KR20090117697A - 조류 독감용 재조합 변형된 백시니아 바이러스 안카라 (ｍｖａ)-기반 백신 - Google Patents

Abstract

본 발명은 인플루엔자 A 바이러스 클래스 H5 항원에서 서열이 유래하는 이종 핵산을 포함하는 재조합 변형된 백시니아 바이러스 안카라 (MVA)의 약물, 특히 백신의 제조에 있어서의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 다른 측면에서, 본 발명은 이종 핵산을 포함하며, 여기서 (a) 이종 핵산이 MVA의 게놈내의 비-필수 위치로 혼입되고, (b) 이종 핵산이 백시니아 바이러스 프로모터, 또는 오르토폭스바이러스 프로모터, 또는 폭스바이러스-특이적 프로모터의 조절하에 있으며, (c) 이종 핵산이 인플루엔자 A 바이러스 클래스 H5로부터의 유전자 또는 유전자의 일부를 코딩하는 핵산의 군으로부터 선택되는 것인, 재조합 변형된 백시니아 바이러스 안카라 (MVA)에 관한 것이다.

재조합 변형된 백시니아 바이러스 안카라 (ＭＶＡ), 백시니아 바이러스, 오르토폭스바이러스, 폭스바이러스, 인플루엔자 Ａ 바이러스 클래스 Ｈ5.

Description

조류 독감용 재조합 변형된 백시니아 바이러스 안카라 (ＭＶＡ)-기반 백신 {RECOMBINANT MODIFIED VACCINIA VIRUS ANKARA (MVA)-BASED VACCINE FOR THE AVIAN FLU}

도입

1997년 H5N1의 최초 인간 감염 사례 이후, 이 서브타입의 인플루엔자 바이러스는 증가하는 조류에서 인간으로의 전염과 관련된 전 세계적인 가금 전염병의 발생을 지속적으로 야기하고 있다. 9월 14일 현재, 246건의 인간 사례가 보고되었고 그 중 144건이 치명적인 것으로 판명되었다 (WHO disease alert 2006. Confirmed human cases of avian influenza H5N1- http://www.who.int/csr/disease/avian influenza/country/cases table 2007 10 17/en/index.html, accessed October 17th, 2007). 또한, H5N1 바이러스 감염은 동남아시아로부터 세계의 다른 대륙들로 확산되고 있다 (WHO. 2007. Affected areas with confirmed cases of H5N1 avian influenza since 2003, status as of 08.10.2007). 이들 바이러스는 조류뿐만 아니라 인간 (문헌 [Beigel, J. H., J. Farrar, A. M. Han, et al. 2005. Avian influenza A (H5N1) infection in humans. N Engl J Med 353:1374-85])을 비롯한 다양한 포유동물 종 (문헌 [Vahlenkamp, T. W., and T. C. Harder. 2006. influenza virus infections in mammals. Berl Munch Tierarztl Wochenschr 119:123-31])을 감염시키기 때문에 포유동물 종 내 복제에 대한 조류 바이러스의 적응을 통해 또는 일반적인 유행성 인플루엔자 A 바이러스와 유전자 절편의 교환을 통해 신종 대유행 균주가 출현할 위험이 있다.

계속 증가하는, 감염된 가금류에서 인간으로 전염되는 인플루엔자 H5N1 바이러스에 의해 야기되는 대유행 위협에 비추어, 안전하고 유효한 백신의 충분한 수의 입수 가능성이 우선적으로 고려되어야 한다 (WHO. 2007. Antigenic and genetic characteristics of H5N1 viruses and candidate H5N1 vaccine viruses developed for potential use as pre-pandemic vaccines-http://www.who.int/csr/disease/avian influenza/guidelines/summarvH5200 70403.pdf).

그러나, 이러한 백신의 개발 및 충분한 양의 백신 투여량의 생산은 간단하지 않다: 현재 모든 제조업자의 통합된 백신 생산 능력은 전 세계적인 백신화 캠페인에 대해 적시에 백신을 제공하기에 충분하지 않다. 이러한 문제점을 극복하는 데 도움을 줄 수 있는 대안적인 백신 전달 시스템 및 생산 기술에 대한 명백한 필요성이 있다.

H5N1 바이러스의 항원성이 상이한 별개의 클레이드 (clade)가 최근에 확인되고 있기 때문에, 이상적 백신은 이들 항원성 변이체에 대항하는 교차-방어 면역을 또한 유도할 수 있을 것이다. 최근, 전 불활성화 바이러스 (whole inactivated virus: WIV) 및 분할 비리온 백신과 같은 종래 불활성화 백신 제제가 평가되고 있다 (문헌 [Nicholson, K. G., A. E. Colegate, A. Podda, et al.. 2001. Safety and antigenicity of non-adjuvanted and MF59-adjuvanted influenza A/Duck/Singapore/97 (H5N3) vaccine: a randomised trial of two potential vaccines against H5N1 influenza. Lancet 357:1937-43]). 이들은 가능한 보관 수명과 관련하여 상당한 부가 생성물 특성화를 요구한다는 결점을 가지고 있다. 게다가, 백신 생산자에 의한 이러한 신규한 공정의 이행은 반드시 성공적인 것은 아니며 유효성에 대한 시험도 재시행이 필요할 것이다. 대유행의 위험에 비추어 이들 결점은 심각하다. 안전하고 유효한 애주번트(adjuvant)는 종래 백신의 면역원성을 개선할 수 있고 적합한 항체 반응을 유도하는데 요구되는 항원-수준을 낮춰줄 수 있다 (투여량 절감). 본원의 결과는 이러한 가능성을 분명히 나타낸다 (스티뮨 (Stimune; 등록상표)-애주번트화 NIBRG-14 전 바이러스 제제). 그러나, 현재 이러한 유력한 애주번트화 제형은 제조 및 인간에 대한 적용이 적합하지 않다고 간주되며 백신의 면역원성의 증진을 위한 애주번트를 요구하지 않는 백신이 미래 백신 개발에 있어서 바람직한 후보이다.

바큘로바이러스 (baculovirus)에 의해 발현되는 재조합 HA 기반의 백신이 시험되었다 (문헌 [Treanor, J. J,, B. E. Wilkinson, F. Masseoud, et al. 2001. Safety and immunogenicity of a recombinant hemagglutinin vaccine for H5 influenza in humans. Vaccine 19:1732-7]). 항원 미노출 개체에서 이들 백신은 온건하게 면역원성이었으나, 보다 중요하게 인지될 수 있는 항체 반응은 높은 투여량에서만 유도되거나, 또는 알룸 (alum)과 같은 애주번트와의 조합물이 사용되었다 (문헌 [Nicholson, K. G., A. E. Coiegate, A. Podda, et al. 2001. Safety and antigenicity of non-adjuvanted and MF59-adjuvanted influenza A/Duck/Singapore/97 (H5N3) vaccine: a randomised trial of two potential vaccines against H5N1 influenza. Lancet 357:1937-43]).

명백하게, 막대한 백신의 부족을 극복하기 위해, 특히 H5N1 인플루엔자 대유행의 경우에 신규한 백신은 시급히 필요하다. 또한 상기 약술된 결점들은 대유행이 초래할 수 있는 결과를 피하기 위해 시급히 극복되어야만 한다.

발명의 설명

본 발명은 치료 분야, 보다 특히 백신 분야, 보다 특히 인플루엔자 A 백신 분야, 보다 특히 H5N1 백신에 관한 것이다.

인플루엔자바이러스 A는 바이러스 분류에서 오르토믹소비리대 (Orthomyxoviridae)라 불리는 바이러스 과의 하나의 속이다. 인플루엔자바이러스 A는 그 안에 단 하나의 종을 가지고 있으며; 그 종을 "인플루엔자 A 바이러스"라 부른다. 인플루엔자 A 바이러스는 "조류 인플루엔자" (새 독감, 조류 독감, 인플루엔자바이러스 A 독감, 타입 A 독감, 또는 속 A 독감으로도 알려짐)를 야기한다. 이는 새를 숙주로 하지만, 포유동물의 몇몇 종을 감염시킬 수 있다. 모든 알려진 서브타입은 새들에서 유행성이다.

본 발명은 상기 약술된 문제점을 해결한다. 본 발명은 약물, 특히 백신의 제조를 위한 단리된 이종 핵산을 포함하는 재조합 변형된 백시니아 바이러스 안카라 (MVA)의 용도를 교시하며, 여기서 이종 핵산의 서열은 인플루엔자 A 바이러스 클래스(class) H5 항원으로부터 유래한다.

"단리된 DNA"는 (1) 본 발명에 따른 어떠한 자연 발생 서열의 DNA와도 동일하지 않은 서열을 함유하는 DNA이거나, 또는 (2) 자연 발생 서열을 갖는 DNA (예를 들어, cDNA 또는 게놈 DNA)와 관련해서는, 관심 DNA를 함유하는 유전자가 자연 발생하는 유기체의 게놈에서 관심 DNA를 함유하는 유전자를 플랭킹하는 하나 이상의 유전자가 없는 DNA이다. 따라서 이 용어는 벡터에, 자발적으로 복제하는 플라스미드 또는 바이러스에, 또는 원핵생물 또는 진핵생물의 게놈 DNA에 혼입되는 재조합 DNA를 포함한다. 이 용어는 또한 개별 분자, 예컨대 상응하는 게놈 DNA가 인트론을 가지며 따라서 상이한 서열을 갖는 cDNA; 하나 이상의 플랭킹 유전자가 결핍된 게놈 단편; 중합효소 연쇄 반응 (PCR)에 의해 생성되며 하나 이상의 플랭킹 유전자가 결핍된, cDNA 또는 게놈 DNA의 단편; 하나 이상의 플랭킹 유전자가 결핍된 제한 단편; 비-자연 발생 단백질, 예컨대 융합 단백질, 뮤테인 (mutein), 또는 이들 단백질의 단편을 코딩하는 DNA; 및 cDNA의 다의성(degenerate) 변이체인 핵산 또는 자연 발생 핵산을 포함한다. 또한, 이는 하이브리드 유전자의 일부인 재조합 뉴클레오티드 서열, 즉, 비-자연 발생 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 포함한다. 단리된 DNA가, 수백 내지 수백만개의 다른 DNA 분자 중에서 예를 들어, 제한 절단 반응 혼합물 또는 전기영동 겔 슬라이스 중, 예를 들어 cDNA 또는 게놈 DNA 라이브러리 또는 게놈 DNA 제한 절단물 내에 존재하는 DNA를 의미하지 않다는 것은 상기로부터 명백할 것이다.

재조합 변형된 백시니아 바이러스 안카라 (MVA)는 이종 핵산을 포함하며, 여기서 (a) 이종 핵산은 MVA의 게놈내의 비-필수 부위에 혼입되고, (b) 이종 핵산은 백시니아 바이러스 프로모터, 또는 오르토폭스바이러스 프로모터, 또는 폭스바이러스-특이적 프로모터의 조절 하에 있고, (c) 이종 핵산은 인플루엔자 A 바이러스 클래스 H5로부터의 유전자 또는 유전자의 일부를 코딩하는 핵산의 군으로부터 선택된다.

용어 "벡터"는 세포 내에 포함된 단백질 및/또는 핵산에 도입될 수 있거나 또는 이를 도입할 수 있는, 단백질 또는 폴리뉴클레오티드 또는 이들의 혼합물을 지칭한다. 도입된 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 단백질이 벡터의 도입시 세포 내에서 발현되는 것이 바람직하다.

"약물, 특히 백신의 제조를 위한 바람직한 핵산", 즉, 본원의 서열 1 내지 3 및 11 내지 15는 본원에 구체적으로 열거된 핵산과 95％, 바람직하게는 98％, 가장 바람직하게는 99％ 동일한 핵산을 지칭한다. 두 서열 간의 백분율 동일성의 측정은 문헌 [Karlin and Altschul (1993) PNAS. 90: 5873-5877]의 수학적 알고리즘을 사용하여 수행한다. 이러한 알고리즘을 문헌 [Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410]의 BLASTN 및 BLASTP 프로그램에 도입하였다. BLAST 뉴클레오티드 서치를 스코어 = 100, 워드 길이 = 12에서 BLASTN 프로그램으로 수행하여 핵산을 코딩하는 EPO 변이체 폴리펩티드와 상동성인 뉴클레오티드 서열을 얻는다. BLAST 단백질 서치를 스코어 = 50, 워드 길이 = 3에서 BLASTP 프로그램으로 수행하여 각각 EPO 변이체 폴리펩티드와 상동성인 아미노산 서열을 얻는다. 비교 목적을 위한 갭핑된 정렬을 얻기 위하여, Gapped BLAST를 문헌 [Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402]에 기재된 바와 같이 사용한다. BLAST 및 Gapped BLAST 프로그램을 이용하는 경우에, 각각의 프로그램의 디폴트 파라미터를 사용한다.

본 발명자들은 약물, 특히 백신의 제조를 위해 서열이 인플루엔자 A 바이러스 클래스 H5 항원으로부터 유래된 것인 이종 핵산을 포함하는 재조합 변형된 백시니아 바이러스 안카라 (MVA)를 사용함으로써 상기 요약된 문제점이 해결됨을 밝혀내었다. 특히, 인플루엔자 H5N1 바이러스의 HA를 생성하는 MVA로의 백신화는, 단일 백신화 후에도 동종 및 이종 접종 감염에 대한 보호와 관련된 효력있는 항체 반응을 유도하였다. 가장 놀라운 것은, 특정한 제1 H5N1 종 (홍콩(Hongkong)/156/97)으로부터의 특정 항원을 생성하는 MVA로의 백신화가 이종의 제2 H5N1 (베트남(Vietnam)/1194/04) 종에 의한 감염 시의 질환에 대해 양호한 보호를 유도함을 본 발명자들이 제시할 수 있다는 것이다. 이러한 보호가 상기 제2 바이러스 종에 대한 검출가능한 항체의 부재 하에서도 일어난다는 것은 매우 놀라운 일이다. 본 발명은 특히 인간뿐 아니라 다른 동물에서의 조류 독감 치료용 약물, 특히 백신의 제조를 위한, 서열이 인플루엔자 A 바이러스 클래스 H5 항원으로부터 유래된 것인 이종 핵산을 포함하는 재조합 변형된 백시니아 바이러스 안카라 (MVA)의 용도에 관한 것이다.

MVA는 원래 인간 천연두에 대한 특히 안전한 백신으로서 120,000명 이상의 개인에게 시험되었다 (문헌 [Mayr, A., and K. Danner, 1978. Vaccination against pox diseases under immunosuppressive conditions. Dev Biol Stand 41: 225-34]).

MVA 벡터 백신을 사용하는 것의 이점에는 인간에 대해서 확립된 안전성 프로 파일, 임상 시험에서의 이종 항체 전달 시의 효능, 및 GMP 요건 하의 대규모 백신 생산 기술 적용성이 포함된다.

본 발명자들은 H5N1 인플루엔자 바이러스 A/홍콩/156/97 (A/HK/156/97) 또는 A/베트남/1194/04 (A/VN/1194/04)의 헤마글루티닌 (HA) 유전자 서열을 또한 발현하는 다른 재조합 MVA 바이러스를 구상하였다. 상기 바이러스는 3가지 상이한 H5N1 바이러스에 대한 보호 면역성의 유도를 평가하기 위한 마우스 모델에서 후보 백신의 역할을 하였다. 2회 투여 면역화 계획은 이종 H5N1 바이러스와 부분적으로 교차-반응하는 강력한 항체 반응; 동종 및 이종 인플루엔자 바이러스로의 접종 감염에 대한 보호와 관련된 유발된 항체 반응을 유도하였다.

본 발명에 따른 백신 (MVA)은 감염을 야기하는 종이 백신 항원과 완전하게 일치하지 않는 경우에도, 기도에서의 심각한 임상적 징후 및 조직병리학적 변화로부터 개인을 보호하는 광범위한 면역 반응을 유도할 수 있다. 본 발명에 따른 재조합 MVA 벡터는 그것이 인간에서 사용하기에 유리한 백신 후보가 되도록 하는 다수의 성질을 가진다.

첫째로, 본 발명에 따른 재조합 MVA는 포유동물 세포에서의 별개적 복제 결함, 및 면역억제된 짧은 꼬리 원숭이에서의 MVA의 안전성 (문헌 [Stittelaar, K. J., T. Kuiken, R. L. de Swart, et al. 2001. Safety of modified vaccinia virus Ankara (MVA) in immunesuppressed macaques. Vaccine 19: 3700-9]) 또는 HIV 감염된 개인에 대한 높은 투여량의 재조합 MVA의 무독성 적용 (문헌 [Harrer, E.; M. Bauerle, B. Ferstl, et al. 2005. Therapeutic vaccination of HIV-1-infected patients on HAART with a recombianat HIV-1 nef-expressing MVA: safety, immunogenicity and influence on viral load during treatment interruption. Antivir Ther 10: 285-300]; [Goonetilleke, N., S. Moore, L. Dally, et al. 2006. Induction of multifunctional human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1)-specific T cells capable of proliferation in healthy subjects by using a prime-boost regimen of DNA- and modified vaccinia virus Ankara-vectored vaccines expressing HIV-1 Gag coupled to CD8+ T-cell epitopes. J Virol 80: 4717-28])을 비롯한 잘 확립된 생체내 무독성에 기인하여 극히 안전한 바이러스성 벡터로 간주될 수 있다.

둘째로, MVA를 오로토폭스바이러스-관련 생물위협에 대한 제3 세대 백신으로 개발하기 위해 취해진 노력에 대한 결과로서, MVA 백신의 산업적 규모 생산은 매우 실현가능한 것으로 여겨진다 (문헌 [Vollmar, J., N. Arndtz, K.M. Eckl, et al. 2006. Safety and immunogenicity of IMVAMUNE, a promising candidate as a third generation smallpox vaccine. Vaccine 15; 24: 2065-70]).

셋째로, 본 발명에 따른 MVA 벡터 백신은 복합적인 이종 항체를 전달하고 높은 수준의 체액 및 세포 면역성의 동시 도입을 허용함으로써 다가 백신의 개발 가능성을 제공할 수 있다.

또한, MVA-기반 백신의 생산은 통상적인 인플루엔자 백신에 대한 기존의 생산 능력과 무관하다. 이러한 방식의 MVA-기반 백신 생산은 신흥 유행의 시기에 예상되는 백신 투여량 부족 현상을 감소시키는 데 기여할 수 있다. 또 다른 이점은 이들 백신의 뛰어난 면역원성이 보조제의 사용과는 무관하다는 것이다.

변형된 백시니아 바이러스 안카라 (MVA)는 백시니아 바이러스의 닭 세포 적응 종이다. 동물 접종 시에 밝혀진 무독성 및 대부분의 포유동물 기원 세포에서 실질적인 양의 새로운 바이러스성 자손을 생성하는 것에 대한 두드러진 결함에 기인하여, MVA는 생물안전성 수준 1의 실험실 조건 하에서 사용될 수 있다. MVA는 현저한 부작용의 야기 없이 천연두에 대해 백신화된 100,000명 이상의 인간에서 전-면역화에 대해 시험되었기 때문에, 높은 안전성 프로파일을 가지고 재조합 유전자의 발현을 위한 효과적인 벡터 바이러스 (문헌 [Sutter, G., and B. Moss. 1992. Nonrepeating vaccinia vector efficiently expresses recombinant genes. PNAS 89: 10847-51]) 및 재조합 백신 후보 (문헌 [Moss, B., M.W. Carroll, L.S. Wyatt, et al. 1996. Host range restricted, non-replicating vaccinia virus vectors as vaccine candidates. Adv Exp Med Biol 397: 7-13])의 역할을 한다. 몇몇 MVA 벡터 백신은 이미 임상 평가에 진입해 있다 (문헌 [McConkey, S.J., W. H. Reece, V.S. Moorthy, et al. 2003. Enhanced T-cell immunogenicity of plasmid DNA vaccines boosted by recombinant modified vaccinia virus Ankara in humans. Nat Med 9: 729-35]; [Cosma, A., R. Nagaraj, S. Buehler, et al. 2003. Therapeutic vaccination with MVA-HIV-1 nef elicits Nef-specific T-helper cell responses in chronically HIV-1 infected individuals. Vaccine 22: 21-9]). 가장 최근에, MVA는 천연두에 대한 제2 세대 백신 후보로서 재평가되었다. 본 발명에 따르면, 본 발명에 따른 이종 핵산은 MVA 게놈의 비-필수 영역에 혼입된다. 본 발명에 따 르면, 임의의 MVA 종을 사용할 수 있다.

WO 03/097844 A1은 제4 쪽에서 다수의 MVA 종을 개시한다. 본 발명에 따라 사용될 수 있는 하나의 종은 MVA-BN 종 또는 그의 유도체이다 (WO 02/42480). 본 발명에 따른 비-필수 영역은 (i) 백시니아 바이러스 종 코펜하겐(Copenhagen)의 게놈과 관련된 MVA 게놈의 천연 발생 결실 측면 또는 (ii) MVA 게놈의 유전자 사이 영역으로부터 선택될 수 있다. 용어 "유전자 사이 영역"은 바람직하게는 코딩 서열이나 조절 서열을 포함하지 않은 2개의 인접한 유전자 사이에 위치한 바이러스성 게놈의 부분을 지칭한다. 그러나, 본 발명의 범위 내에서, 혼입 위치는 적어도 하나의 세포 배양 시스템, 예컨대 닭 배아 섬유아세포 (CEF 세포) 내에서 증폭 및 증식될 수 있는 재조합물을 얻는 것이 가능한 한, 바이러스성 게놈내 임의의 위치일 수 있기 때문에, 본 발명에 따른 이종 핵산의 혼입을 위한 삽입 측면 (비-필수 영역)은 상기 바람직한 삽입 측면에 한정되지 않는다. 따라서, 비-필수 영역은 또한 비-필수 유전자 또는 유전자들일 수도 있고, 이것의 기능은 MVA의 증식에 사용된 세포 시스템에 의해 억제될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 이종 핵산은 MVA 게놈내 비-필수 위치로 혼입된다.

특히 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 이종 핵산은 결실 위치 (III)에서 MVA 게놈으로 혼입된다. 본 발명에 따른 이종 핵산의 혼입은, MVA 게놈으로의 혼입 전에 본 발명에 따른 이종 핵산을 처음으로 포함하는 소위 전달 벡터의 플랭킹 영역의 상동성 재조합에 의해 우선적으로 수행된다. 상동성 혼입 시에 재조합 바이러스의 선택이 수행된다. 재조합 바이러스를 선택하는 이러한 방법의 하나 는 숙주 범위 유전자 K1L의 발현이다 (도 5 및 7 참조).

바람직한 실시양태에서, 이종 핵산은 결실 위치 III에서 MVA 게놈으로 혼입된다.

본 발명에 따르면, 이종 핵산은 백시니아 바이러스-, 또는 오르토폭스바이러스-, 또는 폭스바이러스-특이적 프로모터의 조절 하에 있다. 다수의 프로모터를 본 발명에 대해 사용할 수 있다. 본 발명에 따른 이종 핵산의 발현을 위해, 3OK 및 4OK 프로모터 (US 5,747,324, 문헌 [A Strong Synthetic Early-Late Promoter; Sutter, G., L.S. Wyatt, P. L, Foley, et al. 1994. A recombinant vector derived from the host range-restricted and highly attenuated MVA strain of vaccinia virus stimulates protective immunity in mice to influenza virus. Vaccine 12:1032-1040]), P7.5 프로모터 (문헌 [Endo, A., S. Itamura, H. linuma, et al. 1991. Homotypic and heterotypic protection against influenza virus infection in mice by recombinant vaccinia virus expressing the haemagglutinin or nucleoprotein of influenza virus. J Gen Virol 72: 699-703]), PmH5, P11, 및 우두(cowpox) 바이러스 A형 함유 (ATI) 유전자로부터 유래된 프로모터 (문헌 [Li, Y., R.L. Hall, S.L. Yan, R.W. Mover. 1998. High-level expression of Amsacta moorei entomopoxvirus spheroidin depends on sequences within the gene. J Gen Virol 79:613-22])와 같은 몇몇 프로모터를 사용할 수 있다. 이들 프로모터 모두를 본 발명에 따라 사용할 수 있다. 하나의 실시양태에서는, 이종 핵산이 많은 양으로 발현되는 것이 바람직하다. WO 03/097844 A1은 P7.5, PmH5 및 P11과 같은 프 로모터를 바람직한 것으로 개시한다.

본 발명에 따르면, 이종 핵산의 서열은 H5N1, H5N3, H5N2, H5N7, H7N1, H7N7, H7N3 및 H9N2 서열의 군으로부터 선택된다. 바람직하게는, 서열은 H5N1으로부터 유래된다.

이종 핵산이 H5N1으로부터 유래된 경우, 그것은 바람직하게는 A/베트남/1203/04, A/베트남/1194/04, A/베트남/3046/04, A/홍콩/156/97, A/홍콩/212/03, A/홍콩/213/03, A/인도네시아(Indonesia)/5/05, A/Ck/인도네시아/BL03/03, A/왜가리(Grey heron)/HK/793.1/02, A/붉은 부리 갈매기(Black Headed Gull)/HK/12.1/03, A/Dk/베트남/11/04, A/Ck/베트남/33/04, A/Ck/베트남/C-58/04, A/Dk/TH/D4AT/04, A/Gs/TH/G7CS/04, A/Dk/FJ/1734/05, A/Ck/GX/463/06 및 A/Ck/HK/947/06으로 지칭되는 종의 군으로부터 선택된다.

H5N1의 이종 핵산은 A/베트남/1194/04, A/인도네시아/5/2005, A/인도 기러기(Bar headed goose)/칭하이(Qinghai)/1A/2005, A/큰 백조(Whooper swan)/몽골(Mongolia)/244/2005, A/칠면조/터키(Turkey)/1/2005 및 A/안후이성(Anhui)/1/2005 종으로부터 선택되는 것이 바람직하다.

H5N1의 이종 핵산은 A/베트남/1194/04 종의 이종 핵산인 것이 가장 바람직하다.

이종 핵산의 서열은 헤마글루티닌 유전자의 서열 또는 서열의 일부를 포함하는 것이 바람직하다. 바람직한 실시양태에서, 이종 핵산의 서열은 뉴클레오티드 1에서 1500, 보다 바람직한 실시양태에서는 뉴클레오티드 1에서 1100, 가장 바람직 한 실시양태에서는 뉴클레오티드 40에서 1100의 헤마글루티닌 유전자의 서열 또는 서열의 일부를 포함한다. 가장 바람직한 실시양태에서, 이종 핵산은 서열 1, 서열 2 및 서열 3으로부터 선택되는 A/베트남/1194/04로부터의 헤마글루티닌 유전자의 서열 또는 서열의 일부를 포함한다. 서열 3이 가장 바람직하다 (하기 표 1 참조).

헤마글루티닌 (HA)은 인플루엔자 바이러스 (또한 수많은 다른 박테리아 및 바이러스)의 표면 상에서 발견되는 항원성 당단백질이다. 이것은 바이러스를 감염되는 세포에 결합시킬 수 있다. 헤마글루티닌이라는 명칭은 적혈구가 서로 응집되도록 하는 단백질의 능력에서 유래하였다 (문헌 [Nelson D.L. and Cox M.M., 2005. Principles of Biochemistry, 4th edition, Freeman Publishers, New York]).

16종 이상의 다양한 HA 항원이 있다. 이들 서브타입을 H1 내지 H16이라 한다. 마지막의 H16은 스웨덴 및 노르웨이로부터의 붉은 부리 갈매기로부터 단리된 인플루엔자 A 바이러스에서 최근에야 발견되었다 (문헌 [Fouchier RA, Munster V, Wallensten A, et al. 2005. Characterization of a novel influenza A virus hemagglutinin subtype (H16) obtained from black-headed gulls. J Virol 79:2814-22]). 처음 3종의 헤마글루티닌, 즉 H1, H2 및 H3은 인간 인플루엔자 바이러스에서 발견된다.

조류 바이러스 종 타입 H5 헤마글루티닌에서의 단일 아미노산 변화가 조류 H5N1 바이러스의 수용체 특이성을 유의하게 변경시켜, 상기 바이러스에 인간 인플루엔자 바이러스에 대한 최적의 수용체에 결합하는 능력을 제공할 수 있는 인간 환자에서 발견되었다 (문헌 [Gambaryan, A, A. Tuzikov, G. Pazynina, et al. 2005. Evolution of the receptor binding phenotype of influenza A (H5) viruses. Virology 344:432-8]). 상기 발견은 보통은 인간을 감염시키지 않는 H5N1 바이러스가 어떻게 돌연변이되어 인간 세포를 효과적으로 감염시킬 수 있게 되는지를 설명해주는 것 같다. H5N1 바이러스의 헤마글루티닌은 상기 플루 바이러스 종의 고 병원성과 관련있는데, 이는 단백질분해에 의한 활성형으로의 전환이 용이하기 때문임이 명백하다 (문헌 [Hatta, M., P. Gao. P. Halfmann, et al. 2001. Molecular Basis for High Virulence of Hong Kong H5N1 Influenza A Viruses. Science 293:1840-1842]).

핵산이 HA1 및 HA2 서브유닛을 포함하는 것이 바람직하다. HA는 동종삼량체 내재성 막 당단백질이다. 이것은 실린더형이며, 길이가 대략 135 Å(옹스트롬)이다. HA를 구성하는 3개의 동일한 단량체가 중심 α 나선형 코일로 구조화되고; 3개의 구형 헤드가 시알산 결합 부위를 함유한다. HA 단량체는, 이후에 글리코실화되고 2개의 보다 작은 폴리펩티드: HA1 및 HA2 서브유닛으로 분열되는 전구체로서 합성된다. 각각의 HA 단량체는 HA2에 의해 막에 고정되고 큰 HA1 구체에 의해 토핑된 나선형 장쇄로 이루어진다. HA1 서브유닛이 단독으로 사용되는 것 또한 바람직하다.

추가의 실시양태에서 이종 핵산은 아미노산 1-351, 아미노산 352-500, 아미노산 15-351, 아미노산 120-160, 아미노산 180-230 및 아미노산 120-230으로부터 선택된 아미노산 서열 영역을 코딩하는 서열을 포함한다. 가장 바람직한 아미노산 120-160, 아미노산 180-230 및 아미노산 120-230은 하기와 같다. 더욱 가장 바람직한 영역은 120-160이다. 이종 핵산이 서열 4, 서열 5, 서열 6, 서열 7, 서열 8 및 서열 10으로부터 선택된 아미노산 서열을 코딩하는 것이 가장 바람직하다.

특히 바람직한 실시양태에서 이종 핵산은 (a) 단일 H5N1 종의 서로 다른 유전자 또는 그의 일부 및/또는 (b) 서로 다른 H5N1 종으로부터 유래하는 2개 이상의 서열을 코딩한다. 본 발명에서는 서로 다른 H5N1 종으로부터의 2개 이상, 3개 이상 또는 4개 이상의 HA 서열이 특히 바람직하다. 또한, 2개 이상의 서로 다른 서열이 HA 및 바이러스의 또다른 유전자로부터 유래할 수 있다.

바람직한 실시양태에서 이종 핵산의 서열은 헤마글루티닌 유전자의 서열 또는 서열의 일부, 뉴클레오티드 1-1500 (서열 1)을 포함한다. 보다 바람직한 실시양태에서는 뉴클레오티드 1-1100 (서열 2), 또한 가장 바람직한 실시양태에서는 뉴클레오티드 40-1100 (서열 3)을 포함한다.

바람직한 서열은 뉴라미니다제 (NA)이다. NA는 인플루엔자 바이러스의 표면 상에서 발견되는 항원성 당단백질 효소인 뉴라미니다제를 코딩한다. 이것은 감염된 세포로부터의 자손 바이러스의 방출을 돕는다. NA는 인플루엔자 바이러스-특이적 면역 반응, 즉 다양한 바이러스 변이체 또는 서브타입에 대한 교차-방어에 기여할 수 있는 항체 및 T 세포를 도출하기 위한 가능한 표적 항원으로서 여겨진다. 서열 15 (뉴라미니다제; 베트남/1194/2004)가 특히 바람직하다.

바람직한 서열은 매트릭스 서열이다. 유전자 절편을 코딩하는 매트릭스는 2개의 표면 단백질 (헤마글루티닌 및 뉴라미니다제)과 함께 바이러스의 캡시드 (보호 외피)를 구성하는 매트릭스 단백질 (M1 및 M2)이다. M1은 바이러스 RNA에 결합하는 단백질이다. 서열 13 (M1, 베트남/1194/2004)이 바람직하다.

M2는 바이러스를 둘러싸지 않아 그의 내용물 (8개의 RNA 절편)을 숙주 세포의 세포질에 노출시키는 단백질이다. M2 막횡단 단백질은 효과적인 감염을 위해 필요한 이온 채널이다 (문헌 [Robert B. Couch, Orthomyxoviruses, Baron S. (ed.) in Medical Microbiology, Fourth Edition, The University of Texas Medical Branch at Galveston. 1996. ISBN 0-9631172-1-1]). 몇몇 H5N1 유전자형의 M2에서의 아미노산 치환 (Ser31Asn)은 아만타딘 내성과 관련있다 (문헌 [Guan, Y., L.L. Poon, C.Y. Cheung, et al. 2004. H5N1 influenza: A protean pandemic threat PNAS 108:8156-8161]; 문헌 [Lee, C.-W., D.L. Suarez, T.M. Tumpey, et al. 2005. Characterization of Highly Pathogenic H5N1 Avian Influenza A Viruses Isolated form South Korea. JVirol, 79:3692-3702], 및 [Pandemic Influenza Center for Infectious Disease Research ＆ Policy Academic Health Center - University of Minnesota]). 서열 14 (베트남/1194/2004; M2)가 바람직하다. M1 및 M2는 인플루엔자 바이러스-특이적 면역 반응, 즉 다양한 인플루엔자 바이러스 변이체 또는 서브타입에 대한 교차-방어에 기여할 수 있는 항체 및 T 세포를 도출하기 위한 가능한 표적 항원으로서 여겨진다.

따라서, 한 실시양태에서 2개 이상의 HA 항원이 사용된다. 한 실시양태에서 1개 이상의 HA 항원이 NA, M1 또는 M2와 조합된다. 바람직한 실시양태에서 M1, M2, NA, NP 및 HA가 조합된다. 매우 바람직한 실시양태에서 이들은 서열 11 (NP;홍콩/156/97), 서열 12 (NP; 베트남/1194/04), 서열 13 (M1; 베트남/1194/04), 서열 14 (M2; 베트남/1194/04) 및/또는 서열 15 (NA; 베트남/1194/04)에 의해 코딩된다.

특히 바람직한 실시양태에서 2개 이상의 서열이 헤마글루티닌 또는 헤마글루티닌의 일부를 코딩하고 A/베트남/1203/04, A/베트남/1194/04, 베트남/3046/04, A/인도 기러기/칭하이/1A/2005, A/큰 백조/몽골/244/2005, A/칠면조/터키/1/2005, A/안후이성/1/2005, 및/또는 A/IND/5/05로부터 유래한다.

본 발명의 추가의 측면에서, 본 발명은 이종 핵산을 포함하며, (a) 상기 이종 핵산이 MVA의 게놈내 비-필수 위치로 혼입되고, (b) 상기 이종 핵산이 백시니아 바이러스 프로모터, 또는 오르토폭스바이러스 프로모터, 또는 폭스바이러스-특이적 프로모터의 조절하에 있으며, (c) 상기 이종 핵산이 인플루엔자 A 바이러스 클래스 H5로부터의 유전자 또는 유전자의 일부를 코딩하는 핵산의 군으로부터 선택되는, 재조합 변형된 백시니아 바이러스 안카라 (MVA)에 관한 것이다. 변형된 백시니아 바이러스 안카라 (MVA)는 닭의 세포에 맞게 개조된 백시니아 바이러스 종이다. 동물의 접종시 발견되는 MVA의 비병원성(avirulence) 및 포유동물 기원의 대부분의 세포에서의 상당량의 신규 바이러스 자손들을 생산하는 MVA의 두드러진 결핍 때문에, MVA는 생안전 수준 1의 실험실 조건하에서 사용될 수 있다. MVA는 뚜렷한 부작용 발생 없이 천연두에 대해 백신화된 100,000명 이상의 인간에서 예비면역에 대해 시험되었기 때문에, MVA는 높은 안전 프로파일을 가지고 재조합 유전자의 발현을 위한 효율적인 벡터 바이러스의 기능을 하고 (Sutter, G., and B. Moss. 1992. Nonreplicating vaccinia vector efficiently expresses recombinant genes. PNAS 89:10847-51.), 재조합 백신 후보자의 기능을 한다 (Moss, B., M. W, Carroll, LS. Wyatt, et al. 1996. Host range restricted, non-replicating vaccinia virus vectors as vaccine candidates. Vaccine Adv Exp Med Biol 397:7-13). 몇몇 MVA 벡터 백신은 이미 임상적 평가에 진입되어 있다 ([McConkey, S.J., W.H. Reece, V.S. Moorthy, et al. 2003. Enhanced T-cell immunogenicity of plasmid DNA vaccines boosted by recombinant modified vaccinia virus Ankara in humans. Nat Med 9: 729-35]; [Cosma, A., R. Nagaraj, S. Buehler, et al. 2003, Therapeutic vaccination with MVA-HIV-1 nef elicits Nef-specific T-helper cell responses in chronically HIV-1 infected individuals. Vaccine 22; 21-9]). 가장 최근에, MVA는 천연두에 대한 2세대 백신 후보자로서 재평가된다. 본 발명에 따르면, 본 발명에 따른 이종 핵산은 MVA의 게놈의 비-필수 영역으로 혼입된다. 본 발명에 따르면, 임의의 MVA 종을 사용할 수 있다.

WO 03/097844 A1은 4쪽에 다수의 MVA 종을 개시하고 있다. 본 발명에 따라 사용할 수 있는 한 종은 MVA-BN 종 또는 그의 유도체이다 (WO 02/42480). 본 발명에 따른 비-필수 영역은 (i) 백시니아 바이러스 종 코펜하겐(Copenhagen)의 게놈에 대한 MVA 게놈의 천연 발생 결핍측 또는 (ii) MVA 게놈의 내부 영역으로부터 선택될 수 있다. 용어 "내부 영역"은 바람직하게는 코딩 서열도 조절 서열도 포함하지 않는 2개의 인접 유전자 사이에 위치된 바이러스 게놈의 부분을 의미한다. 그러나, 1개 이상의 세포 배양 시스템, 예를 들어 닭 배아 섬유아세포 (CEF 세포)에서 증폭 및 증식될 수 있는 재조합물을 수득하는 것이 가능한 한, 통합은 바이러스 게놈내의 모든 곳일 수 있다는 본 발명의 범위 내에 속하기 때문에, 본 발명에 따른 이종 핵산의 혼입을 위한 삽입측 (비-필수 영역)은 상기 바람직한 삽입측으로 제한되지 않는다. 따라서, 비-필수 영역은 비-필수 유전자(들)일 수도 있고, 이 유전자의 기능은 MVA의 증식에 사용되는 세포 시스템에 의해 보충될 수 있다.

바람직한 실시양태에서, 이종 핵산은 M1, M2, NA, NP 및 HA를 포함하며, 여기서 M1, M2 및 NA는 결실 II에 위치하고, NP는 결실 VI에 위치하며, HA는 결실 III에 위치한다.

이들은 하기 종: 홍콩/156/97 및 베트남/1194/2004로부터 얻는 것이 가장 바람직하다. 특히 바람직한 실시양태에서, 이들은 서열 11, 12, 13, 14 및 15를 갖는다.

이종 핵산이 H5N1, H5N3, H5N2, H7N7, H3N2 및 H7N3 게놈 서열의 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다.

이종 핵산이 H5N1로부터 얻어지고, A/베트남/1203/04, A/베트남/1194/04, A/베트남/3046/04, A/홍콩/156/97, A/홍콩/212/03, A/홍콩/213/03, A/인도네시아/5/05, A/Ck/인도네시아/BL03/03, A/왜가리/HK/793.1/02, A/붉은 부리 갈매기/HK/12.1/03, A/Dk/베트남/11/04, A/Ck/베트남/33/04, A/Ck/베트남/C-58/04, A/Dk/TH/D4AT/04, A/Gs/TH/G7CS/04, A/Dk/FJ/1734/05, A/Ck/GX/463/06, A/Ck/HK/947/06으로 명명되는 종의 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다.

추가의 실시양태에서, 이종 핵산은 H5N1로부터 얻어지고, A/베트남/1194/04, A/인도네시아/5/2005, A/인도 기러기/칭하이/1A/2005, A/큰 백조/몽골/244/2005, A/칠면조/터키/1/2005, 및 A/안후이성/1/2005로 명명되는 종의 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다.

H5N1의 이종 핵산은 A/베트남/1194/04 종의 것인 것이 가장 바람직하다.

한 실시양태에서, 이종 핵산의 서열은 헤마글루티닌 유전자 (상기 참조)의 서열 또는 서열의 일부를 포함한다. 추가의 실시양태에서, 이종 핵산은 아미노산 1-351, 아미노산 352-500, 아미노산 15-351, 아미노산 120-160, 아미노산 180-230 및 아미노산 120-230으로부터 선택된 아미노산 서열 영역에 대한 서열 코딩을 포함한다. 아미노산 120-160, 아미노산 180-230 및 아미노산 120-230이 가장 바람직하다. 제일 가장 바람직한 영역은 120-160이다.

또한, 마우스의 접종 감염을 위해 제3 H5N1-변이 종을 사용하였다: A/IND/5/0 (이는 다른 2개의 바이러스와 항원면에서 구별됨). 재조합 MVA-HA-HK/97은 고도로 면역원성이었다. 단일 면역화는 이미 인플루엔자 바이러스 A/HK/156/97에 대한 강력한 항체 반응을 유도하였고, 이는 제2 백신화에 의해 추가로 부양되었다. 상기 항체는 HI 및 VN 분석에서 A/VN/1194/04 또는 A/IND/5/05와 교차-반응성이 아니었다. MVA-HA-VN/04는 보다 덜 면역원성이었으나, 2개의 면역화 후 동종 바이러스에 대해서 뿐만 아니라 A/HK/156/97에 대해서 및 (보다 적은 정도로) A/IND/5/05에 대해서도 실질적 항체 반응이 관찰되었다. 관찰된 항체 반응성 패턴은 감염 후 흰족제비(ferret) 혈청으로 관찰된 것과 유사하다. 따라서, MVA-HA 백신화로 유도된 항체로 관찰되는 항체 인식 패턴에서의 이러한 비대칭은 본래의 인플루엔자 바이러스로의 감염 후 유도된 항체로 관찰되는 것과 전체적으로 유사하였다.

전체 바이러스 항원 NIBRG-14 백신 제제는 양성 대조군으로서 실험에 포함되었고, 실험실용 동물에서의 항원-특이적 항체의 생산에 대한 연구에 사용되는 스페콜(Specol)로도 알려진 스티뮨(Stimune; 등록상표) 유중수 애주번트와 함께 고도로 면역원성이었다. 상기 실험 백신은 동종 인플루엔자 바이러스 A/VN/1194/04 뿐만 아니라 다른 2개의 H5N1 종에 대해서도 강한 항체 반응을 유도하였다. HI 및 VN 항체 역가는 접종 감염에 대한 보호와 직접 상관되는 3개의 H5N1 종에 대해 측정하였다.

MVA-HA-HK/97 면역화된 마우스는 단지 동종 접종 감염에 대해서만 보호되었다. 백신화는 바이러스 복제를 완벽하게 예방하였고, 그 결과 조직병리학적 변화도 임상적 신호도 상기 마우스에서는 관찰되지 않았다. MVA-HA-HK/97 유도된 항체가 인플루엔자 바이러스 A/VN/1194/04와 교차-반응하지 않았지만, 상기 바이러스의 복제는 감소되었고 면역화된 동물은 임상적 신호로부터 보호되었다 (표 1).

반대로, 인플루엔자 바이러스 A/IND/5/05로의 접종 감염에 대해서는 보호 효과가 보이지 않았다. MVA 백신화가 보호 (3)에 기여할 수 있는 강한 CTL 반응을 유도할 수 있다고 공지되어 있지만, H-2b 제한된 교차-반응성 CTL 에피토프가 인플루엔자 H5N1 바이러스의 HA 분자상에 존재하는지의 여부는 현재 미지수이다. MVA-HA-VN/04로의 면역화는 동종 종에 대한 불임 면역(sterilizing immunity)을 유도하였다. 또한, 항원면에서 상이한 인플루엔자 바이러스 A/HK/156/97 및 4A/IND/5/05에 대한 강한 보호 효과가 관찰되었다. 이들 바이러스의 복제는 대부분의 면역화된 동물에서 크게 감소하였고, 이는 호흡기에서의 감염된 세포의 부재 및 임상적 신호의 부재와 상관되었다. 상기 보호는 순환계에서 폐포의 상피로 삼출되는 바이러스-중화 HA-특이적 혈장 항체를 바탕으로 할 가능성이 크다 (Ito, R., Y. A. Ozaki, T, Yoshikawa, H. Hasegawa, Y. Sato, Y. Suzuki, R. Inoue, T. Morishima, N. Kondo, T. Sata, T. Kurata, and S. Tamura. 2003. Roles of antihemagglutinin IgA and IgG antibodies in different sites of the respiratory tract of vaccinated mice in preventing lethal influenza pneumonia. Vaccine 21:2362-71).

HA 서열 뿐 아니라 다른 서열도 온전히 존재할 필요는 없다. 이들은 예를 들어 보다 양호하게 발현되기 위하여 코돈 최적화될 수 있다.

본 발명에 따른 재조합 변형된 백시니아 바이러스 안카라 (MVA)의 경우, 핵산은 HA1 및 HA2 서브유닛을 포함하는 것이 바람직하다.

한 실시양태에서, 본 발명에 따른 재조합 변형된 백시니아 바이러스 안카라 (MVA)의 핵산은 (a) 단일 H5N1 종의 상이한 유전자 또는 그의 일부 및/또는 (b) 상이한 H5N1 종으로부터 유래하는 2개 이상의 서열을 코딩한다. 이러한 실시양태는 상기 상세히 요약되어 있다.

바람직한 실시양태에서, 2개 이상의 서열이 헤마글루티닌 또는 헤마글루티닌의 일부를 코딩하며, A/베트남/1203/04, A/베트남/1194/04, A/베트남/3046/04, A/홍콩/156/97, A/홍콩/212/03, A/홍콩/213/03, A/인도네시아/5/05, A/Ck/인도네시아/BL03/03, A/왜가리/HK/793.1/02, A/붉은 부리 갈매기/HK/12.1/03, A/Dk/베트남/11/04, A/Ck/베트남/33/04, A/Ck/베트남/C-58/04, A/Dk/TH/D4AT/04, A/Gs/TH/G7CS/04, A/Dk/FJ/1734/05, A/Ck/GX/463/06 또는 A/Ck/HK/947/06으로부터 유래한다.

한 실시양태에서, 본 발명은 상기 요약된 본 발명에 따른 변형된 백시니아 바이러스 안카라 (MVA)를 코딩하는 핵산에 관한 것이다.

추가의 실시양태에서, 본 발명은 표적 세포를 본 발명에 따른 재조합 MVA로 감염시키는 것을 포함하는, 본 발명에 따른 재조합 MVA를 표적 세포로 도입하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 치료 유효량의 본 발명에 따른 MVA를 면역화가 필요한 인간을 비롯한 살아있는 동물의 신체로 투여하는 것을 포함하는, 인간을 비롯한 살아있는 동물의 신체를 면역화하는 방법에 관한 것이다.

추가의 실시양태에서, 본 발명은 표적 세포를 본 발명에 따른 MVA로 감염시키는 것을 포함하는, 본 발명에 따른 MVA를 표적 세포로 도입하는 방법에 관한 것이다.

바이러스는 표준 방법론에 따라 증식 및 적정된다. 백신 제제를 제조하기 위하여, 바이러스를 수크로스를 통해 초원심분리에 의해 일상적으로 정제하고, 예를 들어 1 mM Tris/HCl (pH 9.0) 중에서 재구성할 수 있다. 토끼 신장 (RK13, ATCC CCL-37™) 세포를 10％ 소 태아 혈청 (FCS)이 보충된 최소 필수 배지 (MEM)에서 성장시키고, 37℃ 및 5％ CO₂에서 유지시킬 수 있다. CEF 세포를 6 웰 조직 배양 플레이트에서 성장시키고, 20 감염다중도 단위의 MVA로 감염시킬 수 있다.

낮거나 높은 다중도 성장 프로파일을 결정하기 위하여, 전면생장(confluent) CEF 단일층 (6 웰 플레이트상에서 성장)은 세포 당 각각 0.05 감염성 단위 (IU) 또는 10 IU MVA 또는 본 발명에 따른 MVA로 감염되어야 한다. 60분 동안 37℃에서의 바이러스 흡수 후, 접종원을 제거해야 한다. 세포는 RPMI 1640으로 2회 세척하고, 37℃의 2％ FCS 및 5％ CO₂를 함유하는 신선한 RPMI 1640 배지로 인큐베이션해야 한다. 감염후 (p.i.) 다수의 시점에서, 감염된 세포를 수확할 수 있고, 동결-해동, 이어서 짧은 초음파처리에 의해 바이러스를 방출시킬 수 있다. 생성된 용균물의 연속 희석물은 2의 복제수(replicate)로서 6 웰 플레이트에서 성장된 전면생장 CEF 단일층에 플레이팅해야 하고, 48시간의 인큐베이션 기간 후 단일층을 빙냉 아세톤:메탄올 (1:1)에서 간단히 고정시킬 수 있고, 세포를 폴리클로날 토끼 항-백시니아 항체 (IgG 분획, 바이오제네시스 엘티디.(Biogenesis Ltd.), 잉글랜드 풀)로 60분 동안 인큐베이션한 후, 호오스래디쉬-퍼옥시다제-접합된 폴리클로날 염소 항-토끼 항체 (다이아노바(Dianova), 함부르크)와 45분 동안 인큐베이션할 수 있다. PBS로 세척한 후, 항체-표지된 세포를 o-다이아니시딘(Dianisidine) (시그마(Sigma), 독일 타우프키르헨) 기질 용액을 사용하여 현상할 수 있고, 염색된 세포의 중심을 계수할 수 있고, 바이러스 역가를 IU/ml로서 계산할 수 있다.

본 발명의 한 실시양태에 따르면, 본 발명은 면역화를 필요로 하는 인간을 비롯한 살아있는 동물의 신체에게 치료 유효량의 본 발명에 따른 MVA를 투여하는 것을 포함하는, 인간을 비롯한 살아있는 동물의 신체를 면역화시키는 방법에 관한 것이다. 상기 본 발명에 따른 방법은 (활성 성분 및 담체 이외에도) 희석제, 통상적인 충전재, 염, 완충제, 안정화제, 가용화제, 및 당업계에 잘 알려져 있는 여타 물질도 함유할 수 있는 조성물을 포함할 수 있다. 이러한 물질은 제약상 허용되는 것일 필요가 있다.

"제약상 허용되는"이란 용어는, 본 발명에 따른 MVA의 생물학적 활성의 효능을 방해하지 않는 무독성 물질을 의미한다. 담체의 특징은 투여 경로에 따라 달라질 것이다. 제약 조성물은 활성을 증진시키거나 치료에 유용한 다른 작용제를 추가로 함유할 수 있다. 이러한 추가적인 인자 및/또는 작용제는, 상승적 효과를 생성하거나 부작용을 최소화시키기 위한 본 발명에 따른 면역화 방법을 위해 적용될 수 있다. 본 발명에 따른 MVA의 제제화 및 투여를 위한 기술은 문헌 ["Remington's Pharmaceutical Sciences" (머크 퍼블리싱 컴퍼니 (Muck Publishing Company), 미국 펜실베이니아주 이스턴, 최신판)]에서 찾아볼 수 있다.

본 발명에 따른 면역화 방법에서는 치료 유효량의 MVA가 사용될 것이다. 치료 유효 용량은 또한, 증상의 완화 (예를 들어, 병태의 치료, 치유, 예방 또는 완화)를 달성하기에 충분한 양의 화합물/활성 성분을 나타낸다. 백신을 제조하기 위해서는, 본 발명에 따라 생성된 MVA 백시니아 바이러스를 생리학상 허용되는 형태로 전환시킨다. 이는 천연두에 대한 백신접종에 사용되는 백신의 제조시에 얻어진 다년간의 경험에 기초하여 수행될 수 있다 (문헌 [Kaplan C. 1969. Immunization against smallpox. Br Med Bull, 25:131-135] 참조). 전형적으로, 2％ 펩톤 및 1％ 인간 알부민의 존재 하에 포스페이트-완충 염수 (PBS) 100 ml 중의 재조합 MVA 약 10⁶ 내지 10⁷개 입자를 앰풀, 바람직하게는 유리 앰풀 내로 동결건조시킨다. 동결건조물은 증량제, 예컨대 만니톨, 덱스트란, 설탕, 글리신, 락토스 또는 폴리비닐피롤리돈, 또는 비경구 투여에 적합한 여타 보조 물질 (예컨대, 항산화제, 안정화제 등)을 함유할 수 있다. 이후, 유리 앰풀을 밀봉하고, 바람직하게는 -20 ℃ 미만의 온도에서 수개월 동안 저장할 수 있다. 백신접종을 위해, 동결건조물을0.1 내지 0.2 ml의 수용액, 바람직하게는 생리 염수에 용해시키고, 예를 들어 피부내 접종에 의해 비경구 투여할 수 있다. 본 발명에 따른 백신은 피부내 주입하는 것이 바람직하다. 약간의 부기 및 붉어짐, 때때로 가려움이 주입 피부면에서 나타날 수 있다. 투여 방식, 투여 용량 및 횟수는 당업자에 의해 공지된 방식으로 최적화될 수 있다. 적절한 경우, 외래 항원에 대한 고수준의 면역 반응을 얻기 위해 장기간에 걸쳐 백신을 수회 투여하는 것이 편리하다. 바람직한 실시양태에서, 면역화는 예방적 및/또는 치료적 면역화일 수 있다.

또한, 본 발명은 백신, 백신이 사전-충전된 주사기, 및 여타 저장 및 적용 방식을 포함하는 백신접종 키트에 관한 것이다.

한 실시양태에서, 살아있는 동물의 신체는 포유동물이고, 한 실시양태의 경우에 이는 새이다. 바람직한 실시양태에서, 상기 살아있는 동물의 신체는 닭 또는 인간이다.

한 실시양태에서, 상기 면역화는 예방적 및/또는 치료적 면역화일 수 있다.

백신 제제

H5N1 바이러스를 MDCK 세포에서 증식시키고, 고순도 RNA 단리 키트 (로셰 (Roche), 네덜란드 알메레)를 이용하여 배양 상층액으로부터 바이러스 RNA를 추출하였다. 이어서, 수퍼스크립트 (Superscript) 역전사효소 (인비트로젠 (Invitrogen), 미국 캘리포니아주 칼즈배드) 및 프라이머로서의 5'-AGCAAAAGCAGG-3' (서열 9) 올리고뉴클레오티드 (유로젠텍 (Eurogentec), 벨기에 세라잉)를 사용하여 vRNA로부터 cDNA를 합성하였다. 그 다음, Pfu (피로코쿠스 푸리오수스 (Pyrococcus furiosus), 스트라타젠 (Stratagene), 미국 캘리포니아주 라 욜라)를 열안정성 DNA 중합효소로서 사용하는 중합효소 연쇄 반응에 의해 HA 유전자 서열을 증폭시켰다. 클로닝 플라스미드인 pBluescriptSK+ (스트라타젠, 미국 캘리포니아주 라 욜라)로의 방향성 클로닝을 용이하게 하기 위해, 프라이머 서열을 NotI 및 XhoI 제한 부위와 함께 확장시켰다.

이들 플라스미드로부터 NotI/XhoI 분해에 의해 HA 유전자 서열을 마련하고, 클레노우 (Klenow) 중합효소로 처리하여 블런트 말단을 생성하고, MVA 발현 플라스 미드 pIIIΔHR-PsynII의 PmeI 부위 내로 클로닝하여 MVA 벡터 플라스미드인 pIII-HA-HK/97 및 pIII-HA-VN/04를 생성하였다.

MVA-감염 세포의 형질감염시, 상기 플라스미드는 외래 유전자가 MVA 게놈내의 결실 부위 III으로 삽입되도록 유도하고 (문헌 [Sutter, G., and B. Moss. 1992. Nonreplicating vaccinnia vector efficiently expresses recombinant genes. PNAS 89:10847-51] 참조), 백시니아 바이러스-특이적 프로모터 PsynII의 조절 하에 HA 표적 유전자의 전사가 가능하게 한다 (문헌 [Wyatt, L.S., P.L. Earl, J.Y. Liu, et al. 2004. AIDS Res Hum Retr 20:645-653] 참조). 1 ㎍ 플라스미드 DNA 형질감염, 0.05 감염 유닛/세포 MVA 단리물 F6 감염 (문헌 [Sutter, G., and B. Moss. 1992. Nonreplicating vaccinia vector efficiently expresses recombinant genes. PNAS 89:10847-51] 참조), 및 RK-13 세포 상에서의 플라크 선별 (문헌 [Staib, C., I. Drexler, and G. Sutter. 2004. Construction and isolation of recombinant MVA. Methods Mol Biol 269:77-100] 참조)에 의해 1차 닭 배아 섬유아세포 (CEF)에서 재조합 바이러스 MVA-HA-HK/97 및 MVA-HA-VN/04를 생성하였다. 재조합 MVA 게놈을 PCR에 의해 분석하여 HA 유전자 삽입 및 유전자 안정성을 확인하였다 (데이타는 주어지지 않음). MVA-HA-HK/97 또는 MVA-HA-VN/04 감염 후에 다양한 시점에서 수거된 CEF 세포 용해물의 웨스턴 블롯 (Western blot) 분석에 의해, MVA 벡터 바이러스에 의한 HA 항원의 생성을 확인하였다 (데이타는 주어지지 않음). CEF에서의 1단계 및 다단계 성장 분석에 따르면, 비-재조합 MVA와 비교시 유사 내지 동일한 MVA-HA-HK/97 및 MVA-HA-VN/04의 복제 능력이 나타났 다 (데이타는 주어지지 않음).

백신 제제를 생성하기 위해, 바이러스를 CEF에서 증폭시키고, 수크로스를 통한 한외여과에 의해 정제하고, 1 mM Tris/HCl (pH 9.0) 중에서 재구성하였다. MVA 백신을 10⁸ PFU의 용량 (100 ㎕ PBS 중에 희석됨)으로 사용하였다.

불활성화된 전 (whole) NIBRG-14 바이러스, 즉 역유전학에 의해 제조된 인플루엔자 바이러스 A/베트남/1194/04에 기초한 재교배 (reassortant) 백신 스트레인을 양성 대조군으로서 사용하였다. 동결건조된 전 바이러스 항원을 증류수 중에서 2 ㎍ HA/50 ㎕의 농도로 재구성하고, 애주번트인 스티뮨 (Stimune, 등록상표) (세디-다이아그노스틱스 (Cedi-Diagnostics), 네덜란드 렐리스타트)과 1:1 혼합하였다. 대조군 마우스에 PBS를 접종시켰다.

인플루엔자 바이러스

인플루엔자 바이러스인 A/HK/156/97, A/VN/1194/04 및 A/인도네시아/5/05 (A/IND/5/05)를 배란 11일차 부화계란의 요막강에 접종시켰다. 3일 후에 요막액을 수거하였다. 선행 문헌에 기재된 바와 같은 마딘-다비 개 신장 (Madin-Darby Canine Kidney, MDCK) 세포에서 감염성 바이러스 역가를 측정하였다 (문헌 [Rimmelzwaan, G. F., M. Baars, E. C. Claas, et al. 1998. Comparison of RNA hybridization, hemagglutination assay, titration of infectious virus and immunofluorescence as methods for monitoring influenza virus replication in vitro. J Virol Methods 4:57-66] 참조).

마우스

생후 6 내지 8주의 특정한 무병원체 암컷 C57BL/6J 마우스를 찰스 리버 (Charles River) (독일 술츠펠트)로부터 구입하였다. 동물들 (n=90)을 5개 군 (군 당 18마리의 마우스)으로 나누고, PBS, MVA-HA-HK/97, MVA-HA-VN/04, wtMVA, 또는 스티뮨 (등록상표)이 애주번트로 첨가된 NIBRG-14로 면역화시켰다.

근육내 투여에 의해 면역화를 수행하였다 (왼쪽 뒷다리: 50 ㎕, 오른쪽 뒷다리: 50 ㎕). 4주 후, 오비탈 천자에 의해 혈액을 채취하고, 상기 기재된 바와 같이 동물을 다시 면역화시켰다. 추가 4주 후, 혈액을 채취하고, 5개의 백신 군 (n=18)을 각각, 동물 6마리씩의 3개 아군으로 나눴다.

각 백신 군의 아군에 10³ TCID₅₀의 인플루엔자 바이러스 A/HK/156/97, A/VN/1194/04 또는 A/IND/5/05 (50 ㎕ PBS 중)를 비내 경로에 의해 접종하였다. 6마리의 비-면역화 동물을 음성 대조군으로서 사용하였고, 이들에는 50 ㎕ PBS를 접종하였다. 감염 후 4일까지 매일 동물의 체중을 측정한 후, 방혈에 의해 희생시켰다.

마우스를 희생시킨 후, 다음과 같은 기관을 절제하였다: 뇌, 폐 (포르말린으로 팽창시킴), 비장 및 장 (intestine). 모든 군의 동물은 접종 감염의 시점에서 적절하게 연령을 매칭시켰다.

실험 프로토콜은 실험 시작 전에 독립적인 동물 윤리 위원회의 승인을 받았다. 근육내 면역화, 비내 감염, 오비탈 천자 사용 및 안락사는 흡입용 이소플루란 을 이용한 마취 하에 수행하였다. 동물들은 필터-탑 (filter-top) 우리에 수용하였고, 음식 및 물에 자유롭게 접근하도록 하였다. H5N1 인플루엔자 바이러스 감염의 5일 동안, 동물들은 생물안전 3등급 격납 시설의 필터-탑 우리 내에 넣었다. 바이러스 당 하나의 BSL-3 격리 설비를 사용하였다.

기관 조직에서의 바이러스 역가

기관을 드라이 아이스 상에서 에탄올과 함께 급냉시키고, -70 ℃에서 저장하였다. 기관을 수송 매질 (행크스 (Hanks) 매질 (MEM), 글리세롤, 100 U/ml 페니실린, 100 ㎍/ml 스트렙토마이신, 폴리믹신 (polymyxin) B, 니스타틴 (nystatin), 젠타마이신, 7.5％ NaHCO₃, 1 M Hepes) 중에서 폴리트론 (Polytron) 균질화기 (키네마티카 아게 (Kinematica AG), 스위스 리타우-루체른)로 균질화시켰다. 이들 샘플의 10배 연속 희석액 (5벌)을 사용하여 마딘-다비 개 신장 세포 (MDCK 세포)의 전면배양층 (confluent layer) 상에서 바이러스 역가를 측정하였다.

혈청학

콜레라 여액으로 처리하고 56℃에서 열-불활성화시킨 후, 항-HA 항체가 존재하는지에 대해 혈청을 시험하였다. 이를 위해 1％ 칠면조 적혈구 및 인플루엔자 바이러스 A/HK/156/97, A/VN/1194/04 또는 A/IND/5/05의 4개의 HA-유닛을 이용하는 표준 프로토콜에 따라 혈구응집 억제 검정법 (HI)을 이용하였다 (문헌 [Palmer, D. F., M. T. Coleman, W. R. Dowdle, et al. 1975. Advanced laboratory techniques for influenza diagnosis, p. 51-52. In Immunology series No. 6, United States Department of Health, Education and Welfare, Washington, D.C]). 이를 위해 염기성 절단 부위를 제거하는 것으로부터 역유전(reverse genetics) 바이러스를 제조하였다. 이러한 역유전 바이러스를 이용하여, 수득한 역가를 야생형 종에 대한 것과 비교하였다 (데이터는 나타내지 않음). 또한, 각 바이러스의 100 TCID₅₀을 이용하는 극소 바이러스 중화 (VN) 검정법을 이용하여 3종의 인플루엔자 바이러스에 대해 특이적인 바이러스 중화 항체가 존재하는지에 대해 혈청을 시험하였다 (문헌 [Frank, A. L., J. Puck, B. J. Hughes, et al. 1980. Microneutralization test for influenza A and B and parainfluenza 1 and 2 viruses that uses continuous cell lines and fresh serum enhancement. J Clin Microbiol 12:426-32]). 불활성화된 H5N2 인플루엔자 바이러스 A/Duck/Potsdam/1402/86 (네덜란드 복스미어 소재의 인터벳(Intervet))으로 2회 면역시킨 백조에서 수득한 고면역 혈청을 3종의 상이한 인플루엔자 A 바이러스에 대한 양성 대조군으로 이용하였다.

조직병리학

포르말린으로 팽창시킨 폐를 10％ 중성 완충 포르말린 중에서 고정시키고, 파라핀에 매입시키고, 4 ㎛로 절단하고, 조직 평가를 위해 헤마톡실린 및 에오신으로 염색하였다. 추가로, 인플루엔자 A 바이러스의 핵단백질에 대한 단일클론성 항체 (클론 HB65 IgG2a (미국 미생물 보존 센터))를 이용하여 면역과산화효소 방법으로 슬라이드를 염색하였다. 2차 항체로서는 염소-항-마우스 IgG2a HRP (미국 알라바마주 버밍햄 소재의 서던 바이오테크(Southern Biotech))를 이용하였다. 기질로 서 디아미노벤지딘을 이용하여, 과산화효소가 인플루엔자 A에 감염된 세포의 핵에 암적색 침전을 야기하고 세포질을 덜 진한 적색으로 염색시킴을 밝혀내었다. 절편들을 헤마톡실린으로 대조염색시켰다.

통계학적 분석

스튜던트의 t 양측 시험을 이용하여 바이러스 역가 및 항체 역가에 대한 데이터를 분석하였고, P < 0.05를 차이가 유의한 것으로 보았다.

임상 징후

감염 이틀 후부터, PBS 또는 wtMVA로 면역시킨 마우스에서 감염에 사용된 인플루엔자 H5N1 바이러스에 관계없이 구부러진 자세, 빠른 호흡, 물결모양 털(ruffled fur), 및 근육 강도의 감소와 같은 임상 징후들이 나타났다. 이러한 임상 징후들은 MVA-HA-HK/97 또는 MVA-HA-VN/04로 백신화한 후 인플루엔자 바이러스 A/HK/156/97 또는 A/VN/1194/04로 감염시킨 마우스에서는 관찰되지 않았다. MVA-HA-VN/04 백신화는 또한 인플루엔자 바이러스 A/IND/5/05의 감염에 의해 유발되는 임상 징후의 발생을 막았다. 임상 징후에 대해 관찰되는 보호는 감염된 이후의 체중 손실의 감소와 관련이 있었다 (도 1). PBS 및 wtMVA로 면역시킨 마우스에서, 평균 체중 손실이 인플루엔자 바이러스 A/HK/156/97로 감염시킨 이후에는 16.2％ 및 11.5％ (도 1A), 또는 인플루엔자 바이러스 A/VN/1194/04로 감염시킨 이후에는 16.9％ 및 10.4％ (도 1B)로 각각 관찰되었다. 이러한 체중 손실은 MVA-HA-HK/97 또는 MVA-HA-VN/04에 의한 백신화에 의해 유의하게 감소되었다 (도 1). 또한, 인플루엔자 바이러스 A/IND/5/05에 의한 감염 (도 1C)은 PBS로 면역시킨 대조 군 마우스 또는 wtMVA로 백신화한 마우스에서 심각한 체중 손실을 야기하였고 (각각 16.9％ 및 18.6％), 이는 MVA-HA-HK/97이 아닌 MVA-HA-VN/04로 백신화하는 것에 의해 유의하게 감소되었다.

기관 내 바이러스 복제

인플루엔자 바이러스 A/HK/156/97 (도 2A), A/VN/1194/04 (도 2B) 또는 A/IND/5/05 (도 2C)로 감염시킨 후 4일째 되는 날 감염성 바이러스의 역가를 뇌, 장, 폐, 및 비장에서 측정하였다.

PBS 접종 마우스를 보호하지 않고 각각 인플루엔자 바이러스 A/HK/156/97, A/VN/1194/04 또는 A/IND/5/05로 감염시킨데 대해, 감염 후 폐에서 평균 폐 바이러스 역가 10^7.9, 10^7.8 및 10^8.9 TCID₅₀/조직(그램)의 가장 높은 바이러스 복제가 관찰되었다. 또한, wtMVA로 백신화한 마우스를 보호하지 않았고, 감염된 마우스의 폐에서 유사한 평균 바이러스 역가가 관찰되었다. 양 그룹의 비보호 마우스의 일부에서는, 뇌, 장, 및 비장을 비롯한 호흡기 이외의 조직에서의 바이러스 복제를 밝혀낼 수 있었다 (표 1).

표 1은 감염성 바이러스의 검출 및 개별 마우스에서 관찰된 체중 손실을 보여준다. 실험과 무관한 복잡성으로 인한 치사로 인해 그룹 개체수는 6마리 미만이었다.

<표 1>

접종 감염에 사용된 바이러스

A/HK/156/97

A/VN/1194/04

A/IND/5/05

백신 그룹

> 10％

> 10％

10％

뇌

장

폐

비장

체중손실

뇌

장

폐

비장

체중손실

뇌

장

폐

비장

체중손실

wtMVA

1/6

1/6

6/6

4/6

5/6

2/6

0/6

6/6

3/6

4/6

2/6

2/6

6/6

4/6

5/6

MVA-HA-HK/97

0/4

0/4

0/4

0/4

0/4

0/6

1/6

6/6

1/6

1/6

0/6

0/6

6/6

0/6

4/6

MVA-HA-VN/04

2/6

0/6

2/6

0/6

0/6

0/6

0/6

0/6

0/6

0/6

0/6

0/6

2/6

0/6

0/6

NIBRG-14

0/6

0/6

0/5

0/6

0/6

0/6

0/6

0/6

0/6

0/6

0/6

0/6

0/6

0/6

0/6

PBS

0/6

0/6

5/5

3/6

4/5

3/5

2/5

5/5

3/6

5/5

0/6

3/6

6/6

4/6

6/6

MVA-HA-HK/97에 의한 백신화는 폐 및 다른 기관에서의 인플루엔자 바이러스 A/HK/156/97의 복제를 완벽하게 막았지만, MVA-HA-VN/04에 의한 백신화로 폐에서 바이러스 복제 감소가 6마리 중 4마리의 마우스에서 관찰되었다.

인플루엔자 바이러스 A/VN/1194/04에 의한 접종 감염 이후에는, 이와 달리 MVA-HA-VN/04에 의한 백신화가 복제를 완벽하게 막는 반면, MVA-HA-HK/97에 의한 백신화는 단지 부분적으로만 바이러스 복제를 감소시켰다.

이러한 감소는 PBS를 접종한 마우스에 비해 통계적으로 유의했고 (p < 0.05), wtMVA로 백신화한 마우스에서는 그러한 차이가 관찰되지 않았다.

MVA-HA-VN/04에 의한 백신화는 또한 6마리 중 4마리의 마우스의 폐에서 인플루엔자 바이러스 A/IND/5/05의 복제를 막아 PBS 및 wtMVA로 백신화한 마우스에 비해 평균 폐 역가를 감소시켰다. MVA-HA-HK/97에 의한 백신화는 인플루엔자 바이러스 A/IND/5/05의 복제를 막지 못했고, 6마리 마우스 모두 양성으로 나타났다 (상기 표 1 참조). 스티뮨(Stimune; 등록상표)이 애주번트화된 불활성화된 전바이러스 백신 NIBRG-14에 의한 백신화는 동종의 인플루엔자 바이러스 A/VN/1194/04의 복제 뿐만 아니라, A/HK/156/97 및 A/IND/5/05의 복제도 막았다.

혈청학

MVA-HA-HK/97에 의한 단일 백신화로 마우스는 동종의 바이러스 종에 대해서는 강한 항체 반응을 나타내었지만, HI 및 VN 시험에서 측정된 바와 같이 항체는 인플루엔자 바이러스 종 A/VN/1194/04 또는 A/IND/5/05와 교차반응하지 않았다 (도 3) (각각 GMT 1629 및 239). 추가 백신화 이후에, HI- 및 VN-검정에서의 동종 항체 역가는 각각 1370 및 744 GMT였다. 역시, 다른 H5N1 종과의 어떤 교차반응도 관찰되지 않았다. MVA-HA-VN/04 백신 제제는 면역원성이 덜했고, 한 마리에서 단 한번의 백신화 이후에 동종의 종에 대한 항체가 VN-검정에서 검출가능하였다. 추가 백신화에 모든 동물들이 반응하였고, HI 및 VN 검정으로 측정하였을때 GMT가 각각 20 및 64로 증가되었다. MVA-HA-VN/04 백신화에 의해 유도된 항체는 H5N1 종인 A/HK/156/97와 교차반응하였고, A/IND/5/05 종과 한정된 범위까지 교차반응하였다. 양성 대조군으로서 실험에 포함된 보강된 NIBRG-14 백신 제제는 동종의 A/VN/1194/04에 대해 확고한 항체 반응을 유도하였고, HI 및 VN 검정 모두에서 A/HK/156/97 및 A/IND/5/05 종과 교차반응하였다.

폐에서의 병리학적 변화 및 바이러스 복제

3종의 HPAI 바이러스 중 어느 것으로 감염시킨 후 4일째 되는 날, 마우스를 희생시켜 폐를 포르말린으로 팽창시키고, 조직학적으로 그리고 면역조직화학을 이용하여 검사하였다. wtMVA 및 PBS로 면역시킨 마우스를 인플루엔자 바이러스 A/홍콩/156/97으로 접종시키는 것은, 적은 기관지주위 침윤 및 적은 세기관지 벽의 괴 사와 함께, 세기관지 및 허파꽈리 상피의 다병소성(multifocal) 감염을 야기하였다 (도 4A, E). MVA-HA-HK/97 및 MVA-HA-VN/04로 면역시킨 마우스의 폐에서, 감염 후 4일째 되는 날에 어떤 바이러스도 검출되지 않았고 어떤 조직병리학적 변화도 관찰되지 않았다 (도 4B, C). 인플루엔자 바이러스 A/VN/1194/04의 감염은 PBS 및 wtMVA로 면역시킨 마우스 모두에서 기관지주위 및 허파꽈리 상피의 더 심한 다병소성 감염을 유발하였다 (도 AF, J). 또한 이들 마우스는 세기관지 상피의 유실, 심한 기관지주위의 침윤, 및 허파꽈리의 손상을 기초로 하는 중등도의 간질성 폐렴을 앓았다. MVA-HA-HK/97로 면역시킨 마우스의 허파꽈리 상피의 감염은 덜한 것으로 보이나, 허파꽈리 침윤은 보다 두드러졌다 (도 4G). MVA-HA-VN/04로 면역시킨 마우스의 폐에서는, 어떤 바이러스 복제도 검출되지 않았고 형태가 정상이었다 (도 4H). 인플루엔자 바이러스 A/IND/5/05에 의한 감염은 wtMVA, PBS, 및 MVA-HA-HK/97로 면역시킨 마우스에서 세기관지 및 허파꽈리 상피 모두의 광범위한 감염을 야기하였다 (도 4K, L, O). 또한, 세기관지 및 허파꽈리 모두에서 중등도의 침윤이 관찰됨에 이어, 세기관지 상피가 유실되고 세기관지 내부 세포 잔해가 존재함이 관찰되었다. MVA-HA-VN/04로 감염시킨 마우스는 중등도의 기관지주위 침윤과 함께 소수의 기관지주위 인플루엔자 바이러스 A/IND/5/05에 감염된 세포를 가졌다 (도 4M). 보강된 NIBRG-14로 면역시킨 마우스의 폐는 3종의 인플루엔자 H5N1 바이러스 중 어느 것으로 감염시킨 이후에도 정상이었고 어떤 바이러스 복제도 관찰되지 않았다 (도 4D, I, N).

도면의 설명

도 1

10³ TCID_5O의 인플루엔자 바이러스 A/홍콩/156/97 (A), A/베트남/1194/04 (B), 또는 A/인도네시아/5/05 (C)로 비내 감염된 마우스의 체중 손실. 평균 체중 손실은 감염 전 원래 체중의 백분율로서 표시한다. (^*)는 (p < 0.05)에서 통계적으로 유의한 차이를 나타낸다.

도 2

인플루엔자 바이러스 A/홍콩/156/97 (A), A/베트남/1194/04 (B), 또는 A/인도네시아/5/05 (C)로의 감염 후 4 일의 시점에서 기관 조직에서의 바이러스 역가. 결과는 wtMVA, MVA-HA-HK/97, MVA-HA-VN/04, 스티뮨(Stimune; 등록상표)-애주번트화 NI BRG 14 및 PBS 면역화된 마우스에 대하여 나타낸다. 역가는 뇌 (

), 장 (

), 폐 (

) 및 비장 (

)에서 측정하였으며, 조직 그램 당 TCID50 (Log10)으로서 나타낸다. (^*)는 시험된 한마리 이상의 동물이 표시된 기관에서 양성임을 나타낸다.

도 3

백신화에 의해 유도된 항체 반응. 세가지 접종 바이러스에 대한 항체 역가: 인플루엔자 바이러스 A/홍콩/156/07 (

), A/베트남/1194/04 (

) 및 A/인도네시아/5/05 (

)는 HI-검정 (A+B)에 의해 측정되었다. 제1 면역화 (A) 후 28 일 및 제2 면역화 (B) 후 28 일. 역가는 GMT (Log 2)로서 나타낸다. 다음, 세가지 상이한 접종 바이러스에 대한 항체 역가: 인플루엔자 바이러스 A/홍콩/156/07 (

), A/베트남/1194/04 (

) 및 A/인도네시아/5/05 (

)는 VN-검정 (C+D)에 의해 측정되었다. 제1 면역화 (C) 및 제2 면역화 (D) 후 28 일. 역가는 GMT (Log 2)로서 나타낸다.

도 4

도면에 나타낸 바와 같은 인플루엔자 바이러스 A/홍콩/157/97, A/베트남/1194/04 또는 A/인도네시아/5/05로 감염된 마우스의 폐 내의 세기관지 및 폐포의 조직병리학 및 면역조직화학. 인플루엔자 바이러스 A/홍콩/156/97 감염은 wtMVA (A) 및 PBS 면역화된 마우스 (E)의 세기관지 벽에서는 적은 세기관지 주위 침윤물과 함께 바이러스 양성 세포를 초래하였지만, MVA-HA-HK/97 (B), MVA-HA-VN/04 (C) 및 스티뮨(Stimune; 등록상표)-애주번트화 NIBRG-14 (D) 면역화된 마우스의 폐에서는 바이러스가 검출되지 않았다. 인플루엔자 바이러스 A/베트남/1194/04로의 감염은 wtMVA (F), MVA-HA-HK/97 (G) 및 PBS (J) 면역화된 마우스의 세기관지 벽에서 또한 중등도의 세기관지 주위 침윤물과 함께 (PBS 면역화된 마우스는 제외함) 바이러스 양성 세포를 초래한다. MVA-HA-VN/04 (H) 및 스티뮨(등록상표)-애주번트화 N1BRG-14 면역화된 마우스 (I)에서는 바이러스 복제 또는 형태학적 변화가 검출되지 않았다. 인플루엔자 바이러스 A/인도네시아/5/05의 접종은 중등도의 세기관지 주위 침윤물과 함께 wtMVA (K), MVA-HA-HK/97 (L) 및 PBS (O) 면역화된 마우스의 세기관지의 심한 감염을 일으켰다. 반면, MVA-HA-VN/04 (M) 면역화된 마우스의 세기관지 벽에서는 중등도의 침윤물과 함께 최소량의 세포만이 감염되었다. 인플루엔자 바이러스 A/인도네시아/5/05로의 감염 후 스티뮨(등록상표)-애주번트화 NIBRG-14 (N) 면역화된 마우스의 폐에서는 바이러스가 검출되지 않았다.

도 5

본 발명에 따른 재조합 MVA의 구성

백시니아 프로모터의 조절 하에 유전자를 MVA 전달 벡터 pIIIΔHR로 도입한 후, 플랭킹 영역 (플랭크 1 및 플랭크 2)의 상동성 재조합에 의해 유전자를 MVA 게놈의 결실 III으로 삽입하였다. 재조합 바이러스의 선별은 숙주 범위 유전자 K1L의 발현에 의해 수행하였다.

도 6

다가 MVA-H5N1 백신에 대한 구성의 개요도

H5N1-항원 코딩 서열을 다음과 같이 MVA 게놈에 도입하였다: A/베트남/1194/2004 (H5N1 아형)의 매트릭스 단백질 (M1)-, 이온 채널 단백질 (M2)- 및 뉴라미니다제 (NA)- 유전자 서열을 백시니아 특이적 프로모터 P7.5, PmH5, P11의 전사 조절하에 놓인 결실 II의 부위로 표적화하였다. A/베트남/1194/2004 및 A/홍콩/156/97 (이들은 모두 H5N1 아형임)의 핵단백질 (NP) 유전자 서열을 PmH5 프로모터에 의해 조절하고, MVA 게놈의 결실 IV에 도입하였다 (세부사항에 대해서는 도 7을 참조한다). A/베트남/1194/2004 및 A/홍콩/156/97 (이들은 모두 H5N1 아형임)의 헤마글루티닌 유전자 서열을 백시니아 프로모터 PsynII의 조절하의 결실 III의 부위로 삽입하였다.

도 7

두가지 상이한 MVA-H5N1-NP 백신의 구성

MVA 전달 벡터 플라스미드 pVIdHR-NP-VN04 또는 pVIdHR-NP-HK97로부터의 DNA로 MVA 감염된 세포를 형질감염시켜 재조합 바이러스 MVA-NP-VN04 및 MVA-NP-HK97을 생성시켰다. 플랭킹 영역 (플랭크 VI₁ 및 플랭크 VI₂)을 이용한 결실 VI의 부위로의 상동성 재조합 에 의해 NP 유전자를 MVA 게놈에 통합시킨다. 숙주 범위 유전자 K1L의 일시적 발현을 이용한 성장 선별에 의해 재조합 바이러스를 단리하였다.

도 8

재조합 MVA-H5N1-NP 바이러스의 다단계 성장 분석

인플루엔자 바이러스 A/홍콩/156/97 (MVA-NP-HK97) 또는 A/베트남/1194/04 (MVA-NP-VN04)로부터의 NP 유전자를 보유하는 재조합 MVA를, 닭 배아 섬유아세포 (CEF)의 배양물 중의 복제능에 대하여 분석하였다. 상기 두가지 재조합 바이러스의 성장능 및 성장속도는 비-재조합 MVA (wtMVA)에 대해 측정된 것들에 가장 필적하였다.

도 9

MVA-H5N1-NP 구조물에 의한 NP-항원의 발현

MVA-NP-HK/97 및 MVA-NP-VN04 재조합 바이러스로 CEF를 감염시켰을 때 인플루엔자 바이러스 핵단백질의 합성을 확인하였다. A/푸에르토리코(PuertoRico)/08/34 (아형 H1N1)를 함유하는 요막액(allantoic fluid) 및 모의 감염된 CEF는 대조군 역할을 하였다. 인플루엔자 바이러스 핵단백질에 대해 지시되는 마우스 모노클로날 항체 HB-65 (ATGC-번호 HB-65)를 사용해서 NP 단백질을 검 출하였다.

SEQUENCE LISTING <110> Paul-Ehrlich Institut Paul-Ehrlich-Institut <120> Recombinant modified vaccinia virus Ankara (MVA)-based vaccine for the avian flu <130> N 1249 PCT BLN <160> 15 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 1500 <212> DNA <213> Avian influenza virus (H5N1) <400> 1 atggagaaaa tagtgcttct ttttgcaata gtcagtcttg ttaaaagtga tcagatttgc 60 attggttacc atgcaaacaa ctcgacagag caggttgaca caataatgga aaagaacgtt 120 actgttacac atgcccaaga catactggaa aagacacaca atgggaagct ctgcgatcta 180 gatggagtga agcctctaat tttgagagat tgtagtgtag ctggatggct cctcggaaac 240 ccaatgtgtg acgaattcat caatgtgccg gaatggtctt acatagtgga gaaggccaat 300 ccagtcaatg acctctgtta cccaggggat ttcaatgact atgaagaatt gaaacaccta 360 ttgagcagaa taaaccattt tgagaaaatt cagatcatcc ccaaaagttc ttggtccagt 420 catgaagcct cattgggggt gagctcagca tgtccatacc agggaaagtc ctcctttttc 480 agaaatgtgg tatggcttat caaaaagaac agtacatacc caacaataaa gaggagctac 540 aataatacca accaagaaga tcttttggta ctgtggggga ttcaccatcc taatgatgcg 600 gcagagcaga caaagctcta tcaaaaccca accacctata tttccgttgg gacatcaaca 660 ctaaaccaga gattggtacc aagaatagct actagatcca aagtaaacgg gcaaagtgga 720 aggatggagt tcttctggac aattttaaaa ccgaatgatg caatcaactt cgagagtaat 780 ggaaatttca ttgctccaga atatgcatac aaaattgtca agaaagggga ctcaacaatt 840 atgaaaagtg aattggaata tggtaactgc aacaccaagt gtcaaactcc aatgggggcg 900 ataaactcta gcatgccatt ccacaatata caccctctca ccatcgggga atgccccaaa 960 tatgtgaaat caaacagatt agtccttgcg actgggctca gaaatagccc tcaaagagag 1020 agaagaagaa aaaagagagg attatttgga gctatagcag gttttataga gggaggatgg 1080 cagggaatgg tagatggttg gtatgggtac caccatagca acgagcaggg gagtgggtac 1140 gctgcagaca aagaatccac tcaaaaggca atagatggag tcaccaataa ggtcaactcg 1200 attattgaca aaatgaacac tcagtttgag gccgttggaa gggaatttaa caacttagaa 1260 aggagaatag agaatttaaa caagaagatg gaagacgggt tcctagatgt ctggacttat 1320 aatgctgaac ttctagttct catggaaaac gagagaactc tagactttca tgactcaaat 1380 gtcaagaacc tttacgacaa ggtccgacta cagcttaggg ataatgcaaa ggagctgggt 1440 aacggttgtt tcgagttcta tcataaatgt gataatgaat gtatggaaag tgtaagaaac 1500 <210> 2 <211> 1100 <212> DNA <213> Avian influenza virus (H5N1) <400> 2 atggagaaaa tagtgcttct ttttgcaata gtcagtcttg ttaaaagtga tcagatttgc 60 attggttacc atgcaaacaa ctcgacagag caggttgaca caataatgga aaagaacgtt 120 actgttacac atgcccaaga catactggaa aagacacaca atgggaagct ctgcgatcta 180 gatggagtga agcctctaat tttgagagat tgtagtgtag ctggatggct cctcggaaac 240 ccaatgtgtg acgaattcat caatgtgccg gaatggtctt acatagtgga gaaggccaat 300 ccagtcaatg acctctgtta cccaggggat ttcaatgact atgaagaatt gaaacaccta 360 ttgagcagaa taaaccattt tgagaaaatt cagatcatcc ccaaaagttc ttggtccagt 420 catgaagcct cattgggggt gagctcagca tgtccatacc agggaaagtc ctcctttttc 480 agaaatgtgg tatggcttat caaaaagaac agtacatacc caacaataaa gaggagctac 540 aataatacca accaagaaga tcttttggta ctgtggggga ttcaccatcc taatgatgcg 600 gcagagcaga caaagctcta tcaaaaccca accacctata tttccgttgg gacatcaaca 660 ctaaaccaga gattggtacc aagaatagct actagatcca aagtaaacgg gcaaagtgga 720 aggatggagt tcttctggac aattttaaaa ccgaatgatg caatcaactt cgagagtaat 780 ggaaatttca ttgctccaga atatgcatac aaaattgtca agaaagggga ctcaacaatt 840 atgaaaagtg aattggaata tggtaactgc aacaccaagt gtcaaactcc aatgggggcg 900 ataaactcta gcatgccatt ccacaatata caccctctca ccatcgggga atgccccaaa 960 tatgtgaaat caaacagatt agtccttgcg actgggctca gaaatagccc tcaaagagag 1020 agaagaagaa aaaagagagg attatttgga gctatagcag gttttataga gggaggatgg 1080 cagggaatgg tagatggttg 1100 <210> 3 <211> 1061 <212> DNA <213> Avian influenza virus (H5N1) <400> 3 gttaaaagtg atcagatttg cattggttac catgcaaaca actcgacaga gcaggttgac 60 acaataatgg aaaagaacgt tactgttaca catgcccaag acatactgga aaagacacac 120 aatgggaagc tctgcgatct agatggagtg aagcctctaa ttttgagaga ttgtagtgta 180 gctggatggc tcctcggaaa cccaatgtgt gacgaattca tcaatgtgcc ggaatggtct 240 tacatagtgg agaaggccaa tccagtcaat gacctctgtt acccagggga tttcaatgac 300 tatgaagaat tgaaacacct attgagcaga ataaaccatt ttgagaaaat tcagatcatc 360 cccaaaagtt cttggtccag tcatgaagcc tcattggggg tgagctcagc atgtccatac 420 cagggaaagt cctccttttt cagaaatgtg gtatggctta tcaaaaagaa cagtacatac 480 ccaacaataa agaggagcta caataatacc aaccaagaag atcttttggt actgtggggg 540 attcaccatc ctaatgatgc ggcagagcag acaaagctct atcaaaaccc aaccacctat 600 atttccgttg ggacatcaac actaaaccag agattggtac caagaatagc tactagatcc 660 aaagtaaacg ggcaaagtgg aaggatggag ttcttctgga caattttaaa accgaatgat 720 gcaatcaact tcgagagtaa tggaaatttc attgctccag aatatgcata caaaattgtc 780 aagaaagggg actcaacaat tatgaaaagt gaattggaat atggtaactg caacaccaag 840 tgtcaaactc caatgggggc gataaactct agcatgccat tccacaatat acaccctctc 900 accatcgggg aatgccccaa atatgtgaaa tcaaacagat tagtccttgc gactgggctc 960 agaaatagcc ctcaaagaga gagaagaaga aaaaagagag gattatttgg agctatagca 1020 ggttttatag agggaggatg gcagggaatg gtagatggtt g 1061 <210> 4 <211> 337 <212> PRT <213> Avian influenza virus (H5N1) <400> 4 Lys Ser Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Glu 1 5 10 15 Gln Val Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ala Gln 20 25 30 Asp Ile Leu Glu Lys Thr His Asn Gly Lys Leu Cys Asp Leu Asp Gly 35 40 45 Val Lys Pro Leu Ile Leu Arg Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp Leu Leu 50 55 60 Gly Asn Pro Met Cys Asp Glu Phe Ile Asn Val Pro Glu Trp Ser Tyr 65 70 75 80 Ile Val Glu Lys Ala Asn Pro Val Asn Asp Leu Cys Tyr Pro Gly Asp 85 90 95 Phe Asn Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Leu Ser Arg Ile Asn His 100 105 110 Phe Glu Lys Ile Gln Ile Ile Pro Lys Ser Ser Trp Ser Ser His Glu 115 120 125 Ala Ser Leu Gly Val Ser Ser Ala Cys Pro Tyr Gln Gly Lys Ser Ser 130 135 140 Phe Phe Arg Asn Val Val Trp Leu Ile Lys Lys Asn Ser Thr Tyr Pro 145 150 155 160 Thr Ile Lys Arg Ser Tyr Asn Asn Thr Asn Gln Glu Asp Leu Leu Val 165 170 175 Leu Trp Gly Ile His His Pro Asn Asp Ala Ala Glu Gln Thr Lys Leu 180 185 190 Tyr Gln Asn Pro Thr Thr Tyr Ile Ser Val Gly Thr Ser Thr Leu Asn 195 200 205 Gln Arg Leu Val Pro Arg Ile Ala Thr Arg Ser Lys Val Asn Gly Gln 210 215 220 Ser Gly Arg Met Glu Phe Phe Trp Thr Ile Leu Lys Pro Asn Asp Ala 225 230 235 240 Ile Asn Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr 245 250 255 Lys Ile Val Lys Lys Gly Asp Ser Thr Ile Met Lys Ser Glu Leu Glu 260 265 270 Tyr Gly Asn Cys Asn Thr Lys Cys Gln Thr Pro Met Gly Ala Ile Asn 275 280 285 Ser Ser Met Pro Phe His Asn Ile His Pro Leu Thr Ile Gly Glu Cys 290 295 300 Pro Lys Tyr Val Lys Ser Asn Arg Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg 305 310 315 320 Asn Ser Pro Gln Arg Glu Arg Arg Arg Lys Lys Arg Gly Leu Phe Gly 325 330 335 Ala <210> 5 <211> 149 <212> PRT <213> Avian influenza virus (H5N1) <400> 5 Ile Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Gln Gly Met Val Asp Gly Trp 1 5 10 15 Tyr Gly Tyr His His Ser Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp 20 25 30 Lys Glu Ser Thr Gln Lys Ala Ile Asp Gly Val Thr Asn Lys Val Asn 35 40 45 Ser Ile Ile Asp Lys Met Asn Thr Gln Phe Glu Ala Val Gly Arg Glu 50 55 60 Phe Asn Asn Leu Glu Arg Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Met Glu 65 70 75 80 Asp Gly Phe Leu Asp Val Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu 85 90 95 Met Glu Asn Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn 100 105 110 Leu Tyr Asp Lys Val Arg Leu Gln Leu Arg Asp Asn Ala Lys Glu Leu 115 120 125 Gly Asn Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Glu Cys Met 130 135 140 Glu Ser Val Arg Asn 145 <210> 6 <211> 41 <212> PRT <213> Avian influenza virus (H5N1) <400> 6 Leu Leu Ser Arg Ile Asn His Phe Glu Lys Ile Gln Ile Ile Pro Lys 1 5 10 15 Ser Ser Trp Ser Ser His Glu Ala Ser Leu Gly Val Ser Ser Ala Cys 20 25 30 Pro Tyr Gln Gly Lys Ser Ser Phe Phe 35 40 <210> 7 <211> 111 <212> PRT <213> Avian influenza virus (H5N1) <400> 7 Leu Leu Ser Arg Ile Asn His Phe Glu Lys Ile Gln Ile Ile Pro Lys 1 5 10 15 Ser Ser Trp Ser Ser His Glu Ala Ser Leu Gly Val Ser Ser Ala Cys 20 25 30 Pro Tyr Gln Gly Lys Ser Ser Phe Phe Arg Asn Val Val Trp Leu Ile 35 40 45 Lys Lys Asn Ser Thr Tyr Pro Thr Ile Lys Arg Ser Tyr Asn Asn Thr 50 55 60 Asn Gln Glu Asp Leu Leu Val Leu Trp Gly Ile His His Pro Asn Asp 65 70 75 80 Ala Ala Glu Gln Thr Lys Leu Tyr Gln Asn Pro Thr Thr Tyr Ile Ser 85 90 95 Val Gly Thr Ser Thr Leu Asn Gln Arg Leu Val Pro Arg Ile Ala 100 105 110 <210> 8 <211> 51 <212> PRT <213> Avian influenza virus (H5N1) <400> 8 Tyr Asn Asn Thr Asn Gln Glu Asp Leu Leu Val Leu Trp Gly Ile His 1 5 10 15 His Pro Asn Asp Ala Ala Glu Gln Thr Lys Leu Tyr Gln Asn Pro Thr 20 25 30 Thr Tyr Ile Ser Val Gly Thr Ser Thr Leu Asn Gln Arg Leu Val Pro 35 40 45 Arg Ile Ala 50 <210> 9 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 9 agcaaaagca gg 12 <210> 10 <211> 351 <212> PRT <213> Avian influenza virus <400> 10 Met Glu Lys Ile Val Leu Leu Phe Ala Ile Val Ser Leu Val Lys Ser 1 5 10 15 Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Glu Gln Val 20 25 30 Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ala Gln Asp Ile 35 40 45 Leu Glu Lys Thr His Asn Gly Lys Leu Cys Asp Leu Asp Gly Val Lys 50 55 60 Pro Leu Ile Leu Arg Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn 65 70 75 80 Pro Met Cys Asp Glu Phe Ile Asn Val Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Val 85 90 95 Glu Lys Ala Asn Pro Val Asn Asp Leu Cys Tyr Pro Gly Asp Phe Asn 100 105 110 Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Leu Ser Arg Ile Asn His Phe Glu 115 120 125 Lys Ile Gln Ile Ile Pro Lys Ser Ser Trp Ser Ser His Glu Ala Ser 130 135 140 Leu Gly Val Ser Ser Ala Cys Pro Tyr Gln Gly Lys Ser Ser Phe Phe 145 150 155 160 Arg Asn Val Val Trp Leu Ile Lys Lys Asn Ser Thr Tyr Pro Thr Ile 165 170 175 Lys Arg Ser Tyr Asn Asn Thr Asn Gln Glu Asp Leu Leu Val Leu Trp 180 185 190 Gly Ile His His Pro Asn Asp Ala Ala Glu Gln Thr Lys Leu Tyr Gln 195 200 205 Asn Pro Thr Thr Tyr Ile Ser Val Gly Thr Ser Thr Leu Asn Gln Arg 210 215 220 Leu Val Pro Arg Ile Ala Thr Arg Ser Lys Val Asn Gly Gln Ser Gly 225 230 235 240 Arg Met Glu Phe Phe Trp Thr Ile Leu Lys Pro Asn Asp Ala Ile Asn 245 250 255 Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys Ile 260 265 270 Val Lys Lys Gly Asp Ser Thr Ile Met Lys Ser Glu Leu Glu Tyr Gly 275 280 285 Asn Cys Asn Thr Lys Cys Gln Thr Pro Met Gly Ala Ile Asn Ser Ser 290 295 300 Met Pro Phe His Asn Ile His Pro Leu Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys 305 310 315 320 Tyr Val Lys Ser Asn Arg Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Ser 325 330 335 Pro Gln Arg Glu Arg Arg Arg Lys Lys Arg Gly Leu Phe Gly Ala 340 345 350 <210> 11 <211> 1542 <212> DNA <213> Avian influenza virus (H5N1) <400> 11 agcaaaagca gggtagataa tcactcactg agtgacatca acatcatggc gtctcaaggc 60 accaaacgat cttatgaaca gatggaaact ggtggagaac gccagaatgc cactgagatc 120 agggcatccg ttggaagaat ggttggtgga attgggaggt tttacataca gatgtgcact 180 gaactcaaac tcagcgacca ggaaggaagg ttgatccaga acagtataac aatagagaga 240 atggttctct ctgcatttga tgaaaggagg aacaggtacc tagaggaaca tcccagtgcg 300 gggaaggacc cgaagaagac cggaggtcca atctaccgaa gaagagacgg gaaatgggtg 360 agagagctga ttctgtatga caaagaggag ataaggagaa tttggcgcca agcgaacaat 420 ggagaagacg caactgctgg tctcactcac atgatgatct ggcattccaa cctaaatgat 480 gccacatacc agagaacaag agccctcgtg cggactggaa tggaccccag aatgtgctct 540 ctgatgcaag gatcaaccct cccgaggaga tctggagctg ctggtgcagc aataaaggga 600 gtcgggacga tggtaatgga actaattcgg atgataaagc gaggcattaa tgaccggaac 660 ttctggagag gcgagaatgg acgaagaaca aggattgcat atgagagaat gtgcaacatc 720 ctcaaaggga aatttcaaac ggcagcacaa aaagcaatga tggatcaggt gcgagaaagc 780 agaaatcctg ggaatgctga aattgaagat ctcatttttc tggcacggtc tgcactcatc 840 ctgagaggat ccgtagccca taagtcctgc ttgcctgctt gtgtgtacgg actcgctgtg 900 gccagtggat atgattttga gagggaaggg tactctctgg ttgggataga tcctttccgt 960 ctgcttcaga acagtcaggt cttcagtctc attagaccaa aagagaattc agcacataaa 1020 agtcaattgg tatggatggc atgccattct gcagcatttg aggacctgag agtctcaagt 1080 ttcattagag gaacaagagt aatcccaaga ggacaactat ccactagagg agttcagatt 1140 gcttcaaatg agaacgtgga agcaatggac tccagcactc ttgaactgag aagcagatat 1200 tgggctataa ggaccaggag tggaggaaac accaaccaac agagagcatc tgcaggacaa 1260 atcagtgtac agcccacttt ctcagtacag agaaatcttc ccttcgaaag agtgaccatt 1320 atggccgcgt ttaaggggaa taccgagggc agaacatctg acatgaggac tgaaatcata 1380 agaatgatgg aaagtgccag accagaagat gtgtctttcc aggggcgggg agtcttcgag 1440 ctctcagacg aaaaggcaac gaacccgatc gtgccttcct ttgacatgag taatgaagga 1500 tcttatttct tcggagacaa tgcagaggaa tatgacaatt ga 1542 <210> 12 <211> 1496 <212> DNA <213> Avian influenza virus (H5N1) <400> 12 atggcgtctc aaggcaccaa acgatcttat gaacagatgg aaactggtgg ggaacgccag 60 aatgctactg agatcagggc atctgttggg agaatggtta gtggcattgg gaggttctac 120 atacagatgt gcacagaact caaactcagt gactatgaag ggaggctgat ccagaacagc 180 ataacaatag agagaatggt actctctgca tttgatgaaa gaaggaacag atacctggaa 240 gaacacccca gtgcgggaaa ggacccgaag aagactggag gtccaattta tcggaggaga 300 gacgggaaat gggtgagaga gctaattctg tacgacaaga ggagatcagg aggatttggc 360 gtcaagcgaa caatggagag gacgcaactg ctggtcttac ccacctgatg atatggcatt 420 ccaatctaaa tgatgccaca tatcagagaa cgagagctct agtgcgtact ggaatggacc 480 caaggatgtg ctctctgatg caagggtcaa ctctcccgag gagatctgga gctgccggtg 540 cagcagtaaa gggggtaggg acaatggtga tggagctgat tcggatgata aaacgaggga 600 tcaacgacgc caatttctgg agaggcgaaa atggaagaag aacaaggatt gcatatgaga 660 gaatgtgcaa catccttaaa gggaaattcc aaacagcagc acaaagagca atgatggatc 720 aagtgcgaga gagcagaaat cctgggaatg ctgaaattga agatctcatt tttctggcac 780 ggtctgcact catcctgaga ggatcagtgg cccataagtc ctgcttgcct gcttgtgtgt 840 acggacttgc agtggccagt ggatatgact ttgagagaga agggtactct ctggttggaa 900 tagatccttt ccgcctgctt caaaacagcc aggtctttag tctcattaga ccaaatgaga 960 atccagcaca taagagtcaa ttagtgtgga tggcatgcca ctctgcagca tttgaggacc 1020 ttagagtctc aagtttcatc agagggacaa gagtggtccc aagaggacag ctatccacca 1080 gaggggttca aattgcttca aatgagaaca tggaggcaat ggactccaac actcttgaac 1140 tgagaagcag atattgggct ataagaacca gaagcggagg aaacaccaac cagcagaggg 1200 catctgcagg acagatcagc gttcagccca ctttctcggt acagagaaac cttcccttcg 1260 aaagagcgac cattatggca gcatttacag gaaatactga gggcagaacg tctgacatga 1320 ggactgaaat cataagaatg atggaaagtg ccagaccaga agatgtgtca ttccaggggc 1380 ggggagtctt cgagctctcg gacgaaaagg caacgaaccc gatcgtgcct tcctttgaca 1440 tgaataatga aggatcttat ttcttcggag acaatgcaga ggagtatgac aattaa 1496 <210> 13 <211> 759 <212> DNA <213> Avian influenza virus (H5N1) <400> 13 atgagtcttc taaccgaggt cgaaacgtac gttctctcta tcatcccgtc aggccccctc 60 aaagccgaga tcgcgcagaa acttgaagat gtctttgcag gaaagaacac cgatctcgag 120 gctctcatgg agtggctaaa gacaagacca atcctgtcac ctctgactaa agggattttg 180 ggatttgtat tcacgctcac cgtgcccagt gagcgaggac tgcagcgtag acgctttgtc 240 cagaatgccc taaatggaaa tggagatcca aataatatgg atagggcagt taagctatat 300 aagaagctga aaagagaaat aacattccat ggggctaagg aggtcgcact cagctactca 360 accggtgcac ttgccagttg catgggtctc atatacaaca ggatgggaac ggtgaccacg 420 gaagtggctt ttggcctagt gtgtgccact tgtgagcaga ttgcagattc acagcatcgg 480 tctcacagac agatggcaac tatcaccaac ccactaatca gacatgagaa cagaatggtg 540 ctggccagca ctacagctaa ggctatggag cagatggcgg gatcaagtga gcaggcagcg 600 gaagccatgg agatcgctaa tcaggctagg cagatggtgc aggcaatgag gacaattggg 660 actcatccta actctagtgc tggtctgaga gataatcttc ttgaaaattt gcaggcctac 720 cagaaacgaa tgggagtgca gatgcagcga ttcaagtga 759 <210> 14 <211> 982 <212> DNA <213> Avian influenza virus (H5N1) <400> 14 atgagtcttc taaccgaggt cgaaacgtac gttctctcta tcatcccgtc aggccccctc 60 aaagccgaga tcgcgcagaa acttgaagat gtctttgcag gaaagaacac cgatctcgag 120 gctctcatgg agtggctaaa gacaagacca atcctgtcac ctctgactaa agggattttg 180 ggatttgtat tcacgctcac cgtgcccagt gagcgaggac tgcagcgtag acgctttgtc 240 cagaatgccc taaatggaaa tggagatcca aataatatgg atagggcagt taagctatat 300 aagaagctga aaagagaaat aacattccat ggggctaagg aggtcgcact cagctactca 360 accggtgcac ttgccagttg catgggtctc atatacaaca ggatgggaac ggtgaccacg 420 gaagtggctt ttggcctagt gtgtgccact tgtgagcaga ttgcagattc acagcatcgg 480 tctcacagac agatggcaac tatcaccaac ccactaatca gacatgagaa cagaatggtg 540 ctggccagca ctacagctaa ggctatggag cagatggcgg gatcaagtga gcaggcagcg 600 gaagccatgg agatcgctaa tcaggctagg cagatggtgc aggcaatgag gacaattggg 660 actcatccta actctagtgc tggtctgaga gataatcttc ttgaaaattt gcaggcctac 720 cagaaacgaa tgggagtgca gatgcagcga ttcaagtgat cctattgttg ttgccgcaaa 780 tatcattggg atcttgcact tgatattgtg gattcttgat cgtcttttct tcaaatgcat 840 ttatcgtcgc cttaaatacg gtttgaaaag agggcctgct acggcagggg tacctgagtc 900 tatgagggaa gagtaccggc aggaacagca gagtgctgtg gatgttgacg atggtcattt 960 tgtcaacata gaattggagt aa 982 <210> 15 <211> 1350 <212> DNA <213> Avian influenza virus (H5N1) <400> 15 atgaatccaa atcagaagat aataaccatc ggatcaatct gtatggtaac tggaatagtt 60 agcttaatgt tacaaattgg gaacatgatc tcaatatggg tcagtcattc aattcacaca 120 gggaatcaac accaatctga accaatcagc aatactaatt tgcttactga gaaagctgtg 180 gcttcagtaa aattagcggg caattcatct ctttgcccca ttaacggatg ggctgtatac 240 agtaaggaca acagtataag gatcggttcc aagggggatg tgtttgttat aagagagccg 300 ttcatctcat gctcccactt ggaatgcaga actttctttt tgactcaggg agccttgctg 360 aatgacaagc actccaatgg gactgtcaaa gacagaagcc ctcacagaac attaatgagt 420 tgtcctgtgg gtgaggctcc ctccccatat aactcaaggt ttgagtctgt tgcttggtca 480 gcaagtgctt gccatgatgg caccagttgg ttgacaattg gaatttctgg cccagacaat 540 ggggcggtgg ctgtattgaa atacaatggc ataataacag acactatcaa gagttggagg 600 aacaacatac tgagaactca agagtctgaa tgtgcatgtg taaatggttc ttgctttact 660 gtaatgactg acggaccaag taatggtcag gcatcacata agatcttcaa aatggaaaaa 720 gggaaagtgg ttaaatcagt cgaattggat gctcctaatt atcactatga ggaatgctcc 780 tgttatcctg atgccggcga aatcacatgt gtgtgcaggg ataattggca tggttcaaat 840 cggccatggg tatctttcaa tcaaaatttg gagtatcaaa taggatatat atgcagtgga 900 gttttcggag acaatccacg ccccaatgat ggaacaggta gttgtggtcc ggtgtcctct 960 aacggggcag gtggggtaaa agggttttca tttaaatacg gcaatggtgt ctggatcggg 1020 agaaccaaaa gcactaattc caggagcggc ttcgaaatga tttgggatcc aaatgggtgg 1080 actgaaacgg acagcagctt ttcagtgaaa caagatatcg tagcaataac tgattggtca 1140 ggatatagcg ggagttttgt ccagcatcca gagctgacag gactagattg cataagacct 1200 tgtttctggg ttgagttgat cagagggcgg cccaaagaga gcacaatttg gactagtggg 1260 agcagcatat ctttttgtgg tgtaaatagt gacactgtgg gttggtcttg gccagacggt 1320 gctgagttgc cattcaccat tgacaagtag 1350

Claims (23)

1. 인플루엔자 A 바이러스 클래스(class) H5 항원에서 서열이 유래하는 이종 핵산을 포함하는 재조합 변형된 백시니아 바이러스 안카라 (MVA)의 약물, 특히 백신의 제조에 있어서의 용도.
2. 제1항에 있어서, 이종 핵산이 MVA의 게놈내의 비-필수 위치로 혼입되는 것인 용도.
3. 제2항에 있어서, 이종 핵산이 결실 III의 부위에서 MVA 게놈내로 혼입되는 것인 용도.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 이종 핵산이 백시니아 바이러스-, 또는 오르토폭스바이러스-, 또는 폭스바이러스-특이적 프로모터의 조절하에 있는 것인 용도.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 이종 핵산의 서열이 H5N1, H5N3, H5N2, H5N7, H7N1, H7N7, H7N3, 및 H9N2 서열의 군으로부터 선택되는 것인 용도.
6. 제5항에 있어서, 이종 핵산의 서열이 H5N1로부터 유래하며 A/베트 남(Vietnam)/1203/04, A/베트남/1194/04, A/베트남/3046/04, A/홍콩(Hongkong)/156/97, A/홍콩/212/03, A/홍콩/213/03, A/인도네시아(Indonesia)/5/05, A/Ck/인도네시아/BL03/03, A/왜가리(Grey heron)/HK/793.1/02, A/붉은 부리 갈매기(Black Headed Gull)/HK/12.1/03, A/Dk/베트남/11/04, A/Ck/베트남/33/04, A/Ck/베트남/C-58/04, A/Dk/TH/D4AT/04, A/Gs/TH/G7CS/04, A/Dk/FJ/1734/05, A/Ck/GX/463/06, A/Ck/HK/947/06으로 명명된 종(strain)들의 군으로부터 선택되는 것인 용도.
7. 제6항에 있어서, H5N1의 이종 핵산의 서열이 A/베트남/1194/04, A/인도네시아/5/2005, A/인도 기러기(Bar headed goose)/칭하이(Qinghai)/1A/2005, A/큰 백조(Whooper swan)/몽골(Mongolia)/244/2005, A/칠면조/터키(Turkey)/1/2005, 및 A/안후이성(Anhui)/1/2005 종의 것인 용도.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 이종 핵산의 서열이 헤마글루티닌 유전자의 뉴클레오티드 1 내지 1500, 뉴클레오티드 1 내지 1100, 또는 뉴클레오티드 40 내지 1100의 서열 또는 서열의 일부를 포함하는 것인 용도.
9. 제6항 또는 제7항에 있어서, 핵산이 HA1 및 HA2 서브유닛을 포함하는 것인 용도.
10. 제6항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산이

    a. 단일 H5N1 종의 여러 유전자들 또는 이들의 일부 및/또는

    b. 여러 H5N1 종들

    로부터 유래하는 둘 이상의 서열을 코딩하는 것인 용도.
11. 제10항에 있어서, 둘 이상의 서열이 헤마글루티닌 또는 헤마글루티닌의 일부를 코딩하며 A/베트남/1203/04, A/베트남/1194/04, 베트남/3046/04, A/인도 기러기/칭하이/1A/2005, A/큰 백조/몽골/244/2005, A/칠면조/터키/1/2005, 및 A/안후이성/1/2005, 및/또는 A/IND/5/05로부터 유래하는 것인 용도.
12. 이종 핵산을 포함하며, 여기서

    a. 이종 핵산이 MVA의 게놈내의 비-필수 위치로 혼입되고,

    b. 이종 핵산이 백시니아 바이러스 프로모터, 또는 오르토폭스바이러스 프로모터, 또는 폭스바이러스-특이적 프로모터의 조절하에 있으며,

    c. 이종 핵산이 인플루엔자 A 바이러스 클래스 H5로부터의 유전자 또는 유전자의 일부를 코딩하는 핵산의 군으로부터 선택되는 것인,

    재조합 변형된 백시니아 바이러스 안카라 (MVA).
13. 제12항에 있어서, 이종 핵산이 H5N1, H5N3, H5N2, H5N7, H7N1, H7N7, H7N3, 및 H9N2 게놈 서열의 군으로부터 선택되는 것인 재조합 변형된 백시니아 바이러스 안카라 (MVA).
14. 제13항에 있어서, 이종 핵산이 H5N1로부터 유래하며 A/베트남/1203/04, A/베트남/1194/04, A/베트남/3046/04, A/홍콩/156/97, A/홍콩/212/03, A/홍콩/213/03, A/인도네시아/5/05, A/Ck/인도네시아/BL03/03, A/왜가리/HK/793.1/02, A/붉은 부리 갈매기/HK/12.1/03, A/Dk/베트남/11/04, A/Ck/베트남/33/04, A/Ck/베트남/C-58/04, A/Dk/TH/D4AT/04, A/GS/TH/G7CS/04, A/Dk/FJ/1734/05, A/Ck/GX/463/06, A/Ck/HK/947/06으로 명명된 종들의 군으로부터 선택되는 것인 재조합 변형된 백시니아 바이러스 안카라 (MVA).
15. 제14항에 있어서, H5N1의 이종 핵산이 A/베트남/1194/04, A/인도네시아/5/2005, A/인도 기러기/칭하이/1A/2005, A/큰 백조/몽골/244/2005, A/칠면조/터키/1/2005, 및 A/안후이성/1/2005 종들로부터 선택되는 것인 재조합 변형된 백시니아 바이러스 안카라 (MVA).
16. 제15항에 있어서, 이종 핵산의 서열이 헤마글루티닌 유전자의 서열 또는 서열의 일부를 포함하는 것인 재조합 변형된 백시니아 바이러스 안카라 (MVA).
17. 제16항에 있어서, 핵산이 HA1 및 HA2 서브유닛을 포함하는 것인 재조합 변형된 백시니아 바이러스 안카라 (MVA).
18. 제12항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산이

    a. 단일 H5N1 종의 여러 유전자들 또는 이들의 일부 및/또는

    b. 여러 H5N1 종들

    로부터 유래하는 둘 이상의 서열을 코딩하는 것인 재조합 변형된 백시니아 바이러스 안카라 (MVA).
19. 제18항에 있어서, 둘 이상의 서열이 헤마글루티닌 또는 헤마글루티닌의 일부를 코딩하며 A/베트남/1203/04, A/베트남/1194/04, A/베트남/3046/04, A/홍콩/156/97, A/홍콩/212/03, A/홍콩/213/03, A/인도네시아/5/05, A/Ck/인도네시아/BL03/03, A/왜가리/HK/793.1/02, A/붉은 부리 갈매기/HK/12.1/03, A/Dk/베트남/11/04, A/Ck/베트남/33/04, A/Ck/베트남/C-58/04, A/Dk/TH/D4AT/04, A/Gs/TH/G7CS/04, A/Dk/FJ/1734/05, A/Ck/GX/463/06 및 A/Ck/HK/947/06으로부터 유래하는 서열로부터 선택되는 것인 재조합 변형된 백시니아 바이러스 안카라 (MVA).
20. 제12항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 변형된 백시니아 바이러스 안카라 (MVA)를 코딩하는 핵산.
21. 표적 세포를 제16항 내지 제25항 중 어느 한 항에 따른 재조합 MVA로 감염시키는 것을 포함하는, 제12항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 재조합 MVA를 표적 세포에 도입하는 방법.
22. 면역화를 필요로 하는 인간을 비롯한 살아있는 동물의 신체에 치료 유효량의 제16항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 MVA를 투여하는 것을 포함하는, 인간을 비롯한 살아있는 동물의 신체를 면역화하는 방법.
23. 제22항에 있어서, 면역화가 예방적 및/또는 치료적일 수 있는 것인 방법.

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