KR20130110948A

KR20130110948A - 광범위한 인플루엔자 바이러스의 감염을 방어할 수 있는 ｔ―세포 기반 유니버설 플루 백신

Info

Publication number: KR20130110948A
Application number: KR1020120033317A
Authority: KR
Inventors: 윤진원; 권지선; 윤정순; 김연정; 윤엽
Original assignee: 재단법인 목암생명공학연구소
Priority date: 2012-03-30
Filing date: 2012-03-30
Publication date: 2013-10-10
Also published as: KR101382244B1; US8685409B2; US20130259886A1

Abstract

본 발명은 예측할 수 없는 인플루엔자 유행에 대비하기 위한 광범위한 인플루엔자 변종에 대한 방어가 가능한 내부 유전자를 포함하는 T-세포 기반 유니버설 플루 백신을 제공한다. 본 발명은 상기 T-세포 기반 유니버설 플루 백신을 개발하기 위해 조류, 돼지 및 인간 인플루엔자 분리주(isolates)로부터 획득한 공통서열(consensus sequence)의 내부 유전자(internal gene)를 선정하였다. 선정한 내부 유전자는 NP(서열번호 1), PA(서열번호 3), PB1(서열번호 5), PB2(서열번호 7), 및 M1(서열번호 9)이다. 본 발명은 상기 내부 유전자 5종을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 T-세포 기반 유니버설 플루 백신을 제공한다. 따라서 본 발명에 따른 T-세포 기반 유니버설 플루 백신은 복수 개의 내부유전자를 포함할 뿐만 아니라 내부유전자의 전체서열을 그대로 사용함으로써 하나 이상의 CTL 항원결정 부위를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 T-세포 기반 유니버설 플루 백신을 마우스 모델에 예방 접종시킨 후 PR8 및 HPAI H5N1 바이러스 등의 감염으로부터 100 LD₅₀으로 성공적인 방어를 확인하였다. 또한, 면역학적으로 거리가 먼 유행성 신종 플루 H1N1(Cal/04/09) 바이러스의 감염에 있어서도 부분적인 방어가 된다는 것은 교차방어에 있어서 우세한 면역원성을 보이는 NP 항원결정부위(epitope)에 대한 T-세포 반응뿐 아니라 PA 항원결정부위에 대한 T-세포 반응도 중요한 역할을 했음을 시사한다. 따라서 본 발명의 T-세포 기반 유니버설 플루 백신은 이질아형(heterosubtypic) 인플루엔자 바이러스 감염에 있어서 광범위한 방어가 가능한 것이다.

Description

광범위한 인플루엔자 바이러스의 감염을 방어할 수 있는 Ｔ―세포 기반 유니버설 플루 백신{Broad protective efficacy of T cell-based universal influenza vaccine}

본 발명은 예측할 수 없는 인플루엔자 유행에 대비할 수 있는 광범위한 이질아형(heterosubtypic)의 인플루엔자 바이러스 감염을 방어할 수 있는 T-세포 기반 유니버설 플루 백신에 관한 것이다.

20세기 이후, 인플루엔자 전염병은 엄청난 수의 희생자를 낳았다(Nat Immunol 7, 449-455, 2006). 글로벌 인플루엔자 감시 네트워크(GISN)의 계절 인플루엔자 대처를 위한 전략으로 다음해 계절에 유행할 변종을 예측하는 것은 가능하였지만, 예측한 백신주와 다음해 유행주가 불일치하거나, 또는 일치한다고 하더라도 재조합백신주를 대량으로 생산하는 것이 불가능할 수 있는 불확실성이 여전히 남아있다. 2003년부터 2004년까지 유행하였던 A/Panama/2007/99 백신주의 변이체인 Fujian 주의 유행으로 인하여 그전까지 9명이던 연평균 소아사망률이 다음해에는 153명으로 급증하였다 (N Engl J Med 350, 218-220, 2004). 이는 예측한 백신 후보주와 유행주가 어긋난 대표적인 사례라고 할 수 있다. 불행히도, 인플루엔자 백신을 제조하는데 있어서, 기존에 알려진 유정란을 이용한 (egg-based) 제조 공정으로는 위와 같은 단점을 극복하는 것이 불가능하였다.

스페인 독감(Spanish flu)은 전례 없는 극단적인 독성으로 인하여 사망률이 높았던 악명 높은 사례이다. 이러한 스페인 독감과 병원성이 유사한 고병원성 가금 인플루엔자 (Highly pathogenic avian influenza : HPAI) H5N1이 등장함으로 인하여 미래에 유행할 전염병 준비가 매우 어렵고 불가능하다는 사실을 부각시켰다 (Nature 437,889-893, 2005). 글로벌 인플루엔자 감시 네트워크 (GISN)는 2004년 이후 H5N1의 역학 조사를 시작하였고, 정기적으로 백신 분리주를 업데이트 하고 있다. 대부분의 백신 제조업체는 글로벌 인플루엔자 감시 네트워크(GISN)의 예측 관점에 맞춰 H5N1 대유행 전기백신(prepandemic vaccine)을 개발하고 있으며, 현재 이것이 유일한 방안으로만 알려져 있다.

2009년 신종 플루 H1N1(pandemic H1N1) 및 고 병원성 가금 인플루엔자 (Highly pathogenic avian influenza: HPAI) H5N1으로부터 미래에 고병원성 및 고전염성 재조합 인플루엔자 바이러스(reassortant)가 출현할 것이라는 우려를 가지게 되었다. 결국 광범위하게 바이러스 감염으로부터 보호할 수 있는 유니버설 인플루엔자 백신만이 궁극적인 해답이 될 것이다. 유니버설 독감 백신에 대한 유망한 타겟으로는 M2 단백질을 제안한 연구가 있었다(Nat Med 5, 1157-1163,1999). M2 단백질은 바이러스에 감염된 세포 표면에 상당한 수준으로 발현되기 때문에, 바이러스 감염된 세포를 제거하기 위한 세포 매개 면역에 있어서, 어느 정도 한계가 있긴 하지만 항-M2 항체를 사용하여 고 병원성 인플루엔자 바이러스에 의해 유도된 질병 또는 사망을 방지할 수 있었다.

또한 M2의 면역원성을 증가시키기 위한 보조제, 유사바이러스 입자(virus-like particle; VLP) 또는 불활성 계절 독감 백신과 조합한 형태 등이 부각되고 있다.

최근 들어, 인플루엔자 바이러스의 고 보존된(highly conserved) HA 줄기(hemagglutinin stem) 영역이 관심을 끌고 있으며, 상대적으로 보존된 (relatively conserved) HA 줄기가 광범위하게 바이러스를 중화(neutralization)시킬 수 있는 매력적인 타겟으로 관심받고 있으며, 여러 그룹에서 이를 이용하여 이질적 인플루엔자에 대항하는 새로운 백신 연구를 시행하고 있다. 그렇지만, 직접적인 중화항체가 아니라는 점에서 항-HA 줄기 항체는 항-M2 항체와 유사하게 상대적으로 낮은 중화 활성을 가지고 있어서, 방어를 목적으로 하는 항체 매개 세포 면역에서 다른 방어협력 수단이 있지 않고서는 공격 접종 용량이 낮은 경우에 대해서만 효과적이다. 상업적으로 성공한 사례가 없었음에도 불구하고 T-세포 기반 백신에 대한 다양한 접근을 시도하여 왔다. HIV와 HCV백신에 관한 최근 연구는 고 가변 (highly variable) 바이러스에 대한 방어시 광범위하고 활발한 T 세포 면역을 유도하기 위해 여러가지 유망한 항원 전달 수단들을 제시하였다. 클리블랜드에서 실시하였던 1957년 아시아 독감의 역사적 사건에 대한 연구 결과에 따르면, 기존에 감염되었던 바이러스에 의해 유도된 교차 반응 기억 T-세포가 존재함으로써 이질아형(heterosubtypic) 인플루엔자가 새롭게 유행하게 되었을 때에도 방어 효과를 나타냄을 알게 되었다. T-세포 반응은 수많은 임상연구 및 페릿과 원숭이를 포함한 동물연구에서 인플루엔자 감염에 대한 교차방어 면역반응으로 제안되어 왔다. 이질아형(heterosubtypic) 독감바이러스의 재감염으로 인한 T-세포 면역의 증가는 결국 T-세포 면역이 높을수록 고 병원성 인플루엔자 감염에 대한 방어가 효율적이라는 결과를 보여주었다. 고 보존된 내부 단백질 또는 NP나 M1과 같은 인플루엔자 바이러스의 항원결정부위(epitope)로 많은 연구 그룹에서 DNA, 아데노바이러스, 폭스바이러스(poxvirus), 약독화 바이러스(live attenuated virus)를 이용하여 항원 전달방법을 연구하였다.

엡스타인 연구진은 백신을 비강 투여하고 치사용량의 공격접종을 시도했을 때에 이질아형(heterosubtypic) 바이러스에 대한 방어에서 NP와 M2를 발현하는 재조합 아데노 바이러스가 놀라운 효능을 나타냄을 보여주었다. T-세포 백신은 방어 면역을 빠르게 유도한다는 부가적인 잇점을 가지며, 특히 예방접종 후 1주일이면 유도된다. 많은 연구에서 백시니아 바이러스(vaccinia virus)가 T-세포 백신 벡터로서 유망한 가능성을 가진다는 것은 입증되어 있다.

1. (Nat Immunol 7,449-455, 2006) 2. (N Engl J Med 350,218-220, 2004) 3. (Nature 437,889-893, 2005) 4. (Nat Med 5,1157-1163,1999)

본 발명은 인플루엔자 바이러스의 다양한 이질아형(heterosubtypic) 변종에 대하여 광범위한 방어가 가능한 내부유전자를 포함하는 T-세포 기반 유니버설 플루 백신을 제공하는 것이 목적이다.

상기의 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 예측할 수 없는 인플루엔자 유행에 대비하기위해 광범위한 인플루엔자 변종을 방어할 수 있는 내부유전자를 포함하는 T-세포 기반 유니버설 플루 백신을 제공한다.

본 발명은 또한 상기 T-세포 기반 유니버설 플루 백신은 조류, 돼지 및 인간 인플루엔자 분리주(isolates)에서 공통서열(consensus sequence)을 갖는 내부 유전자(internal gene)를 선정하였으며, 선정된 내부 유전자는 NP(서열번호 1), PA(서열번호 3), PB1(서열번호 5), PB2(서열번호 7), 및 M1(서열번호 9)이며, 상기 내부 유전자 5종을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 T-세포 기반 유니버설 플루 백신을 제공한다. 본 발명의 하나의 양태는 NP(서열번호 1)와 PA(서열번호 3)의 유전자를 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 T-세포 기반 유니버설 플루 백신이다. 다른 양태로, 본 발명의 백신은 NP(서열번호 1)와 PA(서열번호 3)의 유전자를 유효성분으로 포함하며, 추가로, PB1(서열번호 5), PB2(서열번호 7), 및 M1(서열번호 9) 유전자 중에서 선택된 하나 이상의 유전자가 유효성분으로 포함된 T-세포 기반 유니버설 플루 백신을 제공한다. 또 다른 양태로는 NP(서열번호 1), PA(서열번호 3), PB1(서열번호 5), PB2(서열번호 7), 및 M1(서열번호 9)유전자를 모두 포함하는 것을 특징으로 하는 T-세포 기반 유니버설 플루 백신을 제공한다.

또한, 상기 T-세포 기반 유니버설 플루 백신에서, NP 유전자의 CTL 항원결정부위는

1. MASQGTKRSYEQMET(서열번호 11),

2. GIGRFYIQMCTELKL(서열번호 12),

3. MVLSAFDERRN(서열번호 13),

4. YLEEHPSAGKDPKKTGGPIY(서열번호 14),

5. LYDKEEIRRIWRQANNG(서열번호 15),

6. ATYQRTRAL(서열번호 16),

7. YERMCNILKG(서열번호 17),

8. QVRESRNPGNAEIEDLIFLA(서열번호 18),

9. QLVWMACHSAAFEDLRVSSF(서열번호 19), 또는

10. QPTFSVQRNLPF(서열번호 20) 으로 이루어진 서열을 가지며;

PA 유전자의 CTL 항원결정부위는

1. KIETNKFAAICTHLEVCFMYSDFHF(서열번호 21),

2. RTMAWTVVNSI(서열번호 22),

3. VEKPKFLPDLY(서열번호 23),

4. YYLEKANKIKSE(서열번호 24),

5. THIHIFSFTGEEMA(서열번호 25),

6. RGLWDSFRQSERGEETIEE(서열번호 26),

7. RSKFLLMDALKLSIE(서열번호 27),

8. HEGEGIPLYDAIKC(서열번호 28),

9. SQLKWALGENMA(서열번호 29),

10. EFNKACELTDSSWI(서열번호 30),

11. SRPMFLYVRTNGTSK(서열번호 31), 또는

12. AESRKLLLI(서열번호 32)으로 이루어진 서열을 가지고;

PB1 유전자의 CTL 항원결정부위는

1. MDVNPTLLFLKVPAQNAISTTFPYTGDPPYSHGTGTGYTMDTVNRTHQYSE(서열번호 33),

2. MAFLEESHPGIFENS(서열번호 34),

3. VQQTRVDKLTQGRQTYDWTLNRNQPAATALANTIE(서열번호 35),

4. TKKMVTQRTIGKKK(서열번호 36),

5. FVETLARSICEKLEQSGL(서열번호 37),

6. RMFLAMITYITRNQP(서열번호 38),

7. LSIAPIMFSNKMARLGKGYMFESKSMKLRTQIPAEMLA(서열번호 39),

8. SPGMMMGMFNMLSTVLGVS(서열번호 40),

9. GINMSKKKSYIN(서열번호 41),

10. TGTFEFTSFFYRYGFVANFSMELPSFGVSGINESADMSI(서열번호 42),

11. GVTVIKNNMINNDLGPATAQMALQLFIKDYRYTYRCHRGDTQIQTRRSFE(서열번호 43),

12. VSDGGPNLY(서열번호 44),

13. MEYDAVATTHSW(서열번호 45),

14. PKRNRSILNTSQRGILEDEQMYQ(서열번호 46), 또는

15. AEIMKICST(서열번호 47) 으로 이루어진 서열을 가지고;

PB2 유전자의 CTL 항원결정부위는

1. LMSQSRTREILTKTTVDHMAIIKKYTSGRQEKNP(서열번호 48),

2. WMMAMKYPI(서열번호 49),

3. PERNEQGQTLWSK(서열번호 50),

4. PLAVTWWNRNGP(서열번호 51),

5. GPVHFRNQVKIRR(서열번호 52),

6. YIEVLHLTQGTCW(서열번호 53),

7. EQMYTPGGEV(서열번호 54),

8. NDDVDQSLIIAARNIVRRA(서열번호 55),

9. ASLLEMCHSTQIGG(서열번호 56),

10. SFSFGGFTFK(서열번호 57),

11. LTGNLQTLK(서열번호 58),

12. RVHEGYEEFTMVG(서열번호 59),

13. RATAILRKATRR(서열번호 60),

14. VAMVFSQEDCM(서열번호 61),

15. KAVRGDLNF(서열번호 62),

16. VNRANQRLNPMHQLLRHFQKDAKVLF(서열번호 63),

17. RVSKMGVDEYS(서열번호 64),

18. GNVLLSPEEVSETQG(서열번호 65),

19. LTITYSSSMMWEINGPESVL(서열번호 66),

20. NTYQWIIRNWE(서열번호 67),

21. MLYNKMEFEPFQSLVPKA(서열번호 68),

22. LGTFDTVQIIKLLPFAAAPP(서열번호 69),

23. QSRMQFSSLTVNVRGSGMRILVRGNSPVFNYN(서열번호 70), 또는

24. GVESAVLRGFLI(서열번호 71) 으로 이루어진 서열을 가지고;

M1 유전자의 CTL 항원결정부위는

1. SLLTEVETYVL(서열번호 72),

2. KTRPILSPLTKGIL(서열번호 73),

3. GFVFTLTVPSE(서열번호 74),

4. LYRKLKREITF(서열번호 75),

5. ALASCMGLIY(서열번호 76),

6. MGTVTTEVAFGLVCA(서열번호 77),

7. NRMVLASTTAKAMEQMAGSS(서열번호 78), 또는

8. QARQMVQAMR(서열번호 79) 으로 이루어진 서열을 갖는 것;을 특징으로 T-세포 기반 유니버설 플루 백신을 제공한다.

따라서, 상기 NP(서열번호 1), PA(서열번호 3), PB1(서열번호 5), PB2(서열번호 7), 및 M1(서열번호 9)는 각각 하나 이상의 CTL 항원결정부위를 포함하는 것을 특징으로 한다.

T-세포 백신 전달 벡터(delivery vector)는 재조합 바이러스를 포함하는 것이 특징이며, 재조합 바이러스는 재조합 백시니아 바이러스, 재조합 아데노 바이러스, 재조합 아데노 수반 바이러스(Adeno associated virus), 재조합 레트로 바이러스 또는 재조합 렌티 바이러스에서 선택하는 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는 재조합 (복제) 백시니아 바이러스(replicating Vaccinia Virus, 이하 'rVV'라고 한다)를 이용하는 것이다.

본 발명에 따른 백신의 투여 경로는 피부 난절법(skin scarification; s.s.) 경로, 근육 내(intramuscular; i.m.) 경로, 비강 내(intranasally; i.n.) 경로, 피내(intradermal; i.d.) 경로, 정맥 내(intravenous; i.v.) 경로, 또는 복강 내(intraperitoneal; i.p.) 경로로 투여하는 것을 특징으로 하지만, 이에 한정하지 않으며, 상기의 피부 난절법(skin scarification; s.s.) 경로를 이용하는 투여방법이 가장 바람직하다.

본 발명의 T-세포 기반 유니버설 플루 백신은 약제학적으로 허용되는 면역강화제, 담체, 부형제, 희석제에서 선택한 하나 이상의 첨가제를 포함할 수 있으며, 단위-투여량 또는 다-투여량 용기, 예를 들면 밀봉시킨 앰플 및 병 등으로 제공 할 수도 있다.

본 발명의 T-세포 기반 유니버설 플루 백신은 내부유전자에 하나 이상의 CTL 항원 결정부위를 포함 하고 있으며, 내부 유전자 조합에 따라 면역원성이 증진된 T-세포 기반 유니버설 플루 백신으로 인플루엔자 바이러스의 다양한 아형에 대해 방어가 가능하다.

도 1은 C57BL/6 마우스에서 피부난절법으로 투여한 농도별 rVV-NP 백신의 T세포 면역원성을 나타낸 그래프이다. rVV-EGFP는 음성대조군으로 피부난절법으로 투여하였고, x-31은 양성대조군으로 비강투여하였다. IFN-γ-ELISPOT 어세이는 예방접종 4주후 NP₃₆₆ CTL 항원결정부위 펩티드에 의해 자극시킨 비장세포(splenocyte)를 분석하였다(막대 표시는 2 마우스/그룹의 평균±표준편차(SD)이다.).
도 2는 rVV-NP 예방접종 투여방법에 따른 효과를 IFN-γ-ELISPOT 활성도로 나타낸 그래프이다.
C57BL/6 마우스에 10⁶ pfu rVV-NP 백신을 근육경로(intramuscular (i.m.)), 비강경로(intranasal (i.n.)), 또는 피부난절법 경로(skin scarification (s.s.))를 통해 투여하였다. IFN-γ-ELISPOT 어세이로 예방 접종 10일 또는 4주후 NP₃₆₆ CTL 항원결정부위 펩티드에 의해 자극시킨 비장세포(splenocyte)를 분석하였다(막대 표시는 2 마우스/그룹의 평균±표준편차(SD)이다.).
도 3은 x-31 접종 투여방법에 따른 효과를 IFN-γ-ELISPOT 활성도로 나타낸 그래프이다. C57BL/6 마우스에 마취 없이 근육경로와 비강경로를 조합하여 10⁴ pfu x-31을 4주 간격으로 두 번 접종하였다. IFN-γ-ELISPOT 어세이로 접종 10일 후 NP₃₆₆ CTL 항원결정부위 펩티드에 의해 자극시킨 비장세포(splenocyte)를 분석하였다(막대 표시는 2 마우스/그룹의 평균±표준편차(SD)이다.).
도 4는 x-31으로 1차 면역시킨(primed) 마우스에서 rVV-플루 예방경로에 의해 유도시킨 인플루엔자-특이 T세포반응을 나타낸 그래프이다. a, b, 및 c는 x-31 1차 면역시킨 C57BL/6 마우스에 10⁶ pfu 백시니아 인플루엔자를 접종하였고, d, e, 및 f는 Balb/c 마우스에 각각 10⁶ pfu 백시니아 인플루엔자를 접종하였다; rVV-flu(5)는 rVV-NP, -PA, -M1, -PB2 및 -PB1으로 구성된 백신이며, 모형 백시니아(parental vaccinia (VV)) 또는 x-31 는 대조군이다.
a는 C57BL/6 마우스에서 예방접종 3주후 NP₃₆₆ 및 PA₂₂₄ 항원결정부위 및 PR8-감염 EL4 세포에 의해 자극시킨 비장세포(splenocytes)에서 IFN-γ-ELISPOT 활성도를 평가한 그래프이고;
b는 C57BL/6 마우스에서 예방접종 3주후 NP₃₆₆ 및 PA₂₂₄ 항원결정부위 및 PR8-감염 EL4 세포에 의해 자극시킨 폐세포(lung cells)에서 IFN-γ-ELISPOT 활성도를 평가한 그래프이고;
d는 Balb/c 마우스에서 예방접종 3주후 NP₁₄₇ 항원결정부위로 자극시킨 비장세포(splenocytes)에서 IFN-γ-ELISPOT 활성도를 평가한 그래프이고;
e는 Balb/c 마우스에서 예방접종 3주후 NP₁₄₇ 항원결정부위로 자극시킨 폐세포(lung cells)에서 IFN-γ-ELISPOT 활성도를 평가한 그래프이고;
c와 f는 예방접종 후 7일째, 생체 내 CTL 어세이에 의해 기능적 분해활성(lytic activity)을 나타낸 그래프이다(막대 표시는 2~3 마우스/그룹의 평균±표준편차(SD)이다).
도 5는 인플루엔자-특이 T-세포로부터 다기능성 사이토카인 분비를 나타내는 그래프이다. C57BL/6 마우스 비장세포(splenocytes)를 사용하였으며, rVV-플루 예방접종 7일후 NP₃₆₆(upper panel)와 PA₂₂₄ (lower panel) 항원결정부위에 의해 자극시켰다. IFN-γ, TNF-α 및 IL-2 사이토카인의 분비와 비과립화 마커(CD107a)의 발현 은 세포내 사이토카인 염색에 의해 측정하였다.
a는 각각의 사이토카인이 분비하는 CD8 T-세포 비율(%)을 나타내고,
b는 인플루엔자-특이 T-세포의 다기능성 분석을 위해 다양한 사이토카인의 조합에 대한 T-세포 반응과 비과립화(degranulation)를 측정한 그래프이고(막대 표시는 2 마우스/그룹의 평균±표준편차(SD)이다),
c는 양성(+) 대조군과 rVV-NP+PA에 대한 도트 플랏이다.
도 6은 C57BL/6 마우스에 예방 접종 후, PR8을 감염 시키고 7일간의 체중 감소를 나타낸 그래프이다(0.5/10/100 LD₅₀). (막대 표시는 4 마우스/그룹의 평균±표준오차(SEM)이다)
도 7은 x-31으로 1차 면역시킨 C57BL/6 (a, c, e) 및 Balb/c (b, d, f) 마우스에 rVV-플루 예방접종 3주 후 PR8을 감염시키고, 체중 감소 및 생존률을 나타낸 그래프이다(100 LD₅₀). 체중감소율(a, b)과 생존률(c, d)을 2주간 추적하였다(막대 표시는 8 마우스/그룹의 평균±표준오차(SEM)이다). 폐 바이러스 역가는 3일, 5일, 및 7일(e, f)에서 측정하였다. (막대 표시는 3 마우스/그룹의 평균±표준오차(SEM)이다).
도 8은 x-31으로 1차 면역시킨 C57BL/6 마우스에 rVV-플루 예방접종 3주 후 HPAI H5N1을 감염시키고, 체중 감소 및 생존률을 나타낸 그래프이다 (100 LD₅₀ A/MD/W401/11 (HPAI H5N1 field isolate)). 체중감소율(A) 및 생존률(B)을 2주간 추적하였다(막대 표시는 8 마우스/그룹의 평균±표준오차(SEM)이다). 폐 바이러스 역가는 3일, 5일, 및 7일(C)에서 측정하였다.(막대 표시는 3 마우스/그룹의 평균±표준오차(SEM)이다.)
도 9는 Phil/2/82로 1차 면역시킨 C57BL/6 마우스에 rVV-플루 예방접종 후, CTL 항원결정부위에 대응하는 교차반응성 IFN-γ-ELISPOT 활성도 그래프이다. 교차반응성 IFN-γ-ELISPOT 활성도는 프라이밍 바이러스(Phil/2/82) 및 공격접종에 사용한 바이러스 (Cal/04/09)의 CTL항원결정부위에 대하여 측정하였다. 상기 어세이는 프라이밍(a) 4주 후 및 rVV-플루 접종 3주 후 실행하였다(b) (막대 표시는 2 마우스/그룹의 평균±표준오차(SD)이다).
도 10은 Phil/2/82로 1차 면역시킨 C57BL/6 마우스에 rVV-플루 예방접종 후 마우스에서 적응시킨 유행성 신종플루(H1N1)를 감염시키고, 체중감소 및 생존률을 나타낸 그래프이다. 예방접종 3주 후 100 LD₅₀ 마우스에서 적응시킨 Cal/04/09 바이러스를 감염시키고 2주간 체중감소율(a) 및 생존률(b)을 관찰하였다(막대 표시는 8 마우스/그룹의 평균±표준오차(SEM)이다).

이하, 실시 예 및 도면을 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위를 이들 실시예에 의해 제한하지 않는다는 것은 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명한 것이다.

동물 모델 및 바이러스의 준비

6 주령 암컷 C57BL/6 및 Balb/c 마우스는 찰스 리버 연구소 (오리엔트 바이오 주식회사, 성남, 한국)에서 구입하여 본 발명에 사용하였다. 모형 NYCBH 백시니아 변형을 rVV-플루 제조에 사용하였고, A/PR/8/34 (H1N1)와 x-31 (H3N2)의 인플루엔자 바이러스를 본 발명에 사용하였다. H5N1 바이러스를 사용하는 모든 절차는 바이오안전성 수준 3(BSL-3 +) 시설에서 실시하였다.

공통서열 및 대표서열을 포함하는 내부 유전자의 선정

조류, 돼지 및 인간 인플루엔자 분리주(isolates)에서 등-거리 공통서열을 결정하기 위해, 인플루엔자 내부 유전자의 총 14,011개의 서열(PB2, PB1, PA, NP, M1, M2, NS1 및 NS2)을 미국 국립생물정보센터(NCBI)의 인플루엔자 바이러스 자료에서 검색하였다 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/FLU.html).

각 종(species)에서, 개별 유전자의 계통수는 근연접합법(neighbor-joining method )을 사용하여 작성하였으며, 최종적으로 8종 내부 유전자의 공통서열을 결정하였다. 8종 내부 유전자 중에서, NS1, NS2 및 M2의 3종 유전자는 백신으로부터 하기와 같은 이유로 본 발명의 T-세포 기반 유니버설 플루 백신의 내부유전자 선정에서 제외시켰다.

(1) 상기 3종의 유전자는 다른 내부 유전자에 비해 길이가 짧아서 방어 T-세포 항원결정부위를 제시할 수 있는 기회가 적고;

(2) NS1은 I형 인터페론 반응을 억제하는 것으로 알려져 있어서 NS1을 항원으로 하는 전달벡터 사용시 면역원성 형성에 영향을 줄 수 있으며,

(3) M2는 rVV-NP+PA 또는 rVV-플루(5)와 조합시켰을 때 나타나는 효능이 항-M2 항체반응에서 단일 rVV-M2 백신접종에 의해 유도시킨 것보다 훨씬 낮아 치사용량 접종에 대한 방어에 기여하지 못한다.

따라서 본 발명은 NP, PA, PB1, PB2, 및 M1의 5종 내부유전자를 선정하여 이를 포함하는 T-세포 기반 유니버설 플루 백신의 면역원성 및 효능 분석을 수행하였다.

5종 내부유전자(서열번호 1, 3, 5, 7, 및 9) 및 5종의 유전자로부터 번역된 단백질(서열번호 2, 4, 6, 8 및 10)의 진뱅크(GenBank) 가입 번호는 하기와 같다.

NP 유전자(서열번호 1), gi:323984, gb:M22574.1,

NP 단백질(서열번호 2), gi:323985, gb:AAA43095.1;

PA 유전자(서열번호 3), gi:78097605, gb:CY005610.1,

PA 단백질(서열번호 4), gi:78097606, gb:ABB20301.1;

PB1 유전자(서열번호 5), gi:82654856, gb:CY005794.1,

PB1 단백질 (서열번호 6), gi:82654857, gb:ABB88367.1;

PB2 유전자(서열번호 7), gi:134044357, gb:CY011035.2,

PB2 단백질(서열번호 8), gi:113901268, gb:ABI47980.1;

M1 유전자(서열번호 9), gi:4584881, gb:AAD25173.1,

M1 단백질(서열번호 10), gi:4584882, gb:AAD25173.1,

표 1. 인플루엔자 분리주의 수 및 인플루엔자 A 내부 유전자의 최종 공통서열을 결정하기 위한 하위그룹

5종 내부 유전자를 포함하는 T-세포 기반 유니버설 플루 백신은 면역원성이 대조군보다 높았으며, 기존에 알려진 보존된(conserved) 인간 T-세포 항원결정 부위(epitope)와 인플루엔자 분리주에서의 공통서열을 비교하면 보존된 인간 T-세포 항원결정부위(epitope) 1,147 아미노산 중에서 1,142 아미노산이 공통서열(consensus sequence)과 99.6 % 일치하는 것이 특징이다.

표 2. 알려진 공통 항원결정부위와 본 발명의 T-세포 기반 유니버설 플루 백신의 공통서열과의 상동성.

본 발명의 내부 유전자 및 2009년 신종독감(2009 H1N1)의 서열 상동성은 평균 95% (A/Mexico/InDRE4114/2009은 95.3%; A/Canada-AB/RV1532/2009는 95.2%; 및 A/New York/1669/2009은 95.0%)이며, 미국 국립생물정보센터(NCBI)의 인플루엔자 바이러스 자료에서의 인플루엔자 분리주와의 아미노산 상동성은 97.8%이다. 상기의 상동성은 어떠한 미지의 인플루엔자 유행에 대해서도 광범위한 T-세포 매개된 방어를 할 수 있다는 것을 의미한다.

표 3. 미국 국립생물정보센터(NCBI) 인플루엔자 바이러스 자료에서 인플루엔자 분리주와 본 발명의 T-세포 기반 유니버설 플루 백신의 공통서열과의 상동성.

실시예 1. rVV-플루 백신의 제조

rVV-플루 백신을 제조하기 위해, 인플루엔자 유전자를 최적화시킨 인간 코돈을 합성하여 pUC57의 EcoRV 자리(GenScript (Piscataway, NJ)에 의해 제공됨)에 삽입하였다. NP 또는 M1 유전자를 포함하는 각각의 플라스미드는 제한효소 AscI/SbfI으로 절단한 뒤, 절단된 pBMSF7C 백신 전달 벡터를 PstI/AscI로 연결하였다. pUC57의 절단된 조각에 AscI/SbfI로 PB2, PB1, 및 PA를 적절한 크기로 삽입한 후, 벡터를 DraI 제한효소로 한번 더 절단하고, 절단된 pBMSF7C는 PstI / AscI으로 클로닝 하였다. rVV-플루 백신의 제조는 종래 방법을 약간 변형하여 제조하였다(Vaccine 25,630-637, 2007). 감염다중도(multiplicitiy of infection; MOI) 10으로 백시니아 바이러스(vaccinia virus) 감염시킨 BHK-21 세포는 pBMSF7C-독감으로 형질전환시켰다. 바이러스는 형질전환(transfection)시킨지 24시간 후에 수확하고, 재조합 HA 음성 플라그(plaques)를 스크리닝할 RK-13 세포에 다시 감염시켰다. 감염 3일 후, 세포를 37 ℃에서 30 분 동안 칠면조(turkey) RBC와 반응시켜, HA 음성 플라그를 분리하였다. HA 양성 플라그가 사라질 때까지 HA 음성 플라그를 연속적으로 클로닝 하였고, 100 mm 디쉬(dish)에 ~1,000 플라그의 HA 염색(staining)으로 확인하였다. 최종 재조합 바이러스를 정제하고, BHK-21 세포에서 증폭하였다(0.1 MOI). 사용하기 전까지 -80 ℃에서 저온 보관 하였다.

재조합 백시니아 바이러스(vaccinia virus)에 인플루엔자 유전자 삽입여부는 PCR기법으로 확인하였고, 웨스턴 블랏과 결합 위치에 대한 서열분석으로 최종 클론을 확인하였다.

실시예 1-1. rVV-플루의 웨스턴 블랏 분석

BHK-21 세포를 1 시간 동안 0.1 MOI에서 rVV-플루에 감염시켰다. 이후 상기 세포들을 사흘 동안 배양하여 획득하였다. 단백질은 종래의 알려진 방법(피어스, 록포드, IL)에 따라 M-PER 완충용액으로 추출하였다. 열-변성 단백질은 4-12% SDS-PAGE(Invitrogen Carlsbad, CA)에서 분리하고 니트로셀룰로오스 막 (nitrocellulose membrane)에 옮겼다 (Invitrogen Carlsbad, CA). 막은 0.2 % Tween 20을 포함하는 PBS 완충용액에서 5 % 탈지유와 함께 1 시간 동안 블로킹(blocking)하고 일차 항체와 반응시켰다.

하기와 같은 항체들을 탐지에 사용하였다.

항-PB2 (Santacruz Carlsbad, CA);

항-PB1 (Santacruz Carlsbad, CA);

항-PA (펩트론, 대전, 한국);

항-NP 및 항-M1 (X-31 / PR8 면역 마우스 혈청).

막은 홀스래디쉬(horseradish) 퍼옥시데이즈(peroxidase)-라벨링시킨 항-마우스 IgG 항체 (KPL 게이 스버그, MD)와 함께 배양하였고, ECL 플러스 키트 (Amersham Buckinghamshire, 영국)로 염색하였다.

실시예 2. rVV-플루의 면역원성(immunogenicity) 평가

실시예 2-1. IFN-γ ELISPOT 분석

백시니아(vaccinia) 기반의 인플루엔자 백신 접종에서 최적의 백신조합을 결정하기 위해, 본 발명은 IFN-γ ELISPOT 분석을 통해 rVV-플루의 면역원성(immunogenicity)을 평가하였다. H-2b 마우스 모델에서 뉴클레오단백질(nucleoprotein, NP)의 높은 면역원성(immunogenicity)을 확인하였다. 종래 알려진 피부 난절법 (skin scarification; s.s.)를 통해 rVV-NP를 여러 용량으로 접종하였으며, 이에 따른 면역원성(immunogenicity)은 T-세포 반응의 투여량에 따라 유도시켰으며, 2차 예방접종(Boosting immunization)이 T-세포 반응을 향상시키는 것을 확인하였다(도 1 참조).

본 발명에서 백신을 투여하는 방법은 근육경로(intramuscular; i.m.)법, 비강 투여(intranasally; i.n.) 방법, 또는 피부 난절법 (skin scarification; s.s.) 투여를 실시하였으며, 상기의 피부 난절법(skin scarification; s.s.) 투여 방법이 근육경로(intramuscular; i.m.) 또는 비강 투여(intramasally; i.n.)에 비해 5배 이상의 높은 면역원성(immunogenicity)을 나타내므로 가장 바람직하였다(도 2 참조).

인간의 91 ~ 98 %는 인플루엔자 바이러스에 감염된 경험이 있어, 인플루엔자 특이 기억 T-세포를 가지고 있다. 따라서 본 발명은 백신 면역원성(immunogenicity)과 효능을 평가하기 위한 마우스 모델로 인플루엔자-1차 면역시킨(primed) 마우스를 사용하였다. 근육경로와 비강투여의 네가지 조합 중에서 x-31 근육경로 프라이밍/비강 증폭 (priming/boosting)투여 방법이 가장 높은 T-세포 면역을 유도하였다(도 3 참조).

x-31 1차 면역시킨 C57BL/6 마우스에 10⁶pfu 백시니아 인플루엔자를 접종하였고, Balb/c 마우스에는 10⁶ pfu 백시니아 인플루엔자를 접종하였다

C57BL/6 마우스에서, 하기 두 종류의 T-세포 기반 유니버설 플루 백신의 면역학적으로 우세한 항원 결정부위는 NP₃₆₆ 및 PA₂₂₄이었으며, 플루-특이 T-세포 반응의 90% 이상의 반응을 유도할 수 있었다.(도 4 참조)

1) rVV-NP + PA

2) rVV-플루(5) (플루(5)는 내부유전자 NP, PA, PB1, PB2, 및 M1을 의미한다.)

NP와 PA의 항원결정 부위(epitope) NP₃₆₆ 및 PA₂₂₄가 독감-특이 T-세포 반응에서 가장 우세한 면역원성을 나타냈지만, 상기 5종의 내부 유전자로부터 획득되는 T-세포 항원 결정부위를 포함하는 백신을 제공함으로써 인간에게 T-세포 항원결정부위로서 NP와 PA를 포함하지 않는 경우를 대비하고자 하였다.

실시예 3. 마우스 모델을 이용한 예방접종 실시

마우스에 마취없이 10⁴ pfu X-31을 비강 경로(intransally; i.n.)로 5ul 투여했다(1차 예방접종(프라이밍), 0일째). 상기 마우스는 피부 난절법(skin scarification; s.s. 투여)으로 10⁶ pfu 의 rVV-플루 5ul를 백신접종 하였다(2차 예방접종(부스팅), 28일째).

음성대조군은 모형-VV 단독으로 사용하였고, 양성 대조군의 1차 접종(primed vaccination)은 근육경로로 양쪽 뒷다리 다리 후부 허벅지 근육에 50ul 투여하고, 2차접종(boosting vaccination)은 비강경로(x-31의 10⁴ pfu)를 사용하였다.

각각의 그룹당 8마리의 마우스를 사용하였으며, 예방 접종 후 3주째에 상기의 마우스를 에베르틴(avertin)으로 마취시키고, 50ul의 A/PR/8/34 바이러스를 0.5/10/100 LD₅₀으로 감염시켰다.

독감 바이러스 이질아형(heterosubtypic)은 100 LD₅₀ 고병원성 H5N1 A/Mallard Duck/Korea/W401/11 및 유행성 A/California/04/09를 사용하였다. 상기 마우스의 생존과 체중의 변화를 날마다 2주 동안 확인하였으며, 독감 바이러스에 의해, 초기 체중의 30 % 이상이 감소한 마우스는 동물복지차원에서 안락사시켰다(도 6,7, 및 10 참조).

실시예 4. 세포 면역에 대한 폐 세포의 준비

폐 세포(lung cell)는 종래의 알려진 프로토콜(Miltenyi biotecInc., Carlsbad, CA)에 따라 분쇄하였다. 분쇄시킨 폐 세포는 5분 동안 얼음 위에서 RBC 분해 완충용액에 처리시켰다(시그마-알드리치). RBC가 제거된 폐 세포는 혈청이 없는 RPMI에 풀어서, 생체 내 세포사멸 효력 (in-vivo CTL) 및 ELISPOT(Enzyme-Linked ImmunoSpot) 분석을 하였다.

실시예 5. Ex-vivo IFN-γ ELISPOT 분석

ELISPOT 분석은 마우스 IFN-γ ELISPOT^PLUS 키트 (Mabtech, AB Nacta 스트랜드, 스웨덴)을 사용하여 수행하였다. 2×10⁵ 개의 신선한 비장세포(splenocytes) 또는 폐 세포를 항-마우스 IFN-γ 캡처 항체 코팅시킨 96-웰 플레이트에 깔고, 18시간 동안 독감 펩티드 항원결정부위의 1μM (펩트론, 대전, 한국) 또는 PR8 바이러스의 1 MOI 감염된 EL4(2×10⁵ 세포/웰)로 자극시켰다.

독감-특이 CD8+ T-세포 항원결정 부위는 하기와 같다.

NP_366-74(Db, ASNENMETM);

PA_224-33(Db, SSLENFRAYV);

PB2_196-210,(Db 또는 Kb, CKIAPLMVAYMLERE);

PB1_703-11(Kb, SSYRRPVGI); 및

M1_128-35(Kb, MGLIYNRM).

PB2₁₉₈ _-206과 함께 펄스 또는 B/Malaysia/2506/04 감염시킨 비장세포(splenocytes)는 음성대조군으로 웰당 8±5(SD) 및 13±9(SD)를 사용하였다. 폐 세포는 조금 더 높은 음성대조군을 사용하였다(14±13 및 25± 26). IFN-γ 분비 세포(ISCs)의 수는 ELISPOT 리더 (AID, Strassberg, 독일)를 사용하여 측정하였다. (도 5 참조)

실시예 6. 생체 내(In-Vivo) 독성 T-세포(cytotoxic T cell; CTL) 분석

면역시키지 않은(naive) 생쥐에서 획득한 비장세포를 10분 동안 상온에서 5M PKH26 (시그마-알드리치, 세인트 루이스, 미주리)로 염색시켰다. 라벨은 동일한 양의 FBS를 추가하여 중지시키고, 1분 동안 배양하였다. 37℃에서 10 분간 0.5uM, 2uM, 또는 8uM CFSE(Carboxy Fluorescein Succinimidyl Ester)으로 추가 염색하고, 동량의 FBS를 첨가하여 염색을 중지한 후 1분간 배양하였다. 이중(double) 염색된 세포는 1시간 동안 37 ℃에서 지시 항원결정 부위 펩티드(1 uM)와 함께 자극시켰다.

각각의 타켓 세포와 다른 펩티드를 함께 혼합하여 면역시키지 않거나 또는 면역시킨 마우스에 정맥 내 경로로 투여하였다. 투여 12 시간 후, 비장과 폐 세포를 단일 세포 현탁액으로 준비하고, 생체 내 독성 T-세포(cytotoxic T cell; CTL)의 활성도는 유세포분석기(flow cytometry analysis)를 이용하여(BD LSRFortessa, Bioscience BD, Piscataway, NJ) 측정하였다. 하기의 식에 따른 세포사멸 비율(%)을 계산하였다.

[식]

세포 사멸(killing) 비율(%) = 100 - {(면역시킨 마우스에 남아있는 자극시킨 표적세포 수/면역시킨 마우스에 남아있는 자극시키지 않은 표적세포 수)/(면역시키지 않은 마우스에 남아있는 자극시킨 표적세포 수/면역시키지 않은 마우스에 남아있는 자극시키지 않은 표적세포 수)〕× 100}

실시예 7. 세포내 사이토카인 염색법(ICS) 및 T-세포 다기능성(polyfunctionality) 분석

본 실시예에서는 rVV-플루 백신에 의해 유도시킨 인플루엔자 특이 T-세포의 다기능성을 관찰하였다. rVV-플루 예방접종 후, 7일간 NP₃₆₆(upper panel)와 PA₂₂₄ (lower panel) 항원결정부위에 의해 자극시켰다. IFN-γ, TNF-α 및 IL-2 사이토카인의 분비와 비과립화 마커(CD107a)의 발현은 세포내 사이토카인 염색에 의해 측정하였다.(도 5 참조)

비장세포(splenocytes)는 항-CD107a-PE-Cy7 (BD Biosciences) 존재 하에서 NP₃₆₆및 PA₂₂₄ 같은 독성 T-세포(cytotoxic T cell; CTL) 항원결정부위(epitope) 펩티드(1ug/ml)와 함께 자극시켰고, 세포의 투과성을 항진시키는 수송 항생 물질의 일종인 모넨신(monensin) (GolgiStop, BD Biosciences)을 1시간 후에 첨가하였다. 배양 5시간 후 splenocytes은 에티디움 모노아자이드(ethidium monoazide)로 염색하였고, 이어서 항-CD3-Horizon V500, 항-CD4-Horizon V450 및 항-CD8-APC-H7 (BD Biosciences)이 에티디움 모노아자이드(ethidium monoazide)로 염색하였다. 사이토픽스/사이토펌(Cytofix/Cytoperm) 키트 (BD Biosciences)로 투과시키고, 항-IL-2-FITC(eBioscience), 항-IFN-γ-APC(BD Biosciences) 및 항-TNF-PE(BD Biosciences)로 염색하였다. FACS 분석은 LSRII flow cytometer (BD Biosciences)를 사용하고, 데이터 FlowJo 소프트웨어 (Treestar, 샌프란 카를로스, CA)를 사용하여 분석하였다. 사이토카인(cytokines)의 다양한 조합 및 탈과립(degranulation)에 대한 T-세포의 정량 및 분석은 FlowJo 소프트웨어를 이용하여 분석하였다.

인플루엔자 HA는 항체 매개 호스트 면역 감시의 주요 대상이며, 지속적인 변이가 일어난다. 따라서, 공통서열을 갖는 HA 분자만이 교차-방어의 잇점이 있다. 내부 유전자들은 상대적으로 HA 보다 낮은 면역력을 가지고 있기 때문에 상당히 보존되어 있다. 본 발명의 보존된 서열은 평균 97.8% 상동성을 가지고 있어 교차-반응할 수 있는 세포면역성이 충분한 것이 특징이다. 본 발명은 개개의 HLA 다형성에 따라 T-세포 항원결정 부위(epitope)의 맞춤형 항원제시를 제공하는 항원결정 부위(epitope) 서열보다는 원형 그대로의 전체 내부 유전자를 선택하는 것이 특징이다. 또한, 복수-항원결정부위(epitope)-특이 T-세포 반응은 변종형성의 가능성을 줄일 수 있는 장점이 있다. 복수-유전자(multi-gene)의 사용에도 불구하고, 개별 항원의 면역원성 감소는 T-세포에 복제 및 항원 제시(antigen presentation)에서 개별적인 재조합 바이러스 사이에 항원경쟁 때문이다. 이것은 DNA 백신 조합연구에서 항원 경쟁으로부터 입증되었다. 본 발명에서 교차반응성 IFN-γ-ELISPOT 활성도는 프라이밍 바이러스(Phil/2/82) 및 공격접종에 사용한 바이러스 (Cal/04/09)의 CTL항원결정부위에 대하여 측정하였다. 상기 어세이는 프라이밍(a) 4주후 및 rVV-플루 접종 3주후 실행하였다(도 9 참조).

실시예 8. 폐 바이러스의 역가 분석

인플루엔자에 감염시킨 마우스는 3일, 5일, 및 7일 후에 안락사 시켜 폐 조직을 획득하였다. 획득한 폐조직은 플라그 어세이(plaque assay)를 이용하여 바이러스 역가분석을 위한 10 % W/V 무혈청최소 필요 배지(serum free Minimum Essential Me-dia : MEM)에서 파쇄시켰다. 바이러스 검출 한계는 폐의 100 pfu/g 이었다(이 수치는 ~20 pfu/마우스에 상응한다). HPAI H5N1 바이러스 역가(titer)는 인플루엔자 실험에 관하여 승인받은 BSL3+ 시설에서 유정란을 사용하여 측정하였다. 바이러스 탐지의 한계는 0.7 log10 EID₅₀/ml 이하였다. (도 7 및 8 참조)

그룹 간의 체중 감소 및 폐 바이러스 역가 차이는 T 검정(Student T test)법으로 분석하였다. 생존율 차이는 소 표본의 정확추론(Fisher's exact test)으로 계산하였으며, 통계적 유의성은 p값을 0.05이하로 확인하였다.(도 7 및 8 참조)

<110> Mogam Biotechnology Research Institute <120> Broad protective efficacy of T cell-based universal influenza vaccine <130> P2012-03-Magam <160> 79 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1565 <212> RNA <213> Influenza A virus (A/duck/Bavaria/2/1977(H1N1)) nucleoprotein gene <400> 1 agcaaaagca gggtagataa tcactcactg agtgacatcc acaacatggc gtctcaaggc 60 accaaacgat cttatgagca gatggaaact ggtggagagc gccagaatgc tactgagatc 120 agagcatctg ttgggagaat ggtaggtgga attggaagat tctacataca gatgtgcact 180 gaactcaaac tcagcgacta tgaagggagg ctgatccaga acagcataac aatagagaga 240 atggttctct ctgcgtttga tgaaaggagg aacaaatacc tggaagagca ccccagtgcg 300 ggaaaggacc ctaagaaaac tggaggtccg atttacagaa ggagggatgg aaaatggatg 360 agggagctga ttctgtatga caaagaggaa ataaggagga tctggcgcca ggcgaacaat 420 ggagaagacg caactgctgg tctcacccac ctgatgatct ggcattccaa cctgaatgat 480 gccacatatc agagaacaag agctctcgtg cgtactggga tggaccccag aatgtgctct 540 ctgatgcaag gatcaactct cccgaggaga tctggggcag ctggtgcagc agtgaaggga 600 gttggaacga 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gaacccgatc gtgccttcct ttgacatgag taatgaggga 1500 tcttatttct tcggagacaa tgcagaggag tatgacaatt aaagaaaaat acccttgttt 1560 ctact 1565 <210> 2 <211> 498 <212> PRT <213> nucleoprotein [Influenza A virus (A/duck/Bavaria/2/1977(H1N1))] <400> 2 Met Ala Ser Gln Gly Thr Lys Arg Ser Tyr Glu Gln Met Glu Thr Gly 1 5 10 15 Gly Glu Arg Gln Asn Ala Thr Glu Ile Arg Ala Ser Val Gly Arg Met 20 25 30 Val Gly Gly Ile Gly Arg Phe Tyr Ile Gln Met Cys Thr Glu Leu Lys 35 40 45 Leu Ser Asp Tyr Glu Gly Arg Leu Ile Gln Asn Ser Ile Thr Ile Glu 50 55 60 Arg Met Val Leu Ser Ala Phe Asp Glu Arg Arg Asn Lys Tyr Leu Glu 65 70 75 80 Glu His Pro Ser Ala Gly Lys Asp Pro Lys Lys Thr Gly Gly Pro Ile 85 90 95 Tyr Arg Arg Arg Asp Gly Lys Trp Met Arg Glu Leu Ile Leu Tyr Asp 100 105 110 Lys Glu Glu Ile Arg Arg Ile Trp Arg Gln Ala Asn Asn Gly Glu Asp 115 120 125 Ala Thr Ala Gly Leu Thr His Leu Met Ile Trp His Ser Asn Leu Asn 130 135 140 Asp Ala Thr Tyr Gln Arg Thr Arg Ala Leu Val Arg Thr Gly Met Asp 145 150 155 160 Pro Arg Met 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Glu Asp Glu Gln Met Tyr Gln 20 <210> 47 <211> 9 <212> PRT <213> polymerase PB1 [Influenza A virus (A/turkey/Italy/4169/1999(H7N1))] epitope <400> 47 Ala Glu Ile Met Lys Ile Cys Ser Thr 1 5 <210> 48 <211> 34 <212> PRT <213> polymerase PB2 [Influenza A virus (A/blue-winged teal/Ohio/926/2002(H3N8))] epitope <400> 48 Leu Met Ser Gln Ser Arg Thr Arg Glu Ile Leu Thr Lys Thr Thr Val 1 5 10 15 Asp His Met Ala Ile Ile Lys Lys Tyr Thr Ser Gly Arg Gln Glu Lys 20 25 30 Asn Pro <210> 49 <211> 9 <212> PRT <213> polymerase PB2 [Influenza A virus (A/blue-winged teal/Ohio/926/2002(H3N8))] epitope <400> 49 Trp Met Met Ala Met Lys Tyr Pro Ile 1 5 <210> 50 <211> 13 <212> PRT <213> polymerase PB2 [Influenza A virus (A/blue-winged teal/Ohio/926/2002(H3N8))] epitope <400> 50 Pro Glu Arg Asn Glu Gln Gly Gln Thr Leu Trp Ser Lys 1 5 10 <210> 51 <211> 12 <212> PRT <213> polymerase PB2 [Influenza A virus (A/blue-winged teal/Ohio/926/2002(H3N8))] epitope <400> 51 Pro Leu Ala Val Thr Trp Trp Asn Arg Asn Gly Pro 1 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PB2 [Influenza A virus (A/blue-winged teal/Ohio/926/2002(H3N8))] epitope <400> 57 Ser Phe Ser Phe Gly Gly Phe Thr Phe Lys 1 5 10 <210> 58 <211> 9 <212> PRT <213> polymerase PB2 [Influenza A virus (A/blue-winged teal/Ohio/926/2002(H3N8))] epitope <400> 58 Leu Thr Gly Asn Leu Gln Thr Leu Lys 1 5 <210> 59 <211> 13 <212> PRT <213> polymerase PB2 [Influenza A virus (A/blue-winged teal/Ohio/926/2002(H3N8))] epitope <400> 59 Arg Val His Glu Gly Tyr Glu Glu Phe Thr Met Val Gly 1 5 10 <210> 60 <211> 12 <212> PRT <213> polymerase PB2 [Influenza A virus (A/blue-winged teal/Ohio/926/2002(H3N8))] epitope <400> 60 Arg Ala Thr Ala Ile Leu Arg Lys Ala Thr Arg Arg 1 5 10 <210> 61 <211> 11 <212> PRT <213> polymerase PB2 [Influenza A virus (A/blue-winged teal/Ohio/926/2002(H3N8))] epitope <400> 61 Val Ala Met Val Phe Ser Gln Glu Asp Cys Met 1 5 10 <210> 62 <211> 9 <212> PRT <213> polymerase PB2 [Influenza A virus (A/blue-winged teal/Ohio/926/2002(H3N8))] epitope <400> 62 Lys Ala Val Arg Gly Asp Leu Asn Phe 1 5 <210> 63 <211> 26 <212> PRT <213> polymerase PB2 [Influenza A virus (A/blue-winged teal/Ohio/926/2002(H3N8))] epitope <400> 63 Val Asn Arg Ala Asn Gln Arg Leu Asn Pro Met His Gln Leu Leu Arg 1 5 10 15 His Phe Gln Lys Asp Ala Lys Val Leu Phe 20 25 <210> 64 <211> 11 <212> PRT <213> polymerase PB2 [Influenza A virus (A/blue-winged teal/Ohio/926/2002(H3N8))] epitope <400> 64 Arg Val Ser Lys Met Gly Val Asp Glu Tyr Ser 1 5 10 <210> 65 <211> 15 <212> PRT <213> polymerase PB2 [Influenza A virus (A/blue-winged teal/Ohio/926/2002(H3N8))] epitope <400> 65 Gly Asn Val Leu Leu Ser Pro Glu Glu Val Ser Glu Thr Gln Gly 1 5 10 15 <210> 66 <211> 20 <212> PRT <213> polymerase PB2 [Influenza A virus (A/blue-winged teal/Ohio/926/2002(H3N8))] epitope <400> 66 Leu Thr Ile Thr Tyr Ser Ser Ser Met Met Trp Glu Ile Asn Gly Pro 1 5 10 15 Glu Ser Val Leu 20 <210> 67 <211> 11 <212> PRT <213> polymerase PB2 [Influenza A virus (A/blue-winged teal/Ohio/926/2002(H3N8))] epitope <400> 67 Asn Thr Tyr Gln Trp Ile Ile Arg Asn Trp Glu 1 5 10 <210> 68 <211> 18 <212> PRT <213> polymerase PB2 [Influenza A virus (A/blue-winged teal/Ohio/926/2002(H3N8))] epitope <400> 68 Met Leu Tyr Asn Lys Met Glu Phe Glu Pro Phe Gln Ser Leu Val Pro 1 5 10 15 Lys Ala <210> 69 <211> 20 <212> PRT <213> polymerase PB2 [Influenza A virus (A/blue-winged teal/Ohio/926/2002(H3N8))] epitope <400> 69 Leu Gly Thr Phe Asp Thr Val Gln Ile Ile Lys Leu Leu Pro Phe Ala 1 5 10 15 Ala Ala Pro Pro 20 <210> 70 <211> 32 <212> PRT <213> polymerase PB2 [Influenza A virus (A/blue-winged teal/Ohio/926/2002(H3N8))] epitope <400> 70 Gln Ser Arg Met Gln Phe Ser Ser Leu Thr Val Asn Val Arg Gly Ser 1 5 10 15 Gly Met Arg Ile Leu Val Arg Gly Asn Ser Pro Val Phe Asn Tyr Asn 20 25 30 <210> 71 <211> 12 <212> PRT <213> polymerase PB2 [Influenza A virus (A/blue-winged teal/Ohio/926/2002(H3N8))] epitope <400> 71 Gly Val Glu Ser Ala Val Leu Arg Gly Phe Leu Ile 1 5 10 <210> 72 <211> 11 <212> PRT <213> matrix protein 1 [influenza A virus (A/Chicken/New York/13142-5/94 (H7N2NSB))] epitope <400> 72 Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Tyr Val Leu 1 5 10 <210> 73 <211> 14 <212> PRT <213> matrix protein 1 [influenza A virus (A/Chicken/New York/13142-5/94 (H7N2NSB))] epitope <400> 73 Lys Thr Arg Pro Ile Leu Ser Pro Leu Thr Lys Gly Ile Leu 1 5 10 <210> 74 <211> 11 <212> PRT <213> matrix protein 1 [influenza A virus (A/Chicken/New York/13142-5/94 (H7N2NSB))] epitope <400> 74 Gly Phe Val Phe Thr Leu Thr Val Pro Ser Glu 1 5 10 <210> 75 <211> 11 <212> PRT <213> matrix protein 1 [influenza A virus (A/Chicken/New York/13142-5/94 (H7N2NSB))] epitope <400> 75 Leu Tyr Arg Lys Leu Lys Arg Glu Ile Thr Phe 1 5 10 <210> 76 <211> 10 <212> PRT <213> matrix protein 1 [influenza A virus (A/Chicken/New York/13142-5/94 (H7N2NSB))] epitope <400> 76 Ala Leu Ala Ser Cys Met Gly Leu Ile Tyr 1 5 10 <210> 77 <211> 15 <212> PRT <213> matrix protein 1 [influenza A virus (A/Chicken/New York/13142-5/94 (H7N2NSB))] epitope <400> 77 Met Gly Thr Val Thr Thr Glu Val Ala Phe Gly Leu Val Cys Ala 1 5 10 15 <210> 78 <211> 20 <212> PRT <213> matrix protein 1 [influenza A virus (A/Chicken/New York/13142-5/94 (H7N2NSB))] epitope <400> 78 Asn Arg Met Val Leu Ala Ser Thr Thr Ala Lys Ala Met Glu Gln Met 1 5 10 15 Ala Gly Ser Ser 20 <210> 79 <211> 10 <212> PRT <213> matrix protein 1 [influenza A virus (A/Chicken/New York/13142-5/94 (H7N2NSB))] epitope <400> 79 Gln Ala Arg Gln Met Val Gln Ala Met Arg 1 5 10

Claims

서열번호 1로 기재된 서열을 가지는 NP 유전자 및 서열번호 3로 기재된 서열을 가지는 PA 유전자를 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 T-세포 기반 유니버설 플루 백신.
제 1항에 있어서,
추가로 서열번호 5로 기재된 서열을 가지는 PB1 유전자, 서열번호 7로 기재된 서열을 가지는 PB2 유전자, 및 서열번호 9로 기재된 서열을 가지는 M1 유전자 중에서 선택한 하나 이상의 유전자를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 T-세포 기반 유니버설 플루백신.
NP(서열번호 1), PA(서열번호 3), PB1(서열번호 5), PB2(서열번호 7), 및 M1(서열번호 9) 유전자를 모두 포함하는 것을 특징으로 하는 T-세포 기반 유니버설 플루 백신.
제 1항 내지 제 3항의 어느 한 항에 있어서,
상기 NP(서열번호 1), PA(서열번호 3), PB1(서열번호 5), PB2(서열번호 7), 및 M1(서열번호 9)는 각각 하나 이상의 CTL 항원결정부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 T-세포 기반 유니버설 플루 백신.
제 1항 내지 제 3항의 어느 한 항에 있어서,
상기 NP 유전자의 CTL 항원결정부위는 MASQGTKRSYEQMET(서열번호 11), GIGRFYIQMCTELKL(서열번호 12), MVLSAFDERRN(서열번호 13), YLEEHPSAGKDPKKTGGPIY(서열번호 14), LYDKEEIRRIWRQANNG(서열번호 15), ATYQRTRAL(서열번호 16), YERMCNILKG(서열번호 17), QVRESRNPGNAEIEDLIFLA(서열번호 18), QLVWMACHSAAFEDLRVSSF(서열번호 19), 또는 QPTFSVQRNLPF(서열번호 20) ;
상기 PA 유전자의 CTL 항원결정부위는 KIETNKFAAICTHLEVCFMYSDFHF(서열번호 21), RTMAWTVVNSI(서열번호 22), VEKPKFLPDLY(서열번호 23), YYLEKANKIKSE(서열번호 24), THIHIFSFTGEEMA(서열번호 25), RGLWDSFRQSERGEETIEE(서열번호 26), RSKFLLMDALKLSIE(서열번호 27), HEGEGIPLYDAIKC(서열번호 28), SQLKWALGENMA(서열번호 29), EFNKACELTDSSWI(서열번호 30), SRPMFLYVRTNGTSK(서열번호 31), 또는 AESRKLLLI(서열번호 32);
상기 PB1 유전자의 CTL 항원결정부위는 MDVNPTLLFLKVPAQNAISTTFPYTGDPPYSHGTGTGYTMDTVNRTHQYSE(서열번호 33), MAFLEESHPGIFENS(서열번호 34), VQQTRVDKLTQGRQTYDWTLNRNQPAATALANTIE(서열번호 35), TKKMVTQRTIGKKK(서열번호 36), FVETLARSICEKLEQSGL(서열번호 37), RMFLAMITYITRNQP(서열번호 38), LSIAPIMFSNKMARLGKGYMFESKSMKLRTQIPAEMLA(서열번호 39), SPGMMMGMFNMLSTVLGVS(서열번호 40), GINMSKKKSYIN(서열번호 41), TGTFEFTSFFYRYGFVANFSMELPSFGVSGINESADMSI(서열번호 42), GVTVIKNNMINNDLGPATAQMALQLFIKDYRYTYRCHRGDTQIQTRRSFE(서열번호 43), VSDGGPNLY(서열번호 44), MEYDAVATTHSW(서열번호 45), PKRNRSILNTSQRGILEDEQMYQ(서열번호 46), 또는 AEIMKICST(서열번호 47);
상기 PB2 유전자의 CTL 항원결정부위는 LMSQSRTREILTKTTVDHMAIIKKYTSGRQEKNP(서열번호 48), WMMAMKYPI(서열번호 49), PERNEQGQTLWSK(서열번호 50), PLAVTWWNRNGP(서열번호 51), GPVHFRNQVKIRR(서열번호 52), YIEVLHLTQGTCW(서열번호 53), EQMYTPGGEV(서열번호 54), NDDVDQSLIIAARNIVRRA(서열번호 55), ASLLEMCHSTQIGG(서열번호 56), SFSFGGFTFK(서열번호 57), LTGNLQTLK(서열번호 58), RVHEGYEEFTMVG(서열번호 59), RATAILRKATRR(서열번호 60), VAMVFSQEDCM(서열번호 61), KAVRGDLNF(서열번호 62), VNRANQRLNPMHQLLRHFQKDAKVLF(서열번호 63), RVSKMGVDEYS(서열번호 64), GNVLLSPEEVSETQG(서열번호 65), LTITYSSSMMWEINGPESVL(서열번호 66), NTYQWIIRNWE(서열번호 67), MLYNKMEFEPFQSLVPKA(서열번호 68), LGTFDTVQIIKLLPFAAAPP(서열번호 69), QSRMQFSSLTVNVRGSGMRILVRGNSPVFNYN(서열번호 70), 또는 GVESAVLRGFLI(서열번호 71);
상기 M1 유전자의 CTL 항원결정부위는 SLLTEVETYVL(서열번호 72), KTRPILSPLTKGIL(서열번호 73), GFVFTLTVPSE(서열번호 74), LYRKLKREITF(서열번호 75), ALASCMGLIY(서열번호 76), MGTVTTEVAFGLVCA(서열번호 77), NRMVLASTTAKAMEQMAGSS(서열번호 78), 또는 QARQMVQAMR(서열번호 79)인 것을 특징으로 하는 T-세포 기반 유니버설 플루 백신.
제 1항 내지 제 3항의 어느 한 항에 있어서,
상기 유전자는 재조합 바이러스에 포함시킨 것을 특징으로 하는 T-세포 기반 유니버설 플루 백신.
제 6항에 있어서,
상기 재조합 바이러스는 재조합 백시니아 바이러스, 재조합 아데노 바이러스, 재조합 아데노 수반 바이러스, 재조합 레트로 바이러스 또는 재조합 렌티 바이러스 인 것을 특징으로 하는 T-세포 기반 유니버설 플루 백신.
제 7항에 있어서,
상기 재조합 바이러스는 재조합 백시니아 바이러스인 것을 특징으로 하는 T-세포 기반 유니버설 플루 백신.
제 7항에 있어서,
피부 난절법(skin scarification; s.s.) 경로, 근육 내(intramuscular; i.m.) 경로, 비강 내(intranasally; i.n.) 경로, 피내(intradermal; i.d.) 경로, 정맥 내(intravenous; i.v.) 경로, 또는 복강 내(intraperitoneal; i.p.) 경로로 투여하는 것을 특징으로 하는 T-세포 기반 유니버설 플루 백신.
제 9항에 있어서,
피부 난절법 (skin scarification; s.s.) 경로로 투여하는 것을 특징으로 하는 T-세포 기반 유니버설 플루 백신.
제 7항에 있어서,
상기 T-세포 기반 유니버설 플루 백신은 약제학적으로 허용되는 면역강화제, 담체, 부형제, 희석제에서 선택한 하나 이상의 첨가제를 포함하는 것을 특징으로 하는 T-세포 기반 유니버설 플루 백신.