを提供することができたと考えられる。したがって、本方法は、免疫応答を拡張し、様々なインフルエンザ株、タイプ、およびサブタイプに対する長期（すなわち、複数シーズン）の防御を提供するために利用することができる。

Claims (29)

1. コンセンサスアミノ酸を含む組換えインフルエンザノイラミニダーゼ（ＮＡ）ポリペプチドを生成するための方法であって：
   ａ．１つより多いインフルエンザＮＡポリペプチド配列を選択すること、および該配列をアラインすること；
   ｂ．ペアワイズ類似性／非類似性マトリクスを算出すること；
   ｃ．該ペアワイズ類似性／非類似性マトリクスから類似配列のクラスターを同定することおよび創出すること；
   ｄ．各クラスター内で、ペアワイズアライメント法を使用して配列アライメント中の各位置についてコンセンサスアミノ酸があるかどうかを決定することであって、所与の位置でのアミノ酸の頻度が５０％以上である場合、そのアミノ酸はコンセンサスアミノ酸と指定され、所与の位置でのアミノ酸の頻度が５０％未満である場合、そのアミノ酸は可変アミノ酸と指定されること；
   ｅ．各クラスターについてコンセンサスアミノ酸および可変アミノ酸を含む第１の配列を生成すること；
   ｆ．場合により、複数のクラスターが分析される場合：
   ｉ．各クラスターについて工程（ｅ）において生成された該配列をアラインすること；
   ｉｉ．ペアワイズアライメント法を使用して該配列アライメント中の各位置についてコンセンサスアミノ酸があるかどうかを決定することであって、所与の位置でのアミノ酸の頻度が５０％以上である場合、そのアミノ酸はコンセンサスアミノ酸と指定され、所与の位置でのアミノ酸の頻度が５０％未満である場合、そのアミノ酸は可変アミノ酸と指定されること；ならびに
   ｉｉｉ．コンセンサスアミノ酸および可変アミノ酸を含む第２の配列を生成すること
   によって、クラスターの工程（ｅ）において生成された該第１の配列と別のクラスターまたは複数のクラスターにおいて生成された第１の配列とを比較すること；
   ｇ．工程（ｅ）において生成された該第１の配列または工程（ｆ）（ｉｉｉ）において生成された該第２の配列内で：
   ｉ．該第１のまたは第２の配列に基づいて一連の検査配列を生成することであって、検査アミノ酸を可変アミノ酸位置に位置させること；
   ｉｉ．該検査配列それぞれについて分子モデリングを実行すること；
   ｉｉｉ．負の総エネルギー値を有するポリペプチドをもたらすアミノ酸（複数可）を選択することによって各可変アミノ酸位置についてのコンセンサスアミノ酸を決定すること
   によって、各可変アミノ酸位置についてコンセンサスアミノ酸を決定すること、ならびに
   ｈ．該コンセンサスアミノ酸を含む組換えインフルエンザＮＡポリペプチドを生成すること
   を含む前記方法。
2. 配列をアラインすることは、ＭＡＦＦＴ、ＭＵＳＣＬＥ、ＣＬＵＳＴＡＬ ＯＭＥＧＡ、ＦＡＳＴＡ、これらの組合せまたは任意の他の多重配列アライメントソフトウェアパッケージを使用することを含む、請求項１に記載の方法。
3. ペアワイズ類似性／非類似性マトリクスを算出することは、ＢＬＯＳＵＭ、ＰＡＭ、ＩＤＥＮＴＩＴＹ置換マトリクスまたはこれらの組合せを使用することを含む、請求項１または２に記載の方法。
4. ペアワイズ類似性／非類似性マトリクスから類似配列のクラスターを同定および創出することは、Ｋ平均クラスタリング、ミニマックスクラスタリング、主成分分析（ＰＣＡ）、多次元尺度構成法（ＭＤＳ）またはこれらの組合せを使用することを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
5. 分子モデリングは、インフルエンザＮＡポリペプチドまたはタンパク質の結晶構造と比較することを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
6. 分子モデリングは、Ｒｏｓｅｔｔａまたは任意の他の分子モデリングソフトウェアの使用を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
7. 検査アミノ酸は、タンパク質に見出される任意の天然または非天然アミノ酸を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
8. 請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法を使用して生成された組換えインフルエンザＮＡポリペプチド。
9. 配列番号１、２もしくは３またはこれらの断片から選択されるアミノ酸配列、または配列番号１、２もしくは３またはその断片に少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の組換えインフルエンザＮＡポリペプチド。
10. 配列番号１、２または３のアミノ酸７５〜４６９を含む、請求項９に記載の組換えＮＡポリペプチド。
11. 請求項８〜１０のいずれか１項に記載の１つまたはそれ以上の組み換えＮＡポリペプチドを含む、組換え四量体ＮＡタンパク質。
12. 請求項８〜１０のいずれか１項に記載の組換えＨＡポリペプチドまたは請求項１１に記載の組換え四量体ＮＡタンパク質をコードする単離された核酸。
13. 請求項１２に記載の核酸を含むベクター。
14. 請求項１３に記載のベクターを含む、単離された細胞。
15. 哺乳動物細胞である、請求項１４に記載の単離された細胞。
16. ＨＥＫ２９３Ｔ細胞またはＣＨＯ細胞である、請求項１５に記載の単離された細胞。
17. 昆虫細胞である、請求項１４に記載の単離された細胞。
18. 請求項８〜１０のいずれか１項に記載の組換えＮＡポリペプチドまたは請求項１１に記載の組換え四量体ＮＡタンパク質を含む融合タンパク質。
19. 請求項８〜１０のいずれか１項に記載の組換えＮＡポリペプチドまたは請求項１１に記載の組換え四量体ＮＡタンパク質を含むインフルエンザウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
20. インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質、インフルエンザマトリクス（Ｍ１）タンパク質、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ｇａｇタンパク質またはこれらの組合せの１つもしくはそれ以上をさらに含む、請求項１９に記載のインフルエンザＶＬＰ。
21. 請求項８〜１０のいずれか１項に記載の組換えＮＡポリペプチド、請求項１１に記載の組換え四量体ＮＡタンパク質、請求項１８に記載の融合タンパク質または請求項１９もしくは２０に記載のインフルエンザＶＬＰおよび薬学的に許容される担体、賦形剤またはアジュバントを含む医薬組成物。
22. １つまたはそれ以上のインフルエンザ株、型および／またはサブタイプに対する免疫応答を誘発する、請求項２１に記載の医薬組成物。
23. インフルエンザウイルスに対して対象を免疫化する方法であって、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の組換えＮＡポリペプチド、請求項１１に記載の組換え四量体ＮＡタンパク質、請求項１８に記載の融合タンパク質、請求項１９もしくは２０に記載のインフルエンザＶＬＰまたは請求項２１もしくは２２に記載の医薬組成物の有効量を該対象に投与することを含む前記方法。
24. 対象においてインフルエンザウイルスへの免疫応答を誘導する方法であって、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の組換えＮＡポリペプチド、請求項１１に記載の組換え四量体ＮＡタンパク質、請求項１８に記載の融合タンパク質、請求項１９もしくは２０に記載のインフルエンザＶＬＰまたは請求項２１もしくは２２に記載の医薬組成物の有効量を該対象に投与することを含む前記方法。
25. インフルエンザウイルスは、季節性またはパンデミックインフルエンザウイルスである、請求項２３または２４に記載の方法。
26. 免疫応答は、１つまたはそれ以上のインフルエンザウイルス株、型またはサブタイプに対する抗体の産生を含む、請求項２４または２５に記載の方法。
27. 対象は、哺乳動物である、請求項２３〜２６のいずれか１項に記載の方法。
28. 対象は、ヒトである、請求項２７に記載の方法。
29. 投与することは、筋肉内、鼻腔内、皮内、皮下、経口または静脈内経路を介して実行される、請求項２３〜２８のいずれか１項に記載の方法。

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